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मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से 3 डी रेटिना ऊतकों के व्युत्पन्न के लिए रेटिना ऑर्गेनॉइड इंडक्शन सिस्टम

Published: April 12, 2021 doi: 10.3791/62435
Automatic Translation
*1, *1, 1
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China, 510060
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम एक अनुकूलित रेटिना ऑर्गेनॉइड इंडक्शन सिस्टम का वर्णन करते हैं, जो उच्च प्रजनन क्षमता और दक्षता के साथ रेटिना ऊतक उत्पन्न करने के लिए विभिन्न मानव बहुलता स्टेम सेल लाइनों के लिए उपयुक्त है।

Abstract

रेटिना अपक्षयी रोग प्रभावी उपचार के बिना अपरिवर्तनीय अंधापन के मुख्य कारण हैं। Pluripotent स्टेम सेल है कि रेटिना कोशिकाओं के सभी प्रकार में अंतर करने की क्षमता है, यहां तक कि मिनी रेटिना ऊतकों, इन रोगों और रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग में कई अवसरों के साथ रोगियों के लिए भारी वादों पकड़ो । हालांकि, एचपीएससी से रेटिना कोशिकाओं में शामिल करने की प्रक्रिया जटिल और समय लेने वाली है। यहां, हम उच्च प्रजनन क्षमता और दक्षता के साथ रेटिना ऊतक उत्पन्न करने के लिए एक अनुकूलित रेटिना प्रेरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो विभिन्न मानव बहुलता स्टेम कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है। यह प्रोटोकॉल रेटिनोइक एसिड के अलावा किया जाता है, जो शंकु फोटोरिसेप्टर्स के संवर्धन को लाभ पहुंचाता है। इस प्रोटोकॉल का लाभ रेटिना प्रेरण की दक्षता और पुनरावृत्ति को बढ़ाने के लिए ईबी आकार और चढ़ाना घनत्व का मात्राकरण है। इस विधि के साथ, सभी प्रमुख रेटिना कोशिकाएं क्रमिक रूप से दिखाई देती हैं और रेटिना विकास के मुख्य चरणों को पुन: रीकैपिटल करती हैं। इसमें डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशंस जैसे डिजीज मॉडलिंग और सेल थेरेपी की सुविधा होगी ।

Introduction

रेटिना अपक्षयी रोग (आरडीएस), जैसे उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन (एएमडी) और रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी), फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की शिथिलता और मृत्यु की विशेषता है और आम तौर पर1को ठीक करने के प्रभावी तरीकों के बिना अपरिवर्तनीय दृष्टि हानि का कारण बनता है। इन रोगों में अंतर्निहित तंत्र मानव रोग मॉडल2की कमी के कारण आंशिक रूप से अज्ञात है । पिछले दशकों में, स्टेम सेल प्रौद्योगिकी के माध्यम से पुनर्योजी चिकित्सा में महत्वपूर्ण प्रगति को पूरा किया गया है । अपने आप सहित कई शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) सहित मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs), रेटिना कोशिकाओं के सभी प्रकार में अंतर कर सकते हैं, यहां तक कि विभिन्न भेदभाव दृष्टिकोण के माध्यम से मिनी रेटिना ऊतक3,4,5,6,7,8,9,10, 11, रोग मॉडलिंग और सेल थेरेपी में अपार संभावनाएं प्रदान करना12,13,14.

हालांकि, एचपीएससी से रेटिना कोशिकाओं में प्रेरण प्रक्रिया अत्यधिक जटिल और कम पुनरावृत्ति के साथ समय लेने वाली है, जिसके लिए शोधकर्ताओं को समृद्ध अनुभव और उच्च कौशल की आवश्यकता होती है । जटिल और गतिशील प्रेरण प्रक्रिया के दौरान, कई कारक रेटिना ऊतकों की उपजको प्रभावित करेंगे 15,16,17। इसके अलावा, रेटिना मार्कर के समय और मजबूत अभिव्यक्ति में अक्सर विभिन्न प्रेरण विधियां काफी भिन्न होती हैं, जो नमूना संग्रह और डेटा व्याख्या3को चकित कर सकती हैं। इसलिए, कदम-दर-कदम मार्गदर्शन के साथ एचपीएससी से रेटिना भेदभाव का एक सीधा प्रोटोकॉल मांग में होगा ।

यहां, हमारे प्रकाशित अध्ययनों के आधार पर18,19,20,21,एचपीएससी से समृद्ध शंकु फोटोरिसेप्टर के साथ रेटिना ऑर्गेनॉइड (आरओ) उत्पन्न करने के लिए एक अनुकूलित रेटिना प्रेरण प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जिसके लिए रेटिनोइक एसिड (आरए) के पूरक की आवश्यकता नहीं है। यह प्रोटोकॉल तंत्रिका रेटिना और आरपीई उत्पन्न करने के लिए बहु-चरण विधि के विवरण पर केंद्रित है। ईबी गठन प्रारंभिक प्रेरण चरण का अनिवार्य हिस्सा है। ईबी के आकार और चढ़ाना घनत्व दोनों मात्रात्मक रूप से अनुकूलित होते हैं, जो वैज्ञानिक रूप से रेटिना ऊतकों की उपज को बढ़ाता है और पुनरावृत्ति को बढ़ावा देता है। प्रेरण के दूसरे भाग में, ऑप्टिक वेसिकल्स (ओवी) निलंबन संस्कृति में पालन संस्कृति और आरओ रूप में स्वयं व्यवस्थित करते हैं; इस भाग के समय पाठ्यक्रम और क्षमता विभिन्न एचपीपीएससी लाइनों में काफी भिन्न होती है। आरओ में रेटिना कोशिकाओं की परिपक्वता और विनिर्देश मुख्य रूप से प्रेरण के मध्य और देर चरण में होते हैं। आरए के अलावा, अमीर शंकु और छड़ दोनों के साथ परिपक्व फोटोरिसेप्टर का उत्पादन किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अनुभवहीन शोधकर्ताओं को दोहराने के लिए प्रत्येक कदम का मात्रात्मक रूप से वर्णन और विस्तार करना है। विभिन्न एचपीएससी लाइनों को इस प्रोटोकॉल द्वारा सफलतापूर्वक आरओ में प्रेरित किया गया है जिसमें शंकु से भरपूर रेटिना ऊतकों की मजबूत उपज और उच्च पुनरावृत्ति क्षमता है। इस प्रोटोकॉल के साथ एचपीएससी-व्युत्पन्न आरओ वीवो मेंरेटिना विकास के मुख्य चरणों को फिर से पुनर्पूंजीकरण कर सकते हैं, और दीर्घकालिक जीवित रह सकते हैं, जो रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग और सेल थेरेपी जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की सुविधा प्रदान करता है।

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Protocol

1. एचएसएससी की संस्कृति और विस्तार

  1. एचपीएससी संस्कृति
    1. एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम, एचईएससी-योग्य मैट्रिक्स) के साथ 6-वेल प्लेट के दो कुओं को कोट करें। दुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) में ईसीएम के 8-12 माइक्रोन/एमएल युक्त ईसीएम समाधान का 50 एमएल तैयार करें। डीएमईएम के 49 एमएल में, गल ईसीएम स्टॉक समाधान (50x) का 1 मिलीएल जोड़ें। 6-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में ईसीएम समाधान का 1 एमएल जोड़ें। इसे 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें ।
    2. निर्माता के निर्देश के अनुसार एचपीपीएससी रखरखाव माध्यम (एमएम) तैयार करें।
    3. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर पूर्व गर्म मिमी।
    4. 30 एस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में इनक्यूबेशन करके एक तरल नाइट्रोजन टैंक से एचपीएससी (एचपीएससी या एचएसएससी) (लगभग 1 x 106)की क्रायोजेनिक शीशी को पिघलाएं।
    5. शीशी निकालें, और ध्यान से इसे 75% कीटाणुशोधन अल्कोहल स्प्रे का उपयोग करके कीटाणुरहित करें। इसे जैवसेफ्टी कैबिनेट में रखें।
    6. कोशिका निलंबन को शीशी से 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके ट्यूब में ड्रॉप करके प्री-गर्म एमएम ड्रॉप के 5 एमएल जोड़ें। इस बीच, धीरे से ट्यूब हिला एचपीएससी मिश्रण करने के लिए ।
    7. 5 मिनट के लिए 170 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें। 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके अधिकांश सुपरनेट को ध्यान से निकालें और कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए लगभग 50 माइक्रोन सुपरनेट को पीछे छोड़ दें।
    8. ट्यूब में एमएम के 1 एमएल जोड़ें, और 1 एमएल पिपेट के साथ एक या दो बार धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके गोली को फिर से खर्च करें।
      नोट: एचपीएससी की एकल कोशिकाओं का अस्तित्व कम है। कॉलोनियों में बढ़ते एचपीएससी को रखने के लिए 3-5 कोशिकाओं के साथ छोटे सेल झुरमुट पसंद किए जाते हैं।
    9. पूर्व-लेपित कुओं (चरण 1.1.1) से ईसीएम निकालें, प्रत्येक कुएं में 1.5 एमएल एमएम जोड़ें, और फिर प्रति अच्छी तरह सेल निलंबन के 0.5 एमएल वितरित करें।
    10. एचपीएससी को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को धीरे से हिलाएं, और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक इनक्यूबेटर में रखें। सेल पालन को बढ़ावा देने के लिए कम से कम 24 घंटे के लिए प्लेट को स्थानांतरित न करें।
    11. हर दूसरे दिन एमएम बदलें और बीपीएससी को तब पारण करें जब संगम करीब 80% तक पहुंच गया हो।
  2. एचपीएससी का पासेजिंग
    नोट: एचपीएससी में अविभेदित राज्य का रखरखाव आगे के अनुप्रयोगों के लिए काफी महत्वपूर्ण है। अनुवर्ती परिस्थितियों में, एचपीएससी एक अच्छी तरह से परिभाषित सीमा के साथ कॉलोनियों में बढ़ता है। जब एचपीएससी का संगम लगभग 80% तक पहुंच जाता है तो कोशिकाओं को पारित किया जाना चाहिए।
    1. एक माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। पासिंग से पहले स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली विभेदित कोशिकाओं (<5%) को चिह्नित और यांत्रिक रूप से हटा दें।
    2. चरण 1.1.1 में वर्णित ईसीएम-कोटेड प्लेट तैयार करें।
    3. पूर्व गर्म एमएम और 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) सीए2 + और एमजी2 + के बिना आर टी पर ।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 0.5 एमएम ईडीटीए (1x पीबीएस में) समाधान को पहले से गर्म करें।
    5. एक वैक्यूम-आकांक्षा प्रणाली का उपयोग करके संस्कृति प्लेट से माध्यम निकालें, 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को धोने और दो बार दोहराने के लिए प्रत्येक कुएं में 1x पीबीएस का 1 एमएल जोड़ें।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए 5% सीओ 2 पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में एचपीएससी को अलग करने के लिए प्रति अच्छी तरह से EDTA समाधान का1 मिलीएल जोड़ें। एकल कोशिकाओं के विघटन से बचने के लिए अनुशंसित इनक्यूबेशन समय से अधिक न करें।
    7. प्लेट को बाहर निकालें और माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की टुकड़ी की जांच करें। कन्फ्यूजन एचपीएससी ढीला हो जाता है और प्रत्येक सेल बॉर्डर को देखा जा सकता है, लेकिन कोशिकाएं आसानी से सेल प्लेट को धीरे से हिलाकर नहीं आ सकतीं ।
    8. 1 एमएल पिपेट के साथ ईडीटीए समाधान निकालें, और वियोजन को रोकने के लिए 1 मिलीएमएल एमएम जोड़ें। कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए 1 एमएल पिपेट के साथ एक या दो बार एचपीएससी को धीरे-धीरे पिपेट करें। कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए अपकेंद्रित्र करने की कोई आवश्यकता नहीं है।
      नोट: यदि अधिकांश कोशिकाएं EDTA के साथ इनक्यूबेशन के बाद प्लेट से उतर आती हैं, तो कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र द्वारा एकत्र किया जा सकता है।
    9. पूर्व-लेपित कुओं (चरण 1.2.2) से ईसीएम निकालें, और प्रति अच्छी तरह से 1.5 एमएल एमएम जोड़ें।
    10. प्रत्येक कुएं में सेल झुरमुट के 150-200 माइक्रोन स्थानांतरित करें। आम तौर पर, एचपीएससी को 1:6 के अनुपात में पारित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 6-अच्छी प्लेट के एक कुएं से कोशिकाओं को छह नए कुओं में वितरित किया जा सकता है।
    11. एचपीएससी को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को धीरे-धीरे हिलाएं और एचपीएससी को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 को कम से कम24 घंटे के लिए प्लेट को छुए बिना संस्कृति दें।
    12. चरण 1.1 में वर्णित हर दूसरे दिन एमएम बदलें।

2. एचपीएससी से रेटिना भेदभाव

नोट: जब कालोनियों में ~ 80% संगम(चित्रा 1 बी)पहुंचते हैं, तो उन्हें चित्र 1 एमें किए गए प्रोटोकॉल के बाद रेटिना ऑर्गेनॉइड में अंतर करने के लिए निर्देशित किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि एचपीएससी में उच्च गुणवत्ता और अच्छी उपज हो, नियमित रूप से आईएफसी या क्यूपीसीआर का उपयोग करके ऑकॉट4 या नैनोजी जैसे आणविक मार्कर के साथ प्लुरिपेंसी का मूल्यांकन करें। यदि विभेदित कोशिकाएं कुल कोशिकाओं के 5% से अधिक हैं तो एचपीएससी को छोड़ दिया जाना चाहिए । निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक माइकोप्लाज्मा डिटेक्शन किट के साथ माइकोप्लाज्मा संदूषण की जांच करें। केवल माइकोप्लाज्मा-मुक्त एचपीएससी का उपयोग करें क्योंकि माइकोप्लाज्मा एचपीएससी की भेदभाव क्षमता को बदल सकता है।

  1. मीडिया और रिएजेंट तैयार करें
    1. निम्नलिखित मिलाकर तंत्रिका प्रेरण माध्यम (एनआईएम) तैयार करें: दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम/पोषक तत्व मिश्रण एफ-12 (डीएमईएम/एफ-12, 1:1), 1% N2 पूरक के 5 मिलीएल, 0.1% हेपरिन के 0.5 मिलील (1x पीबीएस में 2 मिलीग्राम/एमएल), और 1% एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए) के 5 एमएल।
    2. डीएमईएम/एफ-12 के 300 मिलीएल, डीएमईएम बेसिक के 200 एमएल, 2% बी27 सप्लीमेंट के 10 एमएल, 1% एंटीबायोटिक एंटीमायकोटिक के 5 एमएल और 1% एमईएम एनईएए के 5 एमएल वाले रेटिना विभेदन माध्यम (आरडीएम) तैयार करें।
      नोट: एनआईएम और आरडीएम दोनों फ़िल्टर नहीं किए जाते हैं लेकिन एक बंध्यता परीक्षण किया जाता है। माध्यम के 1 मिलीएल बाहर ले लो और यह एक 35 मिमी पकवान में जोड़ें, और संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक इनक्यूबेटर में3-7दिनों के लिए। मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और घटकों की गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए 2 सप्ताह के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए।
    3. डीएमएसओ में 10 एमएम ब्लेबिस्टिन (1,000x) तैयार करें। 10 एमएमएल स्टॉक समाधान (1,000x) प्राप्त करने के लिए 5 मिलीग्राम ब्लेबिस्टिन को भंग करने के लिए डीएमएसओ के 1,710 माइक्रोन जोड़ें, 10 माइक्रोन/ट्यूब पर एलिकोट, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: सभी मीडिया और अभिकर्मकों को उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए आरटी पर गर्म किया जाना चाहिए, जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया जाए।
  2. भ्रूण शरीर (ईबी) गठन
    1. दिन 0 (D0) पर, भेदभाव शुरू करते हैं। 6-वेल प्लेट से एचपीएससी का एक कुआं निकालें, जो ~ 80% संगम हो गया है। 1.2.1 से 1.2.6 चरणों में वर्णित EDTA वियोजन समाधान के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    2. EDTA समाधान निकालें, कोशिका वियोजन को रोकने के लिए 10 माइक्रोन ब्लेबिस्टिन युक्त एमएम के 1 एमएल जोड़ें, और कोशिकाओं को 1 एमएल पिपेट के साथ इकट्ठा करें। सेल झुरमुटों का आकार ईबी की उपज को प्रभावित करने वाले प्रमुख कारकों में से एक है। लगभग, प्रति झुरमुट पांच कोशिकाओं को D5 से D7 पर ईबी के सही आकार का उत्पादन करने के लिए पसंद किया जाता है।
      नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है। कोशिकाओं को भी कई बार पिपेट न करें क्योंकि ईबी जैसे समुच्चय एचपीपीएससी की एकल कोशिकाओं से बनाना कठिन होता है।
    3. सेल सस्पेंशन (लगभग 2 x 106 कोशिकाओं) को 100 मिमी अल्ट्रा-कम अटैचमेंट पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और डिश में 10 माइक्रोन ब्लेबिस्टटिन युक्त एमएम के 9 एमएल जोड़ें।
    4. कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए दो बार पकवान को हिलाएं, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेटर में पकवान डालें।
    5. D1 पर, कोशिकाओं को कम से कम 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत होने के बाद, पकवान को बाहर निकालें और माइक्रोस्कोप के नीचे इसका निरीक्षण करें। इस समय(चित्रा 1C)द्वारा बड़ी संख्या में छोटे सेल समुच्चय का गठन किया जाएगा।
    6. 15 एमएल ट्यूब में एमएम और एनआईएम के साथ 3:1 अनुपात (एमएम के 9 एमएल और एनआईएम के 3 एमएल) पर 12 एमएल मिश्रण तैयार करें।
    7. सेल संस्कृतियों को 10 एमएल पिपेट लंबवत के साथ 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और डिश में पूर्व-गर्म मिश्रण के 10 एमएल जोड़ें।
    8. समुच्चय इकट्ठा करने के लिए 3 मिनट के लिए 60 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें, 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके सुपरनेट को हटा दें और कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए लगभग 500 माइक्रोन को पीछे छोड़ दें।
    9. मिश्रण के 2 एमएल को ट्यूब में जोड़ें, और निलंबन को उसी डिश (चरण 2.2.7) में स्थानांतरित करें।
    10. धीरे से पकवान हिला करने के लिए समान रूप से सेल समुच्चय वितरित, और पकवान इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया ।
    11. डी 2 पर, 15 एमएल ट्यूब में एमएम और एनआईएम के साथ 1:1 अनुपात (एमएम के 6 एमएल और एनआईएम के 6 एमएल) पर एक नए मिश्रण का 12 एमएल तैयार करें। 2.2.5 से 2.2.10 तक चरणों को दोहराकर ताजा तैयार मिश्रण के साथ सेल माध्यम बदलें।
    12. डी 3 पर, ऊपर वर्णित के रूप में एनआईएम के 15 एमएल के साथ सेल माध्यम बदलें। निलंबन शर्तों के तहत कम से कम 5 दिनों के लिए कोशिकाओं को संस्कृति।
      नोट: D1 से D3 के दौरान, माध्यम को प्रत्येक दिन बदला जाना चाहिए, पर्याप्त पोषण प्रदान करना चाहिए। D3 के बाद से, एनआईएम हर दूसरे दिन बदला जा सकता है। इसके अलावा, ईबी को प्रचुर मात्रा में पोषण प्रदान करने के लिए कई व्यंजनों में विभाजित किया जा सकता है।
  3. बीज ईबी
    नोट: D5 से D7 पर, ईबी के आकार के अनुसार ईसीएम-लेपित व्यंजनों पर ईबी प्लेट करने के लिए एक उपयुक्त समय बिंदु चुनें। 200 माइक्रोन के अनुमानित व्यास वाले ईबी रेटिना भेदभाव के लिए उपयुक्त हैं। सामान्य तौर पर, 6-अच्छी प्लेट में एचपीएससी का एक कुआं लगभग 300 से 1,000 ईबी का उत्पादन कर सकता है। ईबी यील्ड की भिन्नता एचपीपीएससी लाइनों द्वारा भिन्न होती है।
    1. D4 पर, ईबीएस अनुयायी संस्कृति के लिए ईसीएम-लेपित व्यंजन तैयार करें। प्रत्येक 100 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान (सतह का इलाज) में ईसीएम के 5 एमएल जोड़ें, और उन्हें रात भर इनक्यूबेटर में रखें।
    2. D5 पर, पूर्व-लेपित व्यंजनों से ईसीएम निकालें, और प्रत्येक डिश में पूर्व-गर्म एनआईएम के 10 एमएल जोड़ें।
    3. ईबी युक्त पकवान को बाहर निकालें। माइक्रोस्कोप के तहत ईबी की गुणवत्ता की जांच करें और यह सुनिश्चित करें कि वे काफी उज्ज्वल और आकार में गोल हैं। ईबी का आकार व्यास में लगभग 200 माइक्रोन है। एक 15 एमएल ट्यूब में सभी ईबी ले लीजिए। ईबी को व्यंजनों से 5 एमएल पिपेट के साथ 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ईबी को 5 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें। अधिकांश सुपरनेट निकालें, मध्यम के बारे में 2 एमएल पीछे छोड़ दें।
    4. ईबी को 1 मिलील पिपेट के साथ ड्रॉप करके एनआईएम ड्रॉप के 10 एमएल वाले लेपित व्यंजनों में वितरित करें। प्रतिसेमी2 के घनत्व पर ईबी बीज । उदाहरण के लिए, 100 मिमी डिश में लगभग 120-180 ईबी जोड़ें। मोटे तौर पर ईबी संख्या का न्याय करने के लिए, ईबी निलंबन की एक बूंद को कवरस्लिप पर रखें, और माइक्रोस्कोप के नीचे ईबी की संख्या गिनें।
      नोट: ईबी का चढ़ाना घनत्व रेटिना प्रेरण की दक्षता को प्रभावित करने वाले प्रमुख कारकों में से एक है। घनत्व को प्रत्येक एचपीपीएससी लाइन द्वारा भी समायोजित किया जा सकता है।
    5. धीरे से ईबी समान रूप से वितरित करने के लिए व्यंजन हिला। उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: ईबी के पालन को बढ़ाने के लिए कम से कम 24 घंटे के लिए व्यंजन न ले जाएं।
  4. पालन शर्तों में ऑप्टिक वेसिकल्स (ओवी) और रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) का प्रेरण
    नोट: ईबी को ईसीएम लेपित सतह पर वरीयता प्राप्त करने के बाद, एचपीएससी ओवी जैसी संरचनाओं को विकसित कर सकता है, जिसे भेदभाव के बाद D20 के रूप में देखा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, विशिष्ट विकास कारकों या संकेत अणुओं को मीडिया में N2 और B27 की खुराक के अलावा रेटिना भाग्य में एचपीएससी का मार्गदर्शन करने की आवश्यकता नहीं है ।
    1. D8-D9 पर, व्यंजन निकालें और माइक्रोस्कोप के नीचे ईबी का निरीक्षण करें। सभी ईबी संलग्न और व्यंजन(चित्रा 1D)पर फैल जाएगा । पुराने माध्यम के 10 एमएल युक्त प्रत्येक 100 मिमी पकवान में ताजा एनआईएम के 10 एमएल जोड़ें। उन्हें वापस इनक्यूबेटर में डाल दिया।
      नोट: पुराने माध्यम को न हटाएं।
    2. D12 पर, 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके एनआईएम के साथ माध्यम का आधा बदलें। संस्कृति को इनक्यूबेटर में रखें।
    3. D16 पर, वैक्यूम-आकांक्षा प्रणाली का उपयोग करके व्यंजनों से सभी एनआईएम को हटा दें। प्रत्येक डिश में आरडीएम का 20 एमएल जोड़ें। आरडीएम में खेती करते रहें और हर दूसरे दिन आधे माध्यम को बदलें।
    4. D10-D30 के दौरान, एक माइक्रोस्कोप के तहत सप्ताह में दो बार कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तनों का निरीक्षण करें और रेटिना भेदभाव की दक्षता का मूल्यांकन करें।
      नोट: D10 के बाद से, नेत्र क्षेत्र (ईएफ) डोमेन अनुयायी ईबी के परिधीय क्षेत्रों में स्वयं-संगठित हैं। OV की तरह संरचनाओं D20 से D25 के बीच दिखाई देते हैं, धीरे से पकवान से फैला हुआ है, और स्वयं के रूप में एक ऑप्टिक कप है, जो रंजक RPE(चित्रा 1E)से घिरा हुआ है । ओवी को उज्ज्वल, अपवर्तक और मोटी एनआर अंगूठी के साथ आसानी से पहचाना जा सकता है।
  5. रेटिना ऑर्गेनॉइड (आरओ) प्राप्त करने के लिए निलंबन में अलग और संस्कृति OVs और RPE
    1. D28-D35 पर, OVs के अधिकांश व्यंजनों में दिखाई देते हैं । आसन्न आरपीई के साथ रूपात्मक रूप से पहचाने जाने वाले ओवी को यांत्रिक रूप से अलग करने के लिए 1 एमएल सिरिंज के साथ टंगस्टन सुई या सुई का उपयोग करें। उन्हें निलंबन में संस्कृति।
      नोट: ओवी और आरपीई की उपस्थिति और उपज विभिन्न एचपीएससी लाइनों में व्यापक रूप से भिन्न होती है। इस प्रकार, ओवी और आरपीई को अलग करने का समय बिंदु लचीला है। आसन्न आरपीई के साथ स्पष्ट OVs अलग किया जा सकता है, और फिर एक कम लगाव संस्कृति RDM युक्त पकवान में चले गए । जब तक सभी OVs और RPEs उठा रहे हैं कोशिकाओं के बाकी खेती रखो।
    2. प्रत्येक 100 मिमी कम अटैचमेंट कल्चर डिश में 50-60 ओवी रखें जिसमें आरओ गठन(चित्रा 1F)के लिए आरडीएम के 15 एमएल होते हैं।
    3. D42 तक हर 2-3 दिनों में आरडीएम बदलें, जब आरओ अच्छी तरह से गोल आकार के होते हैं।

3. रेटिना विकास और परिपक्वता

नोट: इस प्रोटोकॉल में, सीरम को दीर्घकालिक संस्कृति के लिए आरओ को बढ़ने और परिपक्व रखने के लिए आवश्यक है।

  1. आरओ में रेटिना लेमिनेशन और स्पेसिफिकेशन
    1. 1x पीबीएस में 100 mm taurine (1,000x) के 10 ml तैयार करें। 125 मिलीग्राम टॉरिन का वजन करें, और 1x पीबीएस के 10 एमएल में भंग करें। 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ समाधान फ़िल्टर करें। 500 μL/tube पर Aliquot, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. रेटिना कल्चर मीडियम 1 (आरसी1) तैयार करें। निम्नलिखित घटकों को मिलाएं: डीएमईएम/एफ-12 के 250 एमएल, डीएमईएम बेसिक का 175 एमएल, भ्रूण गोजातीय सीरम का 50 एमएल, 2% बी27 सप्लीमेंट का 10 एमएल, 1% एंटीबायोटिक एंटीमायकोटिक का 5 एमएल, 1% एमईएम एनईएए का 5 एमएल, 100 माइक्रोन टॉरिन का 05 एमएल और 2 एमएम एल-एलनिल-एल-ग्लूमिन का 5 एमएल।
    3. डीएमईएम/एफ-12 के 450 एमएल युक्त रेटिना कल्चर मीडियम 2 (आरसी2) तैयार करें, भ्रूण गोजातीय सीरम का 50 एमएल, 1% एन2 सप्लीमेंट का 5 एमएल, 1% एंटीबायोटिक एंटीमायकोटिक का 5 एमएल, 100 माइक्रोन टॉरिन का 0.5 एमएल, 1% एमईएम एनईएए का 5 एमएल और 2 एमएम एल-अलनिल-एल-ग्लूटामाइन का 5 एमएल।
      नोट: RC1 और RC2 फ़िल्टर नहीं कर रहे हैं, लेकिन एक बंध्यता परीक्षण से गुजरना । माध्यम के 1 मिलीएल बाहर ले लो, यह एक 35 मिमी पकवान में जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेटर में 3-7 दिनों के लिए संस्कृति, उपयोग से पहले बंध्यता सुनिश्चित करने के लिए। माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और घटकों की गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए 2 सप्ताह के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए। सभी मीडिया और अभिकर् स उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए आरटी पर पूर्व गरम किया जाना चाहिए ।
    4. D42 पर, आरडीएम से आरसी 1 में संस्कृति माध्यम को स्विच करें।
    5. व्यंजनों को लगभग 30 डिग्री पर झुकाएं और आरओ को 30 एस के लिए व्यवस्थित होने दें। पुराने आरडीएम को 10 एमएल पिपेट के साथ हटा दें, जो करीब 1 एमएल मीडियम को पीछे छोड़ दें ताकि खोने से बचा जा सके । प्रत्येक डिश में ताजा आरसी 1 का 15 एमएल जोड़ें।
    6. धीरे से बर्तन हिलाने के लिए आरओ समान रूप से वितरित करते हैं । बर्तन वापस इनक्यूबेटर में रखो। इसके बाद सप्ताह में दो बार पूरा माध्यम बदलें।
    7. D50-D90 के दौरान, दीर्घकालिक संस्कृति के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरओ का चयन करें, जो एक मोटी और उज्ज्वल एनआर के साथ गोल आकार के होते हैं। आरसी1 के 20 एमएल के साथ 100 एमएम कम अटैचमेंट डिश में 30-40 आरओ रखें, और हफ्ते में दो बार पूरे मीडियम को बदल दें।
    8. आरओ के दीर्घकालिक निलंबन संस्कृति के लिए, एक पिपेट का उपयोग करके आरओ-आरओ रिएचिंग से बचने के लिए आरओ को पिपेट करें। व्यंजनों की सतह से चिपके हुए आरओ से बचने के लिए महीने में एक बार नई संस्कृति व्यंजनों में आरओ स्थानांतरित करें।
      नोट: निलंबन संस्कृति की स्थिति के तहत, आरओ गोल आकार के होते हैं, एक उज्ज्वल और मोटी एनआर अंगूठी एक तरफ कम या ज्यादा आरपीई के साथ संलग्न होती है। लैमिनेटेड न्यूरल रेटिना विकसित होता है और रेटिना सेल उपप्रकार क्रमिक रूप से रेटिना गैंगलियन कोशिकाओं के साथ दिखाई देते हैं, जिसके बाद फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं, अमैक्रिन कोशिकाएं और द्विध्रुवी कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं।
  2. आरओ में शंकु के संवर्धन के साथ मानव फोटोरिसेप्टर परिपक्वता
    1. D90 के बाद, माध्यम को आरसी 1 से आरसी 2 पर स्विच करें, जो फोटोरिसेप्टर परिपक्वता के लिए उपयुक्त है।
    2. चरण 3.1.7-3.1.8 में वर्णित माध्यम बदलें।
      नोट: इस संस्कृति की स्थिति के तहत, ROs दीर्घकालिक(चित्रा 1G),D300 परीक्षण करने के लिए विकसित कर सकते हैं । आरओ में रेटिना कोशिकाएं परिपक्व हो जाती हैं, और म्यूलर ग्लियल कोशिकाओं, छड़ और शंकु सहित तंत्रिका रेटिना के सभी सेल उपप्रकार भी प्राप्त किए जाते हैं। आरए के किसी भी अतिरिक्त के बिना, शंकु फोटोरिसेप्टर भी आरओ में समृद्ध हैं।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में रेटिना प्रेरण प्रक्रिया मानव भ्रूण रेटिना के विकास की नकल करती है। रेटिना भेदभाव शुरू करने के लिए, एचपीएससी को छोटे झुरमुटों में अलग किया गया था और निलंबन में सुसंस्कृत किया गया था ताकि ईबी के गठन को प्रेरित किया जा सके । D1 पर, वर्दीधारी सेल एकत्रित या ईबी(चित्रा 1C)का गठन किया । संस्कृति माध्यम धीरे-धीरे एनआईएम में परिवर्तित हो गया था। D5 पर, EBs ECM-लेपित संस्कृति व्यंजन पर चढ़ाया गया । कोशिकाएं धीरे-धीरे ईबीएस(चित्रा 1डी)से बाहर निकल गईं। D10 से, आंखों के क्षेत्रों स्वयं अनुयायी EBs के परिधीय क्षेत्र में आयोजित किया । डी16 पर आरडीएम की जगह इंडक्शन मीडियम किया गया। बाद में, एनआर डोमेन धीरे-धीरे बनते हैं, पकवान से फैलते हैं, और आरपीई कोशिकाओं(चित्रा 1E)से घिरे स्वयं-गठित OV जैसी संरचनाएं हैं। D28-D35 के दौरान, आव को बगल के आरपीई के साथ एक तेज सुई के साथ उठाया गया था और निलंबन में सुसंस्कृत किया गया था। निलंबन संस्कृति की स्थिति के तहत, आरओ स्वयं का गठन तंत्रिका रेटिना (एनआर) एक तरफ कम या ज्यादा आरपीई क्षेत्र के साथ जुड़े(चित्रा 1F)और जीवित रह सकते है और जब तक FBS माध्यम में जोड़ा गया ओवरटाइम परिपक्व ।

रेटिना भेदभाव और विनिर्देश के रूप में प्रगति की, एचपीएससी ने क्रमिक रूप से सभी प्रमुख रेटिना सेल उपप्रकारों का उत्पादन किया। तंत्रिका रेटिना के उपप्रकार धीरे-धीरे परतों में लाइन में खड़े हो जाते हैं, देशी मानव रेटिना(चित्रा 2 ए-जी)की वास्तुकला सुविधाओं की नकल करते हैं। रेटिना गैंगलियन कोशिकाएं (आरजीसी) पहले रेटिना प्रोजेनिटर से उत्पन्न होती थीं और एपिकल साइड में स्थित एनआरएस फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के बेसल साइड में जमा होती थीं, जबकि अमैक्रिन कोशिकाएं, क्षैतिज कोशिकाएं, द्विध्रुवी कोशिकाएं और मूलर ग्लियल कोशिकाएं सभी एनआरएस की मध्यवर्ती परत में स्थित होती हैं।

इस प्रोटोकॉल के साथ, आरओ ने छड़ और शंकु(चित्रा 2G-I)दोनों के साथ अत्यधिक परिपक्व फोटोरिसेप्टर्स में विकसित किया। 8 सप्ताह के बाद विकासशील परमाणु परत(चित्रा 2G)में फोटोरिसेप्टर्स तेजी से बढ़े, और धीरे-धीरे 17 सप्ताह से परिपक्व हो गए। 21 सप्ताह से, छड़, लाल/हरे शंकु, और नीले शंकु सहित फोटोरिसेप्टर के सभी उपप्रकार ROs में पता लगाया जा सकता है । पूरे भेदभाव प्रक्रिया में आरए के किसी भी अतिरिक्त के बिना इस प्रेरण प्रोटोकॉल में समृद्ध छड़ और शंकु दोनों प्राप्त किए जा सकते हैं।

Figure 1
चित्र 1:एचपीएससी से रेटिना ऑर्गेनॉइड की इंडक्शन और रूपात्मक विशेषताएं। (ख)एचपीएससी (10x) की एक ठेठ कॉलोनी । (C)डी 1 (4x) पर ईबीएस । (घ)D7 पर, चढ़ाया EBs संलग्न थे और व्यंजन (4x) पर बाहर फैल गया । (ई)D25 पर, ऑप्टिक वेसिकल जैसी संरचनाएं (ओवी) ने पिगमेंटेड आरपीई (4x) से घिरे पकवान (लाल घेरे द्वारा इंगित) से गठित और फैला हुआ है। (एफ)ओवी को उठा लिए जाने और निलंबन की स्थिति में सुसंस्कृत होने के बाद रेटिना ऑर्गेनॉइड स्वयं गठित (तीर ने एनआर और आरपीई (4x) को इंगित किया । (जी)D180 (4x) पर एनआर (लाल तीर) और आरपीई (काला तीर) शामिल एक रेटिना ऑर्गेनॉइड। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2:रेटिना कोशिकाओं के उपप्रकारों को क्रमिक रूप से त्रि-आयामी रेटिना ऊतकों में पाया गया था। प्रमुख रेटिना सेल प्रकारों की उदाहरण छवियां इम्यूनोफ्लोरेटेंट धुंधला द्वारा विशिष्ट मार्कर व्यक्त करती हैं। (A-B) रेटिना जनक कोशिकाओं Ki67(A)और VSX2(B)व्यक्त की । (ग)आइलेट1 सकारात्मक रेटिना गैंगलियन कोशिकाएं तंत्रिका रेटिना के बेसल साइड में स्थित हैं। (घ)Amacrine कोशिकाओं AP2α के लिए सकारात्मक । (ई)SOX9 के लिए मुलर ग्लियल सेल्स पॉजिटिव । (एफ)पीकेसीα पॉजिटिव बाइपोलर सेल्स। (जी)सकारात्मक फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में ठीक होता है। (ज)रोडोप्सिन पॉजिटिव रॉड फोटोरिसेप्टर्स। (I)एल/एम-ऑप्सिन पॉजिटिव कोन फोटोरिसेप्टर्स । स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस बहु-कदम रेटिना प्रेरण प्रोटोकॉल में, एचपीएससी को रेटिना भाग्य हासिल करने के लिए कदम से कदम पर निर्देशित किया गया था, और टुकड़े टुकड़े में भरे एनआर और आरपीई युक्त रेटिना ऑर्गेनॉइड में स्वयं-संगठित किया गया था। भेदभाव के दौरान, एचपीएससी ने वीवो मेंमानव रेटिना विकास के सभी प्रमुख चरणों को फिर से लागू किया, ईएफ, ओवी और आरपीई से रेटिना लेमिनेशन तक, रेटिना कोशिकाओं के सभी उपप्रकारों को उत्पन्न किया, जिसमें रेटिना गैंगलियन कोशिकाएं, अमैकरीन कोशिकाएं, बाइपोलर कोशिकाएं, रॉड, और शंकु फोटोरिसेप्टर, और मूलर ग्लिकल कोशिकाएं एक स्थानिक और टेम्पोरल ऑर्डरर में शामिल हैं। रेटिना विकास के पुनर्पूंजीकरण से रेटिना रोग मॉडलिंग जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को लाभ होगा।

एचपीएससी3, 4,4, 5, 6, 7, 8,9,10, 13, 14, 15, 16,17,18,20 से रेटिना ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने के लिए कुछ प्रोटोकॉल स्थापित किए गएहैं। . संस्कृति की स्थितियों के अनुसार, प्रोटोकॉल को 2D, 3D में वर्गीकृत किया जा सकता है, और 2D और 3D दृष्टिकोण9,13के संयोजन। 2डी दृष्टिकोण6,10,22 का मतलब है कि सभी प्रेरण प्रक्रिया अनुयायी संस्कृति स्थितियों में होती है, एचपीएससी से वास्तुकला के बिना रेटिना कोशिकाएं उत्पन्न करती हैं। इसके विपरीत, 3 डी दृष्टिकोण7,11,23 का मतलब है कि सभी प्रेरण प्रक्रिया निलंबन संस्कृति की स्थिति के तहत है, संगठित रेटिना ऊतकों उपज । उदाहरण के लिए, Sasai, Y. et al.7,24 एक SFEBq विधि (सीरम मुक्त फ्लोटिंग संस्कृति की सूचना दी भ्रूण शरीर की तरह जल्दी फिर से एकत्रीकरण के साथ समुच्चय) ESCs मार्गदर्शन करने के लिए निलंबन संस्कृति में ऑप्टिक कप में अंतर । इस प्रोटोकॉल सहित मल्टी-स्टेप 3डी दृष्टिकोण8,11,18,20, 25 का उपयोग करके, एचपीएससी को अनुयायी और निलंबन संस्कृति दोनों स्थितियों के तहत रेटिना फैट्स और ऑर्गेनॉइड की ओर प्रेरित किया गया है।

तंत्रिका रेटिना भाग्य के लिए एचपीएससी को प्रेरित करने के लिए, कई प्रोटोकॉल में मीडिया में बहिर्जात कारकों की एक श्रृंखला जोड़ी गई है। उदाहरण के लिए, लांबा, एट अल26 ने एनट्रोरेटर फैट के लिए ईएसएस को निर्देशित करने के लिए नोगिन (बीएमपी पाथवे का अवरोधक) और डिककोफ-1 (dkk1, Wnt/β-catenin सिग्नलिंग पाथवे के विरोधी) और इंसुलिन जैसे विकास कारक-1 (आईजीएफ-1) का संयोजन जोड़ा । ओसाकाडा एट अल6 ने रॉड और शंकु फोटोरिसेप्टर अग्रदूत प्राप्त करने के लिए DAPT (एक पायदान सिग्नलिंग पाथवे अवरोधक) और लेफ्ट-राइट थॉर्पिंग फैक्टर ए (एक डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग पाथवे अवरोधक) जोड़ा। कुवाहारा एट अल27 और कैपोवस्की एट अल3 ने ओवी उत्पादन में सुधार के लिए एचपीएससी संस्कृति के प्रारंभिक एक्सपोजर के लिए BMP4 को जोड़ा। इसके विपरीत, यह अनुकूलित रेटिना प्रेरण प्रोटोकॉल एन 2 और बी 27 के बुनियादी पूरक को छोड़कर बाह्य सिग्नलिंग मॉड्यूलर की आवश्यकता के बिना सरल और कम लागत है।

रेटिनोइक एसिड (आरए) रेटिना विकास और फोटोरिसेप्टर निर्धारण 28 ,29,30में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाताहै । अधिकांश प्रोटोकॉल कुछ अवधियों में आरए (0.5-1 माइक्रोन) के पूरक के साथ विकसित किए गए थे। हमारे अध्ययनों से पता चला है कि आरए की बहुत अधिक सांद्रता या आरए उपचार की बहुत लंबी अवधि के परिणामस्वरूप रॉड से भरपूर फोटोरिसेप्टर होते हैं लेकिन शंकु भेदभाव को रोकते हैं8,18। हालांकि, इस अनुकूलित प्रोटोकॉल में, आरए को पूरे भेदभाव प्रक्रिया18में संस्कृति मीडिया में नहीं जोड़ा जाता है, जो शंकु फोटोरिसेप्टर्स के उत्पादन को बढ़ावा देता है, जो मानव दिवस-समय दृष्टि और रंग दृष्टि के लिए जिम्मेदार है और आरडी उपचार के सेल प्रतिस्थापन के लिए आवश्यक है। यद्यपि कुछ अध्ययनों से पता चलता है कि थायराइड हार्मोन सिग्नलिंग चूहों और मानव रेटिना31,32में शंकु उपप्रकारों को निर्देशित करता है , लेकिन शंकु की प्रतिबद्धता के लिए नियामक अभी भी स्पष्ट नहीं है33. किम एट अल34 और लोव एट अल35से इन अध्ययनों में, दीर्घकालिक संस्कृति भी किसी भी एक्सोजेनोसस रेटिनोइक एसिड उत्पन्न शंकु से भरपूर रेटिना ऑर्गेनॉइड, जो इस अनुकूलित प्रोटोकॉल के अनुरूप है।

समझ करने के लिए इस प्रोटोकॉल के प्रमुख बिंदुओं को उच्च गुणवत्ता वाले ईबी बनाने के लिए और उचित बीज EBs के लिए कर रहे हैं । कोशिकाओं को जल्दी EB निलंबन संस्कृति के दौरान तेजी से बढ़ता है । माध्यम को हर दिन बदला जाना चाहिए और प्रचुर मात्रा में पोषण प्रदान करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। ईबी का आकार, व्यास में लगभग 200 माइक्रोन, रेटिना भेदभाव के लिए उपयुक्त है। 2-3 ईबी प्रतिसेमी 2 पर ईबी का चढ़ाना घनत्व अधिकांश एचपीपीएससी लाइनों के लिए उपयुक्त है। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का सबसे अच्छा लाभ रेटिना प्रेरण की दक्षता और पुनरावृत्ति को बढ़ाने के लिए ईबी आकार और चढ़ाना घनत्व का मात्राकरण है। हमने स्पष्ट रूप से सभी कदमों का विस्तार से वर्णन किया है, जो काफी हद तक अनुभवहीन शोधकर्ताओं को रेटिना प्रेरण को सीखने और दोहराने में मदद करता है ।

इसके अलावा, रेटिना इंडक्शन दक्षता काफी हद तक एचपीएससी36, 37की गुणवत्ता और भेदभाव शक्ति पर निर्भर करती है। विभिन्न एचपीएससी में अलग-अलग क्षमता होती है। कुछ एचपीएससी लाइनों में वास्तव में खराब दक्षता होती है, जो पुनर्प्रोग्रामिंग विधियों, दैहिक कोशिकाओं आदि के कारण हो सकती है। इस प्रोटोकॉल को विभिन्न एचपीएससी के लिए उपयुक्त होने की पुष्टि की गई है, जिसमें फाइब्रोब्लास्ट, रक्त औरमूत्र कोशिकाओं18,20,21से विभिन्न एचईसी और एचपीएससी पुनर्प्रोग्राम शामिल हैं। सामान्य तौर पर, ऊपर वर्णित इस प्रोटोकॉल के साथ, 6-अच्छी प्लेट में एचपीएससी (लगभग 80% संगम) का एक कुआं लगभग 1,000 ईबी उत्पन्न कर सकता है, जो लगभग 200 आरटीओ का उत्पादन कर सकता है। इसलिए, उच्च दक्षता वाला यह प्रोटोकॉल रेटिना ऑर्गेनॉइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन और बुनियादी और अनुवादात्मक अध्ययन सहित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लाभों के लिए उपयुक्त है।

संक्षेप में, अनुकूलित रेटिना प्रेरण प्रोटोकॉल उच्च पुनरावृत्ति और दक्षता के साथ सरल और कम लागत है, रेटिना रोगों के आशाजनक व्यक्तिगत मॉडल प्रदान करता है और सेल थेरेपी, दवा स्क्रीनिंग और जीन थेरेपी परीक्षण के लिए प्रचुर मात्रा में सेल स्रोत प्रदान करता है।

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Disclosures

Xiufeng झेंग मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से रेटिना कोशिकाओं की पीढ़ी से संबंधित पेटेंट आविष्कारक है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016YFC11011103, 2017YFA010101), ग्वांग्झू विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना कोष (201803010078), गुआंगदोंग प्रांत की विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना (2017B02020230003), चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (NSF) द्वारा समर्थित किया गया था ( 81570874, 81970842), सन यात-सेन विश्वविद्यालय (PT1001010) के सौ प्रतिभा कार्यक्रम, और नेत्र विज्ञान के राज्य कुंजी प्रयोगशाला के मौलिक अनुसंधान कोष ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(−)-Blebbistatin Sigma B0560-5mg ROCK-inhibitor
1 ml tips Kirgen KG1313 1 ml
10 ml pipette Sorfa 3141001 Pipette
100 mm Tissue culture BIOFIL TCD000100 100 mm Petri dish
100 mm Tissue culture Falcon 353003 100 mm Petri dish
15 ml Centrifuge tubes BIOFIL CFT011150 Centrifuge tubes
35 mm Tissue culture dishes Falcon 353001 35 mm Petri dish
5 ml pipette Sorfa 313000 Pipette
50 ml Centrifuge tubes BIOFIL CFT011500 Centrifuge tubes
6 wells tissue culture plates Costar 3516 Culture plates
Anti-AP2α Antibody DSHB 3b5 Primary antibody
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X Gibco 15240062 Antibiotic-Antimycotic
Anti-ISL1 Antibody Boster BM4446 Primary antibody
Anti-Ki67 Antibody Abcam ab15580 Primary antibody
Anti-L/M opsin Antibody gift from Dr. jeremy / Primary antibody
Anti-PAX6 Antibody DSHB pax6 Primary antibody
Anti-rabbit 555 Invitrogen A31572 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)
Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin Antibody Millipore ab5585 Primary antibody
Anti-Rhodopsin Antibody Abcam ab5417 Primary antibody
Anti-sheep 555 Invitrogen A21436 Donkey anti-Sheep IgG (H+L)
Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 Antibody Abclonal A19710 Primary antibody
Anti-VSX2 Antibody Millipore ab9016 Primary antibody
B-27 supplement W/O VIT A (50X) Gibco 12587010 Supplement
Cryotube vial Thermo scientific-NUNC 375418 1.8 ml
DAPI DOJINDO D532 4',6-Diamidino-2-phenylindole
dihydrochloride; multiple suppliers
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max Sigma D2650-100ML Multiple suppliers
DMEM Gibco C11995500BT Medium
DMEM /F12 Gibco C11330500BT Medium
EDTA Invitrogen 15575-020 0.5 M PH 8.0
FBS NATOCOR SFBE Serum
Filter Millipore SLGP033RB 0.22μm, sterile Millex filter
GlutaMax, 100X Gibco 35050061 L-alanyl-L-glutamine
Heparin Sigma H3149 2 mg/ml in PBS to use
Matrigel, 100x Corning 354277 Extracellular matrix (ECM)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140050 MEM NEAA
mTeSR1 STEM CELL 85850 hPSCs maintenance medium (MM)
N2 supplement Gibco 17502048 Supplement
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer GNM GNM10010 Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M
Taurine Sigma T0625 Supplement
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment Corning CLS3262-20EA Petri dish

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References

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चिकित्सा अंक 170
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से 3 डी रेटिना ऊतकों के व्युत्पन्न के लिए रेटिना ऑर्गेनॉइड इंडक्शन सिस्टम
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Guan, Y., Xie, B., Zhong, X. Retinal … More

Guan, Y., Xie, B., Zhong, X. Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (170), e62435, doi:10.3791/62435 (2021).

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