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मुराइन हार्ट्स में ऑप्टोजेनेटिक मल्टी-साइट फोटोस्टिम्यूलेशन लागू करके उन्नत कार्डियक रिदम प्रबंधन

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62335
Automatic Translation
*1,2, *1, 8,9, 1,3,4,6, 8,9, 1,5,6,7
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg
* These authors contributed equally

Summary

यह काम ट्रांसजेनिक चैनलरोडोप्सिन -2 (सीएचआर 2) चूहों के बरकरार मुराइन दिलों की हृदय ताल को नियंत्रित करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट करता है, जो माइक्रो-एलईडी सरणी के साथ स्थानीय फोटोस्टिम्यूलेशन और एपिकार्डियल झिल्ली क्षमता के एक साथ ऑप्टिकल मैपिंग का उपयोग करता है।

Abstract

वेंट्रिकुलर टैचीरिथमिया दुनिया भर में मृत्यु दर और रुग्णता का एक प्रमुख कारण है। उच्च ऊर्जा वाले बिजली के झटके का उपयोग करके विद्युत डिफिब्रिलेशन वर्तमान में जीवन-धमकी देने वाले वेंट्रिकुलर फाइब्रिलेशन के लिए एकमात्र उपचार है। हालांकि, डिफिब्रिलेशन के दुष्प्रभाव हो सकते हैं, जिसमें असहनीय दर्द, ऊतक क्षति और रोग का बिगड़ना शामिल है, जो अधिक कोमल हृदय ताल प्रबंधन रणनीतियों के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण चिकित्सा आवश्यकता का संकेत देता है। ऊर्जा को कम करने वाले विद्युत दृष्टिकोण के अलावा, कार्डियक ऑप्टोजेनेटिक्स को प्रकाश-संवेदनशील झिल्ली आयन चैनलों और प्रकाश दालों का उपयोग करके हृदय गतिविधि को प्रभावित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में पेश किया गया था। वर्तमान अध्ययन में, लैंगेंडॉर्फ के सफल फोटोस्टिम्यूलेशन के लिए एक मजबूत और वैध विधि का वर्णन मल्टी-साइट पेसिंग के आधार पर किया जाएगा, जो माइक्रो लाइट-एमिटिंग डायोड (माइक्रो-एलईडी) की 3 x 3 सरणी को लागू करता है। एपिकार्डियल झिल्ली वोल्टेज तरंगों का एक साथ ऑप्टिकल मानचित्रण क्षेत्र-विशिष्ट उत्तेजना के प्रभावों की जांच की अनुमति देता है और सीधे साइट पर नई प्रेरित हृदय गतिविधि का मूल्यांकन करता है। प्राप्त परिणाम बताते हैं कि डिफिब्रिलेशन की प्रभावकारिता कार्डियक अतालता के दौरान फोटोस्टिम्यूलेशन के लिए चुने गए मापदंडों पर दृढ़ता से निर्भर है। यह प्रदर्शित किया जाएगा कि हृदय का रोशन क्षेत्र समाप्ति की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और साथ ही अतालता पैटर्न को संशोधित करने के लिए रोशनी के दौरान हृदय गतिविधि का लक्षित नियंत्रण कैसे प्राप्त किया जा सकता है। सारांश में, यह तकनीक कार्डियक ताल के वास्तविक समय प्रतिक्रिया नियंत्रण के रास्ते पर ऑन-साइट तंत्र हेरफेर को अनुकूलित करने की संभावना प्रदान करती है और, क्षेत्र विशिष्टता के बारे में, गैर-विशिष्ट विद्युत सदमे अनुप्रयोगों के उपयोग की तुलना में हृदय प्रणाली को संभावित नुकसान को कम करने में नए दृष्टिकोण।

Introduction

अतालता के दौरान स्थानिक-अस्थायी गतिशीलता की प्रारंभिक जांच से पता चला है कि कार्डियक फाइब्रिलेशन के दौरान जटिल विद्युत पैटर्न भंवर जैसी घूर्णनउत्तेजना तरंगों द्वारा संचालित होते हैं। इस खोज ने अतालता के अंतर्निहित तंत्र में नई अंतर्दृष्टि दी, जिसके कारण मायोकार्डियम 2,3,4 के बहु-साइट उत्तेजना के आधार पर नए विद्युत समाप्ति उपचारों का विकास हुआ। हालांकि, विद्युत क्षेत्र उत्तेजना का उपयोग करने वाले उपचार गैर-स्थानीय हैं और मांसपेशियों के ऊतकों सहित आसपास की सभी उत्तेजक कोशिकाओं को आंतरिक कर सकते हैं, जिससे सेलुलर और ऊतक क्षति, साथ ही असहनीय दर्द भी हो सकता है। विद्युत चिकित्सा के विपरीत, ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण उच्च स्थानिक और लौकिक परिशुद्धता के साथ कार्डियोमायोसाइट एक्शन पोटेंशिअल को उत्तेजित करने के लिए एक विशिष्ट और ऊतक-सुरक्षात्मक तकनीक प्रदान करते हैं। इसलिए, ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना में कार्डियक फाइब्रिलेशन के दौरान अराजक सक्रियण पैटर्न के न्यूनतम आक्रामक नियंत्रण की क्षमता है।

आनुवंशिक हेरफेर 5,6,7 के माध्यम से उत्तेजक कोशिकाओं में प्रकाश-संवेदनशील आयन चैनल रोडोप्सिन -2 (सीएचआर 2) की शुरूआत ने फोटोस्टिम्यूलेशन का उपयोग करके उत्तेजक कोशिकाओं की झिल्ली क्षमता के विध्रुवण को सक्षम किया। न्यूरोनल नेटवर्क के सक्रियण, हृदय गतिविधि का नियंत्रण, दृष्टि और सुनवाई की बहाली, रीढ़ की हड्डी की चोटों का उपचार, और अन्य 8,9,10,11,12,13,14 सहित कई चिकित्सा अनुप्रयोग विकसित किए गए हैं। कार्डियोलॉजी में सीएचआर 2 के आवेदन में इसके मिलीसेकंड प्रतिक्रिया समय15 के कारण महत्वपूर्ण क्षमता है, जिससे यह लयबद्ध हृदय गतिशीलता के लक्षित नियंत्रण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।

इस अध्ययन में, ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के बरकरार दिलों के बहु-साइट फोटोस्टिम्यूलेशन को दिखाया गया है। संक्षेप में, एक ट्रांसजेनिक अल्फा-एमएचसी-सीएचआर 2 माउस लाइन यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क प्रोग्राम एफपी 7/2007-2013 (हेल्थ-एफ 2-2009-241526) के दायरे में स्थापित की गई थी और कृपया प्रोफेसर एस ई लेहनार्ट द्वारा प्रदान की गई थी। सामान्य तौर पर, ट्रांसजेनिक वयस्क पुरुष C57/B6/J, अल्फा-एमएचसी के नियंत्रण में क्रे-रिकोम्बिनेस को व्यक्त करते हुए मादा B6.Cg-जीटी (ROSA)26Sortm27.1 (CAG-COP4* H134R/tdTomato) Hye/J के साथ संभोग करने के लिए जोड़ा गया था। चूंकि कार्डियक स्टॉप कैसेट को दूसरी पीढ़ी में हटा दिया गया था, इसलिए संतान ने एक स्थिर एमएचसी-सीएचआर 2 अभिव्यक्ति दिखाई और इसका उपयोग कार्डियक फोटोसेंसिटिव कॉलोनियों को बनाए रखने के लिए किया गया था। सभी प्रयोग 36 - 48 सप्ताह की उम्र में दोनों लिंगों के वयस्क चूहों के साथ किए गए थे। रोशनी को 3 x 3 माइक्रो-एलईडी सरणी का उपयोग करके हासिल किया जाता है, जैसा कि16,17 में वर्णित है, सिवाय इसके कि सिलिकॉन-आधारित आवास और लघु ऑप्टिकल ग्लास फाइबर लागू नहीं किए जाते हैं। कार्डियक एप्लिकेशन में इसका पहला उपयोग18 में पाया जाता है। एक समान निर्माण तकनीक पर आधारित एक रैखिक माइक्रो-एलईडी सरणी को हार्ट पेसिंग19 के लिए एक मर्मज्ञ जांच के रूप में लागू किया गया है। माइक्रो-एलईडी को 550 μm की पिच पर 3 x 3 सरणी में व्यवस्थित किया जाता है, जो एक बहुत छोटे क्षेत्र पर एक उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और उच्च चमकदार शक्ति दोनों प्रदान करता है। लेखक इस काम में एक बहुमुखी स्थानीय बहु-साइट फोटोस्टिम्यूलेशन प्रदर्शित करते हैं जो उपन्यास एंटी-लयबद्ध चिकित्सा विधियों को विकसित करने के लिए मार्ग खोल सकता है।

निम्नलिखित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में एक प्रतिगामी लैंगनडॉर्फ छिड़काव एक्स विवो शामिल है, जिसके लिए कैनुलेटेड महाधमनी छिड़काव इनलेट के रूप में कार्य करती है। लागू छिड़काव दबाव और हृदय संकुचन के कारण परफ्यूसेट कोरोनरी धमनियों के माध्यम से बह रहा है, जो महाधमनी से शाखा करता है। प्रस्तुत कार्य में, हृदय को 73.2 मिमीएचजी के बराबर, परफ्यूसेट जलाशयों को 1 मीटर ऊंचाई तक बढ़ाकर प्राप्त निरंतर दबाव सेटअप का उपयोग करके संक्रमित किया जाता है, जो 2.633 ± 0.583 एमएल / मिनट की प्रवाह दर तक उपज देता है। प्रयोग के दौरान दो प्रकार के टायरोड के समाधान का उपयोग परफ्यूसेट के रूप में किया जाता है। नियमित टायरोड का समाधान एक स्थिर साइनस ताल का समर्थन करता है, जबकि लो-के + टायरोड के समाधान को पिनासिडिल के साथ मिलाया जाता है ताकि मुराइन दिल में अतालता के प्रेरण को सक्षम किया जा सके। हेक्सागोनल पानी के स्नान का उपयोग छह अलग-अलग प्लानर खिड़कियों के माध्यम से हृदय के अवलोकन की अनुमति देता है, जिससे अपवर्तन द्वारा कम विकृति के साथ कई ऑप्टिकल घटकों के युग्मन की अनुमति मिलती है।

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Protocol

सभी प्रयोगों ने जर्मन कानून, स्थानीय शर्तों के साथ समझौते में और यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघों (एफईएलएएसए) के महासंघ की सिफारिशों के अनुसार पशु कल्याण विनियमन का सख्ती से पालन किया। पशु प्रयोगों के अनुमोदन के लिए आवेदन को जिम्मेदार पशु कल्याण प्राधिकरण द्वारा अनुमोदित किया गया है, और सभी प्रयोगों को हमारे पशु कल्याण प्रतिनिधियों को सूचित किया गया था।

1. प्रयोग की तैयारी और सामग्री

  1. ऑप्टिकल मैपिंग सेटअप
    नोट: ऑप्टिकल सेटअप, साथ ही विद्युत सेटअप, चित्रा 1 में दिखाए गए हैं। ऑप्टिकल और इलेक्ट्रिकल सेटअप में उपयोग किए जाने वाले सभी घटकों को सामग्री की तालिका में विस्तार से सूचीबद्ध किया गया है।
    1. अतालता और बैकअप डिफिब्रिलेशन के प्रेरण के लिए एलईडी 1 और एलईडी 2 का उपयोग करें। 475 एनएम के पास एक तरंग दैर्ध्यके साथ उच्च शक्ति एलईडी चुनें, जो कि सीएचआर 26 की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का शिखर है। ऑप्टिकल स्पेक्ट्रम को और संकीर्ण करने के लिए, 470 ± 20 एनएम बैंडपास फिल्टर का उपयोग करें।
      नोट: इस काम में, एलईडी 1 और एलईडी 2 में डेटाशीट20 के अनुसार 3.9 से 5.3 डब्ल्यू का एक विशिष्ट चमकदार प्रवाह है।
    2. ऑप्टिकल मैपिंग के लिए एपिकार्डियम को एक उच्च शक्ति वाले लाल एलईडी (चित्रा 1 में एलईडी 3) के साथ रोशन करें, जोलाल = 625 एनएम के केंद्र तरंग दैर्ध्य और 700 एमडब्ल्यू21 के चमकदार प्रवाह के साथ प्रकाश उत्सर्जित करता है। लाल बत्ती को 628 ± 20 एनएम बैंडपास फिल्टर के साथ फ़िल्टर किया जाता है और एक लंबे पास डाइक्रोइक दर्पण (डीएम) द्वारा प्रतिबिंबित किया जाता है, जिसमें 685 एनएम की कटऑफ तरंग दैर्ध्य होती है।
    3. केवल कार्डियक गतिविधि के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को रिकॉर्ड करने के उद्देश्य से कैमरे के सामने 775 ± 70 एनएम के साथ एक उत्सर्जनफिल्टर का उपयोग करें। एक तेज़ उद्देश्य का उपयोग करें जो कम रोशनी अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।
      नोट: माउस हृदय के फाइब्रिलेशन की आवृत्ति 20 से 35 हर्ट्ज तक होती है; इसलिए, 1 से 2 kHz, या उससे भी अधिक की आवृत्ति के साथ रिकॉर्ड करने के लिए एक तेज़ पर्याप्त कैमरे का उपयोग करें।
  2. माइक्रो-एलईडी सरणी
    नोट: यहां लागू माइक्रो-एलईडी सरणियों को माइक्रोसिस्टम प्रोसेसिंग का उपयोग करके महसूस किया जाता है जैसा कि कहीं और विस्तृतहै 16,17.
    1. स्पिन कोट 4 इंच सिलिकॉन सब्सट्रेट्स (सिंगल-साइड पॉलिश, 525-μm मोटी) पर 5 μm मोटी पॉलीमाइड (PI) परत है।
    2. नाइट्रोजन वातावरण के तहत 450 डिग्री सेल्सियस के अधिकतम तापमान पर इस पीआई परत को ठीक करें। अधिकतम तापमान को 10 मिनट के लिए स्थिर रखें।
    3. पराबैंगनी (यूवी) लिथोग्राफी का उपयोग करके एक छवि रिवर्सल फोटोरेसिस्ट (पीआर) जमा करें और स्पटर 250-एनएम पतली प्लैटिनम परत (पीटी) जमा करें।
    4. मास्किंग परत के रूप में काम करने वाले पैटर्न वाले पीआर के साथ 1 μm-मोटी सोने (AU) परत को इलेक्ट्रोप्लेटिंग करके इस PT-आधारित मेटलाइजेशन को मोटा करें।
    5. दूसरी पीआई परत को स्पिन-कोटिंग करने से पहले, वेफर को इसकी पहली पीआई परत और एयू-इलेक्ट्रोप्लेटेड मेटालाइजेशन के साथ एक ऑक्सीजन प्लाज्मा में उजागर करें जो रासायनिक रूप से पीआई परत की सतह को सक्रिय करता है।
    6. 450 डिग्री सेल्सियस पर दूसरी पीआई परत को फिर से ठीक करें, पीआर परत को पैटर्न करने के लिए यूवी लिथोग्राफी लागू करें और माइक्रो-एलईडी चिप्स के लिए सरणी के संपर्क पैड खोलें और प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (आरआईई) द्वारा इंटरफेसिंग प्रिंटेड सर्किट बोर्ड (पीसीबी) को मास्किंग परत के रूप में पैटर्न ्ड पीआर का उपयोग करके खोलें।
      नोट: इस आरआईई प्रक्रिया चरणों में, संपर्क पैड के उद्घाटन के साथ-साथ दो-आयामी (2 डी) माइक्रो-एलईडी सरणी के बाहरी आकार को परिभाषित करने के लिए क्रमशः 10 और 30 मिनट के लिए 200 डब्ल्यू और 100 डब्ल्यू लागू करने की सिफारिश की जाती है।
    7. सॉल्वैंट्स और प्लाज्मा नक़्क़ाशी का उपयोग करके पीआर को स्ट्रिप करें। अतिरिक्त 6 μm मोटी सोने की परत को इलेक्ट्रोप्लेटिंग करके संपर्क पैड को और मोटा करें।
    8. फ्लिप-चिप बॉन्डर का उपयोग करके माइक्रो-एलईडी चिप्स को संपर्क पैड में संलग्न करें।
    9. एक ऑक्सीजन प्लाज्मा में पीआई सतह को सक्रिय करें और विलायक-मुक्त चिपकने वाले के साथ माइक्रो-एलईडी चिप्स को अंडरफिल करें। फिर चिपकने वाले को 120 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए ठीक करें।
    10. माइक्रो-एलईडी चिप्स को एनकैप्सुलेट करने के लिए, आर्गन के साथ एक और प्लाज्मा उपचार करें और मैन्युअल रूप से एक पतली फ्लोरोपॉलीमर परत लागू करें। 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इस परत को पूर्व-उपचार करें।
    11. माइक्रो-एलईडी सरणी को ऑक्सीजन प्लाज्मा में उजागर करने के बाद अंतिम एनकैप्सुलेशन परत के रूप में मैन्युअल रूप से सिलिकॉन लागू करें, जिसका उपयोग अंतर्निहित फ्लोरोपॉलीमर परत में सिलिकॉन आसंजन में सुधार करने के लिए किया जाता है। सिलिकॉन परत को 80 डिग्री सेल्सियस और 180 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ठीक करें। ये अंतिम इलाज चरण फ्लोरोपॉलीमर परत को भी पूरी तरह से ठीक करते हैं।
    12. पीआई सब्सट्रेट के संपर्क पैड को एक मुद्रित सर्किट बोर्ड पर ले जाएं जो सरणी के इंटरकनेक्शन के लिए स्ट्रिप कनेक्टर्स को बाहरी इंस्ट्रूमेंटेशन में ले जाता है। चिपकने वाला का उपयोग करके पीसीबी पर सोल्डर पैड को कवर करें।
  3. विद्युत सेटअप
    1. इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईसीजी) रिकॉर्ड करने के लिए उपयुक्त इलेक्ट्रोड का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, सिल्वर / सिल्वर-क्लोराइड इलेक्ट्रोड या मोनोफैसिक एक्शन पोटेंशियल (एमएपी) इलेक्ट्रोड और एक ईसीजी एम्पलीफायर लगातार हृदय की विद्युत गतिविधि की निगरानी के लिए। इसके अलावा, प्राप्त सभी विद्युत संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए एक उपयुक्त अधिग्रहण उपकरण (एडी) का उपयोग करें।
    2. उच्च शक्ति एलईडी (एलईडी 1, एलईडी 2, और एलईडी 3) के लिए एक अच्छी तरह से अनुकूल ड्राइवर चुनें, जो प्रत्येक डिवाइस पर लागू अधिकतम वर्तमान का प्रबंधन कर सकता है। एलईडी ड्राइवरों के आउटपुट को सटीक रूप से नियंत्रित करने के लिए एक मनमाना फ़ंक्शन जनरेटर (एएफजी) का उपयोग करें।
    3. माइक्रो-एलईडी सरणी के माध्यम से बहने वाली धारा को नियंत्रित करने के लिए एक बहु-चैनल एलईडी ड्राइवर का उपयोग करें। कई आउटपुट के साथ एक एएफजी इस कार्य के लिए उपयुक्त है।
      नोट: माइक्रो-एलईडी की अधिकतम धारा तक धारा को सीमित करने वाले एलईडी ड्राइवरों को चुनने की सलाह दी जाती है, अन्यथा डायोड क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। मल्टी-चैनल माइक्रो-एलईडी ड्राइवर का एक उदाहरण एक अन्य काम18 में वर्णित है। यदि आवश्यक हो, तो एएफजी या किसी अन्य एलईडी ड्राइवर को माइक्रो-एलईडी सेटिंग्स को दूरस्थ रूप से नियंत्रित करने के लिए कंप्यूटर से जोड़ा जा सकता है। यदि यह मामला है, तो एलईडी ड्राइवर को अपनी पसंद के संचार प्रोटोकॉल के साथ कंप्यूटर से कनेक्ट करें, उदाहरण के लिए, सामान्य उद्देश्य इंटरफ़ेस बस (GPIB) या एक सीरियल कनेक्शन।

   

2. प्रायोगिक प्रक्रियाएं

  1. समाधान तैयार करना
    1. टायरोड का समाधान तैयार करें: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 24 mM NaHCO3, 1.8 mM CaCl2,1.2mM KH 2 PO4, 5.6 mM ग्लूकोज, 0.1% बीएसए /
    2. लो-के + टायरोड का समाधान तैयार करें: लो-के + टायरोड को नियमित टायरोड के समाधान के समान ही बनाया जाता है, सिवाय इसके कि केसीएल की केवल आधी मात्रा जोड़ी जाती है (4 एमएम केसीएल के बजाय 2 एमएम)।
      नोट: 3 घंटे तक चलने वाले प्रयोग के लिए आमतौर पर लो-के + टायरोड के 2-3 एल (ऑप्टिकल मैपिंग किए जाने पर ब्लेबिस्टैटिन (चरण 2.1.5) के साथ अतिरिक्त रूप से मिश्रित) और नियमित टायरोड के 1-2 एल पर्याप्त हैं।
    3. 100 एमएम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए,22 में वर्णित अतालता प्रेरण की प्रक्रिया को आसान बनाने के लिए लो-के + टायरोड के समाधान में पिनासिडिल जोड़ें। पिनासिडिल को संभालते समय सुरक्षात्मक प्रयोगशाला दस्ताने पहनें।
    4. नियमित टायरोड के घोल के साथ 50 μM DI-4-ANBDQPQ का 1 एमएल तैयार करें। फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए डाई को प्रकाश से बचाएं।
    5. Blebbistatin का 10 mM स्टॉक समाधान बनाएं। ऑप्टिकल मैपिंग के लिए, 5 μM समाधान प्राप्त करने के लिए 100 mM पिनासिडिल-टायरोड-समाधान (चरण 2.1.3) के साथ Blebbistatin मिलाएं। ब्लेबिस्टैटिन को संभालते समय सुरक्षात्मक प्रयोगशाला दस्ताने पहनें।
      नोट: ऑप्टिकल मैपिंग शुरू होने तक डाई और ब्लेबिस्टैटिन समाधान दोनों को अलग रखें।
  2. लैंगेंडॉर्फ छिड़काव
    नोट: सेटअप में दो टायरोड के समाधानों के लिए दो जलाशय शामिल हैं। वे तीन-तरफा के साथ ट्यूबों के माध्यम से एक बुलबुला जाल से जुड़े होते हैं। दिल को बाद में एक ल्यूर लॉक कनेक्टर द्वारा बुलबुला जाल से जोड़ा जाता है, और फिर इसे हेक्सागोनल पानी के स्नान में निलंबित कर दिया जाता है। पानी का स्नान, बदले में, इस्तेमाल किए गए टायरोड के समाधान को इकट्ठा करने के लिए एक अपशिष्ट कंटेनर से जुड़ा हुआ है।
    1. हर प्रयोग से पहले सभी ट्यूबों को पूरी तरह से डिमिनरलाइज्ड पानी से साफ करें।
    2. प्रयोग की शुरुआत से पहले कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कार्बोजेन (5% सीओ2 और 95% ओ2) के साथ टायरोड के दोनों समाधानों को एरेट करें। टाइरोड के समाधान के पीएच मान को एनएओएच के साथ 7.4 में समायोजित करें।
    3. संबंधित जलाशय में प्रत्येक टायरोड के घोल के 500 एमएल भरें और छिड़काव प्रणाली के माध्यम से टायरोड के समाधान को चलाकर ट्यूबों के साथ-साथ बुलबुला जाल को डी-एरेट करें जब तक कि ट्यूबों में या बुलबुला जाल में कोई और फंसे हुए हवा के बुलबुले न दिखाई दें।
    4. कार्बोजेन के साथ जलाशयों में पूरे प्रयोग के दौरान टायरोड के समाधानों को वातित करना जारी रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि छिड़काव के दौरान बाद में परफ्यूसेट का पीएच स्थिर रहे।
    5. पानी की गर्मी पंप के साथ छिड़काव प्रणाली को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। वॉटरप्रूफ हीटिंग केबल जैसे अतिरिक्त हीटिंग तत्व का उपयोग करके पानी के स्नान के भीतर परफ्यूसेट तापमान स्थिर रखें।
      नोट: प्रयोग के दौरान, खाली चलने से पहले टायरोड के जलाशयों को फिर से भरना महत्वपूर्ण है। अन्यथा, हवा के बुलबुले हृदय में प्रवेश कर सकते हैं, जो वाहिकाओं को रोक सकते हैं और इस्किमिया का कारण बन सकते हैं।
  3. माउस की तैयारी
    1. हार्ट आइसोलेशन प्रक्रिया से 30 मिनट पहले 500 यानी हेपरिन के 0.1 एमएल को इंजेक्ट करें।
    2. बर्फ-ठंडे टायरोड के घोल के साथ 6 सेमी पेट्री डिश और 2 एमएल सिरिंज भरें। स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
    3. 2 मिनट के लिए संतृप्त आइसोफ्लुरेन वातावरण द्वारा चूहों के कम समय के एनेस्थीसिया और बाद में तत्काल ग्रीवा अव्यवस्था करें।
      नोट: पर्याप्त संज्ञाहरण को सत्यापित करने के लिए नकारात्मक इंटर-पैर की अंगुली रिफ्लेक्स की जांच बिल्कुल आवश्यक है।
    4. छाती खोलें, दिल को हटा दें, जैसा कि कहीं और वर्णितहै 23, और इसे बर्फ-ठंडे टायरोड के समाधान के साथ 6 सेमी पेट्री डिश में रखें। तापमान में गिरावट के कारण कार्डियक बीटिंग कम हो जाएगी।
    5. स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के तहत ठीक तैयारी करें, जैसा कि कहीं और विस्तृतहै। कुंद सुई पर महाधमनी संलग्न करें और सीवन सामग्री के साथ पोत को ठीक करें।
    6. एक नियंत्रण के रूप में, सुई के माध्यम से बर्फ-ठंडे टायरोड के घोल को हृदय में इंजेक्ट करें और जांचें कि दिल कसकर चढ़ा हुआ है। यह कदम हृदय से शेष रक्त को भी धोता है।
    7. माउंटेड हार्ट को छिड़काव प्रणाली में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि बुलबुला जाल के साथ सुई को जोड़ते समय हवा को हृदय में प्रवेश करने से रोकने के लिए परफ्यूसेट बह रहा है। जांचें कि दिल पानी के स्नान में टायरोड के घोल से ढका हुआ है। चरण 2.3.4, 2.3.5, और 2.3.7 चित्र 2 में चित्रित किए गए हैं।
    8. सुनिश्चित करें कि दिल कुछ ही मिनटों में धड़कना शुरू कर दे। दिल को 15 से 20 मिनट के लिए छिड़काव सेटअप के अनुकूल होने दें, फिर यदि ऑप्टिकल मैपिंग की जानी है, तो क्रमशः पिनासिडिल (चरण 2.1.3) के साथ कम-के + टायरोड के समाधान पर स्विच करें।
  4. अतालता प्रेरण और ऑप्टिकल डिफिब्रिलेशन
    1. अच्छी सिग्नल गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए ईसीजी इलेक्ट्रोड में से एक को हृदय की सतह के जितना संभव हो उतना करीब रखें। टायरोड के समाधान में दूसरे ईसीजी इलेक्ट्रोड को निलंबित करें। सुनिश्चित करें कि अधिग्रहित ईसीजी को पसंद के एडी द्वारा दर्ज किया जा रहा है।
    2. अध्ययन के रुचि के क्षेत्र पर माइक्रो-एलईडी सरणी रखें, उदाहरण के लिए, बाएं वेंट्रिकल पर।
    3. पिनासिडिल के साथ छिड़काव को कम-के + टायरोड में बदलें और 15 से 30 मिनट के लिए दिल को संक्रमित करें।
    4. अतालता को प्रेरित करने के लिए, 25 से 35 हर्ट्ज की आवृत्ति एफइंड के साथ 20 से 50 हल्के दालों की ट्रेन के साथ एलईडी 1 और एलईडी 2 के साथ दिल को रोशन करें, पल्स अवधि डब्ल्यूइंड 2 से 15 एमएस, और हल्की तीव्रता एलआई 2.8 एमडब्ल्यू मिमी -2 कीopt_ind।
    5. अतालता प्रेरित होने तक प्रक्रिया को दोहराएं।
      नोट: ईसीजी सिग्नल में अतालता की पहचान करना आसान है क्योंकि सिग्नल की आवृत्ति और आकृति विज्ञान सामान्य साइनस ताल से भिन्न होता है। क्या अतालता अगले 5 सेकंड के भीतर समाप्त हो जाती है, इसे आत्म-समाप्त के रूप में वर्गीकृत करें, और एक नया प्रेरण प्रयास शुरू करें।
    6. एक बार जब एक निरंतर अतालता का नेत्रहीन रूप से पता चल जाता है, तो 15 mA की स्पंदन धारा Iपल्स पर सरणी के तीन, छह, या नौ माइक्रो-एलईडी का उपयोग करके अलग-अलग चौड़ाई Wdef और आवृत्तियों fdef के साथ दालों का एक विस्फोट लागू करें, जिससे हल्की तीव्रता LI 33.31 ± 2.05 mW mm-2 प्राप्त होती है।
    7. पांच माइक्रो-एलईडी सरणी-आधारित डिफिब्रिलेशन परीक्षणों के बाद अतालता जारी रहती है, तो प्रयास को असफल के रूप में वर्गीकृत करें और बैकअप डिफिब्रिलेशन शुरू करें।
    8. बैकअप डिफिब्रिलेशन के लिए, माइक्रो-एलईडी सरणी के लिए सेट किए गए समान समय मापदंडों का उपयोग करके एलईडी 1 और एलईडी 2 का उपयोग करें।
      नोट: क्योंकि हृदय पूरी प्रयोगात्मक अवधि में इस्केमिक और चयापचय तनाव के संपर्क में है, यह संभव है कि अतालता के समाप्ति प्रयास बैकअप डिफिब्रिलेशन के साथ भी असफल हों। जब भी ऐसा होता है, छिड़काव समाधान को नियमित टायरोड में बदलें और दिल को 5 से 10 मिनट के लिए ठीक होने दें। जब ईसीजी साइनस लय में लौटता है, तो चरण 2.4.3 से प्रोटोकॉल को फिर से दोहराएं।
  5. ऑप्टिकल मैपिंग
    1. चरण 2.1.5 में तैयार ब्लेबिस्टैटिन समाधान के साथ दिल को भरें और यांत्रिक अनकपलिंग होने तक प्रतीक्षा करें। यह तब पूरा होता है जब दिल धड़कना बंद कर देता है, लेकिन ईसीजी सिग्नल अभी भी मापने योग्य है।
      नोट: ब्लेबिस्टाटिन समाधान को उल्लिखित एकाग्रता में मिलाना और इस समाधान के साथ हृदय को संक्रमित रखना पूरे प्रयोग के दौरान विद्युत गतिविधि से हृदय यांत्रिक गतिविधि को अलग रखता है।
    2. लैंगेंडॉर्फ छिड़काव के बुलबुले जाल में बोलस के रूप में 1 एमएल वोल्टेज डाई डीआई -4-एएनबीडीक्यूपीक्यू (चरण 2.1.4 में तैयार) दें। डाई को समान रूप से हृदय को प्रभावित करने की अनुमति देने के लिए 5 से 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
      नोट: जब भी कोई रिकॉर्डिंग नहीं की जा रही हो तो लाल बत्ती बंद करके डाई के फोटोब्लीचिंग से बचें। यदि रिकॉर्डिंग का सिग्नल-टू-शोर अनुपात बहुत छोटा हो जाता है (अधिग्रहित सिग्नल बहुत शोर है), तो चरण 2.1.4 और 2.5.2 दोहराएं।
    3. कैमरे को हृदय की सतह पर केंद्रित करें, एलईडी 3 चालू करें, और 1.27 mW mm-2 ऑप्टिकल पावर लागू करें।
    4. प्रयोगशाला की रोशनी बंद करें और रिकॉर्डिंग शुरू करें। सुनिश्चित करें कि प्राप्त सिग्नल की आवृत्ति की तुलना रिकॉर्ड किए गए ईसीजी की आवृत्ति से करके एक ऑप्टिकल सिग्नल प्राप्त किया जा रहा है। यह सुनिश्चित करता है कि प्राप्त ऑप्टिकल सिग्नल विशुद्ध रूप से हृदय की विद्युत गतिविधि से संबंधित है।
      नोट: चूंकि डाई द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति प्रकाश बहुत सप्ताह है, ऑप्टिकल मैपिंग एक अंधेरे कमरे में की जाती है। यह किसी भी अन्य प्रकाश स्रोतों से सिग्नल हस्तक्षेप से बचता है।

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Representative Results

प्रोटोकॉल एलईडी 1 और एलईडी 2 (चित्रा 1) द्वारा उत्पन्न फोटोस्टिम्यूलेशन पल्स का उपयोग करके बरकरार मुराइनदिलों में वेंट्रिकुलर अतालता को शामिल करने की अनुमति देता है, जिसमें 25 हर्ट्ज और 35 हर्ट्ज के बीच आवृत्ति एफ इंड और 2 एमएस और 10 एमएस के बीच पल्स अवधि डब्ल्यूइंड होती है। कृपया ध्यान दें कि इस तरह के तीव्र प्रकाश दालों का उद्देश्य हृदय की लय को पकड़ना नहीं है, बल्कि हृदय गतिविधि को असंतुलित करना है ताकि अनियमित विद्युत तरंगें उत्पन्न की जा सकें, जो तब अतालता की सुविधा प्रदान करती हैं। विद्युत उत्तेजना के साथ प्रेरण पर प्रकाश के साथ अतालता को प्रेरित करने का लाभ यह है कि ईसीजी में कोई भी कलाकृतियों को उकसाया नहीं जाता है, जो प्रतिबंधों के बिना अधिग्रहित संकेत का विश्लेषण करने की संभावना प्रदान करता है और यहां तक कि तेजी से पेसिंग के दौरान हृदय की विद्युत प्रतिक्रिया का मूल्यांकन भी करता है, यह तथ्य फोटो-डिफिब्रिलेशन के दौरान हृदय व्यवहार का निरीक्षण करने की संभावना भी प्रदान करता है। यह विद्युत प्रेरण या डिफिब्रिलेशन विधियों के साथ संभव नहीं है। फिर भी, यदि उपयोग किया गया सेटअप बाहरी उच्च शक्ति एलईडी के उपयोग की अनुमति नहीं देता है, उदाहरण के लिए, जगह की कमी के कारण, अतालता को प्रेरित करने के लिए हृदय पर एक अतिरिक्त पेसिंग इलेक्ट्रोड रखा जा सकता है, जैसा कि कहीं और दिखाया गयाहै 3,22,24।

एक बार फाइब्रिलेशन प्रेरित होने के बाद अतालता को कम से कम 5 सेकंड तक चलना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह कायम रहता है, बाद में माइक्रो-एलईडी-आधारित डिफिब्रिलेशन प्रयास शुरू किए जाते हैं। चूंकि कार्डियक अतालता के मुख्य पैरामीटर, जैसे कि बुनियादी चक्र की लंबाई या प्रमुख आवृत्ति, आयाम और आकृति विज्ञान, लगातार बदल रहे हैं और जैसा कि यह भविष्यवाणी करना संभव नहीं है कि कौन से फोटोडिफाइब्रिलेशन पैरामीटर सबसे अच्छा परिणाम प्रदान करते हैं, यह समझना महत्वपूर्ण रुचि का था कि आवृत्ति, पल्स चौड़ाई के बीच कोई संबंध है या नहीं। फोटोस्टिम्यूलेशन और समाप्ति दर का क्षेत्र। इसलिए, विभिन्न आवृत्तियों एफडीईएफ, माइक्रो-एलईडी की संख्या, और पल्स अवधि डब्ल्यूडेफ के साथ प्रयोगों की एक श्रृंखला का परीक्षण किया गया था, और एन = 11 चूहों के लिए सफलता दर निकाली गई थी, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है।

यह प्रदर्शित किया जा सकता है कि 1 से 20 एमएस अवधि की दालें अलग-अलग सफलता दरों के साथ डिफिब्रिलेट कर सकती हैं (चित्रा 3)। चूंकि चरण 2.4.6 में उल्लिखित प्रत्येक फोटोस्टिम्यूलेशन पल्स के दौरान प्रकाश तीव्रता एलआईएसएलईडी को स्थिर रखा गया था, और नौ के खिलाफ तीन माइक्रो-एलईडी की सफलता दर विशेष रूप से कम है, प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि हृदय पर कवर किया गया क्षेत्र, माइक्रो-एलईडी की संख्या, और इस प्रकार लागू कुल चमकदार प्रवाह डिफिब्रिलेशन प्राप्त करने में महत्वपूर्ण कारक हैं। यह देखते हुए कि सरणी पर प्रत्येक माइक्रो-एलईडी एक लैम्बर्टियन प्रकाश स्रोत है और उन्हें सीधे दिल की सतह पर तैनात किया जाता है ताकि ऊतक की अनुमानित दूरी शून्य हो, यह माना जा सकता है कि एकल माइक्रो-एलईडी का उपयोग करते समय दिल पर रोशन क्षेत्र की विकिरण समोच्च ए1एलईडी = 0.059 मिमी² के बराबर है। जैसा कि फ्लैट आयताकार एलईडी के लिए25 में भी दिखाया गया है। इसके अलावा, हालांकि कुछ फोटॉन किनारों से सूक्ष्म-एलईडी को पार्श्व रूप से छोड़ सकते हैं, कुल प्रकाश तीव्रता में उन लोगों का योगदान इतना छोटा माना जाता है कि उनके प्रभाव की उपेक्षा की जा सकती है। सरणी के विकिरणित प्रकाश को निर्धारित करने के लिए, लेखकों ने एक वाणिज्यिक पावर मीटर के साथ माइक्रो-एलईडी सरणी से चमकदार प्रवाह को मापा और प्रकाश तीव्रता की गणना की जो तालिका 1 में दिखाए गए अनुसार हृदय तक पहुंचती है। तालिका 1 से यह भी पढ़ा जा सकता है कि प्रयुक्त माइक्रो-एलईडी की संख्या के साथ चमकदार प्रवाह बढ़ता है, लेकिन पहले उल्लिखित रोशनी प्रोफ़ाइल निहितार्थ के कारण प्रकाश की तीव्रता स्थिर रहती है।

दिलचस्प बात यह है कि यह भी देखा जा सकता है कि डब्ल्यूडेफ = 1 एमएस (चित्रा 3 ए) और डब्ल्यूडेफ = 20 एमएस (चित्रा 3 डी) के साथ नौ एलईडी की सफलता दर डिफिब्रिलेशन आवृत्ति एफडेफ = 18 हर्ट्ज और एफडेफ = 20 हर्ट्ज पर तुलनात्मक रूप से अधिक है। यह देखते हुए कि प्रेरित अतालता की औसत आवृत्ति 22.55 ± 4.03 हर्ट्ज है, यह तथ्य इंगित कर सकता है कि सीएचआर 2 मुराइन दिलों के लिए, सफलता दर काफी बढ़ जाती है क्योंकि पेसिंग आवृत्ति अतालता आवृत्ति के करीब होती है। यह संख्यात्मक सिमुलेशन26 में भी दिखाया गया है। हालांकि, इसे आसानी से सामान्यीकृत नहीं किया जा सकता है क्योंकि जटिल अतालता की प्रमुख आवृत्ति लगातार बदल रही है। इसे स्पष्ट करने के लिए, चित्र 4 एफडेफ = 14 हर्ट्ज के साथ दो अलग-अलग डिफिब्रिलेशन प्रयासों को दर्शाता है। चित्रा 4 ए में ईसीजी खंड की शुरुआत में और ईसीजी सिग्नल की आकृति विज्ञान के अनुसार एक वेंट्रिकुलर फाइब्रिलेशन (वीएफ) दिखाया गया है। जब माइक्रो-एलईडी फोटोस्टिम्यूलेशन शुरू होता है, तो फाइब्रिलेशन को अधिक क्रमबद्ध पैटर्न में बदल दिया जाता है जो वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया (वीटी) होने की अधिक संभावना है। जब भी माइक्रो-एलईडी सरणी बंद हो जाती है, तो मूल अराजक वीएफ तरंगें फिर से हावी हो जाती हैं। इस प्रकार, अतालता समाप्त नहीं होती है। यद्यपि इस उदाहरण में वीएफ को दिए गए मापदंडों के साथ समाप्त नहीं किया जा सकता है, यह परेशान हो जाता है और इसे अधिक नियमित पैटर्न (वीटी) में बदला जा सकता है। चित्र 4b सेगमेंट 1 से पता चलता है कि 24 हर्ट्ज की प्रमुख आवृत्ति तब तक थोड़ी बढ़ जाती है जब तक कि फोटोस्टिम्यूलेशन शुरू नहीं होता है और वीएफ को सेगमेंट 2 में वीटी में बदल दिया जाता है, जहां प्रमुख आवृत्ति 14 हर्ट्ज तक गिर जाती है। इसके अलावा, चित्रा 4 सी एक वीटी दिखाता है जिसे चित्रा 4 ए के समान एफडेफ के साथ समाप्त किया जा सकता है, लेकिन एक अलग डब्ल्यूडेफ के साथ। सबसे पहले, माइक्रो-एलईडी फोटोस्टिम्यूलेशन अतालता की आकृति विज्ञान को बदलता है, अंत में इसे 19वीं पल्स से 1: 1 पेसिंग कैप्चर के साथ समाप्त करने के लिए। इन परिणामों का अर्थ यह हो सकता है कि फोटोडिफाइब्रिलेशन पैरामीटर, उदाहरण के लिए डब्ल्यूडेफ, समय के साथ अतालता के आकृति विज्ञान परिवर्तन के अनुकूल होना चाहिए। इन परिणामों के लिए अग्रणी प्रयोगों को ब्लेबिस्टैटिन का उपयोग किए बिना आयोजित किया गया था क्योंकि परिणामस्वरूप कार्रवाई संभावित अवधि (एपीडी) 27 में परिवर्तन हुआ था। इसलिए, इन श्रृंखलाओं में कोई ऑप्टिकल मैपिंग नहीं की गई थी।

लाल-स्थानांतरित पोटेंशियोमेट्रिक डाई (चरण 2.1.4) का उपयोग करके ऑप्टिकल मैपिंग के लिए प्रयोगों का एक और सेट किया गया था। उच्च गति वाले कैमरों के साथ ऑप्टिकल मैपिंग साइनस ताल (चित्रा 5) और जटिल टैचीरिथमिया28 के दौरान हृदय की सतह पर उत्तेजना तरंगों का निरीक्षण करने की अनुमति देता है। चूंकि पोटेंशियोमेट्रिक डाई का आंशिक परिवर्तन बहुत कम है, इसलिए प्राप्त वीडियो को गणितीय प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोग करके पोस्ट-प्रोसेस किया गया था। ऑप्टिकल संकेतों की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए पहला कदम σ = 1 के मानक विचलन के साथ गॉसियन स्मूथिंग फिल्टर को लागू करने वाले शोर को हटाना है, इसके बाद कोने की आवृत्तियों एफउच्च = 0.1 हर्ट्ज और एफलो = 70 हर्ट्ज के साथ एक बैंडपास फिल्टर है। एफउच्च पर स्टॉपबैंड सिग्नल में धीमे परिवर्तनों को हटा देता है जो हृदय की साइनस आवृत्ति से संबंधित नहीं हैं जो 3 हर्ट्ज < एफसाइनस < 8 हर्ट्ज के बीच स्थित है, जबकि स्टॉपबैंड एफलो उच्च आवृत्ति शोर को हटा देता है जिसे कैमरे द्वारा कैप्चर किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एलईडी 1, एलईडी 2 और माइक्रो-एलईडी सरणी से ब्लू लाइट उत्सर्जन दोनों क्रॉस टॉक और ऑप्टिकल मैपिंग में बहुत अधिक हस्तक्षेप संकेत का कारण बन सकते हैं। इसके अलावा, यह देखा गया कि कैमरे के सामने एक बहुत संकीर्ण बैंडपास फिल्टर भी नहीं है, जिसमें तरंगदैर्ध्य λफ़िल्टर-कैम है, जैसा कि चरण 1.2.3 में उल्लेख किया गया है, नीली रोशनी के प्रभाव को फ़िल्टर करेगा। यह आंशिक रूप से डाई की उत्तेजना प्रतिक्रिया के कारण हो सकता है। इसलिए ऑप्टिकल मैपिंग के लिए ऑप्टिक्स चुनते समय बहुत सावधान रहें। वीडियो विश्लेषण के साधनों के लिए, सभी फ्रेम जिनमें नीली रोशनी दर्ज की गई है, को उपेक्षित किया जाना था ताकि कई मामलों में फोटोस्टिम्यूलेशन के दौरान दिल की कल्पना करना संभव न हो, जैसा कि एक अन्य अध्ययन29 में भी उल्लेख किया गया है।

Figure 1
चित्र 1: विद्युत और ऑप्टिकल सेटअप का योजनाबद्ध। (a) LED 1 और LED 2 अतालता और बैकअप डिफिब्रिलेशन के प्रेरण के लिए उपयोग किया जाने वाला एक नीला प्रकाश स्रोत प्रदान करते हैं। एलईडी 3 का उपयोग लाल-स्थानांतरित डाई डीआई -4-एएनबीडीक्यूपीक्यू के लिए उत्तेजना प्रकाश स्रोत के रूप में किया जाता है। लाल बत्ती को डाइक्रोइक दर्पण डीएम के माध्यम से दिल तक निर्देशित किया जाता है। गहरे लाल रंग में दिखाए गए उत्सर्जन प्रकाश को उच्च गति वाले कैमरे द्वारा उत्सर्जन फ़िल्टर के माध्यम से रिकॉर्ड किया जाता है, जैसा कि पाठ में उल्लेख किया गया है। एलईडी 2 और ईसीजी इलेक्ट्रोड सादगी के लिए नहीं दिखाए गए हैं। (ख) रिकॉर्ड किए गए ईसीजी सिग्नल का एक खंड लाल रंग में दिखाया गया है। गहरा नीला रंग एलईडी 1 और एलईडी 2 से हल्की दालों को आवृत्ति पर दिखाता है find = 35 Hz और Wind = 4 ms फाइब्रिलेशन को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रकाश उत्तेजना समाप्त करने के तुरंत बाद, वेंट्रिकुलर फाइब्रिलेशन (वीएफ) देखा जा सकता है। हल्के नीले रंग में दिखाया गया माइक्रो-एलईडी-आधारित फोटोस्टिम्यूलेशन (एफडेफ = 16 हर्ट्ज, डब्ल्यूडेफ = 20 एमएस) सफलतापूर्वक अतालता को समाप्त करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: हृदय की तैयारी. (क) चूहे की खुली छाती जो अक्षुण्ण हृदय और आसपास के अंगों को दर्शाती है. (ख) आगे की तैयारी के लिए बर्फ-ठंडे टायरोड के घोल में डूबे हुए हृदय का पता लगाया गया। (c) माउस हृदय एक कुंद सुई से ठीक से जुड़ा हुआ है। (घ) टायरोड के घोल में मुराइन हृदय निलंबित हो गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रयोगात्मक रूप से निकाली गई सफलता दर। 30 माइक्रो-एलईडी-आधारित फोटोस्टिम्यूलेशन दालों के लिए सफलता दर तीन, छह और नौ एलईडी का उपयोग करके अलग-अलग पल्स अवधि डब्ल्यूडेफ और आवृत्ति एफडीईएफ एन = 11 के लिए। माध्य S.E.M. की मानक त्रुटि के साथ दिखाए गए त्रुटि पट्टियाँ कृपया इस आरेख के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: फोटोस्टिम्यूलेशन के माध्यम से हृदय ताल का हेरफेर। (क) एक गैर-समाप्त अतालता की ईसीजी रिकॉर्डिंग का खंड। (ख) पैनल क में दर्शाए गए ईसीजी का स्पेक्ट्रोग्राम। खंड (1) का पावर स्पेक्ट्रल घनत्व (पीएसडी) 24 हर्ट्ज की प्रमुख आवृत्ति के साथ एक अतालता दिखाता है। यह देखा जा सकता है कि प्रमुख आवृत्ति 14 हर्ट्ज तक गिर जाती है। खंड (3) असफल समाप्ति और 24 हर्ट्ज की प्रमुख आवृत्ति के साथ लयबद्ध व्यवहार में वापस आ जाता है। (घ) पैनल सी में प्रदर्शित सफल समाप्ति का स्पेक्ट्रोग्राम। खंड (1) 23 हर्ट्ज की प्रमुख आवृत्ति के साथ एक वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया (वीटी) दिखाता है। सेगमेंट (3) एक सफल समाप्ति प्रदर्शित करता है, जो 3.5 हर्ट्ज की मौलिक आवृत्ति और परिणामस्वरूप हार्मोनिक्स के साथ एक सामान्य साइनस लय की ओर जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: पूरे दिल का ऑप्टिकल मानचित्रण। सामान्य साइनस ताल में दिल की एक एकल धड़कन के दौरान प्रतिदीप्ति तीव्रता का परिवर्तन दिखाया गया है। दिल को कैमरे के सामने रखा गया था ताकि दाएं और बाएं वेंट्रिकल दिखाई दें (आरवी, एलवी)। तारांकन चिह्न उस पिक्सेल को दर्शाता है जिस पर शीर्ष पर दिखाई गई कार्रवाई क्षमता ली गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

माइक्रोएलईडी की संख्या विकिरणित क्षेत्र ए1 2 [मिमी2] चमकदार प्रवाह φ [mW] प्रकाश तीव्रता एलआई [mW mm-2]
3 0.178 5.9 ± 0.47 33.11 ± 2.66
6 0.356 11.91 ± 0.84 33.42 ± 2.37
9 0.535 17.85 ± 0.61 33.39 ± 1.14

तालिका 1: माइक्रो-एलईडी सरणी के चमकदार प्रवाह और संबंधित प्रकाश तीव्रता को मापा।

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Discussion

कार्डियक टैचीरिथमिया का एक सफल उपचार कार्डियक थेरेपी के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, अतालता दीक्षा, स्थायीकरण और समाप्ति के अंतर्निहित बायोफिज़िकल तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आते हैं। इसलिए, कार्डियक रिसर्च का उद्देश्य अतालता की अधिक कोमल समाप्ति की दिशा में इलेक्ट्रिकल शॉक थेरेपी को अनुकूलित करना है, जिससे रोगियों के जीवन की गुणवत्ता में वृद्धि होती है 28,29,30,31। कम ऊर्जा विद्युत दृष्टिकोण गंभीर दुष्प्रभावों की महत्वपूर्ण कमी का वादा करते हैं, हालांकि अभी भी अवांछित मांसपेशियों की उत्तेजना को प्रेरित कर सकते हैं। कार्डियक ऑप्टोजेनेटिक्स इस सीमा को दूर कर सकते हैं और न केवल एक ऊतक-कोमल समाप्ति तकनीक प्रदान कर सकते हैं, बल्कि बरकरार मुराइन हृदय औरसेल संस्कृतियों में भंवर जैसी उत्तेजना तरंगों के अतालता-विशिष्ट लक्षित नियंत्रण की जांच करने के लिए एक लचीला मंच भी प्रदान कर सकते हैं।

उस प्रेरणा को देखते हुए, एक मजबूत फोटोस्टिम्यूलेशन सेटअप, साथ ही एक प्रोटोकॉल को डिजाइन और कार्यान्वित किया गया था, दोनों एक अत्यधिक अनुकूलनीय ऑप्टिकल सिस्टम की पेशकश करते थे, जिसे आसानी से तीन आयामी पैनोरमिक ऑप्टिकल मैपिंग अध्ययन34 तक बढ़ाया जा सकता था।

यह दिखाया जा सकता है कि कार्डियक अतालता को फोटोस्टिम्यूलेशन के लिए चुने गए मापदंडों के आधार पर विभिन्न सफलता दरों के साथ सफलतापूर्वक समाप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए हृदय पर रोशन क्षेत्र। प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि विकिरणित सतह में वृद्धि ने कार्डियोमायोसाइट्स की एक महत्वपूर्ण संख्या की भर्ती की, जो चालन ब्लॉक द्वारा अराजक गतिविधि को बुझाती है जैसा कि22 में भी दिखाया गया है। इस अध्ययन में, फोटोडिफाइब्रिलेट के लिए आवश्यक ऊर्जा ई = 10.69 ± 0.37 एमजे (नौ माइक्रो-एलईडी, 30 दालों और पल्स चौड़ाई डब्ल्यूडेफ = 20 एमएस का उपयोग करके) है। यह E 22 = 228.8 mJ और E 24 = 153.6 mJ के साथ 22,24 में पहले की रिपोर्ट की तुलना में कम है, जहां क्रमशः एक बड़ा क्षेत्र22 या पूरे दिल24 रोशन थे। फिर भी, 35 में दिखाए गए दृष्टिकोण की तुलना में, जहां एक अच्छी तरह से सीमांकित पैटर्न वाले क्षेत्र को 10 फोटोडिफाइब्रिलेशन दालों के साथ रोशन किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप ई35 = 1.8 एमजे होता है, वर्तमान अध्ययन में फोटोडिफाइब्रिलेशन ऊर्जा विशेष रूप से अधिक है। तीन अन्य दृष्टिकोणों के विपरीत, प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ 90% से अधिक सफलता दर तक नहीं पहुंचा जा सका। उच्च फोटोडिफाइब्रिलेशन ऊर्जा के बावजूद कम प्रदर्शन का एक संभावित कारण यह हो सकता है कि अंतर्निहित अतालता की जटिलता पर विचार नहीं किया जा रहा है। 35 में प्रस्तुत परिणामों के संबंध में, जहां हृदय पर एक छोटे से क्षेत्र को रोशन करके एक उच्च समाप्ति दर पूरी की जाती है, और साथ ही एक अतालता की स्थानिक-अस्थायी गतिशीलता को मापने के साथ, प्रस्तुत दृष्टिकोण को निश्चित रूप से प्रतिक्रिया-नियंत्रण पर विचार करके और बेहतर बनाया जा सकता है, जो हृदय की वर्तमान स्थिति के आधार पर माइक्रो-एलईडी रोशनी के एक अलग पैटर्न के साथ प्रतिक्रिया करता है।  इसके अलावा, यह भी प्रदर्शित किया गया था कि यद्यपि अतालता को हमेशा वर्तमान विधि के साथ समाप्त नहीं किया जा सकता है, आंतरिक जटिल गतिशीलता को फोटोस्टिम्यूलेशन के दौरान परेशान किया जा सकता है जिससे अधिक व्यवस्थित अस्थायी स्थिति हो सकती है। जैसा कि36 में दिखाया गया है, मोनोमॉर्फिक (अधिक व्यवस्थित) और बहुरूपी (कम क्रमबद्ध) अतालता को संबोधित करते समय समाप्ति दर काफी भिन्न होती है। इसलिए एक बेहतर डिफिब्रिलेशन दर की दिशा में तार्किक कदम एक वीएफ एपिसोड के दौरान हृदय की गतिशीलता को प्रभावित करना, अतालता को कम जटिल पैटर्न में बदलना और दालों के एक और सेट के साथ समाप्त करना हो सकता है, इस तरह से दो-चरणीय फोटोस्टिम्यूलेशन दृष्टिकोण का निर्माण हो सकता है।

छिड़काव प्रोटोकॉल के संबंध में, हृदय के सही निष्कर्षण और तैयारी के साथ-साथ ऑप्टिकल मैपिंग ऑप्टिक्स के सही समायोजन में सबसे महत्वपूर्ण कदम पाए जाते हैं। ऑप्टिकल मैपिंग को शामिल करने के लिए डाई स्पेक्ट्रा, उचित उत्तेजना प्रकाश-स्रोतों और कैमरा29 के लिए अच्छी तरह से चुने गए ऑप्टिकल फिल्टर के उचित चयन की आवश्यकता होती है। अन्यथा, रिकॉर्ड किए गए ऑप्टिकल सिग्नल बहुत शोर हो सकते हैं और डाई उत्तेजना के साथ फोटोस्टिम्यूलेशन की क्रॉस-टॉक भी हो सकती है। इसलिए बाद के विश्लेषण के लिए कई विश्लेषणात्मक फिल्टर और छवि स्मूथिंग के साथ संकेतों के पोस्ट-प्रोसेसिंग की आवश्यकता होगी, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर बिगड़ जाता है।

इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम माइक्रो-एलईडी सरणी का सही और सटीक प्लेसमेंट है। चूंकि माइक्रो-एलईडी सरणी और ड्राइवर के बीच इंटरकनेक्टिंग लीड बहुत पतला और लचीला है, इसलिए कभी-कभी यह सुनिश्चित करना चुनौतीपूर्ण होता है कि सरणी प्रत्येक प्रयोग के लिए हृदय की सतह पर लगभग एक ही स्थान पर स्थित होगी। पोजिशनिंग की सुविधा के लिए और माइक्रो-एलईडी सरणी की अधिग्रहित स्थिति को ठीक करने के लिए, एक धारक को 3 डी में डिज़ाइन और मुद्रित किया गया था, जिससे सरणी को माइक्रोमैनिपुलेटर से जोड़ा जा सकता था। यह टायरोड के समाधान में सरणी के आंदोलन पर अधिक नियंत्रण देता है। माइक्रो-एलईडी सरणी के इंटरकनेक्टिंग लीड के लिए चुनी गई सामग्री के आधार पर, धारक का उपयोग आवश्यक नहीं हो सकता है।

इसके अलावा, प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम प्रो-एरिथमिया दवाओं को जोड़ना है, जैसे, पिनासिडिल37। चूंकि कई रासायनिक यौगिक हृदय की शारीरिक प्रतिक्रिया को बदलने के लिए अच्छी तरह से जाने जाते हैं, इसलिए परिणामों का विश्लेषण और व्याख्या करते समय इस पर विचार किया जाना चाहिए। जहां तक ऑप्टिकल मैपिंग का सवाल है, प्रस्तावित प्रोटोकॉल एक यांत्रिक अनकपलर के रूप में ब्लेबिस्टैटिन का उपयोग करता है। इसमें रिकॉर्डिंग के दौरान गति कलाकृतियों को हटाने का लाभ है, लेकिन यह एपीडी27 को भी लंबा कर सकता है। इस खामी को दूर करने के लिए, रिकॉर्डिंग के दौरान गति ट्रैकिंग के तरीकों का विश्लेषण38,39 माना जा सकता है। इस तरह, हृदय की सामान्य शारीरिक स्थिति को संरक्षित किया जाएगा, और एक उच्च गुणवत्ता वाला संकेत प्राप्त किया जा सकता है।

यद्यपि यह साबित हो गया था कि प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग बहु-साइट फोटो-डिफिब्रिलेशन के लिए किया जा सकता है, फिर भी इसकी कुछ सीमाएं हैं। यह पाया गया है कि कुछ मामलों में फाइब्रिलेशन को माइक्रो-एलईडी-आधारित फोटोस्टिम्यूलेशन द्वारा समाप्त नहीं किया जा सकता है, लेकिन केवल परेशान किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप आवृत्ति परिवर्तन होता है। एक परिकल्पना यह है कि हृदय पर घुमावदार तरंगें केवल बाएं वेंट्रिकल से विस्थापित हो रही हैं, जो दिल के अन्य हिस्सों में खुद को पुनर्जीवित करती हैं। वैश्विक रोशनी24 जैसे अन्य तरीकों की तुलना में, वर्तमान विधि हृदय के छोटे कवरेज के कारण कम सफलता दर प्रदान करती है। हालांकि, हमें विश्वास है कि सर्पिल गतिविधि की उचित हार्डवेयर-आधारित मान्यता विधि के साथ, समाप्ति सफलता दर में सुधार संभव है।

अंत में, प्रस्तुत फोटोस्टिम्यूलेशन सिस्टम कार्डियक अतालता के कई कार्डियोवर्जन दृष्टिकोण और हेरफेर अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक उपकरण स्थापित करता है। इस प्रणाली में सीखे गए ज्ञान का उपयोग नैदानिक रूप से प्रासंगिक बड़े पशु मॉडल में नई क्षमता (फोटो) डिफिब्रिलेशन प्रोटोकॉल की जांच और मूल्यांकन करने के लिए किया जाएगा।

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Disclosures

लेखक किसी भी हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखक प्रयोगों के दौरान अपने उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए मैरियन कुंजे और टीना अल्थॉस को धन्यवाद देना चाहते हैं। परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान को यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क प्रोग्राम एफपी 7/2007-2013 से अनुदान समझौता संख्या हेल्थ-एफ 2-2009-241526 के तहत धन प्राप्त हुआ है। जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च, डीजेडएचके ईवी (प्रोजेक्ट एमडी 28), पार्टनर साइट गोएटिंगेन, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन सीआरसी 1002 (प्रोजेक्ट सी 03), और मैक्स प्लैंक सोसाइटी द्वारा भी सहायता प्रदान की गई थी। यह काम आंशिक रूप से ब्रेनलिंक्स-ब्रेनटूल्स, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी, अनुदान संख्या ईएक्ससी 1086) द्वारा वित्त पोषित उत्कृष्टता के क्लस्टर द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical Components
Blebbistatin TargetMol T6038 10 mM stock solution
BSA/Albumin Sigma-Aldrich A4919
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Carbogen Westfalen 50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ AAT Bioquest 21499 Dye for Optical Mapping
Glucose Sigma-Aldrich D9434 C6H12O6
Heparin LEO Pharma Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid Merck 1.09057.1000 HCl, 1 M stock solution
Isoflurane CP Pharma 1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride Merck 8.14733.0500 MgCl2
Monopotassium Phosphate Sigma-Aldrich 30407 KH2PO4
Pinacidil monohydrate Sigma-Aldrich P154-500mg 10 mM stock solution
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 KCl
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 NaCl
Sodium Hydroxide Merck 1.09137.1000 NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150 Biopac Systems MP150WSW data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C Biopac Systems ECG100C Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable RMS Heating System HK-5,0-12 Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply Thorlabs KPS101 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver Thorlabs LEDD1B T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode Hugo Sachs Elektronik BS4 73-0200 Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG Agilent Instruments A-2230 Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator Agilent Instruments A-2230 AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue Epoxy Technology EPO-TEK 353ND Two component epoxy
Fluoropolymer  Asahi Glass Co. Ltd. Cytop 809M Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist Merck KGaA AZ 5214E Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip  Cree Inc. C460TR2227-S2100 Blue micro-LED
Photoresist Merck KGaA AZ 9260 Thick Positive Photoresists
Polyimide UBE Industries Ltd. U-Varnish S Polyimide Solution
Silicone NuSil Technology LLC MED-6215 Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive John P. Kummer GmbH Epo-Tek 301-2 Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter Chroma Technology Corporation ET470/40x Blue excitation filter
Camera Photometrics Cascade 128+ High performance EMCCD Camera
Camera Objective Navitar DO-5095 Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror Semrock FF685-Di02-25x36 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter Semrock FF01-775/140-25 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink Advanced Thermal Solutions ATSEU-077A-C3-R0 Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2 LED Engin Osram LZ4-00B208 High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3 Thorlabs M625L3 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses LED Engin Osram LLNF-2T06-H LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter Thorlabs S120VC Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter
Red Filter Semrock FF02-628/40-25 BrightLine® single-band bandpass filter

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References

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मुराइन हार्ट्स में ऑप्टोजेनेटिक मल्टी-साइट फोटोस्टिम्यूलेशन लागू करके उन्नत कार्डियक रिदम प्रबंधन
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Diaz-Maue, L., Steinebach, J.,… More

Diaz-Maue, L., Steinebach, J., Schwaerzle, M., Luther, S., Ruther, P., Richter, C. Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (174), e62335, doi:10.3791/62335 (2021).

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