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Gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62335
Automatic Translation
*1,2, *1, 8,9, 1,3,4,6, 8,9, 1,5,6,7
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg
* These authors contributed equally

Summary

Questo lavoro riporta un metodo per controllare il ritmo cardiaco di cuori murini intatti di topi transgenici channelrhodopsin-2 (ChR2) utilizzando la fotostimolazione locale con un array di micro-LED e la mappatura ottica simultanea del potenziale della membrana epicardica.

Abstract

Le tachiaritmie ventricolari sono una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. La defibrillazione elettrica con scosse elettriche ad alta energia è attualmente l'unico trattamento per la fibrillazione ventricolare pericolosa per la vita. Tuttavia, la defibrillazione può avere effetti collaterali, tra cui dolore intollerabile, danno tissutale e peggioramento della prognosi, indicando una significativa necessità medica per lo sviluppo di strategie di gestione del ritmo cardiaco più delicate. Oltre agli approcci elettrici che riducono l'energia, l'optogenetica cardiaca è stata introdotta come un potente strumento per influenzare l'attività cardiaca utilizzando canali ionici a membrana sensibili alla luce e impulsi luminosi. Nel presente studio, verrà descritto un metodo robusto e valido per la fotostimolazione di successo di cuori murini intatti perfusi di Langendorff basato sulla stimolazione multi-sito applicando un array 3 x 3 di diodi micro emettitori di luce (micro-LED). La mappatura ottica simultanea delle onde di tensione della membrana epicardica consente di studiare gli effetti della stimolazione regionale-specifica e valuta l'attività cardiaca appena indotta direttamente in loco. I risultati ottenuti mostrano che l'efficacia della defibrillazione dipende fortemente dai parametri scelti per la fotostimolazione durante un'aritmia cardiaca. Sarà dimostrato che l'area illuminata del cuore svolge un ruolo cruciale per il successo della terminazione e come è possibile ottenere il controllo mirato dell'attività cardiaca durante l'illuminazione per modificare i modelli di aritmia. In sintesi, questa tecnica offre la possibilità di ottimizzare la manipolazione del meccanismo in loco sulla strada per il controllo del feedback in tempo reale del ritmo cardiaco e, per quanto riguarda la specificità della regione, nuovi approcci nel ridurre il potenziale danno al sistema cardiaco rispetto all'uso di applicazioni di scosse elettriche non specifiche.

Introduction

Le prime indagini sulle dinamiche spazio-temporali durante l'aritmia hanno rivelato che i complessi schemi elettrici durante la fibrillazione cardiaca sono guidati da onde di eccitazione rotanti simili a vortici1. Questa scoperta ha fornito nuove informazioni sui meccanismi alla base delle aritmie, che hanno poi portato allo sviluppo di nuove terapie di terminazione elettrica basate sull'eccitazione multi-sito del miocardio 2,3,4. Tuttavia, i trattamenti che utilizzano la stimolazione del campo elettrico non sono locali e possono innervare tutte le cellule eccitabili circostanti, incluso il tessuto muscolare, causando danni cellulari e tissutali, nonché dolore intollerabile. A differenza delle terapie elettriche, gli approcci optogenetici forniscono una tecnica specifica e protettiva dei tessuti per evocare potenziali d'azione dei cardiomiociti con elevata precisione spaziale e temporale. Pertanto, la stimolazione optogenetica ha il potenziale per un controllo minimamente invasivo dei modelli di attivazione caotica durante la fibrillazione cardiaca.

L'introduzione della canalistica ionica sensibile alla lucerhodopsin-2 (ChR2) nelle cellule eccitabili tramite manipolazione genetica 5,6,7, ha permesso la depolarizzazione del potenziale di membrana delle cellule eccitabili utilizzando la fotostimolazione. Sono state sviluppate diverse applicazioni mediche, tra cui l'attivazione delle reti neuronali, il controllo dell'attività cardiaca, il ripristino della vista e dell'udito, il trattamento delle lesioni del midollo spinale e altre 8,9,10,11,12,13,14. L'applicazione di ChR2 in cardiologia ha un potenziale significativo grazie al suo tempo di risposta al millisecondo15, rendendolo adatto per il controllo mirato della dinamica cardiaca aritmica.

In questo studio, viene mostrata la fotostimolazione multi-sito di cuori intatti di un modello murino transgenico. In sintesi, una linea di topi transgenici alfa-MHC-ChR2 è stata istituita nell'ambito del Settimo Programma Quadro FP7/2007-2013 della Comunità Europea (HEALTH-F2-2009-241526) e gentilmente fornita dal Prof. S. E. Lehnart. In generale, i maschi adulti transgenici C57/B6/J, che esprimono Cre-ricombinasi sotto controllo dell'alfa-MHC, sono stati accoppiati per accoppiarsi con B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Poiché la cassetta STOP cardiaca è stata eliminata nella seconda generazione, la prole ha mostrato un'espressione stabile di MHC-ChR2 ed è stata utilizzata per mantenere le colonie fotosensibili cardiache. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con topi adulti di entrambi i sessi ad un'età di 36 - 48 settimane. L'illuminazione è ottenuta utilizzando un array di micro-LED 3 x 3, fabbricato come descritto in16,17 tranne per il fatto che l'alloggiamento a base di silicio e le fibre corte di vetro ottico non sono implementati. Il suo primo utilizzo in un'applicazione cardiaca si trova in18. Un array lineare di micro-LED basato su una tecnologia di fabbricazione simile è stato applicato come sonda penetrante per la stimolazione cardiaca19. I micro-LED sono disposti in un array 3 x 3 con un passo di 550 μm, fornendo sia un'elevata risoluzione spaziale che un'elevata potenza radiante su un'area molto piccola. Gli autori dimostrano in questo lavoro una versatile fotostimolazione locale multi-sito che può aprire la strada allo sviluppo di nuovi metodi di terapia anti-aritmica.

Il seguente protocollo sperimentale prevede una perfusione retrograda di Langendorff ex vivo, per la quale l'aorta cannulata funge da ingresso di perfusione. A causa della pressione di perfusione applicata e della contrazione cardiaca, il perfusato scorre attraverso le arterie coronarie, che si diramano dall'aorta. Nel lavoro presentato, il cuore viene perfuso utilizzando una configurazione a pressione costante ottenuta elevando i serbatoi di perfuso a 1 m di altezza, equivalente a 73,2 mmHg, che produce una portata di 2,633 ± 0,583 ml / min. Due tipi di soluzione di Tyrode sono usati come perfufuto durante l'esperimento. La soluzione di Regular Tyrode supporta un ritmo sinusale stabile, mentre la soluzione di Low-K+ Tyrode viene miscelata con Pinacidil per consentire l'induzione dell'aritmia nei cuori murini. L'utilizzo di un bagno d'acqua esagonale consente l'osservazione del cuore attraverso sei diverse finestre planari, consentendo l'accoppiamento di più componenti ottici con meno distorsione per rifrazione.

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Protocol

Tutti gli esperimenti hanno seguito rigorosamente il regolamento sul benessere degli animali, in accordo con la legislazione tedesca, le disposizioni locali e in conformità con le raccomandazioni della Federazione delle associazioni europee di scienze degli animali da laboratorio (FELASA). La domanda di approvazione degli esperimenti sugli animali è stata approvata dall'autorità responsabile per il benessere degli animali e tutti gli esperimenti sono stati segnalati ai nostri rappresentanti per il benessere degli animali.

1. Preparazione dell'esperimento e materiali

  1. Configurazione della mappatura ottica
    NOTA: la configurazione ottica e la configurazione elettrica sono illustrate nella Figura 1. Tutti i componenti utilizzati nella configurazione ottica ed elettrica sono elencati in dettaglio nella tabella dei materiali.
    1. Utilizzare LED 1 e LED 2 per l'induzione dell'aritmia e la defibrillazione di backup. Scegli LED ad alta potenza con una lunghezza d'onda λblu vicino a 475 nm, che è il picco della lunghezza d'onda di eccitazione di ChR26. Per restringere ulteriormente lo spettro ottico, utilizzare un filtro passa-banda da 470 ± 20 nm.
      NOTA: In questo lavoro, LED 1 e LED 2 hanno un flusso radiante tipico da 3,9 a 5,3 W, secondo la scheda tecnica20.
    2. Illuminare l'epicardio per la mappatura ottica con un LED rosso ad alta potenza (LED 3 in Figura 1), che emette luce con una lunghezza d'onda centrale di λrosso = 625 nm e un flusso radiante di 700 mW21. La luce rossa viene filtrata con un filtro passa banda 628 ± 20 nm e riflessa da uno specchio dicroico a passaggio lungo (DM) con una lunghezza d'onda di taglio di λDM = 685 nm.
    3. Utilizzare un filtro di emissione con λfiltro-camma = 775 ± 70 nm davanti all'obiettivo della telecamera per registrare solo l'emissione di fluorescenza dell'attività cardiaca. Utilizzare un obiettivo veloce adatto per applicazioni in condizioni di scarsa illuminazione.
      NOTA: La frequenza di fibrillazione di un cuore di topo varia da 20 a 35 Hz; pertanto, utilizzare una fotocamera abbastanza veloce per registrare con una frequenza da 1 a 2 kHz o anche superiore.
  2. Array di micro-LED
    NOTA: Gli array di micro-LED qui applicati sono realizzati utilizzando l'elaborazione di microsistemi come ulteriormente dettagliato altrove16,17.
    1. Spin coat uno strato di poliimmide (PI) spesso 5 μm su substrati di silicio da 4 pollici (lucidati su un solo lato, spessi 525 μm).
    2. Polimerizzare questo strato di PI ad una temperatura massima di 450 °C in atmosfera di azoto. Mantenere costante la temperatura massima per 10 minuti.
    3. Depositare e modellare un fotoresist di inversione dell'immagine (PR) utilizzando la litografia ultravioletta (UV) e lo sputter depositano uno strato di platino sottile (Pt) di 250 nm.
    4. Addensare questa metallizzazione a base di Pt galvanizzando uno strato di oro (Au) spesso 1 μm con il PR modellato che funge da strato di mascheratura.
    5. Prima di rivestire in rotazione un secondo strato di PI, esporre il wafer con il suo primo strato PI e la metallizzazione elettrolitica Au a un plasma di ossigeno che attiva chimicamente la superficie dello strato PI.
    6. Polimerizzare nuovamente il secondo strato PI a 450 °C, applicare la litografia UV per modellare uno strato PR e aprire i pad di contatto dell'array per i chip micro-LED e il circuito stampato (PCB) di interfacciamento mediante incisione ionica reattiva (RIE) utilizzando il PR modellato come strato di mascheramento.
      NOTA: in questa fase del processo RIE, si consiglia di applicare 200 W e 100 W per 10 e 30 minuti, rispettivamente, per definire le aperture del pad di contatto e la forma esterna dell'array di micro-LED bidimensionale (2D).
    7. Striscia il PR usando solventi e incisione al plasma. Ispessire ulteriormente i cuscinetti di contatto galvanizzando un ulteriore strato d'oro spesso 6 μm.
    8. Collegare i chip micro-LED ai pad di contatto utilizzando un bonder flip-chip.
    9. Attivare la superficie PI in un plasma di ossigeno e riempire i chip micro-LED con un adesivo privo di solventi. Polimerizzare quindi l'adesivo per 12 h a 120 °C.
    10. Per incapsulare i chip micro-LED, eseguire un altro trattamento al plasma con Argon e applicare manualmente un sottile strato di fluoropolimero. Pre-polimerizzare questo strato a 80 °C per 1 ora.
    11. Applicare manualmente il silicone come strato finale di incapsulamento dopo aver esposto l'array di micro-LED a un plasma di ossigeno, utilizzato per migliorare l'adesione del silicio allo strato di fluoropolimero sottostante. Polimerizzare lo strato di silicone a 80 °C e 180 °C per 1 h ciascuno. Queste fasi finali di polimerizzazione polimerizzano completamente anche lo strato di fluoropolimero.
    12. Saldare i pad di contatto del substrato PI a un circuito stampato che trasporta connettori a striscia per l'interconnessione dell'array a una strumentazione esterna. Coprire i cuscinetti di saldatura sul PCB usando un adesivo.
  3. Configurazione elettrica
    1. Utilizzare elettrodi adatti per la registrazione di un elettrocardiogramma (ECG), ad esempio elettrodi di argento/cloruro d'argento o elettrodi monofasici con potenziale d'azione (MAP) e un amplificatore ECG per monitorare continuamente l'attività elettrica del cuore. Inoltre, utilizzare un dispositivo di acquisizione appropriato (AD) per registrare tutti i segnali elettrici ottenuti.
    2. Scegli un driver adatto per i LED ad alta potenza (LED 1, LED 2 e LED 3), in grado di gestire la corrente massima applicata a ciascun dispositivo. Utilizzare un generatore di funzioni arbitrarie (AFG) per controllare con precisione l'uscita dei driver LED.
    3. Utilizzare un driver LED multicanale per controllare la corrente che scorre attraverso l'array di micro-LED. Un AFG con uscite multiple è adatto anche per questo compito.
      NOTA: Si consiglia di scegliere driver LED che limitino la corrente alla corrente massima del micro-LED, altrimenti i diodi potrebbero danneggiarsi. Un esempio di driver micro-LED multicanale è descritto in un altro lavoro18. Se necessario, AFG o qualsiasi altro driver LED potrebbe essere collegato a un computer per controllare a distanza le impostazioni micro-LED. In questo caso, collegare il driver LED al computer con il protocollo di comunicazione di propria scelta, ad esempio General Purpose Interface Bus (GPIB) o una connessione seriale.

   

2. Procedure sperimentali

  1. Preparazione della soluzione
    1. Preparare la soluzione di Tyrode: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1,8 mM CaCl 2, 1,2 mM KH2 PO4, 5,6 mM glucosio, 0,1% BSA/albumina.
    2. Preparare la soluzione di Tyrode a basso K+: la soluzione di Tyrode a basso K+ viene prodotta allo stesso modo della soluzione di Tyrode normale, tranne per il fatto che viene aggiunta solo la metà della quantità di KCl (2 mM invece di 4 mM KCl).
      NOTA: Per un esperimento della durata di 3 ore, di solito sono sufficienti 2-3 L di Tyrode Low-K+ (miscelati inoltre con Blebbistatin (Passo 2.1.5) se viene eseguita la mappatura ottica) e 1-2 L di Tyrode normale.
    3. Aggiungere Pinacidil alla soluzione di Low-K+ Tyrode per facilitare il processo di induzione dell'aritmia, come descritto alpunto 22, per ottenere una concentrazione di 100 mM. Indossare guanti protettivi da laboratorio quando si maneggia Pinacidil.
    4. Preparare 1 mL di 50 μM DI-4-ANBDQPQ con la soluzione normale di Tyrode. Proteggere il colorante dalla luce per evitare il fotosbiancamento.
    5. Preparare una soluzione madre 10 mM di blebbistatina. Per la mappatura ottica, miscelare Blebbistatin con la soluzione 100 mM di Pinacidil-Tyrode (Fase 2.1.3) per ottenere una soluzione da 5 μM. Indossare guanti protettivi da laboratorio quando si maneggia Blebbistatin.
      NOTA: Tenere da parte sia il colorante che la soluzione di blebbistatina fino all'inizio della mappatura ottica.
  2. Perfusione di Langendorff
    NOTA: La configurazione è composta da due serbatoi per le due soluzioni Tyrode. Sono collegati a una trappola a bolle tramite tubi con rubinetti a tre vie. Il cuore viene successivamente attaccato alla trappola a bolle da un connettore Luer lock, e viene quindi sospeso in un bagno d'acqua esagonale. Il bagno d'acqua è, a sua volta, collegato a un contenitore di rifiuti per raccogliere la soluzione di Tyrode usata.
    1. Pulire tutti i tubi prima di ogni esperimento con acqua completamente demineralizzata.
    2. Aerare entrambe le soluzioni di Tyrode con Carbogen (5% CO 2 e 95% O2) per 30 minuti a temperatura ambiente prima dell'inizio dell'esperimento. Regolare il valore pH delle soluzioni di Tyrode a 7,4 con NaOH.
    3. Riempire 500 mL di ogni soluzione di Tyrode nel serbatoio corrispondente e disaerare i tubi e la trappola a bolle facendo passare la soluzione di Tyrode attraverso il sistema di perfusione fino a quando non si vedono più bolle d'aria intrappolate nei tubi o nella trappola a bolle.
    4. Continuare ad aerare le soluzioni di Tyrode durante l'intero esperimento nei serbatoi con Carbogen per garantire che il pH del perfufato rimanga stabile più tardi durante la perfusione.
    5. Riscaldare il sistema di perfusione a 37 °C con una pompa di calore ad acqua. Mantenere costante la temperatura del perfusto all'interno del bagno d'acqua utilizzando un elemento riscaldante aggiuntivo come un cavo riscaldante impermeabile.
      NOTA: Durante l'esperimento, è fondamentale riempire i serbatoi del Tyrode prima che si svuotino. Altrimenti, le bolle d'aria possono entrare nel cuore, che può ostruire i vasi e portare all'ischemia.
  3. Preparazione del mouse
    1. Iniettare per via sottocutanea 0,1 ml di 500 cioè eparina 30 minuti prima della procedura di isolamento cardiaco.
    2. Riempire una capsula di Petri da 6 cm e una siringa da 2 ml con la soluzione di Tyrode ghiacciata. Posto sotto il microscopio stereoscopico.
    3. Eseguire l'anestesia a breve termine dei topi con un ambiente saturo di isoflurano per 2 minuti e la lussazione cervicale immediata in seguito.
      NOTA: Al fine di verificare un'anestesia sufficiente è assolutamente necessario controllare il riflesso inter-dito negativo.
    4. Aprire il torace, rimuovere il cuore, come descritto altrove23, e metterlo nella capsula di Petri da 6 cm con la soluzione ghiacciata di Tyrode. Il battito cardiaco sarà diminuito a causa del calo di temperatura.
    5. Eseguire la preparazione fine al microscopio stereoscopico, come dettagliato altrove23. Attaccare l'aorta sull'ago smussato e fissare la nave con materiale di sutura.
    6. Come controllo, iniettare la soluzione ghiacciata di Tyrode attraverso l'ago nel cuore e controllare che il cuore sia montato saldamente. Questo passaggio risciacqua anche il sangue rimanente dal cuore.
    7. Trasferire il cuore montato al sistema di perfusione. Assicurarsi che il perfusato scorra per evitare che l'aria entri nel cuore mentre si collega l'ago con la trappola a bolle. Controllare che il cuore sia coperto con la soluzione di Tyrode a bagnomaria. I passaggi 2.3.4, 2.3.5 e 2.3.7 sono illustrati nella Figura 2.
    8. Assicurati che il cuore inizi a battere entro pochi minuti. Lasciare che il cuore si adatti alla configurazione della perfusione per 15-20 minuti, quindi passare alla soluzione di Tyrode a basso K+ con Pinacidil (Fase 2.1.3) rispettivamente alla soluzione di Tyrode a basso K+ con Pinacidil e Blebbistatina (Fase 2.1.5) se deve essere eseguita la mappatura ottica.
  4. Induzione di aritmia e defibrillazione ottica
    1. Posizionare uno degli elettrodi ECG il più vicino possibile alla superficie del cuore per garantire una buona qualità del segnale. Sospendere il secondo elettrodo ECG nella soluzione di Tyrode. Assicurarsi che l'ECG acquisito venga registrato dall'AD di scelta.
    2. Posizionare l'array di micro-LED sull'area di interesse dello studio, ad esempio, sul ventricolo sinistro.
    3. Cambiare la perfusione in Tyrode a basso K+ con Pinacidil e perfondere il cuore per 15-30 minuti.
    4. Per indurre l'aritmia, illuminare il cuore con LED 1 e LED 2 con un treno di 20-50 impulsi luminosi con una frequenza f ind da 25 a 35 Hz, durata dell'impulso Wind da 2 a 15 ms e intensità luminosa LIopt_ind di 2,8 mW mm-2.
    5. Ripetere il processo fino a quando non viene indotta l'aritmia.
      NOTA: Le aritmie sono facili da identificare nel segnale ECG perché la frequenza e la morfologia del segnale differiscono dal normale ritmo sinusale. Se l'aritmia termina entro i prossimi 5 secondi, classificarla come auto-terminata e iniziare un nuovo tentativo di induzione.
    6. Una volta rilevata visivamente un'aritmia prolungata, applicare una raffica di impulsi con diverse larghezze W def e frequenze fdef, utilizzando tre, sei o nove micro-LED dell'array a unimpulso di corrente pulsata I di 15 mA che produce un'intensità luminosa LIμLED = 33,31 ± 2,05 mW mm-2.
    7. Se l'aritmia continua dopo cinque prove di defibrillazione basate su array di micro-LED, classificare il tentativo come non riuscito e avviare la defibrillazione di backup.
    8. Per la defibrillazione di backup, utilizzare LED 1 e LED 2 utilizzando gli stessi parametri di temporizzazione impostati per l'array di micro-LED.
      NOTA: Poiché il cuore è esposto a stress ischemico e metabolico durante l'intero periodo sperimentale, è possibile che i tentativi di interruzione dell'aritmia non abbiano successo anche con la defibrillazione di backup. Ogni volta che ciò accade, cambiare la soluzione di perfusione con la normale Tyrode e lasciare che il cuore si riprenda per 5-10 minuti. Quando l'ECG ritorna al ritmo sinusale, ripetere nuovamente il protocollo dal passaggio 2.4.3.
  5. Mappatura ottica
    1. Perfondere il cuore con la soluzione di blebbistatina preparata al punto 2.1.5 e attendere fino a quando non si verifica il disaccoppiamento meccanico. Ciò si ottiene quando il cuore smette di battere, ma un segnale ECG è ancora misurabile.
      NOTA: Miscelando la soluzione di blebbistatina alla concentrazione menzionata e mantenendo il cuore perfuso con questa soluzione mantiene l'attività meccanica cardiaca disaccoppiata dall'attività elettrica durante l'intero esperimento.
    2. Somministrare il colorante di tensione da 1 mL DI-4-ANBDQPQ (preparato al punto 2.1.4) come bolo nella trappola a bolle della perfusione di Langendorff. Attendere da 5 a 10 minuti per consentire al colorante di perfondere uniformemente il cuore.
      NOTA: Evitare il fotosbiancamento del colorante spegnendo la luce rossa ogni volta che non viene effettuata alcuna registrazione. Se il rapporto segnale/rumore della registrazione diventa troppo piccolo (il segnale acquisito è troppo rumoroso), ripetere i passaggi 2.1.4 e 2.5.2.
    3. Mettere a fuoco la fotocamera sulla superficie cardiaca, accendere LED 3 e applicare una potenza ottica di 1,27 mW mm-2 .
    4. Spegni le luci del laboratorio e inizia a registrare. Assicurarsi che venga acquisito un segnale ottico confrontando la frequenza del segnale ottenuto con la frequenza dell'ECG registrato. Ciò garantisce che il segnale ottico ottenuto sia puramente correlato all'attività elettrica del cuore.
      NOTA: Poiché la luce di fluorescenza emessa dal colorante è molto settimanale, la mappatura ottica viene eseguita in una stanza buia. Ciò evita interferenze di segnale da qualsiasi altra fonte di luce.

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Representative Results

Il protocollo consente l'induzione di aritmie ventricolari in cuori murini intatti utilizzando impulsi di fotostimolazione generati da LED 1 e LED 2 (Figura 1) con una frequenza f ind compresa tra 25 Hz e 35 Hz e una durata dell'impulso Wind compresa tra 2 ms e 10 ms. Si noti che lo scopo di tali impulsi luminosi rapidi non è quello di catturare il ritmo cardiaco, ma piuttosto di sbilanciare l'attività cardiaca in modo che possano essere generate onde elettriche irregolari, che quindi facilitano un'aritmia. Il vantaggio di indurre aritmia con luce rispetto all'induzione con stimolazione elettrica è che nessun artefatto viene provocato nell'ECG, fornendo la possibilità di post-analizzare il segnale acquisito senza restrizioni e persino valutare la risposta elettrica del cuore durante la stimolazione rapida, questo fatto offre anche la possibilità di osservare il comportamento del cuore durante la foto-defibrillazione. Questo non è possibile con i metodi di induzione elettrica o defibrillazione. Tuttavia, se la configurazione utilizzata non consente l'utilizzo di LED esterni ad alta potenza, ad esempio, a causa di vincoli di luogo, un elettrodo di stimolazione aggiuntivo può essere posizionato sul cuore per indurre aritmia, come mostrato altrove 3,22,24.

Una volta indotta la fibrillazione l'aritmia deve durare almeno 5 secondi per garantire che si sostenga, successivamente vengono avviati i tentativi di defibrillazione basati su micro-LED. Poiché i parametri principali dell'aritmia cardiaca, come la lunghezza del ciclo di base o la frequenza dominante, l'ampiezza e la morfologia, sono in continua evoluzione e poiché non è possibile prevedere quali parametri di fotodefibrillazione forniscano il miglior risultato, è stato di notevole interesse capire se esiste una relazione tra frequenza, larghezza dell'impulso, area di fotostimolazione e tasso di terminazione. Pertanto, sono stati testati una serie di esperimenti con diverse frequenze f def, numero di micro-LED e durate degli impulsi Wdef ed è stata estratta la percentuale di successo per N = 11 topi, come mostrato nella Figura 3.

Si potrebbe dimostrare che impulsi di durata da 1 a 20 ms possono defibrillare con diverse percentuali di successo (Figura 3). Poiché l'intensità luminosa LIμLED è stata mantenuta costante durante ogni impulso di fotostimolazione, come menzionato nella fase 2.4.6, e il tasso di successo di tre micro-LED contro nove è notevolmente inferiore, i risultati presentati suggeriscono che l'area coperta sul cuore, il numero di micro-LED e quindi il flusso radiante totale applicato sono fattori cruciali per ottenere la defibrillazione. Considerando che ogni micro-LED sull'array è una sorgente luminosa lambertiana e che sono posizionati direttamente sulla superficie del cuore in modo che la distanza approssimativa dal tessuto sia zero, si può presumere che il contorno di irradianza dell'area illuminata sul cuore quando si utilizza un singolo micro-LED sia equivalente a AμLED = 0,059 mm², come mostrato anche in25 per LED rettangolari piatti. Inoltre, sebbene alcuni fotoni possano lasciare i micro-LED lateralmente dai bordi, il contributo di questi all'intensità luminosa totale è considerato così piccolo che il loro effetto può essere trascurato. Per quantificare la luce irradiata dell'array, gli autori hanno misurato il flusso radiante dall'array di micro-LED con un misuratore di potenza commerciale e hanno calcolato l'intensità della luce che raggiunge il cuore come mostrato nella Tabella 1. Dalla Tabella 1 si può anche leggere che il flusso radiante aumenta con il numero di micro-LED utilizzati, ma l'intensità luminosa rimane costante a causa delle implicazioni del profilo di illuminazione menzionate prima.

È interessante notare che si può anche osservare che il tasso di successo di nove LED con W def = 1 ms (Figura 3a) e W def = 20 ms (Figura 3d) a una frequenza di defibrillazione f def = 18 Hz e fdef = 20 Hz sono relativamente alti. Considerando che la frequenza media delle aritmie indotte è 22,55 ± 4,03 Hz, questo fatto potrebbe indicare che per i cuori murini ChR2, il tasso di successo aumenta significativamente quanto più la frequenza di stimolazione è vicina alla frequenza dell'aritmia. Questo è mostrato anche nelle simulazioni numeriche26. Tuttavia, questo non può essere facilmente generalizzato perché la frequenza dominante delle aritmie complesse è in continua evoluzione. Per illustrare questo, la Figura 4 mostra due diversi tentativi di defibrillazione con fdef = 14 Hz. All'inizio del segmento ECG in Figura 4a) e secondo la morfologia del segnale ECG viene mostrata una fibrillazione ventricolare (VF). Quando inizia la fotostimolazione micro-LED, la fibrillazione si trasforma in un modello più ordinato che è più probabile che sia una tachicardia ventricolare (VT). Ogni volta che l'array di micro-LED viene spento, le onde VF caotiche originali prendono nuovamente il sopravvento. Pertanto, l'aritmia non è terminata. Sebbene in questo esempio il VF non possa essere terminato con i parametri specificati, viene disturbato e può essere modificato in un modello più regolare (VT). Figura 4b Il segmento 1 mostra che la frequenza dominante di 24 Hz aumenta leggermente fino a quando inizia la fotostimolazione e il VF viene trasformato in un VT nel segmento 2, dove la frequenza dominante scende a 14 Hz. Inoltre, la Figura 4c mostra un VT che può terminare con la stessa f def della Figura 4a, ma con una diversa Wdef. In primo luogo, la fotostimolazione micro-LED cambia la morfologia dell'aritmia, per terminarla infine con la cattura del ritmo 1:1 dal 19° impulso in poi. Questi risultati potrebbero implicare che i parametri di fotodefibrillazione, ad esempio Wdef, devono adattarsi al cambiamento morfologico dell'aritmia nel tempo. Gli esperimenti che hanno portato a questi risultati sono stati condotti senza utilizzare blebbistatin a causa del conseguente cambiamento nella durata del potenziale d'azione (APD)27. Pertanto, in queste serie non è stata eseguita alcuna mappatura ottica.

Un'altra serie di esperimenti è stata eseguita per la mappatura ottica utilizzando il colorante potenziometrico spostato verso il rosso (Passo 2.1.4). La mappatura ottica con telecamere ad alta velocità consente di osservare le onde di eccitazione che si propagano sulla superficie del cuore durante il ritmo sinusale (Figura 5) e le tachiaritmie complesse28. Poiché la variazione frazionaria del colorante potenziometrico è molto bassa, i video ottenuti sono stati post-elaborati utilizzando un linguaggio di programmazione matematico. Il primo passo per migliorare la qualità dei segnali ottici è rimuovere il rumore applicando un filtro di livellamento gaussiano con una deviazione standard di σ = 1, seguito da un filtro passa banda con frequenze d'angolo falto = 0,1 Hz e fbasso = 70 Hz. La banda di arresto a falto rimuove i cambiamenti lenti nel segnale che non sono correlati alla frequenza sinusale del cuore che si trova tra 3 Hz < fsinusale < 8 Hz, mentre la banda di arresto fbassa rimuove il rumore ad alta frequenza che viene catturato dalla telecamera. È importante notare che entrambe le emissioni di luce blu da LED 1, LED 2 e dall'array di micro-LED possono causare diafonia e un segnale di interferenza molto elevato nella mappatura ottica. Inoltre, è stato osservato che nemmeno un filtro passa-banda molto stretto davanti alla telecamera, con lunghezza d'onda λfiltro-cam , come menzionato nella fase 1.2.3, filtrava l'influenza della luce blu. Ciò potrebbe essere causato in parte dalla risposta di eccitazione del colorante stesso. Fate quindi molta attenzione quando scegliete le ottiche per la mappatura ottica. Per i mezzi di analisi video, tutti i fotogrammi in cui è stata registrata la luce blu hanno dovuto essere trascurati in modo che in molti casi non sia possibile visualizzare il cuore durante la fotostimolazione, come menzionato anche in un altro studio29.

Figure 1
Figura 1: Schema della configurazione elettrica e ottica. (a) Il LED 1 e il LED 2 forniscono una sorgente di luce blu utilizzata per l'induzione dell'aritmia e la defibrillazione di riserva. Il LED 3 viene utilizzato come sorgente luminosa di eccitazione per il colorante spostato verso il rosso DI-4-ANBDQPQ. La luce rossa è diretta al cuore per mezzo dello specchio dicroico DM. La luce di emissione mostrata in rosso scuro viene registrata dalla telecamera ad alta velocità attraverso un filtro di emissione, come menzionato nel testo. Gli elettrodi LED 2 ed ECG non sono mostrati per semplicità. b) Un segmento del segnale ECG registrato è indicato in rosso. Il blu scuro mostra gli impulsi luminosi del LED 1 e del LED 2 ad una frequenza f ind = 35 Hz e Wind = 4 ms utilizzati per indurre la fibrillazione. Immediatamente dopo aver terminato lo stimolo luminoso, si può osservare la fibrillazione ventricolare (VF). La fotostimolazione basata su micro-LED mostrata in azzurro (f def = 16 Hz, Wdef = 20 ms) termina con successo l'aritmia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Preparazione del cuore. (a) Aprire il petto di un topo che mostra il cuore intatto e gli organi circostanti. (b) Cuore espiantato immerso nella soluzione ghiacciata di Tyrode per un'ulteriore preparazione. c) Cuore di topo correttamente attaccato ad un ago smussato. (d) Cuore murino sospeso nella soluzione di Tyrode. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Percentuali di successo estratte sperimentalmente. Percentuali di successo per 30 impulsi di fotostimolazione basati su micro-LED utilizzando tre, sei e nove LED a diverse durate di impulso W def e frequenze fdef per N = 11. Barre di errore mostrate con errore standard della media S.E.M. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Manipolazione del ritmo cardiaco mediante fotostimolazione . (a) Segmento di una registrazione ECG di un'aritmia non terminata. b) Spettrogramma dell'ECG mostrato nel pannello a. La densità spettrale di potenza (PSD) del segmento (1) mostra un'aritmia con una frequenza dominante di 24 Hz. Fotostimolazione del segmento (2) con i parametri mostrati. Si può osservare che la frequenza dominante scende a 14 Hz. Segmento (3) Terminazione non riuscita e ritorno al comportamento aritmico con una frequenza dominante di 24 Hz. (c) ECG di un tentativo di defibrillazione riuscito. d) Spettrogramma della terminazione riuscita visualizzato nel riquadro c. Il segmento (1) mostra una tachicardia ventricolare (VT) con frequenza dominante di 23 Hz. Fotostimolazione del segmento (2) utilizzando le impostazioni mostrate. Il segmento (3) mostra una terminazione riuscita, che porta a un normale ritmo sinusale con una frequenza fondamentale di 3,5 Hz e le armoniche risultanti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Mappatura ottica di tutto il cuore. Viene mostrato il cambiamento dell'intensità della fluorescenza durante un singolo battito cardiaco nel normale ritmo sinusale. Il cuore è stato posizionato di fronte alla telecamera in modo che il ventricolo destro e sinistro siano visibili (RV, LV). L'asterisco mostra il pixel in cui è stato eseguito il potenziale d'azione mostrato in alto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Numero di microLED Area irradiata Aμled [mm2] Flusso radiante φ [mW] Intensità luminosa LI [mW mm-2]
3 0.178 5,9 ± 0,47 33.11 ± 2.66
6 0.356 11.91 ± 0.84 33.42 ± 2.37
9 0.535 17,85 ± 0,61 33,39 ± 1,14

Tabella 1: Flusso radiante misurato dell'array di micro-LED e intensità luminosa corrispondente.

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Discussion

Un trattamento efficace delle tachiaritmie cardiache è la chiave per la terapia cardiaca. Tuttavia, i meccanismi biofisici alla base dell'inizio, della perpetuazione e della cessazione dell'aritmia non sono completamente compresi. Pertanto, la ricerca cardiaca mira a ottimizzare la terapia con scosse elettriche verso una cessazione più delicata delle aritmie, aumentando così la qualità della vita dei pazienti 28,29,30,31. Gli approcci elettrici a bassa energia promettono una significativa riduzione degli effetti collaterali gravi, tuttavia potrebbero ancora indurre eccitazione muscolare indesiderata. L'optogenetica cardiaca potrebbe superare questa limitazione e fornire non solo una tecnica di terminazione delicata dei tessuti, ma anche una piattaforma flessibile per studiare il controllo mirato specifico dell'aritmia delle onde di eccitazione simili a vortici nel cuore murino intatto e nelle colture cellulari32,33.

Data questa motivazione, sono stati progettati e implementati una robusta configurazione di fotostimolazione e un protocollo, entrambi offrendo un sistema ottico altamente adattabile, che potrebbe essere facilmente esteso agli studi di mappatura ottica panoramica tridimensionale34.

Si potrebbe dimostrare che le aritmie cardiache possono essere terminate con successo con percentuali di successo diverse a seconda dei parametri scelti per la fotostimolazione, ad esempio l'area illuminata sul cuore. I risultati presentati suggeriscono che l'aumento della superficie irradiata ha reclutato un numero critico di cardiomiociti estinguendo l'attività caotica per blocco di conduzione, come mostrato anche in22. In questo studio, l'energia richiesta per fotodefibrillare è E = 10,69 ± 0,37 mJ (utilizzando nove micro-LED, 30 impulsi e larghezza di impulso Wdef = 20 ms). Questo risulta essere inferiore a quello riportato in precedenza in 22,24 con E 22 = 228,8 mJ ed E 24 = 153,6 mJ, dove sono stati illuminati rispettivamente un'area più grande 22 o l'intero cuore 24. Tuttavia, rispetto all'approccio mostrato in 35, dove un'area ben delimitata è illuminata con 10 impulsi di fotodefibrillazione con conseguente E 35 = 1,8 mJ, l'energia di fotodefibrillazione nel presente studio è notevolmente più alta. A differenza degli altri tre approcci, non è stato possibile raggiungere un tasso di successo superiore al 90% con il protocollo presentato. Una possibile ragione per le prestazioni ridotte nonostante una maggiore energia di fotodefibrillazione potrebbe essere che la complessità dell'aritmia sottostante non viene considerata. Per quanto riguarda i risultati presentati in 35, dove un alto tasso di terminazione si ottiene illuminando una piccola area sul cuore, e misurando contemporaneamente le dinamiche spazio-temporali di un'aritmia, l'approccio presentato può certamente essere ulteriormente migliorato considerando il feedback-control, che risponde con un diverso schema di illuminazione micro-LED a seconda dello stato attuale del cuore.  Inoltre, è stato anche dimostrato che, sebbene le aritmie non possano sempre essere terminate con il metodo attuale, le dinamiche complesse intrinseche possono essere disturbate durante la fotostimolazione portando a uno stato temporale più ordinato. Come mostrato in36, il tasso di terminazione è significativamente diverso quando si affrontano aritmie monomorfe (più ordinate) e polimorfiche (meno ordinate). Quindi il passo logico verso un migliore tasso di defibrillazione potrebbe essere quello di influenzare la dinamica cardiaca durante un episodio VF, trasformare l'aritmia in uno schema meno complesso e terminare con un'altra serie di impulsi, costruendo in questo modo un approccio di fotostimolazione in due fasi.

Per quanto riguarda il protocollo di perfusione, i passaggi più critici si riscontrano nella corretta estrazione e preparazione del cuore nonché nella corretta regolazione dell'ottica di mappatura ottica. Il coinvolgimento della mappatura ottica richiede rigorosamente la corretta selezione degli spettri di colorante, sorgenti luminose di eccitazione appropriate e filtri ottici ben scelti per la fotocamera29. In caso contrario, i segnali ottici registrati potrebbero essere troppo rumorosi e potrebbero anche contenere diafonia di fotostimolazione con eccitazione del colorante. L'analisi successiva richiederebbe quindi la post-elaborazione dei segnali con diversi filtri analitici e il livellamento dell'immagine spesso con conseguente peggioramento.

Un altro passo cruciale in questo protocollo è il posizionamento corretto e preciso dell'array di micro-LED. Poiché il cavo di interconnessione tra l'array di micro-LED e il driver è molto sottile e flessibile, a volte è difficile garantire che l'array si trovi approssimativamente nella stessa posizione sulla superficie del cuore per ogni esperimento. Per facilitare il posizionamento e fissare la posizione acquisita dell'array di micro-LED, è stato progettato e stampato un supporto in 3D, che consente di collegare l'array a un micromanipolatore. Ciò offre un maggiore controllo sul movimento dell'array nella soluzione di Tyrode. A seconda del materiale scelto per il cavo di interconnessione dell'array di micro-LED, l'uso di un supporto potrebbe non essere necessario.

Inoltre, un altro passo critico del protocollo è l'aggiunta di farmaci pro-aritmia, come ad esempio Pinacidil37. Poiché diversi composti chimici sono ben noti per modificare la risposta fisiologica del cuore, questo dovrebbe essere considerato quando si analizzano e interpretano i risultati. Per quanto riguarda la mappatura ottica, il protocollo proposto utilizza Blebbistatin come disaccoppiatore meccanico. Questo ha il vantaggio di rimuovere gli artefatti di movimento durante la registrazione, ma può anche prolungare l'APD27. Per ovviare a questo inconveniente, l'analisi dei metodi di tracciamento del movimento durante la registrazione potrebbe essere considerata38,39. In questo modo, la normale condizione fisiologica del cuore sarebbe preservata e si potrebbe ottenere un segnale di alta qualità.

Sebbene sia stato dimostrato che il protocollo presentato può essere utilizzato per la foto-defibrillazione multi-sito, ha ancora alcune limitazioni. È stato riscontrato che in alcuni casi la fibrillazione non può essere terminata dalla fotostimolazione basata su micro-LED, ma solo essere disturbata, con conseguenti variazioni di frequenza. Un'ipotesi è che le onde serpeggianti sul cuore vengano spostate solo dal ventricolo sinistro, rigenerandosi in altre parti del cuore. Rispetto ad altri metodi come l'illuminazione globale24, il metodo attuale offre un tasso di successo inferiore a causa di una minore copertura del cuore. Tuttavia, siamo fiduciosi che con il corretto metodo di riconoscimento basato su hardware dell'attività a spirale, sia possibile migliorare il tasso di successo della terminazione.

In conclusione, il sistema di fotostimolazione presentato stabilisce un potente strumento sperimentale per molteplici approcci di cardioversione e studi di manipolazione dell'aritmia cardiaca. Le conoscenze apprese in questo sistema saranno utilizzate per studiare e valutare nuovi potenziali protocolli di defibrillazione (foto) in modelli animali di grandi dimensioni clinicamente rilevanti.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Marion Kunze e Tina Althaus per il loro eccellente supporto tecnico durante gli esperimenti. La ricerca che ha portato ai risultati ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro FP7/2007-2013 della Comunità europea con il numero di convenzione di sovvenzione HEALTH-F2-2009-241526. Il supporto è stato fornito anche dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, DZHK e.V. (progetto MD28), dal sito partner Goettingen, dalla Fondazione tedesca per la ricerca CRC 1002 (progetto C03) e dalla Max Planck Society. Questo lavoro è stato in parte supportato da BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence finanziato dalla German Research Foundation (DFG, grant number EXC 1086).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical Components
Blebbistatin TargetMol T6038 10 mM stock solution
BSA/Albumin Sigma-Aldrich A4919
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Carbogen Westfalen 50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ AAT Bioquest 21499 Dye for Optical Mapping
Glucose Sigma-Aldrich D9434 C6H12O6
Heparin LEO Pharma Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid Merck 1.09057.1000 HCl, 1 M stock solution
Isoflurane CP Pharma 1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride Merck 8.14733.0500 MgCl2
Monopotassium Phosphate Sigma-Aldrich 30407 KH2PO4
Pinacidil monohydrate Sigma-Aldrich P154-500mg 10 mM stock solution
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 KCl
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 NaCl
Sodium Hydroxide Merck 1.09137.1000 NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150 Biopac Systems MP150WSW data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C Biopac Systems ECG100C Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable RMS Heating System HK-5,0-12 Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply Thorlabs KPS101 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver Thorlabs LEDD1B T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode Hugo Sachs Elektronik BS4 73-0200 Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG Agilent Instruments A-2230 Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator Agilent Instruments A-2230 AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue Epoxy Technology EPO-TEK 353ND Two component epoxy
Fluoropolymer  Asahi Glass Co. Ltd. Cytop 809M Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist Merck KGaA AZ 5214E Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip  Cree Inc. C460TR2227-S2100 Blue micro-LED
Photoresist Merck KGaA AZ 9260 Thick Positive Photoresists
Polyimide UBE Industries Ltd. U-Varnish S Polyimide Solution
Silicone NuSil Technology LLC MED-6215 Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive John P. Kummer GmbH Epo-Tek 301-2 Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter Chroma Technology Corporation ET470/40x Blue excitation filter
Camera Photometrics Cascade 128+ High performance EMCCD Camera
Camera Objective Navitar DO-5095 Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror Semrock FF685-Di02-25x36 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter Semrock FF01-775/140-25 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink Advanced Thermal Solutions ATSEU-077A-C3-R0 Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2 LED Engin Osram LZ4-00B208 High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3 Thorlabs M625L3 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses LED Engin Osram LLNF-2T06-H LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter Thorlabs S120VC Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter
Red Filter Semrock FF02-628/40-25 BrightLine® single-band bandpass filter

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Medicina Numero 174 optogenetica cardiaca mappatura ottica LED DI-4-ANBDQPQ Blebbistatina channelrhodopsin-2 ChR2
Gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini
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