Summary
Her beskriver vi et optimalisert retinal organoid induksjonssystem, som er egnet for ulike menneskelige pluripotente stamcellelinjer for å generere netthinnevev med høy reproduserbarhet og effektivitet.
Abstract
Retinal degenerative sykdommer er hovedårsakene til irreversibel blindhet uten effektiv behandling. Pluripotente stamceller som har potensial til å skille seg ut i alle typer netthinneceller, til og med mini-retinal vev, holder store løfter for pasienter med disse sykdommene og mange muligheter innen sykdomsmodellering og legemiddelscreening. Induksjonsprosessen fra hPSCer til netthinneceller er imidlertid komplisert og tidkrevende. Her beskriver vi en optimalisert retinal induksjonsprotokoll for å generere retinal vev med høy reproduserbarhet og effektivitet, egnet for ulike menneskelige pluripotente stamceller. Denne protokollen utføres uten tilsetning av retinoinsyre, noe som fordeler berikelsen av kegle fotoreseptorer. Fordelen med denne protokollen er kvantifisering av EB-størrelse og platingtetthet for å forbedre effektiviteten og repeterbarheten av retinal induksjon betydelig. Med denne metoden vises alle store retinale celler sekvensielt og rekapitulerer hovedtrinnene i retinal utvikling. Det vil lette nedstrømsapplikasjoner, for eksempel sykdomsmodellering og celleterapi.
Introduction
Retinal degenerative sykdommer (RDs), som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og retinitis pigmentosa (RP), er preget av dysfunksjon og død av fotoreseptorceller og fører vanligvis til irreversibel synstap uten effektive måter å kurere1. Mekanismen som ligger til grunn for disse sykdommene er i stor grad ukjent delvis på grunn av mangel på menneskelige sykdomsmodeller2. I løpet av de siste tiårene har det blitt oppnådd betydelige fremskritt innen regenerativ medisin gjennom stamcelleteknologi. Mange forskere, inkludert oss selv, har vist at humane pluripotente stamceller (hPSCer), inkludert humane embryonale stamceller (hESCer) og menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCer), kan skille seg ut i alle typer netthinneceller, til og med mini-netthinnevev gjennom ulike differensieringsmetoder3,4,5,6,7,8,9,10, 11, gir stort potensial i sykdomsmodellering og celleterapi12,13,14.
Induksjonsprosessen fra hPSCer til netthinneceller er imidlertid svært komplisert og tidkrevende med lav repeterbarhet, noe som krever forskere med rik erfaring og høye ferdigheter. Under den komplekse og dynamiske induksjonsprosessen vil en rekke faktorer påvirke utbyttet av netthinnevev15,16,17. Også ulike induksjonsmetoder varierer ofte betydelig i timing og robust uttrykk for netthinnemarkører, noe som kan forvirre utvalgsinnsamlingen og datatolkningen3. Derfor vil en enkel protokoll for retinal differensiering fra hPSCer med trinnvis veiledning være etterspurt.
Her, basert på våre publiserte studier18,19,20,21, beskrives en optimalisert retinal induksjonsprotokoll for å generere retinal organoider (ROer) med rike kjeglefotoreseptorer fra hPSCer, noe som ikke krever tilskudd av retinoinsyre (RA). Denne protokollen fokuserer på beskrivelsen av flertrinnsmetoden for å generere nevral netthinne og RPE. EB-dannelse er den essensielle delen av det tidlige induksjonsstadiet. Både størrelse og plating tetthet av EBs er kvantitativt optimalisert, noe som vitenskapelig forbedrer utbyttet av retinal vev og fremmer repeterbarhet. I den andre delen av induksjonen organiserer optiske vesikler (OVs) seg selv i overholdelseskulturen og ROene i suspensjonskulturen; Tidskursene og effektiviteten til denne delen varierer betydelig i forskjellige hPSC-linjer. Modning og spesifikasjon av retinalceller i ROer forekommer hovedsakelig i midten og sen fase av induksjon. Uten tilsetning av RA kan modne fotoreseptorer med både rike kjegler og stenger produseres.
Formålet med denne protokollen er å kvantitativt beskrive og detaljere hvert trinn for uerfarne forskere å gjenta. Ulike hPSC linjer har blitt vellykket indusert i ROs av denne protokollen med et robust utbytte av kjeglerik retinal vev og høy repeterbarhet. HPSCs-avledede ROer med denne protokollen kan rekapitulere hovedtrinnene for retinal utvikling i vivo, og overleve langsiktige, noe som letter nedstrøms applikasjoner, for eksempel sykdomsmodellering, legemiddelscreening og celleterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kultur og utvidelse av hPSCer
- HPSC-kultur
- Belegge to brønner av en 6-brønns plate med ekstracellulær matrise (ECM, hESC-kvalifisert matrise). Forbered 50 ml ECM-oppløsning som inneholder 8-12 μg/ml ECM i Dulbeccos modifiserte ørns medium (DMEM). I 49 ml DMEM tilsettes 1 ml av den opptinte ECM-lagerløsningen (50x). Tilsett 1 ml ECM-oppløsning i hver brønn på en 6-brønns plate. Inkuber den i 1 time i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Klargjør hPSC vedlikeholdsmedium (MM) i henhold til produsentens instruksjon.
- Forvarm MM ved romtemperatur (RT) i 30 min.
- Tine et kryogent hetteglass med hPSCer (hiPSCer eller hESCer) (ca. 1 x 106) fra en flytende nitrogentank ved inkubasjon i et vannbad ved 37 °C i 30 s.
- Ta ut hetteglasset, og desinfiser det forsiktig ved hjelp av en 75% desinfeksjonsalkoholspray. Sett den i et biosikkerhetsskap.
- Overfør cellefjæringen fra hetteglasset til et 15 ml rør, tilsett 5 ml forvarmet MM-dråpe for dråpe for røret ved hjelp av en 5 ml pipette. I mellomtiden rist forsiktig røret for å blande hPSCene .
- Sentrifuger røret på 170 x g i 5 min. Fjern det meste av supernatanten ved hjelp av en 1 ml pipette forsiktig og la det være ca. 50 μL supernatant for å unngå å miste cellene.
- Tilsett 1 ml MM i røret, og bruk pelletsen på nytt ved å pipette forsiktig opp og ned en eller to ganger med en 1 ml pipette.
MERK: Overlevelsen til enkeltceller av hPSCer er lav. Små celle klumper med 3-5 celler foretrekkes for å holde hPSCene voksende i kolonier. - Fjern ECM fra de forhåndsbelagte brønnene (trinn 1.1.1), tilsett 1,5 ml MM til hver brønn, og fordel deretter 0,5 ml celleoppheng per brønn.
- Rist platen forsiktig for å fordele hPSCene jevnt, og legg platen i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2. Ikke flytt platen i minst 24 timer for å fremme celletilslutning.
- Endre MM annenhver dag og passere hPSC når samløpet har nådd ca 80%.
- Passivring av hPSCer
MERK: Vedlikehold av den uavklarte tilstanden i hPSCer er ganske kritisk for videre applikasjoner. Under de tilfølgende forholdene vokser hPSCer i kolonier med en veldefinert kant. Cellene skal passeres når sammenløpet av hPSCer når ca 80%.- Vær oppmerksom på cellene under et mikroskop. Merk og fjern de tydelig synlige differensierte cellene mekanisk (<5%) før du passerer.
- Klargjør den ECM-belagte platen som beskrevet i trinn 1.1.1.
- Forvarm MM og 1x fosfatbuffer saltvann (PBS) uten Ca2+ og Mg2+ ved RT.
- Forvarm 0,5 mM EDTA (i 1x PBS) oppløsning i et vannbad ved 37 °C.
- Fjern mediet fra kulturplaten ved hjelp av et vakuumaspirasjonssystem, tilsett 1 ml 1 ml 1x PBS i hver brønn for å vaske cellene ved hjelp av en 1 ml pipette og gjenta to ganger.
- Tilsett 1 ml EDTA-oppløsning per brønn for å fjerne hPSCene i en cellekulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 5 minutter. Ikke overskrid anbefalt inkubasjonstid for å unngå dissosiasjon til enkeltceller.
- Ta ut platen og se etter løsrivelse av celler under et mikroskop. De sammenfallende hPSCene løsner opp og hver cellekantlinje kan ses, men cellene kan ikke lett komme av ved å riste celleplaten forsiktig.
- Fjern EDTA-oppløsningen med en 1 ml pipette, og tilsett 1 ml MM for å stoppe dissosiasjonen. Rør forsiktig hPSCene en eller to ganger med en 1 ml pipette for å resuspendere cellene. Det er ikke nødvendig å sentrifuge for å samle cellene.
MERK: Hvis de fleste cellene kommer ut av platen etter inkubasjon med EDTA, kan cellene samles opp av sentrifuge. - Fjern ECM fra de forhåndsbelagte brønnene (trinn 1.2.2), og tilsett 1,5 ml MM per brønn.
- Overfør 150-200 μL celleklumper til hver brønn. Vanligvis kan hPSCer passeres med et forhold på 1:6. For eksempel kan celler fra en brønn på en 6-brønns plate fordeles til seks nye brønner.
- Rist platen forsiktig for å fordele hPSCene jevnt og kultur hPSCene i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i minst 24 timer uten å berøre platen.
- Endre MM annenhver dag som beskrevet i trinn 1.1.
2. Retinal differensiering fra hPSCs
MERK: Når koloniene når ~ 80% samløp (figur 1B), kan de styres til å skille seg ut i retinal organoider etter protokollskjemaet i figur 1A. For å sikre at hPSCene har høy kvalitet og godt utbytte, må du regelmessig evaluere pluripotensen med molekylære markører som OCT4 eller NANOG ved hjelp av IFC eller QPCR. HPSCer bør forkastes hvis differensierte celler står for mer enn 5 % av de totale cellene. Se etter mykoplasmaforurensning med et mykoplasmadeteksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk bare mykoplasmafrie hPSCer, da mykoplasma kan endre differensieringsevnen til hPSCer.
- Forbered medier og reagenser
- Forbered nevral induksjonsmedium (NIM) ved å blande følgende: 500 ml dulbeccos modifiserte ørn medium/næringsblanding F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 ml 1 % N2-tillegg, 0,5 ml 0,1 % heparin (2 mg/ml i 1x PBS) og 5 ml 1 % MEM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA).
- Forbered retinal differensieringsmedium (RDM) som inneholder 300 ml DMEM/F-12, 200 ml DMEM grunnleggende, 10 ml 2% B27 supplement, 5 ml 1% antibiotisk antimykotisk og 5 ml 1% MEM NEAA.
MERK: Både NIM og RDM filtreres ikke, men en sterilitetstest utføres. Ta ut 1 ml medium og legg det i en 35 mm tallerken, og kultur i 3-7 dager i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2. Mediet kan lagres ved 4 °C og bør brukes innen 2 uker for å sikre aktiviteten til komponentene. - Forbered 10 mM Blebbistatin (1000x) i DMSO. Tilsett 1710 μL DMSO for å oppløse 5 mg Blebbistatin for å oppnå 10 mM lageroppløsning (1000x), aliquot ved 10 μL/rør, og oppbevar ved -20 °C.
MERK: Alle medier og reagenser skal varmes opp ved RT i 30 minutter før bruk, med mindre annet er nevnt.
- Embryoid kroppsdannelse (EB)
- På dag 0 (D0) starter du differensieringen. Ta ut en brønn med hPSCer fra en 6-brønns plate, som har vokst til ~ 80% samløp. Samle cellene med EDTA dissosiasjonsløsning som beskrevet i trinn 1.2.1 til 1.2.6.
- Fjern EDTA-løsningen, tilsett 1 ml MM som inneholder 10 μM Blebbistatin for å stoppe celledissosiasjon, og samle cellene med en 1 ml pipette. Størrelsen på celleklumper er en av nøkkelfaktorene som påvirker utbyttet av EBs. Omtrent fem celler per klump foretrekkes å produsere riktig størrelse på EB-er på D5 til D7.
MERK: Dette er et viktig skritt. Ikke pipette cellene for mange ganger siden EB-lignende aggregater er vanskelig å danne fra enkeltceller av hPSCer. - Overfør celleopphenget (ca. 2 x10 6 celler) til en 100 mm ultralav Petri-tallerken og tilsett 9 ml MM som inneholder 10 μM Blebbistatin til parabolen.
- Rist forsiktig parabolen to ganger for å fordele cellene jevnt, og legg parabolen i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- På D1, etter at cellene er dyrket i minst 24 timer, ta ut parabolen og observere den under mikroskopet. Et stort antall av småcelleaggregatene vil bli spontant dannet av denne tiden (Figur 1C).
- Forbered 12 ml blanding med MM og NIM med et 3:1-forhold (9 ml MM og 3 ml NIM) i et 15 ml rør.
- Overfør cellekulturene til et 15 ml sentrifugerør med en 10 ml pipette vinkelrett, og tilsett 10 ml av den forvarmede blandingen til parabolen.
- Sentrifuger røret på 60 x g i 3 minutter for å samle aggregatene, fjern supernatanten ved hjelp av en 5 ml pipette og la den ligge ca. 500 μL for å unngå å miste celler.
- Tilsett 2 ml av blandingen til røret, og overfør suspensjonen til samme tallerken (trinn 2.2.7).
- Rist forsiktig parabolen for å fordele celleaggregatene jevnt, og legg parabolen tilbake i inkubatoren.
- På D2, lag 12 ml av en ny blanding med MM og NIM med et 1:1-forhold (6 ml MM og 6 ml NIM) i et 15 ml rør. Bytt cellemedium med den friske tilberedte blandingen ved å gjenta trinnene fra 2,2,5 til 2,2,10.
- På D3 endrer du cellemedium med 15 ml NIM som beskrevet ovenfor. Kultur cellene i minst 5 dager under suspensjonsforholdene.
MERK: Under D1 til D3 bør mediet endres hver dag, noe som gir nok ernæring. Siden D3 kan NIM endres annenhver dag. Også EBs kan deles inn i flere retter for å gi rikelig ernæring.
- Frø EB-ene
MERK: På D5 til D7 velger du et passende tidspunkt for å tallerkene EBs på ECM-belagte retter i henhold til størrelsen på EBs. EBs med en omtrentlig diameter på 200 μm er egnet for retinal differensiering. Generelt kan en brønn med hPSCer i en 6-brønns plate produsere ca. 300 til 1000 EB. Variasjonen av EB-utbyttet varierer med hPSC-linjene.- På D4 tilbereder du ECM-belagte retter til EBs adherentkultur. Tilsett 5 ml ECM til hver 100 mm vevskulturfat (overflatebehandlet), og legg dem i inkubatoren over natten.
- På D5 fjerner du ECM fra de forhåndsbelagte rettene, og tilsett 10 ml forvarmet NIM til hver tallerken.
- Ta ut retten som inneholder EBs. Kontroller kvaliteten på EBs under mikroskopet og sørg for at de er ganske lyse og runde i form. Størrelsen på EB-ene er omtrent 200 μm i diameter. Samle alle EB-er i et 15 ml rør. Overfør EB-ene fra rettene til et 15 ml rør med en 5 ml pipette. La EB-ene slå seg til ro i 5 min. Fjern det meste av supernatanten, og etterlater ca 2 ml medium.
- Fordel EB-ene i de belagte rettene som inneholder 10 ml NIM dråpe for dråpe med en 1 ml pipette. Frø EB-ene med en tetthet på ca. 2-3 EBs per cm2. For eksempel, legg til ca 120-180 EBs i en 100 mm tallerken. For å bedømme EB-nummeret grovt, plasser en dråpe EB-suspensjon på en coverlip, og tell antall EBs under mikroskopet.
MERK: Platingtettheten til EBs er en av nøkkelfaktorene som påvirker effektiviteten av retinal induksjon. Tettheten kan også justeres av hver hPSC-linje. - Rist forsiktig oppvasken for å fordele EB-ene jevnt. Legg dem i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
MERK: Ikke flytt oppvasken i minst 24 timer for å forbedre overholdelsen av EB-er.
- Induksjon av optiske vesyrer (OVs) og retinal pigment epitel (RPE) i adherent forhold
MERK: Etter at EBs er sådd på ECM-belagt overflate, kan hPSCer utvikle OV-lignende strukturer, som kan observeres så tidlig som D20 etter differensiering. I denne protokollen er det ikke nødvendig med spesifikke vekstfaktorer eller signalmolekyler for å lede hPSC-ene inn i netthinne skjebnen bortsett fra tillegg av N2 og B27 kosttilskudd i media.- På D8-D9 fjerner du oppvasken og observerer EB-ene under mikroskopet. Alle EBs vil bli festet og spredt ut på oppvasken (Figur 1D). Tilsett 10 ml fersk NIM i hver 100 mm tallerken som inneholder 10 ml gammelt medium. Sett dem tilbake i inkubatoren.
MERK: Ikke fjern det gamle mediet. - På D12 endrer du halvparten av mediet med NIM ved hjelp av en 10 ml pipette. Hold kulturen i inkubatoren.
- På D16 fjerner du all NIM fra rettene ved hjelp av et vakuumaspirasjonssystem. Tilsett 20 ml RDM i hver tallerken. Fortsett å dyrke i RDM og endre halvparten av mediet annenhver dag.
- Under D10-D30, observere morfologiske endringer av cellene to ganger i uken under et mikroskop og vurdere effektiviteten av retinal differensiering.
MERK: Siden D10 er øyefeltdomener (EF) selvorganisert i de perifere sonene til tilhenger-EB-er. De OV-lignende strukturene vises mellom D20 og D25, stikker gradvis ut fra parabolen og danner selv en optisk kopp, som er omgitt av pigmentert RPE (Figur 1E). OVene kan lett gjenkjennes med den lyse, brytning og tykke NR-ring.
- På D8-D9 fjerner du oppvasken og observerer EB-ene under mikroskopet. Alle EBs vil bli festet og spredt ut på oppvasken (Figur 1D). Tilsett 10 ml fersk NIM i hver 100 mm tallerken som inneholder 10 ml gammelt medium. Sett dem tilbake i inkubatoren.
- Løsne og kultur OVs og RPE i suspensjon for å oppnå retinal organoider (ROs)
- På D28-D35 vises de fleste OVer i oppvasken. Bruk en Wolfram nål eller en nål med 1 ml sprøyte for å mekanisk løsne de morfologisk identifiserbare OVene sammen med tilstøtende RPE. Kultur dem i suspensjon.
MERK: Utseendet og utbyttet til OVer og RPE varierer mye i forskjellige hPSC-linjer. Dermed er tidspunktet for å løsne OV og RPE fleksibelt. Åpenbare OVer med tilstøtende RPE kan løsnes, og deretter flyttes til en lav festekulturrett som inneholder RDM. Fortsett å dyrke resten av cellene til alle OVer og RPEer løftes opp. - Legg 50-60 OVer i hver 100 mm lav festekulturfat som inneholder 15 ml RDM for ROsformasjonen (figur 1F).
- Bytt RDM hver 2-3 dager til D42, når ROene er godt rundformet.
- På D28-D35 vises de fleste OVer i oppvasken. Bruk en Wolfram nål eller en nål med 1 ml sprøyte for å mekanisk løsne de morfologisk identifiserbare OVene sammen med tilstøtende RPE. Kultur dem i suspensjon.
3. Retinal utvikling og modning
MERK: I denne protokollen er det nødvendig med serum for å holde ROene i vekst og modne for langsiktig kultur.
-
Retinal laminering og spesifikasjon i ROer
- Forbered 10 ml 100 mM taurin (1000x) i 1x PBS. Vei 125 mg taurin, og oppløs i 10 ml 1x PBS. Filtrer oppløsningen med et 0,22 μm sprøytefilter. Aliquot ved 500 μL/rør, og oppbevar ved -20 °C.
- Forbered retinal kultur medium 1 (RC1). Bland følgende komponenter: 250 ml DMEM/F-12, 175 ml DMEM grunnleggende, 50 ml foster bovint serum,10 ml 2% B27 supplement, 5 ml 1% antibiotisk antimykotisk, 5 ml 1% MEM NEAA, 0,5 ml 100 μM taurin og 5 ml 2 mM L-alanyl-l-glutamin.
- Forbered retinal kultur medium 2 (RC2) som inneholder 450 ml DMEM/F-12, 50 ml foster bovint serum, 5 ml 1% N2 supplement, 5 ml 1% antibiotisk antimykotisk, 0,5 ml 100 μM taurin, 5 ml 1% MEM NEAA og 5 ml 2 ml L-alnyl-L-glutamin.
MERK: RC1 og RC2 filtreres ikke, men gjennomgår en sterilitetstest. Ta ut 1 ml medium, legg det til en 35 mm tallerken og kultur i 3-7 dager i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2for å sikre sterilitet før bruk. Mediet kan oppbevares ved 4 °C og bør brukes innen 2 uker for å sikre aktiviteten til komponentene. Alle medier og reagenser skal forhåndsvarmes ved RT i 30 minutter før bruk. - På D42 bytter du kulturmediet fra RDM til RC1.
- Vipp oppvasken på ca 30° og la ROene slå seg ned i 30 s. Fjern den gamle RDM med en 10 ml pipette som etterlater ca. 1 ml medium for å unngå å miste ROer. Tilsett 15 ml fersk RC1 i hver tallerken.
- Rist forsiktig oppvasken for å fordele ROene jevnt. Sett oppvasken tilbake i inkubatoren. Endre hele mediet to ganger i uken deretter.
- Under D50-D90 velger du ut høy kvalitet på ROer for langsiktig kultur, som er rundformet med et tykt og lyst NR. Plasser 30-40 ROer i en 100 mm lav festefat med 20 ml RC1, og bytt hele mediet to ganger i uken.
- For den langsiktige suspensjonskulturen til ROer, pipette ROene for å unngå RO-RO-reattaching ved hjelp av en pipette. Overfør ROs til nye kulturretter en gang i måneden for å unngå at ROer holder seg til overflaten av oppvasken.
MERK: Under suspensjonskulturforholdene er ROer rundformede, med en lys og tykk NR-ring festet med mer eller mindre RPE på den ene siden. Laminerte nevrale netthinne utvikle og retinal celle subtyper sekvensielt vises med retinal ganglion celler først generert, etterfulgt av fotoreseptorceller, amacrine celler, og bipolare celler.
-
Human fotoreseptormodning med berikelse av kjegler i ROer
- Etter D90 bytter du mediet fra RC1 til RC2, som er egnet for fotoreseptormodning.
- Endre mediet som beskrevet i trinn 3.1.7-3.1.8.
MERK: Under denne kulturtilstanden kan ROer vokse langsiktig (Figur 1G), opptil D300 testet. Retinalceller i ROer blir modne, og alle celleundertyper av nevral netthinne, inkludert muller glialceller, stenger og kjegler er også anskaffet. Uten noen tillegg av RA er kegle fotoreseptorer også rike på ROer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den retinal induksjonsprosessen i denne protokollen etterligner utviklingen av menneskelig foster netthinne. For å initiere retinal differensiering ble hPSC-er dissosiert i små klumper og dyrket i suspensjon for å indusere dannelsen av EBs. På D1 ble de uniformerte cellemengdene eller EB-ene dannet (Figur 1C). Kulturmediet ble gradvis omdannet til NIM. På D5 ble EBs belagt på ECM-belagte kulturretter. Celler migrerte gradvis ut av EB-ene (figur 1D). Fra D10 er øyefelt selvorganisert i den perifere sonen av tilhenger-EBer. På D16 ble induksjonsmediet erstattet av RDM. Etterpå dannet NR-domenene seg gradvis, stakk ut fra retten og selvformede OV-lignende strukturer omgitt av RPE-cellene (Figur 1E). Under D28-D35 ble OVer sammen med den tilstøtende RPE løftet opp med en skarp nål og dyrket i suspensjon. Under suspensjonskulturforholdene ble ROs selvformet bestående av nevral netthinne (NR) festet med mer eller mindre RPE-sfære på den ene siden (figur 1F) og kunne overleve og modne overtid så lenge FBS ble lagt til mediet.
Etter hvert som retinal differensiering og spesifikasjon utviklet seg, produserte hPSCer alle større retinal celleundertyper sekvensielt. Undertypene av nevral netthinne stilte seg gradvis opp i lag, etterligner arkitekturfunksjonene til innfødt menneskelig netthinne (Figur 2A-G). Retinal ganglion celler (RGCs) ble først generert fra retinal forfedre og akkumulert i basal side av NRs. Photoreceptor celler plassert i den apikale siden, mens amacrine celler, horisontale celler, bipolare celler, og muller glial celler alle plassert i mellomlaget av NRs.
Med denne protokollen utviklet ROer seg til de svært modne fotoreseptorene med både stenger og kjegler (Figur 2G-I). Fotoreseptorene økte raskt i utviklingen av kjernefysisk lag (figur 2G) etter uke 8, og modnet gradvis fra uke 17 og utover. Fra uke 21 kan alle undertyper av fotoreseptorer, inkludert stenger, røde/grønne kjegler og blå kjegler, oppdages i ROer. Både rike stenger og kjegler kan oppnås i denne induksjonsprotokollen uten tillegg av RA gjennom hele differensieringsprosessen.
Figur 1: Induksjon og morfologiske trekk ved retinal organoider fra hPSCs. (A) Skjematikk av retinal induksjon fra hPSCer. (B) En typisk koloni av hPSCer (10x). (C) EBs på D1 (4x). (D) På D7 ble belagte EB-er festet og spredt ut på oppvasken (4x). (E) På D25 dannet og stakk den optiske vesicleen som strukturer (OVer) ut og stakk ut av parabolen (indikert av den røde sirkelen), omgitt av pigmentert RPE (4x). (F) Retinal organoider selvformet etter at OVs ble løftet opp og dyrket under suspensjon forhold (pilene spiss NR og RPE (4x). (G) En retinal organoid bestående av NR (rød pil) og RPE (svart pil) på D180 (4x). Skalastenger = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Undertyper av retinalceller ble sekvensielt påvist i tredimensjonalt netthinnevev. Eksempelbilder av store retinal celletyper som uttrykker spesifikke markører ved immunfluorescerende farging. (A-B) Retinal forfedre celler uttrykt Ki67 (A) og VSX2 (B). (C) Islet1 positive retinal ganglion celler plassert i basalsiden av nevral netthinnen. (D) Amacrine celler positiv for AP2α. (E) Muller glialceller positive for SOX9. (F) PKCα positive bipolare celler. (G) Gjenopprette positive fotoreseptorceller. (H) Rhodopsin positive stang fotoreseptorer. (I) L/M-opsin positive kjegle fotoreseptorer. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne flertrinns retinal induksjonsprotokollen ble hPSC-er veiledet trinn for trinn for å få retinal skjebne, og selvorganisert i retinal organoider som inneholder laminert NR og RPE. Under differensiering, hPSC recapitulated alle viktige trinn i menneskelig retinal utvikling i vivo, fra EF, OV, og RPE, til retinal laminering, generere alle undertyper av retinal celler, inkludert retinal ganglion celler, amacrine celler, bipolare celler, stang, og kjegle fotoreseptorer, og muller glial celler i en romlig og temporal rekkefølge. Recapitulation av retinal utvikling ville være til nytte nedstrøms applikasjoner, for eksempel retinal sykdom modellering.
Et par protokoller er etablert for å generere retinal organoider fra hPSCer3,4,5,6,7,8,9,10,13,14,15,16,17,18,19,20 . I henhold til kulturforholdene kan protokollene klassifiseres i 2D, 3D, og kombinasjonen av 2D- og 3D-tilnærminger9,13. 2D nærmer seg6,10,22 betyr at all induksjonsprosessen skjer i de tilfølgende kulturforholdene, og genererer retinalceller uten arkitektur fra hPSCer. Derimot nærmer 3D seg7,11,23 betyr at all induksjonsprosessen er under suspensjonskulturforholdene, noe som gir organisert netthinnevev. For eksempel rapporterte Sasai, Y. et al.7,24 en SFEBq-metode (serumfri flytende kultur av embryoide kroppslignende aggregater med rask reaggregering) for å veilede ESC-er til å skille seg ut i optiske kopper i suspensjonskultur. Ved hjelp av flertrinns 3D-tilnærminger8,11,18,20,25 inkludert denne protokollen, har hPSCer blitt indusert mot retinal skjebner og organoider under både tilhenger- og suspensjonskulturforhold.
For å indusere hPSCer til nevral retinal skjebne, har en rekke eksogene faktorer blitt lagt til media i mange protokoller. For eksempel la Lamba, et al.26 til en kombinasjon av noggin (en hemmer av BMP-banen) og Dickkopf-1 (dkk1, en antagonist av Wnt/β-catenin signalveien) og insulinlignende vekstfaktor-1 (IGF-1) for å lede ESC til en fremre nevral skjebne. Osakada et al.6 la til DAPT (en Notch signalveier inhibitor) og Venstre-høyre Determination Factor A (en WNT signalveier inhibitor) for å oppnå stang og kjegle fotoreseptor forløpere. Kuwahara et al.27 og Capowski et al.3 la til BMP4 for kort, tidlig eksponering av hPSCs kultur for å forbedre OV-produksjonen. Til sammenligning er denne optimaliserte retinal induksjonsprotokollen enkel og lav pris uten å kreve ekstrinsiske signalmodulatorer bortsett fra det grunnleggende tilskuddet til N2 og B27.
Retinoinsyre (RA) spiller en viktig rolle i retinal utvikling og fotoreseptorbestemmelse28,29,30. De fleste protokollene ble utviklet med tilskuddet av RA (0,5-1 μM) i visse perioder. Våre studier har vist at for høy konsentrasjon av RA eller for lang periode med RA-behandling resulterer i stangrike fotoreseptorer, men hemmer kjegledifferensiering8,18. Men i denne optimaliserte protokollen legges RA ikke til kulturmediene gjennom hele differensieringsprosessen18, fremmer produksjonen av kegle fotoreseptorer, som er ansvarlig for menneskelig dagtidsyn og fargesyn og kreves for celleerstatning av RD-behandling. Selv om noen studier avslører skjoldbruskhormon signalering dirigerer kjegle subtyper hos mus og menneskelig netthinne31,32, regulatoren for kjegle forpliktelse er fortsatt uklart33. I disse studiene fra Kim et al.34 og Lowe et al.35, den langsiktige kulturen også uten eksogen retinoinsyre genererte keglerike retinal organoider, som er i samsvar med denne optimaliserte protokollen.
De viktigste punktene i denne protokollen å forstå er å lage høykvalitets EBs og å frø EBs på riktig måte. Celler vokser raskt under tidlig EB-suspensjonskultur. Mediet bør endres hver dag og være nok til å gi rikelig ernæring. Størrelsen på EB-er, ca. 200 μm i diameter, passer for retinal differensiering. Platingtettheten til EBs ved 2-3 EBs per cm2 er egnet for de fleste hPSC-linjer. Den beste fordelen med denne optimaliserte protokollen er kvantifisering av EB-størrelse og platingtetthet for å forbedre effektiviteten og repeterbarheten av retinal induksjon betydelig. Vi har tydelig beskrevet alle trinnene i detalj, noe som i stor grad hjelper de uerfarne forskerne til å lære og gjenta retinal induksjon.
I tillegg avhenger retinal induksjonseffektivitet i stor grad av kvaliteten og differensieringsstyrken til hPSCene36,37. Ulike hPSCer har forskjellig effektivitet. Noen hPSC-linjer har faktisk dårlig effektivitet, noe som kan skyldes omprogrammeringsmetoder, somatiske celler og så videre. Denne protokollen er bekreftet å være egnet for ulike hPSCer for å oppnå 3D retinal organoider og RPE, inkludert ulike hESCer og hiPSCer omprogrammert fra fibroblaster, blod og urinceller18,20,21. Generelt, med denne protokollen beskrevet ovenfor, kan en brønn med hPSCer (ca. 80% samløp) i en 6-brønns plate generere ca 1000 EBs, noe som gir omtrent 200 ROer. Derfor er denne protokollen med høy effektivitet egnet for storskala produksjon av retinal organoider og fordeler nedstrøms applikasjoner, inkludert grunnleggende og translasjonell studie.
Oppsummert er den optimaliserte retinal induksjonsprotokollen enkel og lav pris med høy repeterbarhet og effektivitet, tilbyr lovende personlige modeller av netthinnesykdommer og gir rikelig cellekilde for celleterapi, legemiddelscreening og genterapitest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Xiufeng Zhong er patentoppfinneren relatert til generering av netthinneceller fra humane pluripotente stamceller.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), Science &technology Project of Guangdong Province (2017B020230003), Natural Science Foundation (NSF) i Kina (81570874, 81970842), Hundred talent program of Sun Yat-sen University (PT1001010), og fundamentale forskningsmidler av State Key Laboratory of Ophthalmology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
References
- Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
- Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
- Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
- Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
- Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
- Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
- da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
- Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
- Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
- Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
- Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
- DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).
