Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Murin Kalplerde Optogenetik Çok Bölgeli Fotostimülasyon Uygulayarak İleri Kardiyak Ritim Yönetimi

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62335
Automatic Translation
*1,2, *1, 8,9, 1,3,4,6, 8,9, 1,5,6,7
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg
* These authors contributed equally

Summary

Bu çalışma, transgenik channelrhodopsin-2 (ChR2) farelerinin bozulmamış murin kalplerinin kardiyak ritmini, bir mikro-LED dizisi ile lokal fotostimülasyon ve epikardiyal membran potansiyelinin eşzamanlı optik haritalamasını kullanarak kontrol etmek için bir yöntem bildirmektedir.

Abstract

Ventriküler taşiaritmiler tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önemli bir nedenidir. Yüksek enerjili elektrik şokları kullanan elektriksel defibrilasyon şu anda hayatı tehdit eden ventriküler fibrilasyonun tek tedavisidir. Bununla birlikte, defibrilasyonun dayanılmaz ağrı, doku hasarı ve prognozun kötüleşmesi gibi yan etkileri olabilir, bu da daha yumuşak kardiyak ritim yönetimi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir tıbbi ihtiyacı gösterir. Enerji azaltıcı elektriksel yaklaşımların yanı sıra, kardiyak optogenetik, ışığa duyarlı membran iyon kanalları ve ışık darbeleri kullanarak kardiyak aktiviteyi etkilemek için güçlü bir araç olarak tanıtıldı. Bu çalışmada, Langendorff perfüze edilmiş sağlam murin kalplerinin başarılı fotostimülasyonu için sağlam ve geçerli bir yöntem, 3 x 3 mikro ışık yayan diyotlar dizisi (mikro-LED) uygulanan çok bölgeli pacing temelinde tanımlanacaktır. Epikardiyal membran voltaj dalgalarının eşzamanlı optik haritalanması, bölgeye özgü stimülasyonun etkilerinin araştırılmasına izin verir ve yeni indüklenen kardiyak aktiviteyi doğrudan yerinde değerlendirir. Elde edilen sonuçlar, defibrilasyonun etkinliğinin, kardiyak aritmi sırasında fotostimülasyon için seçilen parametrelere güçlü bir şekilde bağlı olduğunu göstermektedir. Kalbin aydınlatılmış bölgesinin sonlandırma başarısı için çok önemli bir rol oynadığı ve aritmi paternlerinin değiştirilmesi için aydınlatma sırasında kardiyak aktivitenin hedeflenen kontrolünün nasıl sağlanabileceği gösterilecektir. Özetle, bu teknik, kardiyak ritmin gerçek zamanlı geri besleme kontrolüne giden yolda yerinde mekanizma manipülasyonunu optimize etme imkanı ve bölgeye özgüllük açısından, spesifik olmayan elektrik şoku uygulamalarının kullanımına kıyasla kalp sistemine potansiyel zararı azaltmada yeni yaklaşımlar sunmaktadır.

Introduction

Aritmi sırasında mekansal-zamansal dinamiklerin erken araştırmaları, kardiyak fibrilasyon sırasındaki karmaşık elektriksel paternlerin vorteks benzeri dönen uyarma dalgaları tarafından yönlendirildiğini ortaya koymuştur1. Bu bulgu, aritmilerin altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler verdi ve bu da daha sonra miyokard 2,3,4'ün çok bölgeli uyarılmasına dayanan yeni elektriksel sonlandırma tedavilerinin geliştirilmesine yol açtı. Bununla birlikte, elektrik alan stimülasyonu kullanan tedaviler lokal değildir ve kas dokusu da dahil olmak üzere çevredeki tüm uyarılabilir hücreleri innerve edebilir, hücresel ve doku hasarına ve dayanılmaz ağrıya neden olabilir. Elektriksel tedavilerin aksine, optogenetik yaklaşımlar, kardiyomiyosit aksiyon potansiyellerini yüksek uzamsal ve zamansal hassasiyetle uyandırmak için spesifik ve doku koruyucu bir teknik sağlar. Bu nedenle, optogenetik stimülasyon, kardiyak fibrilasyon sırasında kaotik aktivasyon paternlerinin minimal invaziv kontrolü için potansiyele sahiptir.

Işığa duyarlı iyon kanalı channelrhodopsin-2'nin (ChR2) genetik manipülasyon 5,6,7 yoluyla uyarılabilir hücrelere sokulması, fotostimülasyon kullanılarak uyarılabilir hücrelerin membran potansiyelinin depolarizasyonunu sağlamıştır. Nöronal ağların aktivasyonu, kardiyak aktivitenin kontrolü, görme ve işitmenin restorasyonu, omurilik yaralanmalarının tedavisi ve diğerleridahil olmak üzere çeşitli tıbbi uygulamalar geliştirilmiştir 8,9,10,11,12,13,14. ChR2'nin kardiyolojide uygulanması, milisaniye yanıt süresi15 nedeniyle önemli bir potansiyele sahiptir ve bu da onu aritmik kardiyak dinamiklerin hedeflenen kontrolü için çok uygun hale getirmektedir.

Bu çalışmada, transgenik bir fare modelinin sağlam kalplerinin çok bölgeli fotostimülasyonu gösterilmiştir. Özetle, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) kapsamında transgenik bir alfa-MHC-ChR2 fare hattı kurulmuş ve Prof. S. E. Lehnart tarafından sağlanmıştır. Genel olarak, alfa-MHC kontrolü altında Cre-rekombinaz eksprese eden transgenik yetişkin erkek C57 / B6 / J, dişi B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm27.1 (CAG-COP4 * H134R / tdTomato) Hye / J ile çiftleşmek üzere eşleştirildi. Kardiyak STOP kaseti ikinci nesilde silindiğinden, yavrular stabil bir MHC-ChR2 ekspresyonu gösterdi ve kardiyak ışığa duyarlı kolonileri korumak için kullanıldı. Tüm deneyler, 36-48 haftalıkken her iki cinsiyetten yetişkin farelerle yapıldı. Aydınlatma, silikon bazlı mahfaza ve kısa optik cam elyaflarının uygulanmaması dışında,16,17'de açıklandığı gibi imal edilen 3 x 3 mikro-LED dizisi kullanılarak elde edilir. Kardiyak bir uygulamada ilk kullanımı18 yılında bulunur. Benzer bir imalat teknolojisine dayanan doğrusal bir mikro-LED dizisi, kalp hızı19 için nüfuz edici bir prob olarak uygulanmıştır. Mikro LED'ler, 550 μm'lik bir aralıkta 3 x 3'lük bir dizilim halinde düzenlenmiştir ve çok küçük bir alanda hem yüksek uzamsal çözünürlük hem de yüksek radyant gücü sağlar. Yazarlar bu çalışmada, yeni anti-aritmik tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinin yolunu açabilecek çok yönlü bir yerel çok bölgeli fotostimülasyon göstermektedir.

Aşağıdaki deneysel protokol, kanüle aortun perfüzyon girişi olarak işlev gördüğü retrograd Langendorff perfüzyon ex vivo'yu içerir. Uygulanan perfüzyon basıncı ve kardiyak kasılma nedeniyle perfüzyon, aorttan ayrılan koroner arterlerden akmaktadır. Sunulan çalışmada, kalp, perfüzyon rezervuarlarının 1 m yüksekliğe, 73.2 mmHg'ye eşdeğer olarak 2.633 ± 0.583 mL / dak akış hızına ulaşmasıyla elde edilen sabit bir basınç ayarı kullanılarak perfüze edilir. Deney sırasında iki çeşit Tyrode çözeltisi perfüzyon olarak kullanılır. Düzenli Tyrode çözeltisi kararlı bir sinüs ritmini desteklerken, Low-K + Tyrode çözeltisi, murin kalplerinde aritmi indüksiyonunu sağlamak için Pinacidil ile karıştırılır. Altıgen bir su banyosunun kullanılması, kalbin altı farklı düzlemsel pencereden gözlemlenmesine izin verir ve birkaç optik bileşenin kırılma ile daha az bozulma ile birleştirilmesine izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler, Alman mevzuatı, yerel hükümler ve Avrupa Laboratuvar Hayvanları Bilimi Dernekleri Federasyonu'nun (FELASA) tavsiyelerine uygun olarak hayvan refahı yönetmeliğini sıkı bir şekilde takip etti. Hayvan deneylerinin onaylanması için yapılan başvuru, sorumlu hayvan refahı otoritesi tarafından onaylanmış ve tüm deneyler hayvan refahı temsilcilerimize bildirilmiştir.

1. Deney hazırlama ve materyalleri

  1. Optik haritalama kurulumu
    NOT: Optik kurulum ve elektrik kurulumu Şekil 1'de gösterilmiştir. Optik ve elektrik kurulumunda kullanılan tüm bileşenler Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak listelenmiştir.
    1. Aritmi indüksiyonu ve yedek defibrilasyon için LED 1 ve LED 2 kullanın. ChR26'nın uyarma dalga boyunun zirvesi olan 475 nm'ye yakın λmavi dalga boyuna sahip yüksek güçlü LED'leri seçin. Optik spektrumu daha da daraltmak için 470 ± 20 nm bandpass filtresi kullanın.
      NOT: Bu çalışmada, veri sayfası20'ye göre, LED 1 ve LED 2, 3,9 ila 5,3 W tipik bir radyant akıya sahiptir.
    2. Optik haritalama için epikardiyumu, λ kırmızı = 625 nm merkez dalga boyuna ve 700 mW 21 radyant akıya sahip ışık yayan yüksek güçlükırmızı bir LED (Şekil1'de LED 3) ile aydınlatın. Kırmızı ışık, 628 ± 20 nm bandpass filtresi ile filtrelenir ve λ DM = 685 nm kesme dalga boyuna sahip uzun geçişli dikroik ayna (DM ) tarafından yansıtılır.
    3. Sadece kardiyak aktivitenin floresan emisyonunu kaydetmek için kamera hedefinin önünde λfiltre kamı = 775 ± 70 nm olan bir emisyon filtresi kullanın. Düşük ışıklı uygulamalar için çok uygun olan hızlı bir hedef kullanın.
      NOT: Bir fare kalbinin fibrilasyon frekansı 20 ila 35 Hz arasında değişir; bu nedenle, 1 ila 2 kHz veya daha yüksek bir frekansta kayıt yapmak için yeterince hızlı bir kamera kullanın.
  2. Mikro-LED dizisi
    NOT: Burada uygulanan mikro-LED dizileri,16,17 başka bir yerde daha ayrıntılı olarak açıklandığı gibi mikro sistem işleme kullanılarak gerçekleştirilir.
    1. Spin, 5 μm kalınlığında bir poliimid (PI) tabakayı 4 inç silikon substratlar üzerine (tek tarafı cilalı, 525-μm kalınlığında) kaplayın.
    2. Bu PI tabakasını azot atmosferi altında maksimum 450 °C sıcaklıkta kürleyin. Maksimum sıcaklığı 10 dakika boyunca sabit tutun.
    3. Ultraviyole (UV) litografi kullanarak bir görüntü tersine çevrilmiş fotodirenci (PR) biriktirin ve desenleyin ve püskürtün, 250 nm ince bir platin tabaka (Pt) biriktirin.
    4. Bu Pt bazlı metalizasyonu, maskeleme tabakası görevi gören desenli PR ile 1 μm kalınlığında altın (Au) bir tabakayı elektro kaplama yaparak kalınlaştırın.
    5. İkinci bir PI katmanını spin kaplamadan önce, gofreti ilk PI tabakası ve Au-elektrolize metalizasyonu ile PI tabakasının yüzeyini kimyasal olarak aktive eden bir oksijen plazmasına maruz bırakın.
    6. İkinci PI katmanını 450 ° C'de tekrar kürleyin, bir PR katmanını modellemek için UV litografisi uygulayın ve desenli PR'yi maskeleme katmanı olarak kullanarak reaktif iyon aşındırma (RIE) ile mikro-LED çipleri ve ara yüzey baskılı devre kartı (PCB) için dizinin temas pedlerini açın.
      NOT: Bu RIE işlem adımlarında, kontak pedi açıklıklarını ve iki boyutlu (2B) mikro-LED dizisinin dış şeklini tanımlamak için sırasıyla 10 ve 30 dakika boyunca 200 W ve 100 W uygulanması önerilir.
    7. PR'yi çözücüler ve plazma aşındırma kullanarak sıyırın. Ek 6 μm kalınlığında altın tabakayı elektro kaplama yaparak temas pedlerini daha da kalınlaştırın.
    8. Mikro-LED çipleri, bir flip-chip bağlayıcı kullanarak temas pedlerine takın.
    9. PI yüzeyini bir oksijen plazmasında etkinleştirin ve mikro-LED çiplerini solventsiz bir yapıştırıcı ile doldurun. Daha sonra yapıştırıcıyı 120 ° C'de 12 saat kürleyin.
    10. Mikro-LED çipleri kapsüllemek için, Argon ile başka bir plazma işlemi gerçekleştirin ve manuel olarak ince bir floropolimer tabakası uygulayın. Bu tabakayı 1 saat boyunca 80 ° C'de önceden kürleyin.
    11. Mikro-LED dizisini altta yatan floropolimer tabakasına silikon yapışmasını iyileştirmek için kullanılan bir oksijen plazmasına maruz bıraktıktan sonra silikonu son kapsülleme tabakası olarak manuel olarak uygulayın. Silikon tabakayı her biri 1 saat boyunca 80 °C ve 180 °C'de kürleyin. Bu son kürleme adımları aynı zamanda floropolimer tabakasını tamamen iyileştirir.
    12. PI substratının temas pedlerini, dizinin harici bir enstrümantasyona birbirine bağlanması için şerit konektörleri taşıyan baskılı bir devre kartına lehimleyin. PCB üzerindeki lehim pedlerini bir yapıştırıcı kullanarak örtün.
  3. Elektrik tesisatı
    1. Kalbin elektriksel aktivitesini sürekli izlemek için bir elektrokardiyogram (EKG) kaydetmek için uygun elektrotlar, örneğin gümüş / gümüş-klorür elektrotları veya Monofazik Eylem Potansiyeli (MAP) elektrotları ve bir EKG amplifikatörü kullanın. Ayrıca, elde edilen tüm elektrik sinyallerini kaydetmek için uygun bir toplama cihazı (AD) kullanın.
    2. Her aygıta uygulanan maksimum akımı yönetebilen yüksek güçlü LED'ler (LED 1, LED 2 ve LED 3) için çok uygun bir sürücü seçin. LED sürücülerin çıkışını doğru bir şekilde kontrol etmek için rastgele bir işlev üreteci (AFG) kullanın.
    3. Mikro LED dizisinden akan akımı kontrol etmek için çok kanallı bir LED sürücüsü kullanın. Birden fazla çıkışa sahip bir AFG de bu görev için uygundur.
      NOT: Akımı mikro-LED'in maksimum akımıyla sınırlayan LED sürücülerin seçilmesi önerilir, aksi takdirde diyotlar hasar görebilir. Çok kanallı bir mikro-LED sürücünün bir örneği başka bir çalışmada açıklanmıştır18. Gerekirse, mikro LED ayarlarını uzaktan denetlemek için AFG veya başka bir LED sürücüsü bir bilgisayara bağlanabilir. Bu durumda, LED sürücüsünü seçtiğiniz iletişim protokolüyle bilgisayara bağlayın, örneğin Genel Amaçlı Arabirim Veri Yolu (GPIB) veya seri bağlantı.

   

2. Deneysel prosedürler

  1. Çözelti hazırlama
    1. Tyrode çözeltisini hazırlayın: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1.8 mM CaCl 2, 1.2 mM KH 2 PO4, 5.6 mM Glikoz,% 0.1 BSA/ Albümin.
    2. Low-K+ Tyrode çözümünü hazırlayın: Low-K+ Tyrode'lar, KCl miktarının sadece yarısı eklenmesi dışında normal Tyrode çözeltisiyle aynı şekilde yapılır (4 mM KCl yerine 2 mM).
      NOT: 3 saat süren bir deney için genellikle 2-3 L Low-K+ Tyrode (ayrıca optik haritalama yapılırsa Blebbistatin (Adım 2.1.5) ile karıştırılır) ve 1-2 L normal Tyrode yeterlidir.
    3. 100 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için22'de açıklandığı gibi aritmi indüksiyon işlemini kolaylaştırmak için Low-K + Tyrode çözeltisine Pinacidil ekleyin. Pinacidil'i kullanırken koruyucu laboratuvar eldivenleri giyin.
    4. Düzenli Tyrode çözeltisi ile 1 mL 50 μM DI-4-ANBDQPQ hazırlayın. Fotobeyazlatmayı önlemek için boyayı ışıktan koruyun.
    5. 10 mM'lik bir Blebbistatin stok çözeltisi yapın. Optik haritalama için, 5 μM'lik bir çözelti elde etmek için Blebbistatin'i 100 mM Pinacidil-Tyrode çözeltisi (Adım 2.1.3) ile karıştırın. Blebbistatin'i kullanırken koruyucu laboratuvar eldivenleri giyin.
      NOT: Optik haritalama başlayana kadar hem boyayı hem de Blebbistatin çözeltisini bir kenara bırakın.
  2. Langendorff perfüzyonu
    NOT: Kurulum, iki Tyrode çözümü için iki rezervuardan oluşur. Üç yönlü musluklara sahip tüplerle bir kabarcık tuzağına bağlanırlar. Kalp daha sonra bir Luer kilit konektörü ile kabarcık tuzağına bağlanır ve daha sonra altıgen bir su banyosunda askıya alınır. Su banyosu, sırayla, kullanılmış Tyrode çözeltisini toplamak için bir atık kabına bağlanır.
    1. Her deneyden önce tüm tüpleri tamamen demineralize su ile temizleyin.
    2. Deneye başlamadan önce her iki Tyrode çözeltisini de oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Karbojenli (%5 CO 2ve % 95O2) havalandırın. Tyrode çözeltilerinin pH değerini NaOH ile 7,4'e ayarlayın.
    3. Her Tyrode çözeltisinin 500 mL'sini ilgili rezervuara doldurun ve tüplerde veya kabarcık tuzağında daha fazla sıkışmış hava kabarcığı görülmeyene kadar Tyrode'un çözeltisini perfüzyon sisteminden geçirerek tüplerin ve kabarcık tuzağının havasını giderin.
    4. Perfüzyonun pH'ının daha sonra perfüzyon sırasında sabit kalmasını sağlamak için rezervuarlardaki tüm deney boyunca Tyrode çözeltilerini Karbojenle havalandırmaya devam edin.
    5. Perfüzyon sistemini bir su ısı pompası ile 37 ° C'ye ısıtın. Su geçirmez bir ısıtma kablosu gibi ek bir ısıtma elemanı kullanarak su banyosu içinde perfüzyon sıcaklığını sabit tutun.
      NOT: Deney sırasında, Tyrode'un rezervuarlarını boş çalışmadan önce yeniden doldurmak çok önemlidir. Aksi takdirde, hava kabarcıkları kalbe girebilir, bu da damarları tıkayabilir ve iskemiye yol açabilir.
  3. Fare Hazırlığı
    1. Kalp izolasyon prosedüründen 30 dakika önce deri altından 0.1 mL 500 yani Heparin enjekte edin.
    2. 6 cm'lik bir Petri kabını ve 2 mL'lik bir şırıngayı buz gibi soğuk Tyrode çözeltisi ile doldurun. Stereoskopik mikroskop altına yerleştirin.
    3. 2 dakika boyunca doymuş bir İzofluran ortamı ile farelerin kısa süreli anestezisini ve daha sonra derhal servikal çıkığı gerçekleştirin.
      NOT: Yeterli anesteziyi doğrulamak için negatif ayak parmakları arası refleksin kontrol edilmesi kesinlikle gereklidir.
    4. Göğsü açın, başka bir yerde açıklandığı gibi kalbi çıkarın23 ve buz gibi soğuk Tyrode çözeltisi ile 6 cm'lik Petri kabına yerleştirin. Kardiyak atım, sıcaklık düşüşü nedeniyle azalacaktır.
    5. İnce hazırlığı, başka bir yerde detaylandırıldığı gibi stereoskopik bir mikroskop altındayapın 23. Aortu künt iğneye takın ve damarı dikiş malzemesiyle sabitleyin.
    6. Bir kontrol olarak, buz gibi soğuk Tyrode'un solüsyonunu iğneden kalbe enjekte edin ve kalbin sıkıca monte edildiğini kontrol edin. Bu adım aynı zamanda kalpten kalan kanı da durular.
    7. Monte edilmiş kalbi perfüzyon sistemine aktarın. İğneyi kabarcık tuzağına bağlarken havanın kalbe girmesini önlemek için perfüzyonun aktığından emin olun. Kalbin su banyosunda Tyrode çözeltisi ile kaplı olup olmadığını kontrol edin. Adım 2.3.4, 2.3.5 ve 2.3.7 Şekil 2'de gösterilmiştir.
    8. Kalbin birkaç dakika içinde atmaya başladığından emin olun. Kalbin 15 ila 20 dakika boyunca perfüzyon kurulumuna adapte olmasına izin verin, ardından optik haritalama yapılacaksa, Pinacidil ile düşük K + Tyrode çözeltisine (Adım 2.1.3) sırasıyla Pinacidil ve Blebbistatin ile düşük K + Tyrode çözeltisine (Adım 2.1.5) geçin.
  4. Aritmi indüksiyonu ve optik defibrilasyon
    1. İyi sinyal kalitesi sağlamak için EKG elektrotlarından birini kalp yüzeyine mümkün olduğunca yakın yerleştirin. İkinci EKG elektrodunu Tyrode çözeltisinde askıya alın. Edinilen EKG'nin tercih edilen AD tarafından kaydedildiğinden emin olun.
    2. Mikro-LED dizisini çalışmanın ilgi alanına, örneğin sol ventriküle yerleştirin.
    3. Perfüzyonu Pinacidil ile düşük K + Tyrode'lara değiştirin ve kalbi 15 ila 30 dakika boyunca perfüze edin.
    4. Aritmi indüklemek için, kalbi LED 1 ve LED 2 ile, 25 ila 35 Hz frekans find, 2 ila 15 ms darbe Wind ve 2,8 mW mm-2 ışık yoğunluğu LIopt_ind ile 20 ila 50 ışık darbesinden oluşan bir trenle aydınlatın.
    5. Aritmi indüklenene kadar işlemi tekrarlayın.
      NOT: EKG sinyalinde aritmilerin tanımlanması kolaydır, çünkü sinyalin frekansı ve morfolojisi normal sinüs ritminden farklıdır. Aritmi sonraki 5 saniye içinde sona ererse, kendi kendine sonlanan olarak sınıflandırın ve yeni bir indüksiyon girişimi başlatın.
    6. Sürekli bir aritmi görsel olarak tespit edildikten sonra, 15 mA'lık bir darbe akımında dizinin üç, altı veya dokuz mikro LED'ini kullanarak, farklı genişliklerde W def ve frekansları fdef olan birdarbe patlaması uygulayın I darbe, ışık yoğunluğuna LIμLED = 33.31 ± 2.05 mW mm-2'ye kadar verir.
    7. Beş mikro-LED dizi tabanlı defibrilasyon denemesinden sonra aritmi devam ederse, girişimi başarısız olarak sınıflandırın ve yedek defibrilasyona başlayın.
    8. Yedek defibrilasyon için, mikro LED dizisi için ayarlanan zamanlama parametrelerinin aynısını kullanarak LED 1 ve LED 2'yi kullanın.
      NOT: Kalp tüm deney süresi boyunca iskemik ve metabolik strese maruz kaldığından, yedek defibrilasyonda bile aritmi sonlandırma girişimlerinin başarısız olması mümkündür. Bu olduğunda, perfüzyon solüsyonunu normal Tyrode'lara değiştirin ve kalbin 5 ila 10 dakika iyileşmesine izin verin. EKG sinüs ritmine döndüğünde, Adım 2.4.3'teki protokolü tekrar tekrarlayın.
  5. Optik Haritalama
    1. Kalbi Adım 2.1.5'te hazırlanan Blebbistatin çözeltisi ile perfüze edin ve mekanik ayrılma gerçekleşene kadar bekleyin. Bu, kalp atmayı bıraktığında gerçekleştirilir, ancak bir EKG sinyali hala ölçülebilir.
      NOT: Blebbistatin çözeltisinin belirtilen konsantrasyona karıştırılması ve kalbin bu çözelti ile perfüze edilmesi, tüm deney boyunca elektriksel aktiviteden ayrılan kardiyak mekanik aktiviteyi korur.
    2. 1 mL gerilim boyası DI-4-ANBDQPQ'yu (Adım 2.1.4'te hazırlanmıştır) Langendorff perfüzyonunun kabarcık tuzağında bir bolus olarak verin. Boyanın kalbi düzgün bir şekilde delmesine izin vermek için 5 ila 10 dakika bekleyin.
      NOT: Kayıt yapılmadığında kırmızı ışığı kapatarak boyanın fotobeyazlatılmasını önleyin. Kaydın sinyal-gürültü oranı çok küçülürse (alınan sinyal çok gürültülüyse), 2.1.4 ve 2.5.2 numaralı adımları tekrarlayın.
    3. Fotoğraf makinesini kalp yüzeyine odaklayın, LED 3'ü açın ve 1,27 mW mm-2 optik güç uygulayın.
    4. Laboratuvar ışıklarını kapatın ve kayda başlayın. Elde edilen sinyalin frekansını kaydedilen EKG'nin frekansı ile karşılaştırarak optik bir sinyalin alındığından emin olun. Bu, elde edilen optik sinyalin tamamen kalbin elektriksel aktivitesi ile ilgili olmasını sağlar.
      NOT: Boyanın yaydığı floresan ışığı çok hafta olduğundan, optik haritalama karanlık bir odada yapılır. Bu, diğer ışık kaynaklarından gelen sinyal parazitini önler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokol, LED 1 ve LED 2 (Şekil 1) tarafından üretilen fotostimülasyon darbelerini kullanarak sağlam murin kalplerde ventriküler aritmilerin indüklenmesine izin verir ve 25 Hz ile 35 Hz arasında bir frekans f ind ve 2 ms ile 10 ms arasında bir nabız süresi Wind. Bu kadar hızlı ışık darbelerinin amacının kalp ritmini yakalamak değil, kardiyak aktivitenin dengesini bozmak olduğunu, böylece düzensiz elektrik dalgalarının üretilebileceğini ve bunun da bir aritmi kolaylaştırdığını lütfen unutmayın. Elektriksel stimülasyon ile indüksiyona göre ışıkla aritmi indüklemenin avantajı, EKG'de hiçbir artefaktın provoke edilmemesi, elde edilen sinyali kısıtlama olmaksızın post-analiz etme ve hatta hızlı tempo sırasında kalbin elektriksel tepkisini değerlendirme imkanı sağlamasıdır, bu gerçek aynı zamanda foto-defibrilasyon sırasında kalp davranışını gözlemleme imkanı sağlar. Bu, elektriksel indüksiyon veya defibrilasyon yöntemleri ile mümkün değildir. Bununla birlikte, kullanılan kurulum harici yüksek güçlü LED'lerin kullanılmasına izin vermiyorsa, örneğin, yer kısıtlamaları nedeniyle, başka bir yerde gösterildiği gibi aritmi indüklemek için kalbe ek bir pacing elektrodu yerleştirilebilir 3,22,24.

Fibrilasyon indüklendikten sonra aritmi, devam etmesini sağlamak için en az 5 saniye sürmelidir, daha sonra mikro-LED tabanlı defibrilasyon girişimleri başlatılır. Kardiyak aritmi, örneğin temel siklus uzunluğu veya baskın frekans, genlik ve morfoloji gibi ana parametreleri sürekli değiştiğinden ve hangi fotodefibrilasyon parametrelerinin en iyi sonucu sağladığını tahmin etmek güncel olmadığından, frekans, nabız genişliği arasında bir ilişki olup olmadığını anlamak büyük ilgi görmüştür. fotostimülasyon alanı ve sonlandırma oranı. Bu nedenle, farklı frekanslarda fdef, mikro-LED sayısı ve Wdef darbe süreleri ile bir dizi deney test edildi ve Şekil 3'te gösterildiği gibi N = 11 fareler için başarı oranı çıkarıldı.

1 ila 20 ms süreli darbelerin farklı başarı oranları ile defibrillenebileceği gösterilebilir(Şekil 3). Adım 2.4.6'da belirtildiği gibi, her fotostimülasyon darbesi sırasında ışık yoğunluğu LIμLED sabit tutulduğundan ve üç mikro-LED'in dokuza karşı başarı oranı önemli ölçüde daha düşük olduğundan, sunulan sonuçlar kalpte kaplanan alanın, mikro-LED'lerin sayısının ve dolayısıyla uygulanan toplam radyant akının defibrilasyonun sağlanmasında çok önemli faktörler olduğunu göstermektedir. Dizideki her mikro-LED'in bir Lambertian ışık kaynağı olduğu ve dokuya yaklaşık mesafenin sıfır olması için doğrudan kalbin yüzeyine yerleştirildiği göz önüne alındığında, tek bir mikro-LED kullanıldığında kalpteki aydınlatılmış alanın ışıma konturunun AμLED = 0.059 mm²'ye eşdeğer olduğu varsayılabilir, düz dikdörtgen LED'ler için25'te de gösterildiği gibi. Ayrıca, bazı fotonlar mikro-LED'i kenarlardan yanal olarak terk edebilse de, bunların toplam ışık yoğunluğuna katkısı o kadar küçük kabul edilir ki, etkileri ihmal edilebilir. Dizinin ışınlanmış ışığını ölçmek için, yazarlar mikro-LED dizisinden gelen radyant akıyı ticari bir güç ölçerle ölçtüler ve Tablo 1'de gösterildiği gibi kalbe ulaşan ışık yoğunluğunu hesapladılar. Tablo 1'den , radyant akının kullanılan mikro-LED'lerin sayısıyla arttığı, ancak daha önce bahsedilen aydınlatma profili etkileri nedeniyle ışık yoğunluğunun sabit kaldığı da okunabilir.

İlginçtir ki, defibrilasyon frekansında W def = 1 ms (Şekil 3a) ve W def = 20 ms (Şekil 3d) olan dokuz LED'in başarı oranının f def = 18 Hz ve f def = 20 Hz ile karşılaştırılabilir derecede yüksek olduğu da gözlemlenebilir. İndüklenen aritmilerin ortalama sıklığının 22.55 ± 4.03 Hz olduğu göz önüne alındığında, bu gerçek ChR2 murin kalpleri için başarı hızının önemli ölçüde arttığını gösterebilir. Bu aynı zamanda sayısal simülasyonlarda da gösterilmiştir26. Bununla birlikte, bu kolayca genelleştirilemez, çünkü karmaşık aritmilerin baskın frekansı sürekli değişmektedir. Bunu göstermek için, Şekil 4, fdef = 14 Hz ile iki farklı defibrilasyon girişimini göstermektedir. Şekil 4a'da EKG segmentinin başlangıcında ve EKG sinyalinin morfolojisine göre ventriküler fibrilasyon (VF) gösterilmiştir. Mikro-LED fotostimülasyon başladığında, fibrilasyon ventriküler taşikardi (VT) olma olasılığı daha yüksek olan daha düzenli bir modele dönüştürülür. Mikro-LED dizisi her kapatıldığında, orijinal kaotik VF dalgaları tekrar devralır. Böylece aritmi sonlandırılmaz. Bu örnekte VF verilen parametrelerle sonlandırılamamasına rağmen, rahatsız edilir ve daha düzenli bir desene (VT) değiştirilebilir. Şekil 4b Segment 1, fotostimülasyon başlayana kadar 24 Hz'lik baskın frekansın hafifçe arttığını ve VF'nin, baskın frekansın 14 Hz'e düştüğü Segment 2'de bir VT'ye dönüştüğünü göstermektedir. Ayrıca, Şekil 4c, Şekil 4a'dakiyle aynı f def ile sonlandırılabilen, ancak farklı bir Wdef ile sonlandırılabilen birVT'yi göstermektedir. İlk olarak, mikro-LED fotostimülasyon aritmi morfolojisini değiştirir ve sonunda 19. darbeden itibaren 1: 1 tempolu yakalama ile sonlandırır. Bu sonuçlar, fotodefibrilasyon parametrelerinin, örneğin Wdef'in, zaman içinde aritminin morfoloji değişikliğine uyum sağlaması gerektiği anlamına gelebilir. Bu sonuçlara yol açan deneyler, eylem potansiyeli süresinde (APD) 27 ortaya çıkan değişiklik nedeniyle Blebbistatin kullanılmadan gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle, bu serilerde optik haritalama yapılmamıştır.

Kırmızıya kaymış potansiyometrik boya kullanılarak optik haritalama için başka bir deney seti gerçekleştirildi (Adım 2.1.4). Yüksek hızlı kameralarla optik haritalama, sinüs ritmi (Şekil 5) ve karmaşık taşiaritmiler28 sırasında kalbin yüzeyinde yayılan uyarma dalgalarını gözlemlemeyi sağlar. Potansiyometrik boyanın fraksiyonel değişimi çok düşük olduğundan, elde edilen videolar matematiksel bir programlama dili kullanılarak sonradan işlenmiştir. Optik sinyallerin kalitesini artırmanın ilk adımı, σ = 1 standart sapmasına sahip bir Gauss yumuşatma filtresi uygulayarak gürültüyü ortadan kaldırmak, ardından köşe frekansları fyüksek = 0,1 Hz ve fdüşük = 70 Hz olan bir bandpass filtresi uygulamaktır. Fyüksekliğindeki durdurma bandı, kalbin 3 Hz < f sinüs frekansı ile 8 Hz arasında kalansinüs frekansı ile ilgili olmayan sinyaldeki yavaş değişiklikleri <, fdüşük durdurma bandı ise kamera tarafından yakalanan yüksek frekanslı gürültüyü ortadan kaldırır. Hem LED 1, LED 2 hem de mikro-LED dizisinden gelen mavi ışık emisyonlarının çapraz konuşmaya ve optik haritalamada çok yüksek bir parazit sinyaline neden olabileceğini belirtmek önemlidir. Ek olarak, kameranın önünde, Adım 1.2.3'te belirtildiği gibi, dalga boyu λfiltre-kam ile çok dar bir bandpass filtresinin bile mavi ışığın etkisini filtreleyemeyeceği gözlenmiştir. Bu kısmen boyanın kendisinin uyarma tepkisinden kaynaklanabilir. Bu nedenle, optik haritalama için optik seçerken çok dikkatli olun. Video analizi araçları için, mavi ışığın kaydedildiği tüm karelerin ihmal edilmesi gerekiyordu, böylece birçok durumda, başka bir çalışmada da belirtildiği gibi, fotostimülasyon sırasında kalbi görselleştirmek mümkün değildir29.

Figure 1
Şekil 1: Elektrik ve optik kurulumun şeması. (a) LED 1 ve LED 2, aritmi indüksiyonu ve yedek defibrilasyon için kullanılan mavi bir ışık kaynağı sağlar. LED 3, kırmızıya kayan boya DI-4-ANBDQPQ için bir uyarma ışık kaynağı olarak kullanılır. Kırmızı ışık, dikroik ayna DM aracılığıyla kalbe yönlendirilir. Koyu kırmızı renkte gösterilen emisyon ışığı, metinde belirtildiği gibi yüksek hızlı kamera tarafından bir emisyon filtresi aracılığıyla kaydedilir. LED 2 ve EKG elektrotları basitlik için gösterilmemiştir. (b) Kaydedilen EKG sinyalinin kırmızı renkle gösterilen bir segmenti. Koyu mavi, LED 1 ve LED 2'den gelen ışık darbelerini f ind = 35 Hz ve Wind = 4 ms frekansında fibrilasyonuindüklemek için kullanılan bir frekansta gösterir. Işık uyaranını bitirdikten hemen sonra, ventriküler fibrilasyon (VF) gözlenebilir. Açık mavi renkte gösterilen mikro-LED tabanlı fotostimülasyon (f def = 16 Hz, Wdef = 20 ms) aritmi başarıyla sonlandırır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Kalp hazırlığı . (a) Sağlam kalbi ve çevresindeki organları gösteren bir farenin açık göğsü. (b) Daha fazla hazırlık için buz gibi soğuk Tyrode'un çözeltisine batırılmış ekşimiş kalp. (c) Fare kalbi künt bir iğneye düzgün bir şekilde bağlanmıştır. (d) Murine'in kalbi Tyrode'un çözümünde askıya alındı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Deneysel olarak çıkarılan başarı oranları. Farklı darbe sürelerinde üç, altı ve dokuz LED kullanan 30 mikro-LED tabanlı fotostimülasyon darbesi için başarı oranları W def ve N = 11 için fdef frekansları. Ortalama S.E.M.'nin standart hatasıyla gösterilen hata çubukları. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Fotostimülasyon yoluyla kardiyak ritmin manipülasyonu . (a) Sonlandırılmamış bir aritmi EKG kaydının segmenti. (b) Panel a'da gösterilen EKG'nin spektrogramı. Segment (1)'in güç spektral yoğunluğu (PSD), baskın frekansı 24 Hz. olan bir aritmi gösterir. Başarılı bir defibrilasyon girişiminin baskın frekansının 14 Hz. Segment (3) Başarısız sonlandırma ve baskın frekans 24 Hz. (c) EKG'si ile aritmik davranışa geri döndüğü gözlenebilir. (d) Panel c'de görüntülenen başarılı sonlandırmanın spektrogramı. Segment (1), baskın frekansı 23 Hz olan bir ventriküler taşikardi (VT) gösterir. gösterilen ayarları kullanarak segment (2) fotostimülasyonu. Segment (3), 3.5 Hz'lik temel bir frekansa sahip normal bir sinüs ritmine ve bunun sonucunda ortaya çıkan harmoniklere yol açan başarılı bir sonlandırma görüntüler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Tüm kalbin optik haritalanması. Normal sinüs ritminde kalbin tek bir atışı sırasında floresan yoğunluğunun değişimi gösterilmiştir. Kalp, sağ ve sol ventrikül görünür olacak şekilde kameraya bakacak şekilde konumlandırıldı (RV, LV). Yıldız işareti, üstte gösterilen işlem potansiyelinin alındığı pikseli gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

MicroLED sayısı Işınlanmış alan Aμled [mm2] Radyant akı φ [mW] Işık Yoğunluğu LI [mW mm-2]
3 0.178 5.9 ± 0.47 33,11 ± 2,66
6 0.356 11,91 ± 0,84 33,42 ± 2,37
9 0.535 17,85 ± 0,61 33,39 ± 1,14

Tablo 1: Mikro-LED dizisinin ölçülen radyant akısı ve buna karşılık gelen ışık yoğunluğu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kardiyak taşiaritmilerin başarılı bir tedavisi kardiyak tedavinin anahtarıdır. Ancak aritmi başlangıcı, sürekliliği ve sonlandırılmasının altında yatan biyofiziksel mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, kardiyak araştırmalar, elektrik şoku tedavisini aritmilerin daha yumuşak bir şekilde sonlandırılmasına yönelik olarak optimize etmeyi ve böylece hastaların yaşam kalitesini arttırmayı amaçlamaktadır 28,29,30,31. Düşük enerjili elektriksel yaklaşımlar, ciddi yan etkilerin önemli ölçüde azaltılmasını vaat eder, ancak yine de istenmeyen kas uyarımına neden olabilir. Kardiyak optogenetik bu sınırlamanın üstesinden gelebilir ve sadece doku-nazik bir sonlandırma tekniği değil, aynı zamanda sağlam murin kalbindeki ve hücre kültürlerinde vorteks benzeri uyarma dalgalarının aritmi-spesifik hedefli kontrolünü araştırmak için esnek bir platform sağlayabilir32,33.

Bu motivasyon göz önüne alındığında, sağlam bir fotostimülasyon kurulumunun yanı sıra bir protokol tasarlandı ve uygulandı, her ikisi de üç boyutlu panoramik optik haritalama çalışmalarına kolayca genişletilebilecek son derece uyarlanabilir bir optik sistem sunuyor34.

Kardiyak aritmilerin, fotostimülasyon için seçilen parametrelere, örneğin kalpteki aydınlatılmış alana bağlı olarak farklı başarı oranları ile başarılı bir şekilde sonlandırılabileceği gösterilebilir. Sunulan sonuçlar, ışınlanmış yüzeyin arttırılmasının,22'de de gösterildiği gibi, iletim bloğu ile kaotik aktiviteyi söndüren kritik sayıda kardiyomiyosit aldığını göstermektedir. Bu çalışmada, fotodefibrillate için gereken enerji E = 10.69 ± 0.37 mJ'dir (dokuz mikro LED, 30 darbe ve darbe genişliği Wdef = 20 ms kullanılarak). Bu, sırasıyla daha büyük bir alan 22 veya tüm kalp 24'ün aydınlatıldığı E 22 = 228.8 mJ ve E 24 = 153.6 mJ ile 22,24'te daha önce bildirilenden daha düşük olduğu ortaya çıktı. Bununla birlikte, iyi sınırlandırılmış desenli bir alanın, E 35 = 1.8 mJ ile sonuçlanan 10 fotodefibrilasyon darbesi ile aydınlatıldığı 35'te gösterilen yaklaşımla karşılaştırıldığında, bu çalışmadaki fotodefibrilasyon enerjisi önemli ölçüde daha yüksektir. Diğer üç yaklaşımın aksine, sunulan protokol ile %90'ın üzerinde bir başarı oranına ulaşılamamıştır. Daha yüksek bir fotodefibrilasyon enerjisine rağmen düşük performansın olası bir nedeni, altta yatan aritminin karmaşıklığının dikkate alınmaması olabilir. Kalpteki küçük bir alanı aydınlatarak ve aynı anda bir aritminin mekansal-zamansal dinamiklerini ölçerek yüksek bir sonlandırma oranının elde edildiği 35'te sunulan sonuçlarla ilgili olarak, sunulan yaklaşım, kalbin mevcut durumuna bağlı olarak farklı bir mikro-LED aydınlatma paterni ile yanıt veren geri bildirim kontrolü göz önünde bulundurularak kesinlikle daha da geliştirilebilir.  Ayrıca, aritmilerin her zaman mevcut yöntemle sonlandırılamamasına rağmen, fotostimülasyon sırasında içsel kompleks dinamiklerin bozularak daha düzenli bir zamansal duruma yol açabileceği de gösterilmiştir. 36'da gösterildiği gibi, monomorfik (daha sıralı) ve polimorfik (daha az sıralı) aritmilere hitap ederken sonlandırma oranı önemli ölçüde farklıdır. Bu nedenle, daha iyi bir defibrilasyon hızına doğru atılacak mantıklı adım, bir VF atağı sırasında kardiyak dinamikleri etkilemek, aritmi daha az karmaşık bir modele dönüştürmek ve başka bir darbe seti ile sona erdirmek ve bu şekilde iki aşamalı bir fotostimülasyon yaklaşımı oluşturmak olabilir.

Perfüzyon protokolü ile ilgili olarak, en kritik adımlar kalbin doğru ekstraksiyonu ve hazırlanmasında ve ayrıca optik haritalama optiklerinin doğru ayarlanmasında bulunur. Optik haritalama dahil olmak kesinlikle boya spektrumlarının doğru seçimini, uygun uyarma ışık kaynaklarını ve kamera29 için iyi seçilmiş optik filtreleri gerektirir. Aksi takdirde, kaydedilen optik sinyaller çok gürültülü olabilir ve ayrıca boya uyarımı ile fotostimülasyonun çapraz konuşmasını içerebilir. Bu nedenle, sonraki analizler, sinyallerin birkaç analitik filtreyle sonradan işlenmesini ve genellikle kötüleşmeye neden olan görüntü yumuşatma işlemini gerektirecektir.

Bu protokoldeki bir diğer önemli adım, mikro-LED dizisinin doğru ve hassas bir şekilde yerleştirilmesidir. Mikro-LED dizisi ile sürücü arasındaki ara bağlantı ucu çok ince ve esnek olduğundan, dizinin her deney için kalp yüzeyinde yaklaşık olarak aynı yere yerleştirilmesini sağlamak bazen zordur. Konumlandırmayı kolaylaştırmak ve mikro-LED dizisinin edinilen konumunu sabitlemek için, dizinin bir mikromanipülatöre bağlanmasına izin veren bir tutucu 3D olarak tasarlanmış ve basılmıştır. Bu, Tyrode'un çözümündeki dizinin hareketi üzerinde daha fazla kontrol sağlar. Mikro-LED dizisinin birbirine bağlanan ucu için seçilen malzemeye bağlı olarak, bir tutucunun kullanılması gerekli olmayabilir.

Ayrıca, protokolün bir diğer kritik adımı, örneğin Pinacidil37 gibi aritmi yanlısı ilaçların eklenmesidir. Birkaç kimyasal bileşiğin kalbin fizyolojik tepkisini değiştirdiği iyi bilindiğinden, sonuçları analiz ederken ve yorumlarken bu dikkate alınmalıdır. Optik haritalama söz konusu olduğunda, önerilen protokol mekanik bir çözücü olarak Blebbistatin'i kullanır. Bu, kayıt sırasında hareket artefaktlarını kaldırma avantajına sahiptir, ancak APD27'yi de uzatabilir. Bu dezavantajın üstesinden gelmek için, kayıt sırasında hareket izleme yöntemlerini analiz etmek38,39 olarak kabul edilebilir. Bu şekilde, kalbin normal fizyolojik durumu korunur ve yüksek kaliteli bir sinyal elde edilebilir.

Sunulan protokolün çok bölgeli foto-defibrilasyon için kullanılabileceği kanıtlanmış olmasına rağmen, hala bazı sınırlamaları vardır. Bazı durumlarda fibrilasyonun mikro-LED bazlı fotostimülasyon ile sonlandırılamayacağı, ancak sadece bozulabileceği ve frekans değişikliklerine neden olduğu bulunmuştur. Bir hipotez, kalpteki kıvrımlı dalgaların sadece sol ventrikülden yer değiştirdiği ve kalbin diğer bölgelerinde kendilerini yenilediğidir. Global aydınlatma24 gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, mevcut yöntem kalbin daha küçük bir kapsama alanı nedeniyle daha düşük bir başarı oranı sunmaktadır. Bununla birlikte, spiral aktivitenin uygun donanım tabanlı tanıma yöntemiyle, sonlandırma başarı oranının iyileştirilmesinin mümkün olduğundan eminiz.

Sonuç olarak, sunulan fotostimülasyon sistemi, kardiyak aritmi ile ilgili çoklu kardiyoversiyon yaklaşımları ve manipülasyon çalışmaları için güçlü bir deneysel araç oluşturmaktadır. Bu sistemde öğrenilen bilgiler, klinik olarak ilgili büyük hayvan modellerinde yeni potansiyel (fotoğraf) defibrilasyon protokollerini araştırmak ve değerlendirmek için kullanılacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Acknowledgments

Yazarlar, deneyler sırasında mükemmel teknik destekleri için Marion Kunze ve Tina Althaus'a teşekkür eder. Sonuçlara yol açan araştırma, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı FP7/2007-2013'ten HEALTH-F2-2009-241526 hibe anlaşması numarası altında fon almıştır. Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi, DZHK e.V. (Proje MD28), ortak site Goettingen, Alman Araştırma Vakfı CRC 1002 (proje C03) ve Max Planck Derneği tarafından da destek sağlandı. Bu çalışma kısmen Alman Araştırma Vakfı tarafından finanse edilen BrainLinks-BrainTools, Mükemmellik Kümesi (DFG, hibe numarası EXC 1086) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical Components
Blebbistatin TargetMol T6038 10 mM stock solution
BSA/Albumin Sigma-Aldrich A4919
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Carbogen Westfalen 50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ AAT Bioquest 21499 Dye for Optical Mapping
Glucose Sigma-Aldrich D9434 C6H12O6
Heparin LEO Pharma Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid Merck 1.09057.1000 HCl, 1 M stock solution
Isoflurane CP Pharma 1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride Merck 8.14733.0500 MgCl2
Monopotassium Phosphate Sigma-Aldrich 30407 KH2PO4
Pinacidil monohydrate Sigma-Aldrich P154-500mg 10 mM stock solution
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 KCl
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 NaCl
Sodium Hydroxide Merck 1.09137.1000 NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150 Biopac Systems MP150WSW data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C Biopac Systems ECG100C Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable RMS Heating System HK-5,0-12 Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply Thorlabs KPS101 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver Thorlabs LEDD1B T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode Hugo Sachs Elektronik BS4 73-0200 Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG Agilent Instruments A-2230 Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator Agilent Instruments A-2230 AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue Epoxy Technology EPO-TEK 353ND Two component epoxy
Fluoropolymer  Asahi Glass Co. Ltd. Cytop 809M Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist Merck KGaA AZ 5214E Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip  Cree Inc. C460TR2227-S2100 Blue micro-LED
Photoresist Merck KGaA AZ 9260 Thick Positive Photoresists
Polyimide UBE Industries Ltd. U-Varnish S Polyimide Solution
Silicone NuSil Technology LLC MED-6215 Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive John P. Kummer GmbH Epo-Tek 301-2 Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter Chroma Technology Corporation ET470/40x Blue excitation filter
Camera Photometrics Cascade 128+ High performance EMCCD Camera
Camera Objective Navitar DO-5095 Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror Semrock FF685-Di02-25x36 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter Semrock FF01-775/140-25 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink Advanced Thermal Solutions ATSEU-077A-C3-R0 Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2 LED Engin Osram LZ4-00B208 High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3 Thorlabs M625L3 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses LED Engin Osram LLNF-2T06-H LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter Thorlabs S120VC Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter
Red Filter Semrock FF02-628/40-25 BrightLine® single-band bandpass filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. 36th Annual Internation Conference IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Chicago, IL, , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. 28th IEEE Proceedigns. MEMS, Estoril, , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light - From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. 40thAnnual International Conference of IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Honolulu, HI, , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. mouser.de, LED Engin, [Online]. , Available: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208- 1531969.pdf (2020).
  21. thorlabs.com, thorlabs, [Online]. , Available: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020).
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Computing in Cardiology, Belfast, , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O'Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping - Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).

Tags

Tıp Sayı 174 kardiyak optogenetik optik haritalama LED DI-4-ANBDQPQ Blebbistatin channelrhodopsin-2 ChR2
Murin Kalplerde Optogenetik Çok Bölgeli Fotostimülasyon Uygulayarak İleri Kardiyak Ritim Yönetimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diaz-Maue, L., Steinebach, J.,… More

Diaz-Maue, L., Steinebach, J., Schwaerzle, M., Luther, S., Ruther, P., Richter, C. Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (174), e62335, doi:10.3791/62335 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter