Summary
Este trabalho relata um método de controle do ritmo cardíaco de corações murinos intactos de camundongos transgênicos com canalrodopsina-2 (ChR2) utilizando fotoestimulação local com matriz micro-LED e mapeamento óptico simultâneo do potencial de membrana epicárdica.
Abstract
As taquiarritmias ventriculares são uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. A desfibrilação elétrica usando choques elétricos de alta energia é atualmente o único tratamento para fibrilação ventricular com risco de vida. No entanto, a desfibrilação pode ter efeitos colaterais, incluindo dor intolerável, danos teciduais e piora do prognóstico, indicando uma necessidade médica significativa para o desenvolvimento de estratégias de manejo do ritmo cardíaco mais suaves. Além das abordagens elétricas redutoras de energia, a optogenética cardíaca foi introduzida como uma ferramenta poderosa para influenciar a atividade cardíaca usando canais iônicos de membrana sensíveis à luz e pulsos de luz. No presente estudo, um método robusto e válido para fotoestimulação bem-sucedida de corações murinos intactos perfundidos de Langendorff será descrito com base na estimulação multi-local aplicando uma matriz 3 x 3 de microdiodos emissores de luz (micro-LED). O mapeamento óptico simultâneo das ondas de tensão da membrana epicárdica permite a investigação dos efeitos da estimulação específica da região e avalia a atividade cardíaca recém-induzida diretamente no local. Os resultados obtidos mostram que a eficácia da desfibrilação é fortemente dependente dos parâmetros escolhidos para a fotoestimulação durante uma arritmia cardíaca. Será demonstrado que a área iluminada do coração desempenha um papel crucial para o sucesso da terminação, bem como a forma como o controle direcionado da atividade cardíaca durante a iluminação para modificar os padrões de arritmia pode ser alcançado. Em resumo, essa técnica oferece a possibilidade de otimizar a manipulação do mecanismo no local no caminho para o controle de feedback em tempo real do ritmo cardíaco e, em relação à especificidade da região, novas abordagens na redução do dano potencial ao sistema cardíaco em comparação com o uso de aplicações de choque elétrico não específicas.
Introduction
Investigações iniciais da dinâmica espaço-temporal durante a arritmia revelaram que os complexos padrões elétricos durante a fibrilação cardíaca são impulsionados por ondas de excitação rotativas semelhantes a vórtices1. Esse achado deu novos insights sobre os mecanismos subjacentes das arritmias, o que levou ao desenvolvimento de novas terapias de terminação elétrica baseadas na excitação multissítio do miocárdio 2,3,4. No entanto, os tratamentos que utilizam estimulação elétrica de campo não são locais e podem inervar todas as células excitáveis circundantes, incluindo o tecido muscular, causando danos celulares e teciduais, bem como dor intolerável. Em contraste com as terapias elétricas, as abordagens optogenéticas fornecem uma técnica específica e protetora dos tecidos para evocar potenciais de ação de cardiomiócitos com alta precisão espacial e temporal. Portanto, a estimulação optogenética tem o potencial de controle invasivo mínimo dos padrões de ativação caótica durante a fibrilação cardíaca.
A introdução do canal iônico sensível à luz canalrodopsina-2 (ChR2) em células excitáveis via manipulação genética 5,6,7, possibilitou a despolarização do potencial de membrana de células excitáveis por meio da fotoestimulação. Várias aplicações médicas, incluindo a ativação de redes neuronais, o controle da atividade cardíaca, a restauração da visão e da audição, o tratamento de lesões medulares e outras 8,9,10,11,12,13,14 têm sido desenvolvidas. A aplicação da ChR2 em cardiologia tem potencial significativo devido ao seu tempo de resposta de milissegundos15, tornando-a adequada para o controle direcionado da dinâmica cardíaca arrítmica.
Neste estudo, a fotoestimulação multi-local de corações intactos de um modelo de rato transgênico é mostrada. Em resumo, foi criada uma linha de ratinhos alfa-MHC-ChR2 transgénicos no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) e gentilmente fornecida pelo Prof. S. E. Lehnart. Em geral, machos adultos transgênicos C57/B6/J, expressando Cre-recombinase sob controle de alfa-MHC foram pareados para acasalar com fêmeas B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Como o STOP cardíaco foi apagado na segunda geração, a prole apresentou expressão estável de MHC-ChR2 e foi utilizada para manter colônias fotossensíveis cardíacas. Todos os experimentos foram feitos com camundongos adultos de ambos os sexos com uma idade de 36 a 48 semanas. A iluminação é obtida usando uma matriz de micro-LED 3 x 3, fabricada conforme descrito em16,17, exceto que o invólucro à base de silício e as fibras de vidro ópticas curtas não são implementados. Seu primeiro uso em uma aplicação cardíaca é encontrado em18. Uma matriz linear de micro-LED baseada em uma tecnologia de fabricação semelhante foi aplicada como uma sonda penetrante para o ritmo cardíaco19. Os micro-LEDs são dispostos em uma matriz 3 x 3 a um passo de 550 μm, proporcionando uma alta resolução espacial e uma alta potência radiante em uma área muito pequena. Os autores demonstram neste trabalho uma fotoestimulação multissítio local versátil que pode abrir caminho para o desenvolvimento de novos métodos de terapia antiarrítmica.
O protocolo experimental a seguir envolve uma perfusão retrógrada de Langendorff ex vivo, para a qual a aorta canulada funciona como entrada de perfusão. Devido à pressão de perfusão aplicada e à contração cardíaca, o perfusato está fluindo através das artérias coronárias, que se ramificam da aorta. No trabalho apresentado, o coração é perfundido utilizando-se uma configuração de pressão constante alcançada pela elevação dos reservatórios de perfusato a 1 m de altura, equivalente a 73,2 mmHg, o que resulta em uma vazão de 2,633 ± 0,583 mL/min. Dois tipos de solução de Tyrode's são usados como perfusato durante o experimento. A solução de Tyrode regular suporta um ritmo sinusal estável, enquanto a solução de Tyrode Low-K+ é misturada com Pinacidil para permitir a indução de arritmia em corações murinos. O uso de um banho-maria hexagonal permite a observação do coração através de seis janelas planares diferentes, permitindo o acoplamento de vários componentes ópticos com menor distorção por refração.
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Protocol
Todos os experimentos seguiram estritamente o regulamento de bem-estar animal, de acordo com a legislação alemã, as estipulações locais e de acordo com as recomendações da Federação das Associações Europeias de Zootecnia de Laboratório (FELASA). O pedido de aprovação de experiências em animais foi aprovado pela autoridade responsável pelo bem-estar animal e todas as experiências foram comunicadas aos nossos representantes em matéria de bem-estar animal.
1. Preparação e materiais da experiência
- Configuração de mapeamento óptico
NOTA: A configuração óptica, bem como a configuração elétrica, são mostradas na Figura 1. Todos os componentes utilizados na configuração óptica e elétrica estão listados em detalhes na Tabela de Materiais.- Use LED 1 e LED 2 para indução de arritmia e desfibrilação de backup. Escolha LEDs de alta potência com um comprimento de onda λazul perto de 475 nm, que é o pico do comprimento de onda de excitação de ChR26. Para estreitar ainda mais o espectro óptico, use um filtro passa-banda de 470 ± 20 nm.
NOTA: Neste trabalho, o LED 1 e o LED 2 têm um fluxo radiante típico de 3,9 a 5,3 W, de acordo com a ficha técnica20. - Ilumine o epicárdio para mapeamento óptico com um LED vermelho de alta potência (LED 3 na Figura 1), que emite luz com um comprimento de onda central de λvermelho = 625 nm e um fluxo radiante de 700 mW21. A luz vermelha é filtrada com um filtro passa-banda de 628 ± 20 nm e refletida por um espelho dicroico de passagem longa (DM) com um comprimento de onda de corte de λDM = 685 nm.
- Use um filtro de emissão com λfilter-cam = 775 ± 70 nm na frente da objetiva da câmera para registrar apenas a emissão de fluorescência da atividade cardíaca. Use um objetivo rápido que seja adequado para aplicações com pouca luz.
NOTA: A frequência de fibrilação de um coração de rato varia de 20 a 35 Hz; portanto, use uma câmera rápida o suficiente para gravar com uma frequência de 1 a 2 kHz, ou até mais.
- Use LED 1 e LED 2 para indução de arritmia e desfibrilação de backup. Escolha LEDs de alta potência com um comprimento de onda λazul perto de 475 nm, que é o pico do comprimento de onda de excitação de ChR26. Para estreitar ainda mais o espectro óptico, use um filtro passa-banda de 470 ± 20 nm.
- Matriz de micro-LED
NOTA: As matrizes de micro-LED aplicadas aqui são realizadas usando o processamento de microssistemas, conforme detalhado em outro lugar16,17.- Gire uma camada de poliimida (PI) de 5 μm de espessura sobre substratos de silício de 4 polegadas (polido de lado único, 525 μm de espessura).
- Curar esta camada PI a uma temperatura máxima de 450 °C sob uma atmosfera de azoto. Mantenha a temperatura máxima constante por 10 min.
- Depositar e padronizar um fotorresistente de reversão de imagem (PR) usando litografia ultravioleta (UV) e depósito de sputter uma fina camada de platina (Pt) de 250 nm.
- Engrosse esta metalização à base de Pt galvanizando uma camada de ouro (Au) de 1 μm de espessura com o PR padronizado servindo como uma camada de mascaramento.
- Antes de revestir uma segunda camada PI, exponha a bolacha com sua primeira camada PI e a metalização galvanizada por Au a um plasma de oxigênio que ativa quimicamente a superfície da camada PI.
- Cure a segunda camada PI novamente a 450 °C, aplique litografia UV para padronizar uma camada PR e abra as almofadas de contato da matriz para os chips micro-LED e a placa de circuito impresso (PCB) de interface por gravação de íons reativos (RIE) usando o PR padronizado como uma camada de mascaramento.
NOTA: Nesta etapa do processo RIE, recomenda-se aplicar 200 W e 100 W por 10 e 30 min, respectivamente, para definir as aberturas da almofada de contato, bem como a forma externa da matriz de micro-LED bidimensional (2D). - Retire o PR usando solventes e gravura a plasma. Engrosse ainda mais as almofadas de contato galvanizando uma camada de ouro adicional de 6 μm de espessura.
- Conecte os chips micro-LED às almofadas de contato usando um colador flip-chip.
- Ative a superfície PI em um plasma de oxigênio e preencha os chips micro-LED com um adesivo sem solvente. Cura, em seguida, o adesivo durante 12 h a 120 °C.
- Para encapsular os chips micro-LED, execute outro tratamento de plasma com argônio e aplique uma fina camada de fluoropolímero manualmente. Pré-curar esta camada a 80 °C durante 1 h.
- Aplique manualmente o silicone como a camada de encapsulamento final depois de expor a matriz de micro-LED a um plasma de oxigênio, usado para melhorar a adesão do silício à camada subjacente de fluoropolímero. Curar a camada de silicone a 80 °C e 180 °C durante 1 h cada. Essas etapas finais de cura também curam completamente a camada de fluoropolímero.
- Solde as almofadas de contato do substrato PI a uma placa de circuito impresso que transporta conectores de tira para interconexão da matriz a uma instrumentação externa. Cubra as almofadas de solda na PCB usando um adesivo.
- Configuração elétrica
- Use eletrodos adequados para registrar um eletrocardiograma (ECG), por exemplo, eletrodos de prata/cloreto de prata ou eletrodos de Potencial de Ação Monofásica (MAP) e um amplificador de ECG para monitorar a atividade elétrica do coração continuamente. Além disso, use um dispositivo de aquisição (DA) apropriado para registrar todos os sinais elétricos obtidos.
- Escolha um driver adequado para os LEDs de alta potência (LED 1, LED 2 e LED 3), que possa gerenciar a corrente máxima aplicada a cada dispositivo. Use um gerador de função arbitrária (AFG) para controlar a saída dos drivers LED com precisão.
- Use um driver de LED multicanal para controlar a corrente que flui através da matriz de micro-LED. Um AFG com várias saídas também é adequado para essa tarefa.
NOTA: É aconselhável escolher drivers LED limitando a corrente à corrente máxima do micro-LED, caso contrário, os diodos podem ficar danificados. Um exemplo de um driver micro-LED multicanal é descrito em outro trabalho18. Se necessário, o AFG ou qualquer outro driver de LED pode estar conectado a um computador para controlar remotamente as configurações de micro-LED. Se este for o caso, conecte o driver LED ao computador com o protocolo de comunicação de sua escolha, por exemplo, GPIB (General Purpose Interface Bus) ou uma conexão serial.
2. Procedimentos experimentais
- Preparação da solução
- Preparar a solução da Tyrode: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1,8 mM CaCl 2, 1,2 mM KH2 PO4, 5,6 mM de glicose, 0,1% BSA/Albumina.
- Prepare a solução Low-K+ Tyrode: Low-K+ Tyrode's é feita da mesma forma que a solução Tyrode's regular, exceto que apenas metade da quantidade de KCl é adicionada (2 mM em vez de 4 mM KCl).
NOTA: Para um experimento com duração de 3 h geralmente 2-3 L de Tyrode Low-K+ (adicionalmente misturado com Blebistatina (Passo 2.1.5) se o mapeamento óptico for realizado) e 1-2 L de Tyrode regular são suficientes. - Adicionar Pinacidil à solução de Low-K+ Tyrode para facilitar o processo de indução de arritmia, conforme descrito em22, para obter uma concentração de 100 mM. Use luvas de laboratório protetoras ao manusear Pinacidil.
- Preparar 1 ml de 50 μM DI-4-ANBDQPQ com a solução regular de Tyrode. Proteja o corante da luz para evitar o fotobranqueamento.
- Faça uma solução de estoque de 10 mM de Blebbistatin. Para o mapeamento óptico, misturar a Blebistatina com a solução de Pinacidil-Tirode a 100 mM (Passo 2.1.3) para obter uma solução de 5 μM. Use luvas de laboratório protetoras ao manusear Blebbistatin.
NOTA: Mantenha o corante e a solução de Blebistatina de lado até que o mapeamento óptico comece.
- Perfusão Langendorff
NOTA: A configuração consiste em dois reservatórios para as duas soluções da Tyrode. Eles são conectados a uma armadilha de bolhas através de tubos com galos de três vias. O coração é posteriormente anexado à armadilha de bolhas por um conector de bloqueio Luer, e é então suspenso em um banho de água hexagonal. O banho-maria é, por sua vez, ligado a um contentor de resíduos para recolher a solução utilizada da Tyrode.- Limpe todos os tubos antes de cada experimento com água totalmente desmineralizada.
- Arejar ambas as soluções da Tyrode com Carbogen (5% de CO 2 e 95% de O2) por 30 min à temperatura ambiente antes do início do experimento. Ajustar o valor de pH das soluções de Tyrode para 7,4 com NaOH.
- Encha 500 ml de cada solução de Tyrode no reservatório correspondente e desaregue os tubos, bem como a armadilha de bolhas, executando a solução de Tyrode através do sistema de perfusão até que não sejam mais vistas bolhas de ar presas nos tubos ou na armadilha de bolhas.
- Continue arejando as soluções de Tyrode durante todo o experimento nos reservatórios com Carbogen para garantir que o pH do perfusato permaneça estável mais tarde durante a perfusão.
- Aqueça o sistema de perfusão a 37 °C com uma bomba de calor de água. Mantenha a temperatura do perfusato constante dentro do banho-maria usando um elemento de aquecimento adicional, como um cabo de aquecimento à prova d'água.
NOTA: Durante o experimento, é crucial reabastecer os reservatórios do Tyrodes antes que eles fiquem vazios. Caso contrário, as bolhas de ar podem entrar no coração, o que pode entupir os vasos e levar à isquemia.
- Preparação do mouse
- Injetar por via subcutânea 0,1 mL de 500 I.E. Heparina 30 min antes do procedimento de isolamento cardíaco.
- Encha uma placa de Petri de 6 cm e uma seringa de 2 ml com solução de Tyrode gelada. Coloque sob o microscópio estereoscópico.
- Realizar anestesia de curto prazo de camundongos por um ambiente saturado de isoflurano por 2 min e luxação cervical imediata depois.
NOTA: A fim de verificar anestesia suficiente, uma verificação para o reflexo negativo entre os dedos do pé é absolutamente necessária. - Abra o peito, retire o coração, como descrito em outro lugar23, e coloque-o na placa de Petri de 6 cm com solução gelada de Tyrode. O batimento cardíaco será diminuído devido à queda de temperatura.
- Faça a preparação fina sob um microscópio estereoscópico, conforme detalhado em outro lugar23. Prenda a aorta na agulha contundente e fixe o vaso com material de sutura.
- Como controlo, injete a solução de Tyrode gelada através da agulha no coração e verifique se o coração está bem montado. Este passo também enxagua o sangue restante para fora do coração.
- Transfira o coração montado para o sistema de perfusão. Certifique-se de que o perfusato está fluindo para evitar que o ar entre no coração enquanto conecta a agulha com a armadilha de bolhas. Verifique se o coração está coberto com a solução de Tyrode's no banho de água. As etapas 2.3.4, 2.3.5 e 2.3.7 são ilustradas na Figura 2.
- Certifique-se de que o coração comece a bater dentro de alguns minutos. Deixe o coração adaptar-se à configuração de perfusão durante 15 a 20 minutos e, em seguida, mude para a solução de Tyrode de baixo K + com Pinacidil (Passo 2.1.3) respetivamente solução de Tyrode de baixo K + com Pinacidil e Blebistatina (Passo 2.1.5) se o mapeamento óptico for para ser realizado.
- Indução de arritmia e desfibrilação óptica
- Coloque um dos eletrodos de ECG o mais próximo possível da superfície do coração para garantir uma boa qualidade de sinal. Suspender o segundo eléctrodo de ECG na solução de Tyrode. Certifique-se de que o ECG adquirido está sendo registrado pelo DA de escolha.
- Coloque a matriz micro-LED na área de interesse do estudo, por exemplo, no ventrículo esquerdo.
- Mude a perfusão para Tyrode's low-K+ com Pinacidil e perfunda o coração por 15 a 30 min.
- Para induzir arritmia, ilumine o coração com LED 1 e LED 2 com um trem de 20 a 50 pulsos de luz com uma frequência f ind de 25 a 35 Hz, duração do pulso Wind de 2 a 15 ms, e intensidade de luz LIopt_ind de 2,8 mW mm-2.
- Repita o processo até que a arritmia seja induzida.
NOTA: As arritmias são fáceis de identificar no sinal de ECG porque a frequência e a morfologia do sinal diferem do ritmo sinusal normal. Se a arritmia terminar dentro dos próximos 5 s, classifique-a como auto-terminada e inicie uma nova tentativa de indução. - Uma vez que uma arritmia sustentada é detectada visualmente, aplique uma explosão de pulsos com diferentes larguras W def e frequências fdef, usando três, seis ou nove micro-LEDs da matriz a umpulso de corrente pulsante I de 15 mA cedendo a uma intensidade de luz LIμLED = 33,31 ± 2,05 mW mm-2.
- Se a arritmia continuar após cinco ensaios de desfibrilação baseados em matriz de micro-LED, classifique a tentativa como malsucedida e inicie a desfibrilação de backup.
- Para desfibrilação de backup, use o LED 1 e o LED 2 usando os mesmos parâmetros de temporização definidos para a matriz de micro-LED.
NOTA: Como o coração é exposto ao estresse isquêmico e metabólico durante todo o período experimental, é possível que as tentativas de terminação da arritmia não sejam bem-sucedidas, mesmo com a desfibrilação de backup. Sempre que isso acontecer, mude a solução de perfusão para o Tyrode regular e deixe o coração se recuperar por 5 a 10 minutos. Quando o ECG retornar ao ritmo sinusal, repita o protocolo da Etapa 2.4.3 novamente.
- Mapeamento óptico
- Perfundir o coração com a solução de Blebistatina preparada na Etapa 2.1.5 e aguardar até que ocorra o desacoplamento mecânico. Isso é realizado quando o coração para de bater, mas um sinal de ECG ainda é mensurável.
NOTA: A mistura da solução de Blebistatina à concentração mencionada e a manutenção do coração perfundido com esta solução mantêm a atividade mecânica cardíaca desacoplada da atividade elétrica durante todo o experimento. - Dê o corante de tensão de 1 mL DI-4-ANBDQPQ (preparado na Etapa 2.1.4) como um bolus na armadilha de bolhas da perfusão de Langendorff. Aguarde de 5 a 10 minutos para permitir que o corante perfunda o coração uniformemente.
NOTA: Evite o fotobranqueamento do corante desligando a luz vermelha sempre que nenhuma gravação estiver sendo feita. Se a relação sinal-ruído da gravação se tornar muito pequena (o sinal adquirido é muito ruidoso), repita as etapas 2.1.4 e 2.5.2. - Foque a câmera na superfície do coração, ligue o LED 3 e aplique energia óptica de 1,27 mW mm-2 .
- Desligue as luzes do laboratório e comece a gravar. Certifique-se de que um sinal óptico está sendo adquirido comparando a frequência do sinal obtido com a frequência do ECG gravado. Isso garante que o sinal óptico obtido esteja puramente relacionado à atividade elétrica do coração.
NOTA: Como a luz de fluorescência emitida pelo corante é muito semanal, o mapeamento óptico é feito em uma sala escura. Isso evita a interferência de sinal de quaisquer outras fontes de luz.
- Perfundir o coração com a solução de Blebistatina preparada na Etapa 2.1.5 e aguardar até que ocorra o desacoplamento mecânico. Isso é realizado quando o coração para de bater, mas um sinal de ECG ainda é mensurável.
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Representative Results
O protocolo permite a indução de arritmias ventriculares em corações murinos intactos utilizando pulsos de fotoestimulação gerados por LED 1 e LED 2 (Figura 1) com frequência f ind entre 25 Hz e 35 Hz e pulso de duração Wind entre 2 ms e 10 ms. Observe que o objetivo de tais pulsos de luz rápidos não é capturar o ritmo cardíaco, mas sim desequilibrar a atividade cardíaca para que ondas elétricas erráticas possam ser geradas, o que facilita uma arritmia. A vantagem de induzir arritmia com luz sobre indução com estimulação elétrica é que nenhum artefato é provocado no ECG, proporcionando a possibilidade de pós-analisar o sinal adquirido sem restrições e até mesmo avaliar a resposta elétrica do coração durante a estimulação rápida, fato esse fato também proporciona a possibilidade de observar o comportamento cardíaco durante a fotodesfibrilação. Isso não é possível com métodos de indução elétrica ou desfibrilação. No entanto, se a configuração utilizada não permitir o uso de LEDs externos de alta potência, por exemplo, devido a restrições de local, um eletrodo de estimulação adicional pode ser colocado no coração para induzir arritmia, como mostrado em outro lugar 3,22,24.
Uma vez que a fibrilação é induzida, a arritmia deve durar pelo menos 5 segundos para garantir que ela se sustente, depois as tentativas de desfibrilação à base de micro-LED são iniciadas. Uma vez que os principais parâmetros da arritmia cardíaca, como a duração do ciclo básico ou a frequência dominante, amplitude e morfologia, estão em constante mudança e, como é até o momento não é possível prever quais parâmetros de fotodesfibrilação fornecem o melhor resultado, foi de interesse significativo entender se há uma relação entre a frequência, a largura de pulso, área de fotoestimulação e taxa de terminação. Portanto, uma série de experimentos com diferentes frequências f def, número de micro-LEDs e durações de pulso Wdef foram testadas, e a taxa de sucesso para N = 11 camundongos foi extraída, como mostra a Figura 3.
Pôde-se demonstrar que pulsos de 1 a 20 ms de duração podem desfibrilar com diferentes taxas de sucesso (Figura 3). Uma vez que a intensidade da luz LIμLED foi mantida constante durante cada pulso de fotoestimulação, como mencionado na Etapa 2.4.6, e a taxa de sucesso de três micro-LEDs contra nove é notavelmente menor, os resultados apresentados sugerem que a área coberta no coração, o número de micro-LEDs e, portanto, o fluxo radiante total aplicado são fatores cruciais para alcançar a desfibrilação. Considerando que cada micro-LED na matriz é uma fonte de luz lambertiana e que eles são posicionados diretamente na superfície do coração de modo que a distância aproximada ao tecido é zero, pode-se supor que o contorno de irradiância da área iluminada no coração ao usar um único micro-LED é equivalente a AμLED = 0,059 mm², como também mostrado em25 para LEDs retangulares planos. Além disso, embora alguns fótons possam deixar o micro-LED lateralmente das bordas, a contribuição deles para a intensidade total da luz é considerada tão pequena que seu efeito pode ser negligenciado. Para quantificar a luz irradiada da matriz, os autores mediram o fluxo radiante da matriz micro-LED com um medidor de potência comercial e calcularam a intensidade da luz que atinge o coração, conforme mostrado na Tabela 1. A partir da Tabela 1 também pode ser lido que o fluxo radiante aumenta com o número de micro-LEDs utilizados, mas a intensidade da luz permanece constante devido às implicações do perfil de iluminação mencionadas anteriormente.
Curiosamente, também pode ser observado que a taxa de sucesso de nove LEDs com W def = 1 ms (Figura 3a) e W def = 20 ms (Figura 3d) em uma frequência de desfibrilação f def = 18 Hz e f def = 20 Hz são comparativamente altas. Considerando que a frequência média das arritmias induzidas é de 22,55 ± 4,03 Hz, esse fato pode indicar que, para os corações murinos ChR2, a taxa de sucesso aumenta significativamente quanto mais próxima a frequência de estimulação estiver da frequência de arritmia. Isso também é mostrado em simulações numéricas26. No entanto, isso não pode ser facilmente generalizado porque a frequência dominante de arritmias complexas está em constante mudança. Para ilustrar isso, a Figura 4 mostra duas tentativas diferentes de desfibrilação com fdef = 14 Hz. No início do segmento do ECG na Figura 4a) e de acordo com a morfologia do sinal do ECG é mostrada uma fibrilação ventricular (FV). Quando a fotoestimulação micro-LED começa, a fibrilação é transformada em um padrão mais ordenado, que é mais provável que seja uma taquicardia ventricular (TV). Sempre que a matriz micro-LED é desligada, as ondas VF caóticas originais assumem o controle novamente. Assim, a arritmia não é terminada. Embora neste exemplo o VF não possa ser terminado com os parâmetros fornecidos, ele fica perturbado e pode ser alterado para um padrão mais regular (VT). Figura 4b O segmento 1 mostra que a frequência dominante de 24 Hz aumenta ligeiramente até que a fotoestimulação comece e a FV seja transformada em TV no Segmento 2, onde a frequência dominante cai para 14 Hz. Além disso, a Figura 4c mostra um VT que pode ser terminado com o mesmo f def que na Figura 4a, mas com um Wdef diferente. Primeiro, a fotoestimulação micro-LED altera a morfologia da arritmia, para finalmente terminá-la com captura de ritmo 1:1 a partir do19º pulso. Esses resultados podem implicar que os parâmetros de fotodesfibrilação, por exemplo, Wdef, devem se adaptar à mudança morfológica da arritmia ao longo do tempo. Os experimentos que levaram a esses resultados foram conduzidos sem o uso de Blebistatina, devido à consequente mudança na duração do potencial de ação (DPA)27. Portanto, nenhum mapeamento óptico foi realizado nessas séries.
Outro conjunto de experimentos foi realizado para mapeamento óptico utilizando o corante potenciométrico com desvio para o vermelho (Etapa 2.1.4). O mapeamento óptico com câmeras de alta velocidade permite observar a propagação de ondas de excitação na superfície do coração durante o ritmo sinusal (Figura 5) e taquiarritmias complexas28. Como a variação fracionada do corante potenciométrico é muito baixa, os vídeos obtidos foram pós-processados utilizando uma linguagem de programação matemática. O primeiro passo para melhorar a qualidade dos sinais ópticos é remover o ruído aplicando um filtro de suavização gaussiano com um desvio padrão de σ = 1, seguido por um filtro passa-banda com frequências de canto falta = 0,1 Hz e fbaixa = 70 Hz. A banda de parada em f alta remove mudanças lentas no sinal que não estão relacionadas à frequência sinusal do coração, que fica entre 3 Hz < fsinus < 8 Hz, enquanto a banda de parada fbaixa remove o ruído dealta frequência que é capturado pela câmera. É importante notar que tanto as emissões de luz azul do LED 1, LED 2 quanto da matriz micro-LED podem causar conversa cruzada e um sinal de interferência muito alto no mapeamento óptico. Além disso, observou-se que nem mesmo um filtro passa-banda muito estreito na frente da câmera, com comprimento de onda λfilter-cam, como mencionado na Etapa 1.2.3, filtraria a influência da luz azul. Isso pode ser causado em parte pela resposta de excitação do próprio corante. Portanto, tenha muito cuidado ao escolher a óptica para mapeamento óptico. Para os meios de análise de vídeo, todos os quadros em que a luz azul foi registrada tiveram que ser negligenciados para que, em muitos casos, não seja possível visualizar o coração durante a fotoestimulação, como também mencionado em outro estudo29.
Figura 1: Esquema da configuração elétrica e óptica. (a) LED 1 e LED 2 fornecem uma fonte de luz azul usada para indução de arritmia e desfibrilação de backup. O LED 3 é usado como uma fonte de luz de excitação para o corante di-4-ANBDQPQ deslocado para o vermelho. A luz vermelha é direcionada para o coração por meio do espelho dicroico DM. A luz de emissão mostrada em vermelho escuro é registrada pela câmera de alta velocidade através de um filtro de emissão, como mencionado no texto. Os eletrodos LED 2 e ECG não são mostrados para simplificar. (b) Um segmento do sinal de ECG gravado mostrado em vermelho. O azul escuro mostra os pulsos de luz do LED 1 e LED 2 em uma frequência f ind = 35 Hz e Wind = 4 ms usada para induzir fibrilação. Imediatamente após o término do estímulo luminoso, pode-se observar fibrilação ventricular (FV). A fotoestimulação baseada em micro-LED mostrada em azul claro (f def = 16 Hz, Wdef = 20 ms) termina com sucesso a arritmia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação do coração. (a) Peito aberto de um rato mostrando o coração intacto e os órgãos circundantes. b) Coração explantado imerso na solução gelada de Tyrode, para posterior preparação. c) Coração de rato devidamente ligado a uma agulha contundente. d) Coração murino suspenso na solução de Tyrode. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Taxas de sucesso extraídas experimentalmente. Taxas de sucesso para 30 pulsos de fotoestimulação baseados em micro-LED usando três, seis e nove LEDs em diferentes durações de pulso W def e frequências fdef para N = 11. Barras de erro mostradas com erro padrão de média S.E.M. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Manipulação do ritmo cardíaco por meio de fotoestimulação . (a) Segmento de um registro eletrocardiográfico de uma arritmia não terminada. b) Espectrograma do ECG indicado no painel a. A densidade espectral de potência (PSD) do Segmento (1) mostra uma arritmia com frequência dominante de 24 Hz. Fotoestimulação do Segmento (2) com os parâmetros mostrados. Pode-se observar que a frequência dominante cai para 14 Hz. Segmento (3) Término malsucedido e retorno ao comportamento arrítmico com frequência dominante de 24 Hz. (c) ECG de uma tentativa de desfibrilação bem-sucedida. d) Espectrograma da terminação bem sucedida apresentada no painel c. O segmento (1) mostra uma taquicardia ventricular (TV) com frequência dominante de 23 Hz. Fotoestimulação do segmento (2) usando as configurações mostradas. O segmento (3) exibe uma terminação bem-sucedida, o que leva a um ritmo sinusal normal com uma frequência fundamental de 3,5 Hz e os harmônicos resultantes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Mapeamento óptico de todo o coração. A mudança da intensidade da fluorescência durante um único batimento do coração no ritmo sinusal normal é mostrada. O coração foi posicionado de frente para a câmera de modo que os ventrículos direito e esquerdo sejam visíveis (VD, LV). O asterisco mostra o pixel no qual o potencial de ação mostrado na parte superior foi tomado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Número de microLED | Área irradiada Aμled [mm2] | Fluxo radiante φ [mW] | Intensidade da luz LI [mW mm-2] |
| 3 | 0.178 | 5,9 ± 0,47 | 33,11 ± 2,66 |
| 6 | 0.356 | 11,91 ± 0,84 | 33,42 ± 2,37 |
| 9 | 0.535 | 17,85 ± 0,61 | 33,39 ± 1,14 |
Tabela 1: Medido o fluxo radiante da matriz micro-LED e a intensidade de luz correspondente.
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Discussion
Um tratamento bem-sucedido das taquiarritmias cardíacas é fundamental para a terapia cardíaca. No entanto, os mecanismos biofísicos subjacentes ao início, perpetuação e término da arritmia não são totalmente compreendidos. Portanto, a pesquisa cardíaca visa otimizar a terapia de choque elétrico para uma terminação mais suave das arritmias, aumentando assim a qualidade de vida dos pacientes 28,29,30,31. Abordagens elétricas de baixa energia prometem uma redução significativa dos efeitos colaterais graves, no entanto, ainda podem induzir excitação muscular indesejada. A optogenética cardíaca poderia superar essa limitação e fornecer não apenas uma técnica de terminação suave dos tecidos, mas também uma plataforma flexível para investigar o controle direcionado específico da arritmia de ondas de excitação semelhantes a vórtices no coração murino intacto e em culturas celulares32,33.
Diante dessa motivação, uma configuração robusta de fotoestimulação, bem como um protocolo foram projetados e implementados, ambos oferecendo um sistema óptico altamente adaptável, que poderia ser facilmente estendido para estudos de mapeamento óptico panorâmico tridimensional34.
Pode-se demonstrar que as arritmias cardíacas podem ser terminadas com sucesso com diferentes taxas de sucesso, dependendo dos parâmetros escolhidos para a fotoestimulação, por exemplo, a área iluminada no coração. Os resultados apresentados sugerem que o aumento da superfície irradiada recrutou um número crítico de cardiomiócitos extinguindo a atividade caótica por bloqueio de condução, como também demonstrado em22. Neste estudo, a energia necessária para fotodesfibrilar é E = 10,69 ± 0,37 mJ (usando nove micro-LEDs, 30 pulsos e largura de pulso Wdef = 20 ms). Isso acaba sendo menor do que o relatado anteriormente em 22,24 com E 22 = 228,8 mJ e E 24 = 153,6 mJ, onde uma área maior 22 ou todo o coração 24 foram iluminados, respectivamente. No entanto, em comparação com a abordagem mostrada em 35, onde uma área padronizada bem delimitada é iluminada com 10 pulsos de fotodesfibrilação resultando em E 35 = 1,8 mJ, a energia de fotodesfibrilação no presente estudo é notavelmente maior. Em contraste com as outras três abordagens, uma taxa de sucesso superior a 90% não pôde ser alcançada com o protocolo apresentado. Uma possível razão para o desempenho reduzido, apesar de uma maior energia de fotodesfibrilação, pode ser que a complexidade da arritmia subjacente não está sendo considerada. Com relação aos resultados apresentados em 35, onde uma alta taxa de terminação é realizada iluminando uma pequena área no coração e, simultaneamente, medindo a dinâmica espaço-temporal de uma arritmia, a abordagem apresentada certamente pode ser melhorada considerando o controle de feedback, que responde com um padrão diferente de iluminação micro-LED dependendo do estado atual do coração. Além disso, também foi demonstrado que, embora as arritmias nem sempre possam ser terminadas com o método atual, a dinâmica complexa intrínseca pode ser perturbada durante a fotoestimulação, levando a um estado temporal mais ordenado. Como mostrado em36, a taxa de terminação é significativamente diferente quando se trata de arritmias monomórficas (mais ordenadas) e polimórficas (menos ordenadas). Portanto, o passo lógico para uma melhor taxa de desfibrilação pode ser influenciar a dinâmica cardíaca durante um episódio de FV, transformar a arritmia em um padrão menos complexo e terminar com outro conjunto de pulsos, construindo desta forma uma abordagem de fotoestimulação em duas etapas.
Em relação ao protocolo de perfusão, as etapas mais críticas são encontradas na correta extração e preparo do coração, bem como no ajuste correto da óptica de mapeamento óptico. O envolvimento do mapeamento óptico requer estritamente a seleção adequada de espectros de corante, fontes de luz de excitação apropriadas e filtros ópticos bem escolhidos para a câmera29. Caso contrário, os sinais ópticos gravados podem ser muito barulhentos e também podem conter conversas cruzadas de fotoestimulação com excitação de corante. A análise subsequente exigiria, portanto, o pós-processamento de sinais com vários filtros analíticos e suavização de imagens, muitas vezes resultando em piora.
Outro passo crucial neste protocolo é a colocação correta e precisa da matriz micro-LED. Como o cabo de interconexão entre a matriz micro-LED e o driver é muito fino e flexível, às vezes é um desafio garantir que a matriz esteja localizada aproximadamente no mesmo local na superfície do coração para cada experimento. Para facilitar o posicionamento e fixar a posição adquirida da matriz micro-LED, um suporte foi projetado e impresso em 3D, permitindo que a matriz fosse conectada a um micromanipulador. Isso dá mais controle sobre o movimento da matriz na solução do Tyrode. Dependendo do material escolhido para o cabo de interconexão da matriz de micro-LED, o uso de um suporte pode não ser necessário.
Além disso, outra etapa crítica do protocolo é a adição de drogas pró-arritmia, como, por exemplo, o Pinacidil37. Como vários compostos químicos são bem conhecidos por alterar a resposta fisiológica do coração, isso deve ser considerado ao analisar e interpretar os resultados. No que diz respeito ao mapeamento óptico, o protocolo proposto utiliza a Blebistatina como um desacoplador mecânico. Isso tem a vantagem de remover artefatos de movimento durante a gravação, mas também pode prolongar o APD27. Para superar essa desvantagem, a análise de métodos de rastreamento de movimento durante a gravação poderia ser considerada38,39. Desta forma, a condição fisiológica normal do coração seria preservada e um sinal de alta qualidade pode ser obtido.
Embora tenha sido comprovado que o protocolo apresentado pode ser utilizado para fotodesfibrilação multissítio, ele ainda apresenta algumas limitações. Verificou-se que, em alguns casos, a fibrilação não pode ser terminada pela fotoestimulação baseada em micro-LED, mas apenas ser perturbada, resultando em mudanças de frequência. Uma hipótese é que as ondas sinuosas no coração estão apenas sendo deslocadas do ventrículo esquerdo, regenerando-se em outras partes do coração. Comparado com outros métodos, como a iluminação global24, o presente método oferece uma menor taxa de sucesso devido a uma menor cobertura do coração. No entanto, estamos confiantes de que, com o método de reconhecimento adequado de atividade espiral baseado em hardware, a melhoria da taxa de sucesso de terminação é viável.
Em conclusão, o sistema de fotoestimulação apresentado estabelece uma poderosa ferramenta experimental para múltiplas abordagens de cardioversão e estudos de manipulação de arritmia cardíaca. O conhecimento aprendido neste sistema será utilizado para investigar e avaliar novos potenciais (foto) protocolos de desfibrilação em modelos animais de grande porte clinicamente relevantes.
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Disclosures
Os autores não declaram qualquer conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Marion Kunze e Tina Althaus por seu excelente suporte técnico durante os experimentos. A investigação que conduziu aos resultados recebeu financiamento do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia FP7/2007-2013 ao abrigo da convenção de subvenção número HEALTH-F2-2009-241526. O apoio também foi fornecido pelo Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular, DZHK e.V. (Projeto MD28), site parceiro Goettingen, a Fundação Alemã de Pesquisa CRC 1002 (projeto C03) e a Sociedade Max Planck. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG, número de concessão EXC 1086).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25x36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
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