Summary
De in vitro Cell Invasion assay wordt gebruikt om het potentieel van kanker metastasen te meten door het cellulaire potentieel voor invasie en migratie te kwantificeren met behulp van celkweek inserts met eiwit matrix. Cellen worden uitgedaagd om te migreren door de eiwit matrix en een poreus membraan, naar een chemoaantretant, en vervolgens gekwantificeerd door lichte microscopie.
Abstract
De in vitro invasie test gebruikt een eiwitrijke matrix in een Boyden kamer om het vermogen van gekweekte cellen te meten door de matrix en een poreus membraan te passeren in een proces dat analoog is aan de initiële stappen van kankercellen metastasen. De geteste cellen kunnen worden gewijzigd voor de genexpressie of worden behandeld met remmers om te testen op veranderingen in het invasie potentieel. Dit experiment test het agressieve fenotype van de muizen-borstkanker tumorcellen te ontdekken en karakteriseren de potentiële oncogenen die celinvasie bevorderen. Deze techniek kan echter veelzijdig zijn en aan veel verschillende toepassingen worden aangepast. Het experiment zelf kan worden gedaan in een dag en de resultaten worden verworven door lichte microscopie in minder dan een dag. De resultaten omvatten tellingen van het aantal binnenvallende cellen voor vergelijking en analyse. De in vitro invasie test is een snelle, goedkope en duidelijke methode voor het bepalen van het Celgedrag in een cultuur die kan worden gebruikt als een initiële beoordeling voordat er meer bij vivo-testen wordt betrokken.
Introduction
De in vitro invasie test kan een nuttig hulpmiddel zijn bij het meten van het vermogen van een cel om te migreren via een eiwit gecoat membraan, analoog aan de eerste stappen in metastasen. Een belangrijk kenmerk van kwaadaardige kankercellen is hun vermogen om te migreren door en binnendringen in de buurt weefsels. Kanker die zich heeft verspreid of metastaseert, brengt meer behandelings uitdagingen met zich mee en heeft een lager percentage langdurig overleven, terwijl gelokaliseerde tumoren gemakkelijker te behandelen zijn en hogere percentages van overleving op lange termijn hebben. Om metastaseren, kankercellen moeten verlaten van de primaire tumor en migreren naar de bloedsomloop of lymfestelsel, een proces dat het passeren van de extracellulaire matrix en kelder membraan1vereist. In het proces genaamd de epitheliale mesenchymale transitie (EMT), moeten de tumorcellen celcelcontacten breken, directioneel migreren en nabijgelegen bloed of lymfevaten binnendringen. De eerste stappen van deze metastasen Cascade zijn van groot belang, omdat deze stappen zijn wat kan kanker Deadlier maken. De genetische en epigenetische factoren die betrokken zijn bij de eerste stappen van metastase zijn de focus van een grote hoeveelheid onderzoek, maar nauwkeurige en betrouwbare experimentele instrumenten zijn nodig om deze vroege stappen zowel in vivo als in vitro te testen.
Hulpmiddelen voor het meten van veranderingen in Celmigratie zoals wondgenezing (scratch) of groei in 3D-omgevingen zoals zachte agar-assays kunnen gedeeltelijk de behoefte aan experimentele methoden voor het meten van vroege stappen van metastasen aanpakken, maar een test om de invasie te meten is meer uitdagend omdat het proces in het lichaam in een complexe tumor micro-omgeving optreedt. Met het oog op de screening van geneesmiddelen of genveranderingen om belangrijke factoren in de invasie en metastase te bepalen, een systeem dat in vitro met gekweekte cellen kan worden gebruikt en de uitdagingen waarmee gemetastaseerde cellen worden geconfronteerd na te bootsen, is de invasie test2, 3. Borstkanker is de meest gediagnosticeerde vorm van kanker bij vrouwen en de tweede belangrijkste oorzaak van de kanker sterfte bij vrouwen, dus het begrijpen van de genen die verantwoordelijk zijn voor de invasie van borstkanker cellen en metastase is van cruciaal belang voor de volksgezondheid. Bovendien zijn muis cellen een handig modelsysteem voor het bestuderen van borstkanker en de progressie ervan.
De in vitro invasie test is gebaseerd op de vergadering van de Boyden Chamber, waar twee kamers van groeimedia worden gescheiden door een poreus membraan3. Om na te bootsen van de tumor micro omgeving, een eiwitrijke gel is ook opgenomen om cellen in één kamer van een chemoaantretant in de andere scheiden en fungeren als een kelder membraan barrière. Om te migreren naar de chemoaantretant, moeten cellen eerst door de eiwitrijke barrière passeren en vervolgens door het poreuze membraan passeren-een proces dat analoog is aan hoe gemetastaseerde cellen migreren via stroma. De proteïnerijke gel kan worden aangepast op basis van de behoeften van het experiment, maar bestaat meestal uit collageen, of kelder membraan extract (bijv. Matrigel)4. Het is een complex mengsel van eiwitten, proteoglycanen en groeifactoren, maar meestal bestaat uit lamininen en collageen IV 4,5. Cellen moeten dan een poreus membraan passeren dat typisch is gemaakt van polycarbonaat, polyester of polytetrafluorethyleen (PTFE). Membranen kunnen commercieel worden gekocht met of zonder een proteïne-gel (meestal collagens), of de gel kan afzonderlijk worden aangeschaft en toegevoegd. De poriegrootte kan worden aangepast op basis van de celgrootte. Hoewel porie maten verkrijgbaar zijn van 0,4-8,0 μm, zijn alleen poriën van 3,0-8,0 μm groot genoeg voor Celmigratie. De invasie test is gebruikt om de effectiviteit te bepalen van remmers op het vermogen van cellen om te migreren en binnen te vallen. Terwijl de exacte tumor micro omgeving ontbreekt die in vivo aanwezig is, is de in vitro invasie test voordelig bij het screenen van vele aandoeningen in korte tijd, terwijl de behoefte aan diermodellen wordt geminimaliseerd. Het doel van deze experimenten is het vergelijken van genexpressie van vermoedelijke oncogenen en het bepalen van de effecten op het gedrag van kankercellen en de agressiviteit van de ziekte met behulp van de in vitro invasie assay en andere tests. Over het algemeen biedt de invasie test consistente, kwantitatieve en snelle resultaten voor het bepalen van gemetastaseerd potentieel, terwijl het ook een relatief goedkope, ongecompliceerde en aanpasbare methode is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten en methoden werden uitgevoerd zoals goedgekeurd door Villanova University institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC).
1. genexpressie in gekweekte muis mammary tumor cellen
- Bereid eerst de te testen cellijnen voor.
-
Gebruik een broed kolonie van BALB/cV muizen. Deze muizen dragen de Balb/cV stam van muis borsttumor virus, overgedragen aan pups in melk6,7. 50 procent van de vrouwelijke fokdieren ontwikkelen borsttumoren met een leeftijd van 10 maanden.
- Voor het vestigen van een tumor cellijn, offeren een tumor-dragende dam met behulp van een IACUC-goedgekeurd protocol. Week de buikhuid in 70% EtOH en verwijder de tumor onder steriele omstandigheden in een laminaire stroom afzuigkap. Tumoren zijn subcutaan, dus wees voorzichtig om te voorkomen dat het peritoneum prikken.
- Plaats tumor fragmenten uit niet-necrotische gebieden in een petrischaaltje met een kleine hoeveelheid steriele Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en gehakt zeer fijn met een steriel scheermesje.
- Breng de gedispergeerde cel klonters over naar een celkweek maatkolf van T25 met 5 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium of DMEM (4,5 g/L glucose, fenolrood en L-glutamine) aangevuld met 50% foetaal runderserum of FBS en 1% antibioticum/antimycotische oplossing. Kweekcellen in kolven van behandelde celkweek in een incubator met 5% CO2 en 100% luchtvochtigheid bij 37 °c.
- Afwassen van niet-aanhandige cellen na 24-48 h en vervang de DMEM met 50% FBS en 1% antibioticum/antimycotische oplossing. Retourneer de cellen naar de incubator.
- Vervang vloeibare kweekmedia elke 3 dagen.
- Splitsen of doorgang van de cellen als ze 90% Confluent. Verwijder cultuur media en was aanhechting cellen met HBSS (zonder calcium of magnesium). Incuberen cellen met 0,25% trypsine-EDTA-oplossing voor 1-5 min bij 37 °C totdat cellen worden afgerond en losgemaakt. Verdun cellen 1:10 in verse kweekmedia en voeg toe aan een nieuwe kolf. Een T-25 celkweek kolf vereist 5-8 mL kweekmedia, 5 mL HBSS om te wassen, en 1 mL trypsine-EDTA naar passage. De kolf terug naar de incubator.
- Verlaag de FBS-concentratie tot 40% na de eerste passage, daarna 30% na de tweede passage, daarna 20% na de derde passage en uiteindelijk 10% voor alle daaropvolgende passages. Het proces van het vaststellen van groei in standaard DMEM-medium met 10% FBS vereist vier passages en 2-8 maanden.
-
Zodra de cellijn (en) zijn vastgesteld, verander de uitdrukking van vermoedelijke oncogenen door transfectie van shRNA gericht op mRNA of CRISPR voor niet-essentiële genen.
- Stel antibiotica bestendige stabiele cellijnen vast met individuele klonen die worden geverifieerd door Western Blot en/of RT-qPCR voor consistente resultaten, maar voorbijgaande transfecties kunnen ook werken, omdat de bepaling slechts 22 h vereist. regel cellijnen met niet-specifieke doel sequenties zijn ook vereist.
2. in vitro invasie test
- Groeien aanhandige muis borstkanker tumorcellen in een fles T25 tot 70-90% Confluent Health voor dag 1 van het experiment.
Opmerking: Andere cellijnen of experimentele omstandigheden kunnen verschillende celkweek media vereisen. Bijvoorbeeld, als hormoon-responsieve borstkanker cellen worden getest, houtskool-gefilterde serum kan nodig zijn voor het verwijderen van verbindingen die oestrogeen of andere hormoon receptoren activeren. - Bereid de boden kamer inserts door ze te verwarmen op kamertemperatuur (van-20 °C opslag) voor ongeveer 20 min in een cel cultuur kap. Vermijd bevriezen-ontdooien cycli voor ongebruikte inserts. Gebruik drie wisselplaten (replicaten) voor het genereren van statistisch geldige gegevens voor elke cellijn voor elk experiment.
- Voeg pre-warmed 37 °C serum vrije DMEM media toe aan de put en vervolgens de insert. Voor wisselplaten die zijn ontworpen voor 24-Well gerechten, voeg 500 μL serum vrije DMEM toe aan de put en vervolgens 500 μL serum vrije DMEM aan de wisselplaat zodat het poreuze membraan en de gel aan beide zijden gehydrateerd worden.
Opmerking: Voor grotere wisselplaten ontworpen voor een 6-goed gerecht, gebruik 2 mL serum vrije DMEM aan beide zijden.
- Voeg pre-warmed 37 °C serum vrije DMEM media toe aan de put en vervolgens de insert. Voor wisselplaten die zijn ontworpen voor 24-Well gerechten, voeg 500 μL serum vrije DMEM toe aan de put en vervolgens 500 μL serum vrije DMEM aan de wisselplaat zodat het poreuze membraan en de gel aan beide zijden gehydrateerd worden.
- Plaats de schaal met inserts in een celkweek Incubator van 37 °C met 5% CO2 en 100% luchtvochtigheid gedurende ten minste 2 uur om grondig te hydrateren en acclimeren.
- Bereid de cellen voor door de groeimedia te verwijderen en de cellen met 5 mL HBSS te spoelen.
- Verwijder de HBSS en voeg 1 mL 0,25% trypsine-EDTA-oplossing toe voor 1-5 min bij 37 °C of totdat de cellen zijn afgerond of tekenen van loslating van de kolf vertonen.
- Tik zachtjes op de kolf om alle cellen los te maken. Regeer de cellen in 5 mL DMEM + 10% FBS en breng over naar een steriele centrifugebuis van 15 mL.
- Centrifugeer de cellen op 1.000 x g gedurende 5 minuten om de cellen zachtjes te pellet. Verwijder de media en vervang met 5 mL serum vrije DMEM om de cellen te hervatten.
- Herhaal de centrifugeren en suspensie in serum vrije media twee keer meer voor een totaal van 3 wasruimtes.
- De cellen in de laatste 5 mL serum vrije DMEM grondig hervatten en ervoor zorgen dat er geen klonters cellen zijn.
- Bepaal de celconcentratie met behulp van een hemocytometer. Tel alleen levensvatbare cellen. Verdun de celsuspensie tot 5 x 104 cellen/ml in 5 ml serum vrije DMEM.
Opmerking: Deze concentratie levert 2.500 cellen per insert in een 24-Well Dish. Dit aantal cellen is genoeg voor agressieve kankercellen met hoge snelheden van migratie en invasie. Minder agressieve cellijnen kunnen meer cellen nodig hebben, tot 10.000 cellen per insert voor waarneembare binnenvallende cellen. Als een verminderde celinvasie wordt verwacht, u overwegen de binnenvallende cellen te maximaliseren door het celnummer te verhogen. Als een verhoogde celinvasie wordt verwacht, begint u met minder cellen. - Haal de celkweek schaal uit de incubator en zuig de media voorzichtig op uit de wisselplaat. Til de INSERT en aspiraat de media uit de put. Werk snel, voeg de chemoaantretant toe aan de onderste kamer. Voeg voor een 24-goed gerecht 750 μL DMEM toe met 5% FBS.
- Plaats de insert in de put en voeg de cellen toe aan de insert. Gebruik voor een 24-put-schotel 500 μL celsuspensie. Gebruik voor een 6-well schaaltje 2,5 mL chemoattract en 2 mL cellen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn aan weerszijden van het membraan.
- Keer het gerecht terug naar de celkweek incubator voor 22 uur.
- Na 22 h, fixeren en vlekken op de cellen. Bereid een oplossing van 1% Paraformaldehyde in 1x fosfaatgebufferde Saline (PBS) voor fixatie.
- In een schone 24-Well celkweek schotel, voeg 1 mL fixatief toe aan individuele putten, zodat er één goed is voor elke wisselplaat.
- Bereid de kleurings oplossing (vers gemaakt) van 0,1% kristalviolet (w/v) in een oplossing van PBS met 10% ethanol (v/v). Voeg op dezelfde manier 1 mL kleurings oplossing toe aan een schoon goed in een 24-goed kweek schaal voor elke wisselplaat.
- Verwijder elke insert een voor een met een tang en plaats een steriel wattenstaafje in de wisselplaat en veeg de bovenzijde van het membraan om niet-gemigreerde cellen te verwijderen.
- Herhaal dit met een tweede wattenstaafje. Het membraan is vrij sterk, dus zachte druk terwijl Zwaben de integriteit van het membraan niet in gevaar brengt.
- Verwijder de resterende media van de binnenzijde van de wisselplaat en voeg 750 μL PBS toe om losgekoppelde cellen weg te spoelen.
- Verwijder de PBS en herhaal de wassing. Plaats het insert in een goed bevattende fixeermiddel om de gemigreerde cellen aan de onderzijde van het membraan te bevestigen. Herhaal dit voor alle wisselplaten.
- Bevestig de wisselplaten gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Na fixatie Verwijder de insert. Was de wisselplaat opnieuw met 750 μL PBS.
- Plaats de insert in de put met de kleurings oplossing om alle gemigreerde en vaste cellen te vlekken. Beits de cellen 15 min bij kamertemperatuur.
Opmerking: Gebruik voor 6-well schaalinserts 2 mL fixatieve oplossing, 2 mL kleurings oplossing en 2 mL PBS Wash.
- Gebruik een bekerglas met gedistilleerd water om de wisselplaten te ontvlekken. Verwijder de wisselplaten en dompel het water in het gedestilleerde water totdat de wisselplaat helder is.
- Verwijder eventuele overtollige waterdruppels en plaats de inserts op een filtreerpapier naar de lucht droog (meestal 's nachts).
- Bereid het membraan voor de beeldvorming door het labelen van een schone glazen Microscoop glijbaan voor elke wisselplaat en plaats een kleine druppel Microscoop onderdompeling olie in het midden van de glijbaan.
- Maak het membraan los van de wisselplaat met behulp van een scalpel om de omtrek van het membraan aan de binnenkant van het kunststof inzetstuk te snijden.
- Verwijder het membraan met behulp van de Tang en plaats op de bovenkant van de olie druppel op de glijbaan om het op zijn plaats te houden.
Opmerking: De membranen zijn zeer dun en zeer licht, zodat ze gemakkelijk kunnen worden verloren door zachte luchtstroom.
3. beeldvorming en analyse
- Omdat de poreuze membranen duidelijk zijn en kleurings cellen met kristalviolet contrast geven, gebruikt u een samengestelde lichtmicroscoop om de cellen te bekijken. Gebruik een camera en/of software om te kwantificeren voor veel monsters, maar is niet nodig. Bekijk cellen met een vergroting van 5x, 10x of 20x. Gebruik voor kwantificering meerdere, niet-overlappende afbeeldingen met een vergroting van 10x. U ook alle gemigreerde cellen op het membraan tellen bij een vergroting van 10x.
- Bepaal het totale aantal binnenvallende cellen of cellen per gebied voor alle samples. Voer voor elk experiment elke voorwaarde in de test uit met drie replicaatinserts en herhaal meerdere keren voor statistisch bruikbare resultaten.
- Bij het vergelijken van verschillende cellijnen met verschillende groeipercentages en migratie percentages, doe een parallel experiment om cellen te vergelijken die door een eiwit matrix binnendringen en vergelijken met een Boyden kamer assemblage zonder eiwit matrix (alleen gemigreerde cellen). Bereken percentage invasie voor elke cellijn (aantal binnengevallen cellen/aantal gemigreerde cellen x 100%).
Opmerking: Deze aanpak kan helpen om de invasie snelheid te vergelijken met de migratie percentages. Als het vergelijken van verschillende voorwaarden toegepast op dezelfde cellijn, het berekenen van de invasie alleen is relevantere berekeningen. De buitenste rand van het membraan heeft soms een groter aantal cellen dan de centrale gebieden en is daarom minder nauwkeurig. Als dit gebeurt, uitsluiten die cellen van de kwantificering en zorg ervoor dat alle cellen worden verwijderd door een wattenstaafje in een herhalingsexperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode van in vitro invasie door middel van een eiwit matrix werd gebruikt om de agressieve fenotypes en oncogene celgedragingen van muizen-borstkanker tumorcellen met veranderde expressie van het zink vinger eiwit ZC3H88te beoordelen. In combinatie met andere benaderingen die ook de Celmigratie en groei in 3D-omgevingen onderzoeken, bleek dat hogere niveaus van expressie van Zc3h8 in tumor cellijnen, of door Promoter-gemedieerde expressie van een plasmide, resulteerde in snelle percentages van de cel proliferatie, snelle migratie, groei in 3D-omgevingen en toegenomen invasie in de in vitro invasie test8. Omgekeerd, verminderde expressie door shRNA constructies resulteerde in minder agressieve proliferatie, migratie, en invasie8. Deze resultaten werden bevestigd in vivo waar hogere expressie van Zc3h8 grotere tumoren produceerde die snel verschenen, terwijl verminderde expressie minder tumoren produceerde die kleiner en minder frequent waren8.
Om uit te breiden dat dit werk, expressie plasmiden die kunnen redden shRNA-gemedieerde knockdown van Zc3h8 uitdrukking werden stabiel getransfundeerd in muizen borst cellen om te evalueren als agressieve celgroei en gedrag in deze cellen kan worden heropgericht. Alle knock-down en redding van uitdrukkingen werden geverifieerd door Western Blot of RT-qPCR8. Een invasie test werd gebruikt met 5.000 cellen per kamer in een 24-Well Dish en gedocumenteerd met Foto's zoals afgebeeld in Figuur 1 en Figuur 2. Figuur 3 toont de resultaten van de invasie test die aantonen hoe de celinvasie daalde bij shRNA knockdown van Zc3h8 expressie, maar die invasie wordt gered wanneer de uitdrukking wordt gered. Deze gegevens tonen aan dat de invasie test een snelle methode kan bieden voor het testen van cellijnen in vitro voordat er meer dure en langdurige benaderingen worden begonnen.
Figuur 1: onderdelen van de Invasion assay. (A) Boyden kamer invoegen voor een 24-goed weefselcultuur gerecht. B) een 24-goed weefselkweek schotel die wordt gebruikt voor fixatie, kleuring en wassen na 22 uur incubatie met cellen. Getallen 1, 2 en 3 zijn replicaten van een enkele cellijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: invasie test stroomdiagram met de tijdschaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: monster invasie assay resultaten van een muis borsttumor cellen gewijzigd voor expressie van Zc3h8, die verandert het oncogene fenotype. (a, B) Cellen geïsoleerd van muizen borsttumoren werden stabiel getransfunteerd met shRNA gericht op een controle sequentie van mRNA of targeting Zc3h8 mRNA. (C) de latere cellijn werd vervolgens gered door het uitdrukken van recombinant Zc3h8 ontworpen om te worden aangetast door shRNA. Cellen zijn gekleurd met kristalviolet en gevangen met 10x vergroting met behulp van een lichte Microscoop. Schaalbalk = 500 μm.D) kwantificering waaruit blijkt dat de verlaagde expressie van Zc3h8 het aantal binnenvallende cellen en het metastasen-potentieel heeft verlaagd. Redding van genexpressie redt hogere tarieven van celinvasie. Waarden vertegenwoordigen het totale aantal binnenvallende cellen van een 24-Well invasie assay insert. Voor elke replicatie in het experiment is het gemiddelde aantal binnenvallende cellen berekend. Dit werd herhaald voor drie experimenten. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in vitro invasie test is een goedkope, snelle, kwantitatieve en eenvoudige methode voor het bestuderen van de factoren die de invasie van kankercellen bevorderen. Borstkanker is de meest gediagnosticeerde kanker onder vrouwen. Van de drie belangrijkste subtypen van borstkanker, drievoudig negatief, (of er-, PR-, HER2/Neu-), is de meest agressieve, meest waarschijnlijke metastasize, en de meeste dodelijke9. Daarom kan het begrijpen van de genen en expressie die resulteren in metastasen helpen bij het vinden van nieuwe therapeutische doelen en genetische markers voor de ziekte. Hoewel veel van de genen die belangrijk zijn voor de invasie van kankercellen en metastase geïdentificeerd en gekarakteriseerd zijn, kunnen uitdrukkings niveaus en activiteit van metastase-bestuurders versus metastase suppressors een kritisch aspect zijn van ziekteprogressie9, 10.
Naast genexpressie is ook de in vitro invasie test gebruikt om de rol van microRNA en andere regulatoren te bestuderen in het bevorderen of voorkomen van de invasie van kankercellen11,12. De in vitro Invasion Setup methode kan worden gebruikt voor de studie van Remmers, Multi-Cell type tumor omgevingen, CRISPR-bewerkte cellen, of op korte termijn veranderingen in cellulaire groei-omgevingen. De veelzijdigheid en aanpassingsvermogen maken deze assay zeer voordelig.
De invasie test kan worden gebruikt in een eerste stap in de analyse van genen en factoren die bijdragen aan of voorkomen van tumorprogressie. Bijvoorbeeld, Yan et al. (2010) gebruikt de in vitro invasie testen om de rol van GATA-3 te definiëren bij het onderdrukken van de EMT door de zeer agressieve borstkanker cellijn MDA-MB 23113. Vervolgens konden ze aantonen dat deze onderdrukking gecorreleerd was met een verminderd vermogen om metastasen te vormen in een in vivo assay13. Potentiële therapeutische strategieën kunnen in eerste instantie worden gekenmerkt door het vermogen van pathway remmers om invasie via Matrigel te beperken, ook correleren met het effect van deze remmers op tumorvorming in diermodellen. De in vitro invasie test kan worden gebruikt voor een diepgravende analyse van bekende en potentiële oncogenen en interagerende partners. Bijvoorbeeld, moleculaire dissectie van bekende functionele motieven van een oncoproteïne of snelle analyse van mutaties kan worden gedaan met de in vitro invasie assay als een eerste scherm of beoordeling van significantie. Dit kan waardevol inzicht bieden in kritieke domeinen, evenals een functioneel begrip van celfenotypes op moleculair niveau.
Hoewel de Boyden Chamber-invasie test veel voordelen heeft, zijn er beperkingen. Bijvoorbeeld, de invasie assay kijkt alleen naar intravasatie, een van de eerste stappen van metastasen, maar niet de latere stappen wanneer kankercellen secundaire locaties koloniseren. Daarom kan slechts een gedeeltelijke weergave van metastase potentieel worden gesloten. De lengte van 22 h van de test, hoewel flexibel, kan sommige celdeling die subtiele veranderingen in het meten van invasie van asynchrone celpopulaties scheeftrekken, niet uitsluiten. Remmers zoals mitomycine C kunnen worden gebruikt om celdeling te voorkomen in het geval van snel duik cellen. Ten slotte zal het gebruik van 5% FBS-oplossing voor chemotaxis in de loop van de tijd langzaam diffuus worden en een evenwicht vinden tussen de bovenste en onderste kamers. De dichtheid van de proteïne-gel vertraagt deze diffusie en presenteert de cellen met de optie om lateraal over de gel en het membraan (haplotaxis) te migreren of via de eiwit matrix en door de poriën naar de hogere concentraties van FBS (chemotaxis). Alternatieve chemotaxis-agenten kunnen worden vervangen of kortere tijdslimieten voor invasies kunnen worden gebruikt om alleen de cellen te meten die vóór de equilibratie zijn binnengevallen. Het is de flexibiliteit, niet de stijfheid, van de in vitro-invasie test die aanpassing mogelijk maakt waardoor deze assay zo nuttig is. Toekomstige aanpassingen van deze test omvatten een grootschalige screening van verbindingen, genexpressie veranderingen en beoordeling van allel-specifieke geneesmiddel effectiviteit. Bovendien kan een dubbel kamer systeem met circulerende media cellen uitdagen om door een eiwit matrix binnen te dringen, een vloeibare omgeving doorkruisen en een tweede eiwit matrix op een secundaire locatie herstellen. Ten slotte kan een meer uitdagende membraan worden gebruikt met het in vitro Invasion assay-systeem, zoals een monolaag van niet-invasieve cellen die moeilijker zou zijn voor kankercellen om over te steken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door Grant R15CA169978 van de National Institutes of Health. Aanvullende financiering kwam van de Villanova University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y.
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), pii: BSR20180571 (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
