Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Avansert hjerterytmehåndtering ved å bruke optogenetisk multi-site fotostimulering i murine hjerter

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62335
Automatic Translation
*1,2, *1, 8,9, 1,3,4,6, 8,9, 1,5,6,7
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg
* These authors contributed equally

Summary

Dette arbeidet rapporterer en metode for å kontrollere hjerterytmen til intakte murinhjerter av transgene kanalrhodopsin-2 (ChR2) mus ved hjelp av lokal fotostimulering med en mikro-LED-matrise og samtidig optisk kartlegging av epikardial membranpotensial.

Abstract

Ventrikulære takyarytmier er en viktig årsak til dødelighet og sykelighet over hele verden. Elektrisk defibrillering ved hjelp av høy-energi elektriske støt er for tiden den eneste behandlingen for livstruende ventrikkelflimmer. Defibrillering kan imidlertid ha bivirkninger, inkludert uutholdelig smerte, vevskader og forverring av prognosen, noe som indikerer et betydelig medisinsk behov for utvikling av mer milde styringsstrategier for hjerterytme. I tillegg til energireduserende elektriske tilnærminger ble hjerteoptogenetikk introdusert som et kraftig verktøy for å påvirke hjerteaktiviteten ved hjelp av lysfølsomme membranionkanaler og lyspulser. I denne studien vil en robust og gyldig metode for vellykket fotostimulering av Langendorff-perfunderte intakte murinehjerter bli beskrevet basert på multi-site pacing ved å bruke en 3 x 3 array av mikrolysdioder (mikro-LED). Samtidig optisk kartlegging av epikardiale membranspenningsbølger gjør det mulig å undersøke effekten av regionspesifikk stimulering og evaluerer den nylig induserte hjerteaktiviteten direkte på stedet. De oppnådde resultatene viser at effekten av defibrillering er sterkt avhengig av parametrene som er valgt for fotostimulering under hjertearytmi. Det vil bli demonstrert at det opplyste området av hjertet spiller en avgjørende rolle for termineringssuksess, samt hvordan målrettet kontroll av hjerteaktivitet under belysning for å endre arytmimønstre kan oppnås. Oppsummert gir denne teknikken en mulighet til å optimalisere manipuleringen på stedet på vei til sanntids tilbakemeldingskontroll av hjerterytmen og, med hensyn til regionspesifisiteten, nye tilnærminger for å redusere potensiell skade på hjertesystemet sammenlignet med bruken av ikke-spesifikke elektriske støtapplikasjoner.

Introduction

Tidlige undersøkelser av romlig-temporal dynamikk under arytmi viste at de komplekse elektriske mønstrene under hjerteflimmer drives av virvellignende roterende eksitasjonsbølger1. Dette funnet ga ny innsikt i de underliggende mekanismene for arytmier, som deretter førte til utvikling av nye elektriske termineringsbehandlinger basert på multi-site eksitasjon av myokardiet 2,3,4. Imidlertid er behandlinger som bruker elektrisk feltstimulering ikke-lokale og kan innervere alle omkringliggende spennende celler, inkludert muskelvev, forårsaker cellulær og vevskader, samt utålelig smerte. I motsetning til elektriske terapier gir optogenetiske tilnærminger en spesifikk og vevbeskyttende teknikk for å fremkalle kardiomyocyttvirkningspotensialer med høy romlig og tidsmessig presisjon. Optogenetisk stimulering har derfor potensial for minimal invasiv kontroll av de kaotiske aktiveringsmønstrene under hjerteflimmer.

Innføringen av den lysfølsomme ionkanalen channelrhodopsin-2 (ChR2) i spennende celler via genetisk manipulasjon 5,6,7, muliggjorde depolarisering av membranpotensialet til spennende celler ved hjelp av fotostimulering. Flere medisinske applikasjoner, inkludert aktivering av nevrale nettverk, kontroll av hjerteaktivitet, restaurering av syn og hørsel, behandling av ryggmargsskader og andre 8,9,10,11,12,13,14 er utviklet. Anvendelsen av ChR2 i kardiologi har betydelig potensial på grunn av sin millisekund responstid15, noe som gjør den godt egnet for målrettet kontroll av arytmisk hjertedynamikk.

I denne studien vises multi-site fotostimulering av intakte hjerter av en transgen musemodell. Oppsummert ble en transgen alfa-MHC-ChR2-muselinje etablert innenfor rammen av Det europeiske fellesskaps syvende rammeprogram FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) og vennlig levert av prof. S. E. Lehnart. Generelt ble transgen voksen hann C57/B6/J, som uttrykker Cre-recombinase under kontroll av alfa-MHC, paret for å parre seg med kvinnelig B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Siden hjerte-STOP-kassetten ble slettet i andre generasjon, viste avkommet et stabilt MHC-ChR2-uttrykk og ble brukt til å opprettholde hjerte-lysfølsomme kolonier. Alle eksperimenter ble gjort med voksne mus av begge kjønn i en alder av 36-48 uker. Belysningen oppnås ved hjelp av en 3 x 3 mikro-LED-array, produsert som beskrevet i16,17, bortsett fra at det silisiumbaserte huset og de korte optiske glassfibrene ikke er implementert. Den første bruken i en hjerteapplikasjon er funnet i18. En lineær mikro-LED-matrise basert på en lignende fabrikasjonsteknologi har blitt brukt som en penetrerende sonde for hjertetempo19. Mikro-lysdiodene er arrangert i en 3 x 3 array i en tonehøyde på 550 μm, noe som gir både en høy romlig oppløsning og en høy stråleeffekt på et svært lite område. Forfatterne demonstrerer i dette arbeidet en allsidig lokal multi-site fotostimulering som kan åpne veien for å utvikle nye antiarytmiske terapimetoder.

Følgende eksperimentelle protokoll innebærer en retrograd Langendorff perfusjon ex vivo, for hvilken kanylert aorta fungerer som perfusjonsinnløp. På grunn av det påførte perfusjonstrykket og hjertekontraksjonen strømmer perfusatet gjennom koronararteriene, som forgrener seg fra aorta. I det presenterte arbeidet blir hjertet perfundert ved hjelp av et konstant trykkoppsett oppnådd ved å heve perfusatreservoarene til 1 m høyde, tilsvarende 73,2 mmHg, noe som gir en strømningshastighet på 2,633 ± 0,583 ml / min. To typer Tyrodes løsning brukes som perfusat under forsøket. Vanlig Tyrodes løsning støtter en stabil sinusrytme, mens Low-K + Tyrodes løsning blandes med Pinacidil for å muliggjøre induksjon av arytmi i murine hjerter. Bruken av et sekskantet vannbad tillater observasjon av hjertet gjennom seks forskjellige plane vinduer, noe som gjør det mulig å koble flere optiske komponenter med mindre forvrengning ved brytning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøkene fulgte dyrevelferdsforskriften strengt, i samsvar med tysk lovgivning, lokale bestemmelser og i samsvar med anbefalinger fra Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Søknad om godkjenning av dyreforsøk er godkjent av ansvarlig dyrevelferdsmyndighet, og alle forsøk er meldt til våre dyrevelferdsrepresentanter.

1. Eksperimentforberedelse og materialer

  1. Oppsett for optisk kartlegging
    MERK: Det optiske oppsettet, samt det elektriske oppsettet, er vist i figur 1. Alle komponenter som brukes i det optiske og elektriske oppsettet er oppført i detalj i materialtabellen.
    1. Bruk LED 1 og LED 2 for induksjon av arytmi og backup defibrillering. Velg lysdioder med høy effekt med en bølgelengde λblå nær 475 nm, som er toppen av eksitasjonsbølgelengden til ChR26. For å begrense det optiske spekteret ytterligere, bruk et 470 ± 20 nm båndpassfilter.
      MERK: I dette arbeidet har LED 1 og LED 2 en typisk strålingsfluks på 3,9 til 5,3 W, ifølge databladet20.
    2. Belys epikardiet for optisk kartlegging med en høyeffekts rød LED (LED 3 i figur 1), som avgir lys med en senterbølgelengde på λrød = 625 nm og en strålingsfluks på 700 mW21. Det røde lyset filtreres med et 628 ± 20 nm båndpassfilter og reflekteres av et langpassert dikroisk speil (DM) med en avskjæringsbølgelengde på λDM = 685 nm.
    3. Bruk et utslippsfilter med λfilter-cam = 775 ± 70 nm foran kameramålet for å bare registrere fluorescensutslippet av hjerteaktiviteten. Bruk et raskt mål som er godt egnet for applikasjoner med lite lys.
      MERK: Frekvensen av fibrillering av et musehjerte varierer fra 20 til 35 Hz; Bruk derfor et raskt nok kamera til å ta opp med en frekvens på 1 til 2 kHz, eller enda høyere.
  2. Mikro-LED-array
    MERK: Mikro-LED-arrayene som brukes her, realiseres ved hjelp av mikrosystembehandling som nærmere beskrevet andre steder16,17.
    1. Spinnbelegg et 5 μm tykt polyimid (PI) lag på 4-tommers silisiumunderlag (enkeltsidig polert, 525-μm tykt).
    2. Herd dette PI-laget ved en maksimumstemperatur på 450 °C under en nitrogenatmosfære. Hold maksimal temperatur konstant i 10 minutter.
    3. Innskudd og mønster et bilde reversering fotoresist (PR) ved hjelp av ultrafiolett (UV) litografi og sputter innskudd en 250 nm tynn platina lag (Pt).
    4. Tykne denne Pt-baserte metalliseringen ved å galvanisere et 1 μm tykt gull (Au) lag med mønstret PR som fungerer som et maskeringslag.
    5. Før du spinnbelegger et andre PI-lag, utsett waferen med sitt første PI-lag og den Au-galvaniserte metalliseringen for et oksygenplasma som kjemisk aktiverer overflaten av PI-laget.
    6. Herd det andre PI-laget igjen ved 450 °C, påfør UV-litografi for å mønstre et PR-lag og åpne kontaktputene til matrisen for mikro-LED-brikkene og grensesnittkretskortet (PCB) ved reaktiv ionetsing (RIE) ved å bruke mønstret PR som et maskeringslag.
      MERK: I disse RITE-prosesstrinnene anbefales det å bruke 200 W og 100 W i henholdsvis 10 og 30 minutter for å definere kontaktputeåpningene samt den ytre formen til det todimensjonale (2D) mikro-LED-arrayet.
    7. Stripp PR ved hjelp av løsemidler og plasmaetsing. Gjør kontaktputene tykkere ytterligere ved å galvanisere et ytterligere 6 μm tykt gulllag.
    8. Fest mikro-LED-brikkene til kontaktputene ved hjelp av en flip-chip-bonder.
    9. Aktiver PI-overflaten i et oksygenplasma og underfyll mikro-LED-brikkene med et løsemiddelfritt lim. Herd deretter limet i 12 timer ved 120 °C.
    10. For å innkapsle mikro-LED-brikkene, utfør en annen plasmabehandling med Argon og påfør et tynt fluoropolymerlag manuelt. Forherd dette laget ved 80 °C i 1 time.
    11. Påfør silikon manuelt som det endelige innkapslingslaget etter å ha utsatt mikro-LED-matrisen for et oksygenplasma, som brukes til å forbedre silisiumadhesjonen til det underliggende fluoropolymerlaget. Herd silikonlaget ved 80 °C og 180 °C i 1 time hver. Disse siste herdetrinnene kurerer også fluoropolymerlaget fullstendig.
    12. Lodd kontaktputene til PI-substratet til et trykt kretskort som bærer stripekontakter for sammenkobling av matrisen til en ekstern instrumentering. Dekk loddeputene på PCB med et lim.
  3. Elektrisk oppsett
    1. Bruk elektroder som er egnet for opptak av et elektrokardiogram (EKG), for eksempel sølv / sølvkloridelektroder eller MAP-elektroder (monofasisk handlingspotensial) og en EKG-forsterker for å overvåke hjertets elektriske aktivitet kontinuerlig. Videre bruker du en passende innsamlingsenhet (AD) for å registrere alle elektriske signaler som er oppnådd.
    2. Velg en velegnet driver for de kraftige LED-ene (LED 1, LED 2 og LED 3), som kan håndtere den maksimale strømmen som brukes på hver enhet. Bruk en vilkårlig funksjonsgenerator (AFG) for å kontrollere utgangen til LED-driverne nøyaktig.
    3. Bruk en flerkanals LED-driver for å kontrollere strømmen som strømmer gjennom mikro-LED-matrisen. En AFG med flere utganger er like godt egnet for denne oppgaven.
      MERK: Det anbefales å velge LED-drivere som begrenser strømmen til maksimal strøm av mikro-LED, ellers kan diodene bli skadet. Et eksempel på en flerkanals mikro-LED-driver er beskrevet i et annet arbeid18. Om nødvendig kan AFG eller en annen LED-driver være koblet til en datamaskin for å fjernstyre mikro-LED-innstillingene. Hvis dette er tilfelle, kobler du LED-driveren til datamaskinen med den kommunikasjonsprotokollen du velger, for eksempel GPIB (General Purpose Interface Bus) eller en seriell tilkobling.

   

2. Eksperimentelle prosedyrer

  1. Løsning forberedelse
    1. Klargjør Tyrodes løsning: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1,8 mM CaCl 2, 1,2 mM KH 2 PO4, 5,6 mM glukose, 0,1 % BSA/albumin.
    2. Forbered Low-K+ Tyrodes løsning: Low-K+ Tyrode's er laget på samme måte som vanlig Tyrodes løsning, bortsett fra at bare halvparten av KCl tilsettes (2 mM i stedet for 4 mM KCl).
      MERK: For et eksperiment som varer 3 timer vanligvis 2-3 L av Low-K + Tyrode's (i tillegg blandet med Blebbistatin (trinn 2.1.5) hvis optisk kartlegging utføres) og 1-2 L av vanlige Tyrode's er tilstrekkelig.
    3. Tilsett Pinacidil til Low-K + Tyrodes løsning for å lette prosessen med arytmiinduksjon, som beskrevet i22, for å oppnå en konsentrasjon på 100 mM. Bruk beskyttende laboratoriehansker ved håndtering av Pinacidil.
    4. Forbered 1 ml 50 μM DI-4-ANBDQPQ med vanlig Tyrodes løsning. Beskytt fargestoffet mot lys for å forhindre fotobleking.
    5. Lag en 10 mM lagerløsning av Blebbistatin. For optisk kartlegging, bland Blebbistatin med 100 mM Pinacidil-Tyrode's-løsningen (trinn 2.1.3) for å oppnå en 5 μM løsning. Bruk beskyttende laboratoriehansker ved håndtering av Blebbistatin.
      MERK: Hold både fargestoffet og Blebbistatin-løsningen til side til optisk kartlegging begynner.
  2. Langendorff perfusjon
    MERK: Oppsettet består av to reservoarer for de to Tyrodes løsninger. De er koblet til en boblefelle via rør med treveis haner. Hjertet er senere festet til boblefellen med en Luer-låsekontakt, og den blir deretter suspendert i et sekskantet vannbad. Vannbadet er i sin tur koblet til en avfallsbeholder for å samle den brukte Tyrodes løsning.
    1. Rengjør alle rør før hvert eksperiment med fullstendig demineralisert vann.
    2. Luft begge Tyrodes løsninger med karbogen (5 % CO 2 og 95 % O2) i 30 minutter ved romtemperatur før eksperimentet starter. Juster pH-verdien til Tyrodes løsninger til 7,4 med NaOH.
    3. Fyll 500 ml av hver Tyrodes løsning i det tilsvarende reservoaret og avluft rørene samt boblefellen ved å kjøre Tyrodes løsning gjennom perfusjonssystemet til det ikke ses flere fangede luftbobler i rørene eller i boblefellen.
    4. Fortsett å lufte Tyrodes løsninger under hele eksperimentet i reservoarene med karbogen for å sikre at pH i perfusatet forblir stabil senere under perfusjon.
    5. Varm opp perfusjonssystemet til 37 °C med en vannvarmepumpe. Hold den perfuserte temperaturen konstant i vannbadet ved å bruke et ekstra varmeelement som en vanntett varmekabel.
      MERK: Under eksperimentet er det avgjørende å fylle på Tyrodes reservoarer før de går tomme. Ellers kan luftbobler komme inn i hjertet, noe som kan tette karene og føre til iskemi.
  3. Mus forberedelse
    1. Injiser subkutant 0,1 ml 500 IE heparin 30 minutter før hjerteisoleringsprosedyren.
    2. Fyll en 6 cm petriskål og en 2 ml sprøyte med iskald Tyrodes oppløsning. Plasser under stereoskopisk mikroskop.
    3. Utfør korttidsanestesi av mus ved et mettet isofluranmiljø i 2 minutter og umiddelbar cervikal dislokasjon etterpå.
      MERK: For å verifisere tilstrekkelig anestesi er en sjekk for den negative inter-tårefleksen absolutt nødvendig.
    4. Åpne brystet, fjern hjertet, som beskrevet andre steder23, og legg det i 6 cm petriskålen med iskald Tyrodes løsning. Hjerteslag vil bli redusert på grunn av temperaturfall.
    5. Gjør det fine preparatet under et stereoskopisk mikroskop, som beskrevet andre steder23. Fest aorta på den stumpe nålen og fest karet med suturmateriale.
    6. Som en kontroll, injiser iskald Tyrodes oppløsning gjennom nålen inn i hjertet og kontroller at hjertet er tett montert. Dette trinnet skyller også det gjenværende blodet ut av hjertet.
    7. Overfør det monterte hjertet til perfusjonssystemet. Forsikre deg om at perfusatet strømmer for å forhindre at luft kommer inn i hjertet mens du kobler nålen til boblefellen. Kontroller at hjertet er dekket med Tyrodes oppløsning i vannbadet. Trinn 2.3.4, 2.3.5 og 2.3.7 er illustrert i figur 2.
    8. Sørg for at hjertet begynner å slå i løpet av få minutter. La hjertet tilpasse seg perfusjonsoppsettet i 15 til 20 minutter, og bytt deretter til lav-K+ Tyrodes løsning med henholdsvis Pinacidil (trinn 2.1.3) lav-K+ Tyrodes løsning med Pinacidil og Blebbistatin (trinn 2.1.5) hvis optisk kartlegging skal utføres.
  4. Arytmiinduksjon og optisk defibrillering
    1. Plasser en av EKG-elektrodene så nær hjerteoverflaten som mulig for å sikre god signalkvalitet. Stopp den andre EKG-elektroden i Tyrodes oppløsning. Forsikre deg om at EKG som er oppnådd, blir registrert av ønsket AD.
    2. Plasser mikro-LED-matrisen på områdets interesseområde, for eksempel på venstre ventrikel.
    3. Endre perfusjonen til lav-K + Tyrode's med Pinacidil og perfuse hjertet i 15 til 30 min.
    4. For å indusere arytmi, belyse hjertet med LED 1 og LED 2 med et tog på 20 til 50 lyspulser med en frekvens f ind på 25 til 35 Hz, pulsvarighet Wind på 2 til 15 ms, og lysintensitet LIopt_ind på 2,8 mW mm-2.
    5. Gjenta prosessen til arytmi er indusert.
      MERK: Arytmier er enkle å identifisere i EKG-signalet fordi frekvensen og morfologien til signalet er forskjellig fra normal sinusrytme. Skulle arytmien avsluttes innen de neste 5 s, klassifisere den som selvavsluttet, og start et nytt induksjonsforsøk.
    6. Når en vedvarende arytmi er visuelt oppdaget, bruk en utbrudd av pulser med forskjellige bredder W def og frekvenser fdef, ved hjelp av tre, seks eller ni mikro-lysdioder av matrisen ved en pulserende strømI-puls på 15 mA som gir en lysintensitet LIμLED = 33,31 ± 2,05 mW mm-2.
    7. Skulle arytmien fortsette å pågå etter fem mikro-LED-arraybaserte defibrilleringsforsøk, klassifiser forsøket som mislykket og start sikkerhetskopieringsdefibrillering.
    8. For sikkerhetskopieringsdefibrillering, bruk LED 1 og LED 2 ved å bruke de samme tidsparametrene som er angitt for mikro-LED-matrisen.
      MERK: Fordi hjertet er utsatt for iskemisk og metabolsk stress over hele eksperimentell periode, er det mulig at termineringsforsøk på arytmi mislykkes selv med backup defibrillering. Når dette skjer, bytt perfusjonsoppløsningen til den vanlige Tyrode og la hjertet komme seg i 5 til 10 minutter. Når EKG går tilbake til sinusrytme, gjenta protokollen fra trinn 2.4.3 igjen.
  5. Optisk kartlegging
    1. Perfuse hjertet med Blebbistatin-løsningen tilberedt i trinn 2.1.5 og vent til mekanisk frakobling oppstår. Dette oppnås når hjertet slutter å slå, men et EKG-signal er fortsatt målbart.
      MERK: Blanding av Blebbistatin-løsningen til den nevnte konsentrasjonen og å holde hjertet perfundert med denne løsningen opprettholder den hjertemekaniske aktiviteten frakoblet fra den elektriske aktiviteten under hele forsøket.
    2. Gi 1 ml spenningsfargestoff DI-4-ANBDQPQ (fremstilt i trinn 2.1.4) som en bolus i boblefellen til Langendorff-perfusjonen. Vent i 5 til 10 minutter for å la fargestoffet perfusere hjertet jevnt.
      MERK: Unngå fotobleking av fargestoffet ved å slå av det røde lyset når det ikke gjøres opptak. Hvis signal-til-støy-forholdet mellom opptaket blir for lite (det innhentede signalet bråker), gjentar du trinn 2.1.4 og 2.5.2.
    3. Fokuser kameraet på hjerteoverflaten, slå på LED 3, og bruk 1,27 mW mm-2 optisk strøm.
    4. Slå av laboratorielysene og start opptaket. Forsikre deg om at et optisk signal blir anskaffet ved å sammenligne frekvensen til det oppnådde signalet med frekvensen til det innspilte EKG. Dette sikrer at det oppnådde optiske signalet er rent relatert til hjertets elektriske aktivitet.
      MERK: Siden fluorescenslyset som sendes ut av fargestoffet er veldig uken, gjøres optisk kartlegging i et mørkt rom. Dette unngår signalforstyrrelser fra andre lyskilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen tillater induksjon av ventrikulære arytmier i intakte murinhjerter ved bruk av fotostimuleringspulser generert av LED 1 og LED 2 (figur 1) med en frekvens f ind mellom 25 Hz og 35 Hz og en pulsvarighet Wind mellom 2 ms og 10 ms. Vær oppmerksom på at målet med slike raske lyspulser ikke er å fange hjerterytmen, men heller å balansere hjerteaktiviteten slik at uberegnelige elektriske bølger kan genereres, noe som deretter letter en arytmi. Fordelen med å indusere arytmi med lys over induksjon med elektrisk stimulering er at ingen gjenstander blir provosert i EKG, noe som gir mulighet til å post-analysere det oppkjøpte signalet uten begrensninger og til og med evaluere hjertets elektriske respons under rask pacing, dette faktum gir også muligheten til å observere hjerteadferden under fotodefibrillering. Dette er ikke mulig med elektriske induksjons- eller defibrilleringsmetoder. Likevel, hvis oppsettet som brukes ikke tillater bruk av eksterne lysdioder med høy effekt, for eksempel på grunn av plassbegrensninger, kan en ekstra pacing-elektrode plasseres på hjertet for å indusere arytmi, som vist andre steder 3,22,24.

Når fibrillering er indusert, må arytmien vare minst 5 sekunder for å sikre at den opprettholdes, etterpå startes de mikro-LED-baserte defibrilleringsforsøkene. Siden hovedparametrene for hjertearytmi, som grunnleggende sykluslengde eller dominerende frekvens, amplitude og morfologi, kontinuerlig endres, og da det er oppdatert ikke mulig å forutsi hvilke fotodefibrilleringsparametere som gir det beste resultatet, var det av betydelig interesse å forstå om det er et forhold mellom frekvensen, pulsbredden, område av fotostimulering og termineringshastighet. Derfor ble en rekke eksperimenter med forskjellige frekvenser f def, antall mikro-lysdioder og pulsvarigheter Wdef testet, og suksessraten for N = 11 mus ble ekstrahert, som vist i figur 3.

Det kan påvises at pulser på 1 til 20 ms varighet kan defibrillere med ulik suksessrate (figur 3). Siden lysintensiteten LIμLED ble holdt konstant under hver fotostimuleringspuls, som nevnt i trinn 2.4.6, og suksessraten for tre mikro-lysdioder mot ni er betydelig lavere, antyder de presenterte resultatene at området dekket på hjertet, antall mikro-lysdioder, og dermed den totale strålingsfluksen som påføres, er avgjørende faktorer for å oppnå defibrillering. Tatt i betraktning at hver mikro-LED på matrisen er en Lambertian-lyskilde og at de er plassert direkte på overflaten av hjertet slik at den omtrentlige avstanden til vevet er null, kan det antas at bestrålingskonturen til det opplyste området på hjertet når du bruker en enkelt mikro-LED tilsvarer AμLED = 0,059 mm², som også vist i25 for flate rektangulære lysdioder. Videre, selv om noen fotoner kan forlate mikro-LED sideveis fra kantene, anses bidraget fra dem til den totale lysintensiteten som så liten at effekten kan overses. For å kvantifisere det bestrålte lyset til matrisen, målte forfatterne strålingsfluksen fra mikro-LED-matrisen med en kommersiell effektmåler og beregnet lysintensiteten som når hjertet som vist i tabell 1. Fra tabell 1 kan det også leses at strålingsfluksen øker med antall brukte mikro-lysdioder, men lysintensiteten forblir konstant på grunn av belysningsprofilimplikasjonene nevnt tidligere.

Interessant nok kan det også observeres at suksessraten for ni lysdioder med W def = 1 ms (figur 3a) og W def = 20 ms (figur 3d) ved defibrilleringsfrekvens f def = 18 Hz og f def = 20 Hz er sammenlignbart høye. Tatt i betraktning at gjennomsnittsfrekvensen til de induserte arytmiene er 22,55 ± 4,03 Hz, kan dette faktum tyde på at for ChR2 murine hjerter øker suksessraten betydelig jo nærmere pacingfrekvensen er til arytmifrekvensen. Dette er også vist i numeriske simuleringer26. Dette kan imidlertid ikke lett generaliseres fordi den dominerende frekvensen av komplekse arytmier er i stadig endring. For å illustrere dette viser figur 4 to forskjellige defibrilleringsforsøk med fdef = 14 Hz.. I begynnelsen av EKG-segmentet i figur 4a) og i henhold til EKG-signalets morfologi vises en ventrikkelflimmer (VF). Når mikro-LED-fotostimuleringen starter, blir flimmer omgjort til et mer ordnet mønster som er mer sannsynlig å være en ventrikulær takykardi (VT). Når mikro-LED-arrayet er slått av, tar de opprinnelige kaotiske VF-bølgene over igjen. Dermed blir arytmien ikke avsluttet. Selv om VF i dette eksemplet ikke kan avsluttes med de gitte parametrene, blir den forstyrret og den kan endres til et mer vanlig mønster (VT). Figur 4b Segment 1 viser at den dominerende frekvensen på 24 Hz øker litt til fotostimuleringen begynner og VF blir omgjort til en VT i segment 2, hvor den dominerende frekvensen faller til 14 Hz. Videre viser figur 4c en VT som kan avsluttes med samme f def som i figur 4a, men med en annen Wdef. Først endrer mikro-LED-fotostimuleringen morfologien til arytmien, for endelig å avslutte den med 1: 1 pacing-fangst fra den 19. pulsen og utover. Disse resultatene kan tyde på at fotodefibrilleringsparametrene, for eksempel Wdef, må tilpasse seg arytmiens morfologiendring over tid. Forsøkene som førte til disse resultatene ble utført uten bruk av Blebbistatin på grunn av den resulterende endringen i handlingspotensialvarighet (APD)27. Det ble derfor ikke utført optisk kartlegging i disse seriene.

Et annet sett med eksperimenter ble utført for optisk kartlegging ved hjelp av det rødforskjøvne potensiometriske fargestoffet (trinn 2.1.4). Optisk kartlegging med høyhastighetskameraer gjør det mulig å observere forplantende eksitasjonsbølger på overflaten av hjertet under sinusrytme (figur 5) og komplekse takyarytmier28. Siden brøkendringen av det potensiometriske fargestoffet er svært lavt, ble de oppnådde videoene etterbehandlet ved hjelp av et matematisk programmeringsspråk. Det første trinnet for å forbedre kvaliteten på de optiske signalene er å fjerne støy ved å bruke et Gaussisk utjevningsfilter med et standardavvik på σ = 1, etterfulgt av et båndpassfilter med hjørnefrekvenser fhøy = 0,1 Hz og flav = 70 Hz. Stoppbåndet ved fhøy fjerner langsomme endringer i signalet som ikke er relatert til sinusfrekvensen til hjertet som ligger mellom 3 Hz < fsinus < 8 Hz, mens stoppbåndet flow fjerner høyfrekvent støy som fanges opp av kameraet. Det er viktig å merke seg at både blått lysutslipp fra LED 1, LED 2 og fra mikro-LED-matrisen kan forårsake kryssprat og et svært høyt interferenssignal i optisk kartlegging. I tillegg ble det observert at ikke engang et veldig smalt båndpassfilter foran kameraet, med bølgelengde λfilterkamera , som nevnt i trinn 1.2.3, ville filtrere ut påvirkningen fra det blå lyset. Dette kan delvis skyldes eksitasjonsresponsen til selve fargestoffet. Vær derfor svært forsiktig når du velger optikk for optisk kartlegging. For videoanalyse måtte alle rammer der blått lys er registrert, forsømmes slik at det i mange tilfeller ikke er mulig å visualisere hjertet under fotostimulering, som også nevnt i en annen studie29.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for det elektriske og optiske oppsettet. (a) LED 1 og LED 2 gir en blå lyskilde som brukes til induksjon av arytmi og backup defibrillering. LED 3 brukes som eksitasjonslyskilde for det rødforskjøvne fargestoffet DI-4-ANBDQPQ. Det røde lyset rettes mot hjertet ved hjelp av det dikroiske speilet DM. Utslippslyset som vises i mørkerødt registreres av høyhastighetskameraet gjennom et utslippsfilter, som nevnt i teksten. LED 2- og EKG-elektroder vises ikke for enkelhets skyld. (b) Ett segment av det registrerte EKG-signalet vist i rødt. Mørk blå viser lyspulsene fra LED 1 og LED 2 med en frekvens f ind = 35 Hz og Wind = 4 ms som brukes til åindusere fibrillering. Umiddelbart etter ferdigstillelse av lysstimuleringen kan ventrikulær fibrillering (VF) observeres. Den mikro-LED-baserte fotostimuleringen vist i lyseblå (f def = 16 Hz, Wdef = 20 ms) avslutter arytmien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Hjerteforberedelse . (a) Åpen bryst av en mus som viser det intakte hjertet og de omkringliggende organene. (b) Eksplantert hjerte nedsenket i iskald Tyrodes løsning for videre forberedelse. (c) Musehjerte riktig festet til en stump nål. (d) Murine hjerte suspendert i Tyrode løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Eksperimentelt utvunnet suksessrate. Suksessrater for 30 mikro-LED-baserte fotostimuleringspulser ved bruk av tre, seks og ni lysdioder ved forskjellige pulsvarigheter W def og frekvenser fdef for N = 11. Feilfelt vist med standardfeil for gjennomsnittlig S.E.M. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Manipulering av hjerterytmen ved hjelp av fotostimulering . (a) Segment av et EKG-opptak av en ikke-avsluttet arytmi. b) EKG-spektrogram vist i panel a. Effektspektral tetthet (PSD) av segment (1) viser en arytmi med en dominerende frekvens på 24 Hz. Segment (2) fotostimulering med de viste parametrene. Det kan observeres at den dominerende frekvensen faller til 14 Hz. Segment (3) Mislykket avslutning og retur til arytmisk oppførsel med en dominerende frekvens på 24 Hz. (c) EKG av et vellykket defibrilleringsforsøk. (d) Spektrogram for vellykket avslutning vist i panel c. Segment (1) viser en ventrikulær takykardi (VT) med dominerende frekvens på 23 Hz. Segment (2) fotostimulering ved hjelp av de viste innstillingene. Segment (3) viser en vellykket avslutning, noe som fører til en normal sinusrytme med en grunnleggende frekvens på 3,5 Hz og de resulterende harmoniske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Optisk kartlegging av hele hjertet. Endringen av fluorescensintensitet under ett enkelt slag i hjertet i normal sinusrytme er vist. Hjertet ble plassert vendt mot kameraet slik at høyre og venstre ventrikkel er synlige (RV, LV). Stjernen viser pikselen der handlingspotensialet som vises på toppen ble tatt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Antall microLED Bestrålt område Aμled [mm2] Strålende fluks φ [mW] Lysintensitet LI [mW mm-2]
3 0.178 5,9 ± 0,47 33.11 ± 2,66
6 0.356 11,91 ± 0,84 33.42 ± 2,37
9 0.535 17.85 ± 0,61 33.39 ± 1,14

Tabell 1: Målt strålefluks av mikro-LED-matrisen og tilhørende lysintensitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En vellykket behandling av hjertetakyarytmier er nøkkelen til hjertebehandling. Imidlertid er de biofysiske mekanismene som ligger til grunn for arytmiinitiering, fortsettelse og avslutning ikke fullt ut forstått. Derfor har hjerteforskning som mål å optimalisere elektrisk sjokkterapi mot en mer skånsom avslutning av arytmier, og dermed øke livskvaliteten til pasienter 28,29,30,31. Lav energi elektriske tilnærminger lover en betydelig reduksjon av alvorlige bivirkninger, men kan fortsatt indusere uønsket muskel excitasjon. Hjerteoptogenetikk kan overvinne denne begrensningen og gi ikke bare en vev-mild termineringsteknikk, men også en fleksibel plattform for å undersøke arytmi-spesifikk målrettet kontroll av virvellignende eksitasjonsbølger i det intakte murinhjertet og i cellekulturer32,33.

Gitt den motivasjonen ble et robust fotostimuleringsoppsett, samt en protokoll designet og implementert, begge tilbyr et svært tilpasningsdyktig optisk system, som lett kan utvides til tredimensjonale panoramiske optiske kartleggingsstudier34.

Det kan vises at hjertearytmier med hell kan avsluttes med forskjellige suksessrater avhengig av parametrene som er valgt for fotostimulering, for eksempel det opplyste området på hjertet. De presenterte resultatene tyder på at økning av den bestrålte overflaten rekrutterte et kritisk antall kardiomyocytter som slukket den kaotiske aktiviteten ved ledningsblokk som også vist i22. I denne studien er energien som kreves for å fotodefibrillate E = 10,69 ± 0,37 mJ (ved bruk av ni mikro-lysdioder, 30 pulser og pulsbredde Wdef = 20 ms). Dette viser seg å være lavere enn tidligere rapportert i 22,24 med E 22 = 228,8 mJ og E 24 = 153,6 mJ, hvor et større område 22 eller hele hjertet 24 ble opplyst, henholdsvis. Likevel, sammenlignet med tilnærmingen vist i 35, hvor et godt avgrenset mønstret område er opplyst med 10 fotodefibrilleringspulser som resulterer i E 35 = 1,8 mJ, er fotodefibrilleringsenergien i denne studien betydelig høyere. I motsetning til de tre andre tilnærmingene, kunne en suksessrate over 90% ikke nås med den presenterte protokollen. En mulig årsak til redusert ytelse til tross for høyere fotodefibrilleringsenergi kan være at kompleksiteten i den underliggende arytmien ikke blir vurdert. Med hensyn til resultatene presentert i 35, hvor en høy termineringshastighet oppnås ved å belyse et lite område på hjertet, og samtidig måle den romlige-temporale dynamikken til en arytmi, kan den presenterte tilnærmingen sikkert forbedres ytterligere ved å vurdere tilbakemeldingskontroll, som reagerer med et annet mønster av mikro-LED-belysning avhengig av hjertets nåværende tilstand.  Videre ble det også vist at selv om arytmier ikke alltid kan avsluttes med den nåværende metoden, kan den iboende komplekse dynamikken forstyrres under fotostimulering som fører til en mer ordnet tidsmessig tilstand. Som vist i36, er termineringshastigheten signifikant forskjellig når man adresserer monomorfe (mer bestilte) og polymorfe (mindre bestilte) arytmier. Derfor kan det logiske skrittet mot en bedre defibrilleringshastighet være å påvirke hjertedynamikken under en VF-episode, gjøre arytmien til et mindre komplekst mønster og avslutte med et annet sett med pulser, og på denne måten bygge en to-trinns fotostimuleringstilnærming.

Når det gjelder perfusjonsprotokollen, finnes de mest kritiske trinnene i riktig ekstraksjon og klargjøring av hjertet, samt i riktig justering av den optiske kartleggingsoptikken. Involvering av optisk kartlegging krever strengt tatt riktig valg av fargespekter, passende eksitasjonslyskilder og velvalgte optiske filtre for kameraet29. Ellers kan de innspilte optiske signalene være for støyende og kan også inneholde kryssprat av fotostimulering med fargestoffeksitasjon. Senere analyser vil derfor kreve etterbehandling av signaler med flere analytiske filtre og bildeutjevning som ofte resulterer i forverring.

Et annet viktig skritt i denne protokollen er riktig og presis plassering av mikro-LED-matrisen. Siden sammenkoblingsledningen mellom mikro-LED-matrisen og driveren er veldig tynn og fleksibel, er det noen ganger utfordrende å sikre at matrisen vil være plassert på omtrent samme sted på hjerteoverflaten for hvert eksperiment. For å lette posisjonering og for å fikse den oppkjøpte posisjonen til mikro-LED-matrisen, ble en holder designet og skrevet ut i 3D, slik at matrisen kan festes til en mikromanipulator. Dette gir mer kontroll over bevegelsen av matrisen i Tyrodes løsning. Avhengig av materialet som er valgt for sammenkoblingsledningen til mikro-LED-matrisen, kan det hende at bruk av en holder ikke er nødvendig.

Dessuten er et annet kritisk trinn i protokollen tilsetning av pro-arytmi-legemidler, som for eksempel Pinacidil37. Siden flere kjemiske forbindelser er kjent for å endre hjertets fysiologiske respons, bør dette vurderes når man analyserer og tolker resultatene. Når det gjelder optisk kartlegging, bruker den foreslåtte protokollen Blebbistatin som en mekanisk frakobling. Dette har fordelen av å fjerne bevegelsesartefakter under opptak, men det kan også forlenge APD27. For å overvinne denne ulempen kan analysemetoder for bevegelsessporing under opptak betraktes som38,39. På denne måten vil den normale fysiologiske tilstanden til hjertet bli bevart, og et signal av høy kvalitet kan oppnås.

Selv om det ble bevist at den presenterte protokollen kan brukes til fotodefibrillering på flere steder, har den fortsatt noen begrensninger. Det har blitt funnet at flimmer i noen tilfeller ikke kan avsluttes ved mikro-LED-basert fotostimulering, men bare forstyrres, noe som resulterer i frekvensendringer. En hypotese er at de buktende bølgene på hjertet bare blir forskjøvet fra venstre ventrikkel, og regenererer seg selv i andre deler av hjertet. Sammenlignet med andre metoder som global belysning24, gir dagens metode en lavere suksessrate på grunn av en mindre dekning av hjertet. Selv om vi er sikre på at med riktig maskinvarebasert gjenkjenningsmetode for spiralaktivitet, er forbedring av termineringssuksessraten mulig.

Avslutningsvis etablerer det presenterte fotostimuleringssystemet et kraftig eksperimentelt verktøy for flere kardioversjonsmetoder og manipulasjonsstudier av hjertearytmi. Kunnskapen i dette systemet vil bli brukt til å undersøke og evaluere nye potensielle (foto) defibrilleringsprotokoller i klinisk relevante store dyremodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Marion Kunze og Tina Althaus for deres utmerkede tekniske støtte under eksperimenter. Forskningen som fører til resultatene har mottatt finansiering fra EUs syvende rammeprogram FP7/2007-2013 under tilskuddsavtale nummer HEALTH-F2-2009-241526. Støtte ble også gitt av det tyske senteret for kardiovaskulær forskning, DZHK eV (Project MD28), partnerstedet Goettingen, den tyske forskningsstiftelsen CRC 1002 (prosjekt C03) og Max Planck Society. Dette arbeidet ble delvis støttet av BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence finansiert av den tyske forskningsstiftelsen (DFG, tilskuddsnummer EXC 1086).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical Components
Blebbistatin TargetMol T6038 10 mM stock solution
BSA/Albumin Sigma-Aldrich A4919
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Carbogen Westfalen 50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ AAT Bioquest 21499 Dye for Optical Mapping
Glucose Sigma-Aldrich D9434 C6H12O6
Heparin LEO Pharma Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid Merck 1.09057.1000 HCl, 1 M stock solution
Isoflurane CP Pharma 1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride Merck 8.14733.0500 MgCl2
Monopotassium Phosphate Sigma-Aldrich 30407 KH2PO4
Pinacidil monohydrate Sigma-Aldrich P154-500mg 10 mM stock solution
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 KCl
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 NaCl
Sodium Hydroxide Merck 1.09137.1000 NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150 Biopac Systems MP150WSW data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C Biopac Systems ECG100C Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable RMS Heating System HK-5,0-12 Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply Thorlabs KPS101 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver Thorlabs LEDD1B T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode Hugo Sachs Elektronik BS4 73-0200 Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG Agilent Instruments A-2230 Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator Agilent Instruments A-2230 AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue Epoxy Technology EPO-TEK 353ND Two component epoxy
Fluoropolymer  Asahi Glass Co. Ltd. Cytop 809M Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist Merck KGaA AZ 5214E Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip  Cree Inc. C460TR2227-S2100 Blue micro-LED
Photoresist Merck KGaA AZ 9260 Thick Positive Photoresists
Polyimide UBE Industries Ltd. U-Varnish S Polyimide Solution
Silicone NuSil Technology LLC MED-6215 Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive John P. Kummer GmbH Epo-Tek 301-2 Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter Chroma Technology Corporation ET470/40x Blue excitation filter
Camera Photometrics Cascade 128+ High performance EMCCD Camera
Camera Objective Navitar DO-5095 Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror Semrock FF685-Di02-25x36 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter Semrock FF01-775/140-25 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink Advanced Thermal Solutions ATSEU-077A-C3-R0 Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2 LED Engin Osram LZ4-00B208 High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3 Thorlabs M625L3 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses LED Engin Osram LLNF-2T06-H LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter Thorlabs S120VC Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter
Red Filter Semrock FF02-628/40-25 BrightLine® single-band bandpass filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. 36th Annual Internation Conference IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Chicago, IL, , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. 28th IEEE Proceedigns. MEMS, Estoril, , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light - From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. 40thAnnual International Conference of IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Honolulu, HI, , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. mouser.de, LED Engin, [Online]. , Available: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208- 1531969.pdf (2020).
  21. thorlabs.com, thorlabs, [Online]. , Available: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020).
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Computing in Cardiology, Belfast, , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O'Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping - Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).

Tags

Medisin cardiac optogenetics optisk kartlegging LED DI-4-ANBDQPQ Blebbistatin channelrhodopsin-2 ChR2
Avansert hjerterytmehåndtering ved å bruke optogenetisk multi-site fotostimulering i murine hjerter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diaz-Maue, L., Steinebach, J.,… More

Diaz-Maue, L., Steinebach, J., Schwaerzle, M., Luther, S., Ruther, P., Richter, C. Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (174), e62335, doi:10.3791/62335 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter