Summary
Detta protokoll visar studien av patofysiologiska effekter av cigarettrök (CS) med en helkropps inandning (WBI) exponeringssystem (WBIS) byggt internt. Detta system kan utsätta djur för CS under kontrollerade repeterbara förhållanden för forskning av CS-medierade effekter på lungemfysem och hematopoiesis.
Abstract
Nära 14 procent av de vuxna i USA rapporterades röka cigaretter under 2018. Effekterna av cigarettrök (CS) på lungor och hjärt-kärlsjukdomar har studerats i stor utsträckning, men effekten av CS i andra vävnader och organ som blod och benmärg förblir ofullständigt definierad. Att hitta det lämpliga systemet för att studera effekterna av CS hos gnagare kan vara oöverkomligt dyrt och kräva inköp av kommersiellt tillgängliga system. Således gav vi oss ut för att bygga ett prisvärt, pålitligt och mångsidigt system för att studera de patologiskt effekterna av CS hos möss. Denna helkropps inandning exponeringssystem (WBIS) uppsättning efterliknar andning och puffning av cigaretter genom alternerande exponering för CS och ren luft. Här visar vi att detta gör-det-själv -system (DIY) inducerar luftvägsinflammation och lungemfysem hos möss efter 4 månaders cigarettrökexponering. Effekterna av helkroppsinandning (WBI) av CS på hematopoetiska stam- och stamceller (HSPCs) i benmärgen med denna apparat visas också.
Introduction
Cigarettrökning är fortfarande en av de främsta orsakerna till sjukdomar som kan förebyggas i USA trots den stadiga minskningen av antalet cigarettrökande vuxna under de senaste 50-60 åren1. Det är allmänt känt att rökning är kopplad till flera sjukdomar i lungorna och blodet inklusive kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), en grupp sjukdomar som inkluderar emfysem och kronisk bronkit2,3,4. Enligt Center for Disease Control (CDC) var KOL 2014 den tredje ledande dödsorsaken i USA med över 15 miljoner amerikaner som lider av denna sjukdom5.
CS har också nyligen associerats med en högre risk att utveckla klonurmär hematokies (CH)6,7, ett tillstånd där en enda hematoopoetisk stamcell oproportionerligt producerar en stor andel av en persons perifera blod. Detta konstaterande indikerar ett potentiellt samband mellan rökning och benmärgsfunktion. Med tanke på de utbredda och mycket betydande hälsokonsekvenserna av CS och med tanke på att murinmodeller av sjukdomar är en hörnsten i framstegen inom biomedicinsk forskning, är det användbart att utveckla effektiva och överkomliga system för att modellera CS hos möss.
Här ger vi en steg-för-steg-guide för att bygga ett prisvärt system för att behandla och studera CS in vivo-effekter på lungemfysem och benmärgshomeostas. Monteringen av denna utrustning kräver inte att användaren har specialiserad kunskap och därmed möjliggör DIY-montering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur som deltar i experimenten och utvecklingen av denna teknik har varit enligt vårt djuranvändningsprotokoll godkänt av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och under Baylor College of Medicine och MD Anderson institutioner som är ackrediterade av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).
1. Bygga apparaten
- Montering av luftkompressorn med ventilsystemet.
- Anslut flödesmätarna (två 15 L/min med Y-stång och 2 strömuttag) till miniatyrtryckregulatorn med en 1/8 tums gängad mansadapternippelkoppling. Se till att använda gängtätningsbandet i alla gängade ändar.
- Anslut den monterade tryckregulatorn till flödesmätaren till det medicinska luftkompressorinstrumentet med hjälp av följande: en 1/8 tums hexnippel på kompressorns luftutlopp, en 1/8 tums gängad kopplingskoppling och en 1/8 tums gängad mansadapternippelkoppling som ansluts till tryckregulatorn.
- Montera syrgassvivel barbed-kontakten på varje (4) flödesmätare.
- Installera en manlig adapter på luftkompressorns övre luftutlopp (del ingår i det medicinska luftkompressorinstrumentet).
- Montering av exponeringskammare (gör 4 enheter)
- Skär ett 3/4 tums klorerat polyvinylkloridrör (CPVC) i åtta 4-tumssegment.
- Sätt i varje segment till en 3/4 tums 90° armbåge CPVC-montering och fäst armbågens monteringssida på en 3/4 tums diameter CPVC hanadapter. Det bör finnas åtta CPVC-segment, var och en fäst vid en CPVC-armbågskoppling och en CPVC-hanadapter.
- Borra två hål (1 1/4 tums diameter) på motsatta sidor som ligger närmast varandra i en 8,5 L lufttät behållare (11,25 x 7,75 x 6 tum) med lock (se figur 1 exponeringskammare). Hålens placering ska centreras uppifrån och ned och från vänster till höger.
- För in de gängade sidorna på CPVC-mansadaptern som monterats tidigare i varje hål i behållarna.
- Fäst ett 3/4 tums CPVC-lock på den andra sidan (kammarens rökingång) och en 3/4 tums CPVC Droppbevattningsadapter på ena sidan (kammarens rökutgång).
- Borra fem 3 mm hål på toppen av CPVC-locket på kammarens rökutgång i ett quincunx -mönster (duschhuvud). Detta gör att cigarettröken kan komma in i kammaren med högre hastighet och säkerställer att den sprider sig jämnt inne i kammaren i alla riktningar.
- Montering av cigarettkammare (utgör upp till 4 murinexponeringsenheter)
- Ta en gummipropp med ett hål (tillverkarens storlek 8,5) och sätt in en 1/4 tums taggad Y-kontakt på den bredare sidan och en rak taggad montering (8 mm öppning) på den smalare sidan. Cigaretten kommer att placeras här under rökningsproceduren (cigarett piedestal).
- Anslut ena änden av ett 12 tum långt vinylrör av medicinsk kvalitet till en av de taggtrådiga kontakterna på Y-kontakten som är fäst vid gummiproppen och den andra änden till en 1/4 tums montering och sätt in motsatt sida av denna montering på en gummipropp med ett hål (tillverkarens storlek 1).
- På en annan gummipropp (tillverkarens storlek 8,5) sätter du in en 1/4 tums rak slangkontakt på den bredare sidan av proppen och ansluter armaturens yttre ände till ett 7 ft medicinskt vinylrör.
- Anslut de två gummiproppstrukturerna som monterats före steg 1.3.1–1.3.3 till en 8 tum x 1,75 tums glascylinder från ett avloppsrör av laboratorieglas.
- Ventilstyrsystem
- Systemet styrs av en rytmisk öppning och stängning av magnetventiler som simulerar inandning (puffning) av cigarettrök och ren luft. Systemet som styr magnetventilerna var kommersiellt utformat (se Materialförteckning ).
- Montering av alla komponenter tillsammans (se figur 1)
- Montera fyra magnetventiler på sidorna av ventilstyrningssystemet med 1 tums fästelement.
- Anslut magnetventilerna till ventilstyrningssystemet enligt tillverkarens instruktioner.
- Fäst en 10–32 (M) gängad rak kontakt på avgasanslutningen ("EXH") på magnetventilen och en gängad portadapter på in- och "OUT"-anslutningarna på samma magnetventil.
- Anslut flödesmätaren som är fäst vid kompressorn till magnetventilen genom "OUT"-anslutningen med hjälp av ett 7 ft medicinskt vinylrör.
- Anslut det 7 fot stora vinylröret som är monterat med gummiproppen i steg 1.3.3. på IN-kontakten på magnetventilen.
- Sätt i cigarettkammarens lilla gummipropp på kammarens rökingång.
- Anslut magnetventilen till den andra anslutningen av taggtrådskontakten på cigarett piedestalen monterad i steg 1.3.1.
Bild 1: Schematiskt för anslutningarna till vår WBIS för exponering för CS. Denna siffra visar hur alla komponenter monteras för att bilda en arbetsapparat. Figuren visar endast en monterad rökkammare av de fyra som maskinen kan använda. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
2. Exponering för cigarettrök
VARNING: Undvik andra och tredje hand exponering för cigarettrök. Cigarett- och exponeringskammare ska användas i biologiska säkerhetsskåp av klass II typ B2-flöde. Korrekt personlig skyddsutrustning bör bäras under rökexponeringsexperimenten (dvs. masker, handskar, hårnät, klänning).
-
Ställa in tryck och luftflöde
- När alla komponenter har monterats enligt figur 1slår du på luftkompressorn och väntar på att säkerhetslarmet ska stängas av på egen hand.
- Justera luftkompressorns tryck till 40–50 psi genom att vrida vredet på tryckregulatorn.
- Justera luftflödet från luftkompressorn till 5 L med hjälp av flödesmätaren.
- Slå på ventilregulatorn.
- Justera den digitala timern på ventilstyrenheten till PULS-C-driftläget (visas i displayen som "Pu-c") genom att trycka på SET/LOCK-knappen samtidigt som du håller ned UP-tangenten vid timerns första siffra. Tryck sedan på UP-tangenten tills Pu-c-läget har uppnåtts. Tryck på RESET för att ställa in det visade driftläget (dvs. Pu-C) som arbetsläge.
- Tryck på SET/LOCK för att byta timer 1 (visas på displayen som "T1").
- Tryck på UPP- eller DOWN-tangenterna för att ställa in T1 på 20 s.
- Tryck på SET/LOCK för att byta timer 2 (visas på displayen som "T2").
- Tryck på UPP- eller DOWN-tangenterna för att ställa in T2 på 3 s.
OBS: Steg 2.1.5 till 2.1.9 är skräddarsydda för att användas med den specifika timern (se Materialförteckning ). För ytterligare instruktioner om andra användningsområden för denna produkt, se motsvarande användarhandbok.
-
Behandling av cigarettrök
OBS: Detta system möjliggör användning av 1–4 murinexponeringskammare samtidigt.- Slå på luftkompressorn och vänta tills säkerhetslarmet är avstängt på egen hand.
- Slå på ventilregulatorn.
- Överför 5 möss till var och en av de fyra exponeringskamrarna med lufttäta avtagbara lock med en volym på 8,5 L. Placera de fyra exponeringskamrarna med möss i ett biologiska säkerhetsskåp av klass II typ B2 Laminar Flow.
- Inuti laminarflödets biologiska säkerhetsskåp, tänd en cigarett och sätt in cigaretten inuti cigarettkammaren. Använd kommersiellt tillgängliga cigaretter som innehåller 15 mg/cig tjära och 1,1 mg/cig nikotin8 jämfört med Kentucky 3RF4 forskningscigaretter (9,5 mg/cig tjära och 0,73 mg/cig nikotin)9.
- Slå på ventilerna på ventilregulatorn som motsvarar de kammare som för närvarande används. Exponeringen är uppdelad i 2 faser: (T1) ren luft pumpas in i exponeringskammaren i 20 s och (T2) luftflödet gör att cigaretten brinner och rök från cigarettkammaren pumpas in i exponeringskammaren i 3 s. Låt cigaretten brinna ut helt tills den når filtret.
- Justera timerinställningarna för att utföra i genomsnitt ~10 puffar/cigarett under en ~4-min period. Observera att timern och systemet är lätt anpassningsbara för att förbättra eller sänka CS doseringsregim enligt utredarnas forskningsbehov.
- Ta bort cigarettfiltret och kassera det genom att placera cigarettfimpen i en glasbägare med vatten för att släcka lågan och dämpa lukten.
- Se till att cigarettkammaren är stängd igen och utan cigarett. Låt maskinen pumpa ren luft i 10 min. Det är av yttersta vikt att upprätthålla ständig övervakning av de ryggradsdjur som exponeras för CS. Denna exponerande regim är optimerad för 5 kvinnliga möss över 9 veckor gamla per exponeringskammare.
- Upprepa steg 2.3.4 till 2.3.7 tre gånger för totalt 4 cigaretter per kammare om dagen. Denna procedur upprepas 5 dagar i veckan så länge forskaren behöver för sina experiment.
- Ta bort mössen från exponeringskamrarna tillbaka i motsvarande burar.
- Stäng av ventilregulatorn och luftkompressorn.
- Ta bort exponerings- och cigarettkamrarna och tvätta med vatten och tvål för att avlägsna eventuella rester av tjära.
- Låt kamrarna torka helt innan du använder dem igen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett av de viktigaste kännetecknen för CS-exponering är emfysem som kännetecknas av skador och förstörelse av luftsäckar (alveoli) i lungan. Således fokuserade de första experimenten på DIY-systemets förmåga att provocera emfysematösa förändringar i lungorna hos kvinnliga möss vid upprepad helkroppsexponering för CS. CS dosering regim valdes baserat på våra tidigare publikationer där vi använde DIY systemet beskrivs här för att behandla möss med CS och studera den molekylära patofysiologin av emfysem10,11,12,13,14,15,16. Specifikt exponerades möss hela kroppen för rök av fyra kommersiella cigaretter med filter dagligen, med rökfria intervaller på 10 minuter mellan varje cigarett, fem dagar i veckan under en varaktighet av 4 månader10,11,12,13,14,15,16.
Hematoxylin och eosin (H&E)-fläckad lung histologi visade förstörelsen av alveol hos möss som exponerats för CS i jämförelse med luftbehandlade möss (Figur 2A). I samförstånd visade histomorfetrisk analys av lungsektioner på ett förblindat sätt att den genomsnittliga linjära avlyssningen (MLI) var betydligt högre hos möss som exponerades för CS jämfört med luftkontroller (figur 2B). Som förväntat framkallar WBIS till CS en minskning av kroppsvikten (figur 2C). I överensstämmelse med ovanstående observationer visade CS-exponerade möss också förbättrad luftvägsinfiltration av immunceller samt induktion av Matrix metalloproteaser 9 och 12 (Mmp9 och Mmp12) genuttryck, som är ansvariga för vävnadsskador (Figur 2D, E)17. Cotinin, en metabolit av nikotin och en biomarkör för CS- exponering, upptäcktes vara signifikant förhöjt i serum hos möss som exponerats för 4 månaders CS men var oidentifierbart hos luftexponerade möss (figur 2F).
Det finns en ökande uppskattning av den mångfacetterade effekten av CS-exponering på kroppens celler och vävnader. En tidigare studie visade att WBI exponering av möss till CS med en regim av 6 h/dag, 5 dagar/vecka i 9 månader med 3R4F cigaretter ledde till en förändring i den hematopoetiska stamcell nisch18. Därför testade vi förmågan hos detta DIY-system att ändra benmärgshomeostas med hjälp av vår företablerade CS doseringsregim10,11,12,13,14,15,16. Efter exponering analyserade vi BM-populationer med hjälp av flödescytometri (Figur 3A). I enlighet med förväntningarna resulterade behandling av möss med CS på detta DIY-system i en förändring i benmärgspopulationer (BM). Specifikt visade flödescytometrisk analys en signifikant ökning av populationer av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) efter 4 månaders CS-exponering jämfört med luftkontroller (figur 3B). Genom att utvidga dessa observationer visade helkroppsexponering för CS hos möss som använder ett kommersiellt tillgängligt system (se materialförteckningen)också en förändring i HSPC-populationerna(figur 3C). Doseringsregimen och varaktigheten av CS-exponering som används i det kommersiella systemet och den tidigare publiceringen på CS och hematopoiesis18 var helt annorlunda än detta DIY-system som tyder på att benmärgshomeostas är utsökt känsligt för ett brett spektrum av CS doserings- och behandlingsregimer (figur 3C). Sammantaget belyser dessa data att detta GÖR-det-själv-system är ett överkomligt alternativ som kan användas för att exponera möss för CS under kontrollerade förhållanden för att tillförlitligt studera dess effekter i en rad celler och vävnader.
Figur 2: CS-medierad induktion av luftvägsinflammation och lungefysematösa förändringar av möss. A)H&E-färgade lungsektioner från WT C57BL/6 möss som exponerats för luft eller CS i 4 månader. 4x förstoring; inset 20x förstoring. Skala bom 200 μM. B)Genomsnittlig linjär avlyssning (MLI) som mått på interalveolärt väggavstånd mättes med hjälp av opartisk histomorfologi från möss som behandlats med luft- eller CS. (C) Mössvikter efter 4 månaders luft- eller CS-exponering. D)Totalt och differentiellt antal celler från bronkolveolär lavagevätska (BAL) för kontrollvätska (luft) jämfört med CS-behandlade möss. Totalt leukocyter (totalt), makrofager (Mac), neutrofiler (Neu) och lymfocyter (Lym). Relativt uttryck för (E) Mmp9 och (F) Mmp12 mRNA kvantifierat av PCR i realtid från BAL-vätska från luft eller CS-exponerade möss och normaliserat till Gapdh-uttryck. n = 4–5 möss/grupp. g)Serumnivåerna av cotinin hos möss som exponerats för luft eller CS mättes med ELISA 24 timmar efter den senaste CS-behandlingen. n = 7–8 möss/grupp. Statistiska jämförelser gjordes medhjälp av ( B,C,D,E) Unpaired t-test och (F) Welchs t-test. Data som visas ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: I linje med förväntningarna kan detta gör-det-själv-system användas för att studera CS-medierade effekter i mössens benmärg. A)Gating strategier för att identifiera HSPCs och HSCs genom flöde cytometri. Härstamningsmarkörer inkluderar: Gr1, Mac1, B220, CD4, CD8 och Ter119. B)Procentandel HSPC och HSC i hela benmärgen efter CS- exponering med detta gör-det-själv-system med samma 4-månadersregim. C)Procentandel HSPC och HSC i hela benmärgen efter CS-exponering med hjälp av det kommersiellt tillgängliga systemet med följande exponeringsförfarande: 24 3RF4 forskningscigaretter dagligen, 12 puffar/cigaretter, 5 dagar i veckan under 4,5 veckors varaktighet. (B–C) Mann-Whitney testar; n = 5 möss/grupp. Data som visas som ± SEM. *p < 0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här tillhandahåller vi den information som krävs för att bygga en apparat för WBIS av möss till CS. Efter installationen av systemet är det mycket viktigt att utredarna kalibrerar systemet baserat på den levererade dosen nikotin eller cotinin hos djur. Apparaten innehåller en timer och tryckmätare som kan användas för att justera cigarettpuffvolym, pufffrekvens, kombinerad rökexponeringsperiod och vilointervaller som djur får mellan varje cigarett. Dessutom kan det faktiska antalet cigaretter som administreras dagligen variera beroende på tjära och nikotinhalt. Slutligen är det absolut nödvändigt att varje komponent som utsätts för cigarettrök rengörs regelbundet för att säkerställa korrekt rökcirkulation och konsekvent rökexponering för djuren.
Det finns minst ett halvt dussin kommersiella system och protokoll tillgängliga för behandling av möss med CS och lufttoxiska medel. Majoriteten av den utrustning som används för detta ändamål kräver dock kommersiella leverantörer eller djupgående kunskaper om elektronik och/eller elektroteknik för montering. Vissa av dessa system använder WBI-regimer medan andra innehåller näsbehandlingar, men dessa system kan kosta upp till $ 100,000 vilket gör dem oöverkomligt dyra för de flesta laboratorier.
Fördelen med detta GÖR-det-själv-system är den inneboende enkelheten i tillverkningen, låg kostnad (~ $ 6,000) och mångsidighet. Dessutom är de komponenter som är nödvändiga för byggandet av denna gör-det-själv-apparat lätt tillgängliga från kommersiella återförsäljare och leveranskedjor. Vi erkänner att en begränsning av exponeringsprotokollet och exponeringsutrustningen är bristen på dosimetriutrustning för att mäta cigarettrökbeståndsdelar som levereras till musens exponeringskammare. Utformningen av detta system fungerar dock på ett kontrollerat sätt och vi visade att nivåerna av serumkotinin i denna valda rökning regim är jämförbara med andra murinmodeller av CS-inducerad emfysem20,21. Dessutom har denna metod visat sig ha tillämpningar utöver övervakning av effekterna av CS i lungorna och BM. Vår grupp använde detta system för att studera hur cigarettrök påverkar tarmvävnaden15. Vi har också nyligen anpassat detta system för att studera de skadliga effekterna av exponering för elektroniska cigaretter på lungorna22.
Sammanfattningsvis utgör denna apparat ett överkomligt och lättbyggd exponeringssystem för att studera det stora utbudet av skadliga effekter av cigarettrökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
AR, XH och PE stöddes av NIH-bidrag R01HL140398 och ett Gilson Longenbaugh Foundation-anslag. DEMM och KK stöddes av NIH-bidragen R01HL136333 och R01HL134880 (KYK) och ett bidrag från Helis Medical Research Foundation. DEMM stöds också av Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Gilliam Fellowship for Advanced Study. PE stöds också av Utbildning i precisionsmiljöhälsovetenskap NIEHS T32 ES027801 Fellowship Program. JC och MF stöds av Tobacco Research Funds från Institutionen för epigenetik och molekylär carcinogenes och av Center for Epigenetics (Scholar Award to MF) vid MD Anderson. FK och YZ stöds av NIH-bidrag R01 ES029442-01 och R01 AI135803-01 samt VA Merit grant CX000104. Detta projekt stöddes av Cytometry and Cell Sorting Core vid Baylor College of Medicine med finansiering från CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (CA125123 och RR024574) och hjälp av Joel M. Sederstrom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 in fastener | Lowes | 756990 | |
| 1/4 in Barbed Y connector | VWR | 89093-282 | |
| 1/4 in straight tubing connector | VWR | 62866-378 | |
| 1/8 hex nipple | Lowes | 877221 | |
| 1/8 in threaded coupling fitting | Lowes | 877208 | |
| 1/8 in threaded male adapter nipple fitting | Lowes | 877243 | |
| 10/32 (M) threaded straight connector | Bimba | EB60 | |
| 3/4 in 90-degree elbow CPVC fitting | Lowes | 22643 | |
| 3/4 in chlorinated polyvinyl chloride (CPVC) pipe | Lowes | 23814 | |
| 3/4 in CPVC cap | Lowes | 23773 | |
| 3/4 in CPVC Drip irrigation female adapter | Lowes | 194629 | |
| 3/4 in diameter CPVC male adapter | Lowes | 23766 | |
| 8.5 L airtight container with lid (11.25in x 7.75in x 6 in) | Komax | N/A | Listed as "Komax Biokips Large Bread Box | (280-oz) Large Storage Container" |
| Glass drain tube (1.75 in diameter x 8 in length) | KIMAX | 6500 | |
| Isonic Solenoid Valves | Bimba | V2A02-AW1 | |
| Marlboro Red 100's | Marlboro | N/A | |
| Oxygen swivel barbed connector | Global Medical Solutions | RES002 | |
| Panasonic Timer LT4H-W | Panasonic | LT4HW | Item was built-in the valve controller by Shepherd Controls & Associates |
| Pressure regulator | Allied Electronics and Automation | 70600552 | Also listed as "Norgren R07-100-RGKA" |
| Rubber stopper # 1 (one hole) | VWR | 59581-163 | |
| Rubber stopper # 8.5 (one hole) | VWR | 59581-389 | |
| Scireq inExpose system | Scireq and Emka Technologies | N/A | Commercial system used for comparison with our DIY WBIS |
| Straight barbed fitting (8mm opening) | VWR | 10028-872 | |
| Thread Sealant tape | Lowes | 1184243 | |
| Threaded port adaptor | Bimba | P1SA1 | |
| Timeter Aridyne 2000 Medical Air Compressor | MFI Medical | AHC-TE20 | |
| Timeter flowmeter | Allied Healthcare Products | 15006-03YP2 | Also listed as "Puritan Air Meter" |
| Valve Control system | Shepherd Controls and Associates | N/A | Company custom designed the valve control system for this model. |
| Vinyl pipes | Vitality Medical | RES3007 |
References
- Current Cigarette Smoking Among Adults in the United States. Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/tobacco/data_statistics/fact_sheets/adult_data/cig_smoking/index.htm (2018).
- Salvi, S. Tobacco smoking and evironmental risk factors for chronic obstructive pulmonary disease. Clinics in Chest Medicine. 35, 17-27 (2014).
- Sunyer, J., et al. Longitudinal relation between smoking and white blood cells. American Journal of Epidemiology. 144, 734-741 (1996).
- Freedman, D. S., Flanders, D., Barboriak, J. J., Malarcher, A. M., Gates, L. Cigarette smoking and leukocyte subpopulations in men. Annals of Epidemiology. 6, 299-306 (1996).
- Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/copd/basics-about.html (2019).
- Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. , (2014).
- Steensma, D. P.
- Tobacco. Federal Trade Comission. , Available at: . Accessed: 4th (2020).
- 3R4F Cigarettes. University of Kentucky - College of Agriculture Food and Environment. , Available from: https://ctrp.uky.edu/products/gallery/Reference Cigarettes/detail/936 (2020).
- Shan, M., et al. Cigarette smoke induction of osteopontin (SPP1) mediates T H 17 inflammation in human and experimental emphysema. Science Translational Medicine. 4, 1-10 (2012).
- Yuan, X., et al. Activation of C3a receptor is required in cigarette smoke-mediated emphysema. Nature Mucosal Immunology. 8, 874-885 (2014).
- Yuan, X., et al. Cigarette smoke - induced reduction of C1q promotes emphysema. JCI Insight. 4, 1-17 (2019).
- Shan, M., et al. Agonistic induction of PPAR g reverses cigarette smoke - induced emphysema Find the latest version: Agonistic induction of PPAR γ reverses cigarette smoke - induced emphysema. Journal of Clinical Investigation. 124, 1371-1381 (2014).
- Hong, M. J., et al. Protective role of gd T cells in cigarette smoke and influenza infection. Nature Mucosal Immunology. 11, 834-908 (2018).
- Kim, M., et al. Cigarette smoke induces intestinal inflammation via a Th17 cell-neutrophil axis. Frontiers in Immunology. 10, 1-11 (2019).
- Lu, W., et al. The microRNA miR-22 inhibits the histone deacetylase HDAC4 to promote T H 17 cell - dependent emphysema. Nature Immunology. 16, 1185-1194 (2015).
- Hendrix, A. Y., Kheradmand, F. The Role of Matrix Metalloproteinases in Development, Repair, and Destruction of the Lungs. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 148, Elsevier Inc. (2017).
- Siggins, R. W., Hossain, F., Rehman, T., Melvan, J. N., Welsh, D. A. Cigarette smoke alters the hematopoietic stem cell niche. Med Sci. 2, 37-50 (2014).
- Kheradmand, F., You, R., Gu, B. H., Corry, D. B. Cigarette smoke and DNA cleavage promote lung inflammation and emphysema. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 128, 222-233 (2017).
- Ha, M. A., et al. Menthol attenuates respiratory irritation and elevates blood cotinine in cigarette smoke exposed mice. PLoS ONE. , 1-16 (2015).
- Moreno-Gonzalez, I., Estrada, L. D., Sanchez-Mejias, E., Soto, C. Smoking exacerbates amyloid pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Nature Communications. 4, 1-10 (2013).
- Madison, M. C., et al. Electronic cigarettes disrupt lung lipid homeostasis and innate immunity independent of nicotine. Journal of Clinical Investigation. 129, 4290-4304 (2019).
