Summary
Hier beschrijven we een geoptimaliseerd retinale organoïde inductiesysteem, dat geschikt is voor verschillende menselijke pluripotente stamcellijnen om retinale weefsels met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie te genereren.
Abstract
Retinale degeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaken van onomkeerbare blindheid zonder effectieve behandeling. Pluripotente stamcellen die het potentieel hebben om te differentiëren in alle soorten retinale cellen, zelfs mini-retinale weefsels, houden enorme beloften in voor patiënten met deze ziekten en vele mogelijkheden in ziektemodellering en geneesmiddelenscreening. Het inductieproces van hPSC's naar retinale cellen is echter ingewikkeld en tijdrovend. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd retinaal inductieprotocol om retinale weefsels met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie te genereren, geschikt voor verschillende menselijke pluripotente stamcellen. Dit protocol wordt uitgevoerd zonder de toevoeging van retinoïnezuur, wat de verrijking van kegelfotoreceptoren ten goede komt. Het voordeel van dit protocol is de kwantificering van EB-grootte en platingdichtheid om de efficiëntie en herhaalbaarheid van retinale inductie aanzienlijk te verbeteren. Met deze methode verschijnen alle belangrijke retinale cellen sequentieel en vatten ze de belangrijkste stappen van retinale ontwikkeling samen. Het zal downstream-toepassingen vergemakkelijken, zoals ziektemodellering en celtherapie.
Introduction
Retinale degeneratieve ziekten (ED's), zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en retinitis pigmentosa (RP), worden gekenmerkt door de disfunctie en dood van fotoreceptorcellen en leiden meestal tot onomkeerbaar verlies van het gezichtsvermogen zonder effectieve manieren om te genezen1. Het mechanisme dat aan deze ziekten ten grondslag ligt, is grotendeels onbekend, deels als gevolg van een gebrek aan menselijke ziektemodellen2. In de afgelopen decennia zijn er aanzienlijke vorderingen geboekt in de regeneratieve geneeskunde door middel van stamceltechnologie. Veel onderzoekers, waaronder wijzelf, hebben aangetoond dat menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's), inclusief menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's), kunnen differentiëren in alle soorten retinale cellen, zelfs mini-retinale weefsels door verschillende differentiatiebenaderingen3,4,5,6,7,8,9,10, 11, biedt een enorm potentieel in ziektemodellering en celtherapie12,13,14.
Het inductieproces van hPSC's naar retinale cellen is echter zeer gecompliceerd en tijdrovend met een lage herhaalbaarheid, wat onderzoekers met rijke ervaring en hoge vaardigheden vereist. Tijdens het complexe en dynamische inductieproces zullen een aantal factoren de opbrengst van retinale weefselsbeïnvloeden 15,16,17. Ook variëren verschillende inductiemethoden vaak aanzienlijk in timing en robuuste expressie van retinale markers, wat de monsterverzameling en gegevensinterpretatie kan verstoren3. Daarom zou een eenvoudig protocol van retinale differentiatie van hPSC's met stapsgewijze begeleiding in trek zijn.
Hier, op basis van onze gepubliceerde studies18,19,20,21,wordt een geoptimaliseerd retinale inductieprotocol beschreven om retinale organoïden (RO's) te genereren met rijke kegelfotoreceptoren van hPSC's, waarvoor geen supplement van retinoïnezuur (RA) nodig is. Dit protocol richt zich op de beschrijving van de meerstappenmethode om neuraal netvlies en RPE te genereren. EB-vorming is het essentiële onderdeel van de vroege inductiefase. Zowel de grootte als de platingdichtheid van EB's zijn kwantitatief geoptimaliseerd, wat de opbrengst van retinale weefsels wetenschappelijk verbetert en de herhaalbaarheid bevordert. In het tweede deel van de inductie organiseren optische blaasjes (OVs) zichzelf in de therapietrouwcultuur en vormen zich ERRO's in de suspensiecultuur; de tijdscursussen en efficiëntie van dit deel variëren aanzienlijk in verschillende hPSC-lijnen. De rijping en specificatie van retinale cellen in RA's vindt voornamelijk plaats in het middelste en late stadium van inductie. Zonder de toevoeging van RA kunnen volwassen fotoreceptoren met zowel rijke kegels als staafjes worden geproduceerd.
Het doel van dit protocol is om elke stap kwantitatief te beschrijven en te detailleren voor onervaren onderzoekers om te herhalen. Verschillende hPSC-lijnen zijn met succes geïnduceerd in RO's door dit protocol met een robuuste opbrengst van kegelrijke retinale weefsels en een hoge herhaalbaarheid. HPSC-afgeleide RO's met dit protocol kunnen de belangrijkste stappen van retinale ontwikkeling in vivosamenvatten en op lange termijn overleven, wat downstream-toepassingen vergemakkelijkt, zoals ziektemodellering, geneesmiddelenscreening en celtherapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultuur en uitbreiding van hPSC's
- HPSC cultuur
- Bedek twee putten van een 6-putsplaat met extracellulaire matrix (ECM, hESC-gekwalificeerde matrix). Bereid 50 ml van een ECM-oplossing met 8-12 μg/ml ECM in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM). Voeg in 49 ml DMEM 1 ml van de ontdooide ECM-stamoplossing (50x) toe. Voeg 1 ml van de ECM-oplossing toe aan elke put van een 6-well plaat. Incubeer het gedurende 1 uur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Bereid hPSC-onderhoudsmedium (MM) voor volgens de instructies van de fabrikant.
- Verwarm MM voor bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 min.
- Ontdooi een cryogene injectieflacon met hPSC's (hiPSC's of hESCs) (ongeveer 1 x10 6) uit een tank met vloeibare stikstof door incubatie in een waterbad bij 37 °C gedurende 30 s.
- Haal de injectieflacon eruit en desinfecteer deze zorgvuldig met een 75% desinfectiealcoholspray. Zet het in een bioveiligheidskast.
- Breng de celsuspensie van de injectieflacon over naar een buis van 15 ml, voeg druppelsge voor druppel 5 ml voorverwarmde MM toe aan de buis met behulp van een pipet van 5 ml. Schud ondertussen voorzichtig aan de buis om de hPSC's te mengen.
- Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 170 x g. Verwijder het grootste deel van het supernatant voorzichtig met een pipet van 1 ml en laat ongeveer 50 μL supernatant achter om te voorkomen dat de cellen verloren gaan.
- Voeg 1 ml MM toe aan de buis en suspenseer de pellet door een of twee keer voorzichtig op en neer te pipetteren met een pipet van 1 ml.
OPMERKING: De overleving van enkele cellen van hPSC's is laag. Kleine celklonten met 3-5 cellen hebben de voorkeur om de hPSC's in kolonies te laten groeien. - Verwijder ECM uit de voorgecoate putten (stap 1.1.1), voeg 1,5 ml MM toe aan elke put en verdeel vervolgens 0,5 ml celsuspensie per put.
- Schud de plaat voorzichtig om de hPSC's gelijkmatig te verdelen en plaats de plaat in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Beweeg de plaat niet gedurende ten minste 24 uur om de celtrouw te bevorderen.
- Verander MM om de andere dag en doorloop de hPSC's wanneer de samenvloeiing ongeveer 80% heeft bereikt.
- Doorgeven van hPSC's
OPMERKING: Het onderhoud van de ongedifferentieerde toestand in hPSC's is vrij kritisch voor verdere toepassingen. Onder de aanhankelijke omstandigheden groeien hPSC's in kolonies met een goed gedefinieerde grens. De cellen moeten worden gepasseerd wanneer de samenvloeiing van hPSC's ongeveer 80% bereikt.- Observeer de cellen onder een microscoop. Markeer en verwijder mechanisch de duidelijk zichtbare gedifferentieerde cellen (<5%) voordat ze passeren.
- Bereid de met ECM beklede plaat voor zoals beschreven in stap 1.1.1.
- Voorverwarm mm en 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) zonder Ca2+ en Mg2+ bij RT.
- Verwarm de 0,5 mM EDTA (in 1x PBS) oplossing voor in een waterbad bij 37 °C.
- Verwijder het medium van de kweekplaat met behulp van een vacuümaspiratiesysteem, voeg 1 ml 1x PBS toe in elke put om de cellen te wassen met een pipet van 1 ml en herhaal dit tweemaal.
- Voeg 1 ml EDTA-oplossing per put toe om de hPSC's te dissociëren in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 5 minuten. Overschrijd de aanbevolen incubatietijd niet om dissociatie naar afzonderlijke cellen te voorkomen.
- Haal de plaat eruit en controleer op het losmaken van cellen onder een microscoop. De samenvloeiende hPSC's worden losser en elke celrand is te zien, maar de cellen kunnen niet gemakkelijk loskomen door de celplaat zachtjes te schudden.
- Verwijder de EDTA-oplossing met een pipet van 1 ml en voeg 1 ml MM toe om de dissociatie te stoppen. Pipetteer de hPSC's voorzichtig een of twee keer met een pipet van 1 ml om de cellen opnieuw te suspenen. Het is niet nodig om te centrifugeren om de cellen te verzamelen.
OPMERKING: Als de meeste cellen na incubatie met EDTA van de plaat komen, kunnen cellen worden verzameld door een centrifuge. - Verwijder ECM uit de voorgecoate putten (stap 1.2.2) en voeg 1,5 ml MM per put toe.
- Breng 150-200 μL celklonten over naar elke put. Over het algemeen kunnen hPSC's worden gepasseerd in een verhouding van 1: 6. Cellen uit één put van een 6-putplaat kunnen bijvoorbeeld worden verdeeld over zes nieuwe putten.
- Schud de plaat voorzichtig om de hPSC's gelijkmatig te verdelen en kweek de hPSC's in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 24 uur zonder de plaat aan te raken.
- Vervang MM om de dag zoals beschreven in stap 1.1.
2. Retinale differentiatie van hPSC's
OPMERKING: Wanneer de kolonies ~80% samenvloeiing bereiken(figuur 1B),kunnen ze worden geleid om te differentiëren in retinale organoïden volgens het protocol dat is geschematiseerd in figuur 1A. Om ervoor te zorgen dat de hPSC's een hoge kwaliteit en een goede opbrengst hebben, evalueert u regelmatig de pluripotentie met moleculaire markers zoals OCT4 of NANOG met behulp van IFC of QPCR. HPSC's moeten worden weggegooid als gedifferentieerde cellen meer dan 5% van de totale cellen uitmaken. Controleer op mycoplasmabesmetting met een mycoplasma-detectiekit volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik alleen mycoplasma-vrije hPSC's omdat mycoplasma het differentiatievermogen van hPSC's kan veranderen.
- Media en reagentia voorbereiden
- Bereid neuraal inductiemedium (NIM) voor door het volgende te mengen: 500 ml Dulbecco's gemodificeerd eaglemedium / voedingsmengsel F-12 (DMEM / F-12, 1: 1), 5 ml 1% N2-supplement, 0,5 ml 0,1% heparine (2 mg / ml in 1x PBS) en 5 ml 1% MEM niet-essentiële aminozuren (NEAA).
- Bereid retinale differentiatiemedium (RDM) voor met 300 ml DMEM / F-12, 200 ml DMEM basisch, 10 ml 2% B27-supplement, 5 ml 1% antibioticumantie antimycotisch en 5 ml 1% MEM NEAA.
OPMERKING: Zowel NIM als RDM worden niet gefilterd, maar er wordt een steriliteitstest uitgevoerd. Haal 1 ml medium eruit en voeg het toe in een schaal van 35 mm en kweek gedurende 3-7 dagen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. De media kunnen worden bewaard bij 4 °C en moeten binnen 2 weken worden gebruikt om de activiteit van de componenten te garanderen. - Bereid 10 mM Blebbistatine (1.000x) in DMSO. Voeg 1.710 μL DMSO toe om 5 mg blebbistatine op te lossen om 10 mM stamoplossing (1.000x) te verkrijgen, aliquot bij 10 μL/buis en bewaren bij -20 °C.
OPMERKING: Alle media en reagentia moeten vóór gebruik gedurende 30 minuten bij RT worden opgewarmd, tenzij anders vermeld.
- Embryoïde lichaamsvorming (EB)
- Start op dag 0 (D0) de differentiatie. Haal een put hPSCs uit een 6-well plaat, die is gegroeid tot ~ 80% confluentie. Verzamel de cellen met EDTA-dissociatieoplossing zoals beschreven in stappen 1.2.1 tot en met 1.2.6.
- Verwijder de EDTA-oplossing, voeg 1 ml MM met 10 μM blebbistatine toe om de celdissociatie te stoppen en verzamel de cellen met een pipet van 1 ml. De grootte van celklonten is een van de belangrijkste factoren die van invloed zijn op de opbrengst van EB's. Ongeveer vijf cellen per klomp hebben de voorkeur om de juiste grootte van EB's op D5 tot D7 te produceren.
OPMERKING: Dit is een belangrijke stap. Pipetteer de cellen niet te vaak, omdat EB-achtige aggregaten moeilijk te vormen zijn uit afzonderlijke cellen van hPSC's. - Breng de celsuspensie (ongeveer 2 x10 6 cellen) over in een 100 mm ultralage petrischaal en voeg 9 ml MM met 10 μM blebbistatine toe aan de schaal.
- Schud de schaal twee keer voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen en zet de schaal in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
- Op D1, nadat de cellen gedurende ten minste 24 uur zijn gekweekt, haalt u de schaal eruit en observeert u deze onder de microscoop. Een groot aantal van de kleine celaggregaten zal tegen die tijd spontaan worden gevormd (Figuur 1C).
- Bereid 12 ml mengsel met MM en NIM in een verhouding van 3:1 (9 ml MM en 3 ml NIM) in een buis van 15 ml.
- Breng de celculturen over in een centrifugebuis van 15 ml met een pipet van 10 ml loodrecht en voeg 10 ml van het voorverwarmde mengsel toe aan de schaal.
- Centrifugeer de buis gedurende 3 minuten bij 60 x g om de aggregaten te verzamelen, verwijder het supernatant met een pipet van 5 ml en laat ongeveer 500 μL achter om te voorkomen dat cellen verloren gaan.
- Voeg 2 ml van het mengsel toe aan de buis en breng de suspensie over in dezelfde schaal (stap 2.2.7).
- Schud de schaal voorzichtig om de celaggregaten gelijkmatig te verdelen en plaats de schaal terug in de couveuse.
- Bereid op D2 12 ml van een nieuw mengsel met MM en NIM in een verhouding van 1:1 (6 ml MM en 6 ml NIM) in een buis van 15 ml. Ververs het celmedium met het vers bereide mengsel door de stappen van 2.2.5 tot en met 2.2.10 te herhalen.
- Verander op D3 het celmedium met 15 ml NIM zoals hierboven beschreven. Kweek de cellen gedurende ten minste 5 dagen onder de suspensieomstandigheden.
OPMERKING: Tijdens D1 tot D3 moet het medium elke dag worden vervangen, waardoor er voldoende voeding is. Sinds D3 kan NIM om de dag worden gewijzigd. Ook kunnen EB's worden onderverdeeld in verschillende gerechten om overvloedige voeding te bieden.
- Zaai de EB's
OPMERKING: Kies op D5 tot en met D7 een geschikt tijdstip om de EB's op de ECM-gecoate schotels te borden op basis van de grootte van de EG's. EB's met een geschatte diameter van 200 μm zijn geschikt voor de retinale differentiatie. Over het algemeen kan één put hPSC's in een 6-putplaat ongeveer 300 tot 1.000 EB's produceren. De variatie van eb-opbrengst wordt gevarieerd door de hPSC-lijnen.- Bereid op D4 ECM-gecoate gerechten voor de EC-aanhangercultuur. Voeg 5 ml ECM toe aan elke 100 mm weefselkweekschaal (behandeld oppervlak) en leg ze een nacht in de couveuse.
- Verwijder op D5 ECM uit de voorgecoate gerechten en voeg 10 ml voorverwarmde NIM toe aan elk gerecht.
- Haal het gerecht met EB's eruit. Controleer de kwaliteit van EB's onder de microscoop en zorg ervoor dat ze vrij helder en rond van vorm zijn. De grootte van de EB's is ongeveer 200 μm in diameter. Verzamel alle EB's in een buis van 15 ml. Breng de EB's van de schotels over naar een buis van 15 ml met een pipet van 5 ml. Laat de EB's 5 minuten tot rust komen. Verwijder het grootste deel van het supernatant en laat ongeveer 2 ml medium achter.
- Verdeel de EB's druppelsge voor druppel in de gecoate schalen met 10 ml NIM met een pipet van 1 ml. Zaai de EB's met een dichtheid van ongeveer 2-3 EBs per cm2. Voeg bijvoorbeeld ongeveer 120-180 EB's toe aan een schotel van 100 mm. Om het EB-getal ruwweg te beoordelen, plaatst u één druppel EB-suspensie op een coverslip en telt u het aantal EB's onder de microscoop.
OPMERKING: De platingdichtheid van EB's is een van de belangrijkste factoren die van invloed zijn op de efficiëntie van retinale inductie. De dichtheid kan ook worden aangepast door elke hPSC-lijn. - Schud de gerechten voorzichtig om de EB's gelijkmatig te verdelen. Doe ze in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
OPMERKING: Verplaats de gerechten niet gedurende ten minste 24 uur om de hechting van EB's te verbeteren.
- Inductie van optische blaasjes (OVs) en retinaal pigmentepitheel (RPE) in aanhankelijke omstandigheden
OPMERKING: Nadat EB's op het ecm-gecoate oppervlak zijn gezaaid, kunnen hPSC's OV-achtige structuren ontwikkelen, die al na differentiatie kunnen worden waargenomen. In dit protocol zijn geen specifieke groeifactoren of signaalmoleculen vereist om de hPSC's in het retinale lot te leiden, behalve de toevoeging van N2- en B27-supplementen in de media.- Verwijder op D8-D9 de schotels en observeer de EB's onder de microscoop. Alle EB's worden bevestigd en verspreid over de schotels(figuur 1D). Voeg 10 ml verse NIM toe aan elke schaal van 100 mm met 10 ml oud medium. Leg ze terug in de couveuse.
OPMERKING: Verwijder het oude medium niet. - Vervang op D12 de helft van het medium met NIM met behulp van een pipet van 10 ml. Houd de cultuur in de incubator.
- Verwijder op D16 alle NIM uit de schotels met behulp van een vacuümaspiratiesysteem. Voeg 20 ml RDM toe aan elk gerecht. Blijf kweken in RDM en verander om de dag de helft van het medium.
- Observeer tijdens D10-D30 de morfologische veranderingen van de cellen twee keer per week onder een microscoop en evalueer de efficiëntie van retinale differentiatie.
OPMERKING: Sinds D10 zijn oogveld (EF) domeinen zelfgeorganiseerd in de perifere zones van adherente EB's. De OV-achtige structuren verschijnen tussen D20 en D25, steken geleidelijk uit de schaal en vormen zelf een optische beker, die wordt omringd door de gepigmenteerde RPE (figuur 1E). De EV's zijn gemakkelijk te herkennen aan de heldere, brekings- en dikke NR-ring.
- Verwijder op D8-D9 de schotels en observeer de EB's onder de microscoop. Alle EB's worden bevestigd en verspreid over de schotels(figuur 1D). Voeg 10 ml verse NIM toe aan elke schaal van 100 mm met 10 ml oud medium. Leg ze terug in de couveuse.
- Losmaken en kers en RPE in suspensie om retinale organoïden (RA's) te verkrijgen
- Op D28-D35 verschijnen de meeste OVs in de schotels. Gebruik een wolfraamnaald of een naald met een spuit van 1 ml om de morfologisch identificeerbare OK's mechanisch los te maken, samen met de aangrenzende RPE. Kweek ze in schorsing.
OPMERKING: Het uiterlijk en de opbrengst van OK's en RPE variëren sterk in verschillende hPSC-lijnen. Het tijdspunt van het loskoppelen van OV en RPE is dus flexibel. Voor de hand liggende OVs met de aangrenzende RPE kunnen worden losgemaakt en vervolgens worden verplaatst naar een cultuurschaal met lage aanhechting met RDM. Blijf de rest van de cellen kweken totdat alle OVs en RPE's zijn opgetild. - Plaats 50-60 OK's in elke 100 mm lage aanbouwcultuurschaal met 15 ml RDM voor de OK-formatie(figuur 1F).
- Vervang RDM elke 2-3 dagen tot D42, wanneer de ROs goed rond zijn.
- Op D28-D35 verschijnen de meeste OVs in de schotels. Gebruik een wolfraamnaald of een naald met een spuit van 1 ml om de morfologisch identificeerbare OK's mechanisch los te maken, samen met de aangrenzende RPE. Kweek ze in schorsing.
3. Retinale ontwikkeling en rijping
OPMERKING: In dit protocol is serum vereist om de RA's te laten groeien en rijpen voor langdurige kweek.
-
Retinale laminatie en specificatie in ROs
- Bereid 10 ml taurine van 100 mM (1.000x) in 1x PBS. Weeg 125 mg taurine af en los op in 10 ml 1x PBS. Filtreer de oplossing met een spuitfilter van 0,22 μm. Aliquot bij 500 μL/buis en bewaren bij -20 °C.
- Bereid retinaal kweekmedium 1 (RC1) voor. Meng de volgende componenten: 250 ml DMEM /F-12, 175 ml dmem basisch, 50 ml foetaal runderserum, 10 ml 2% B27-supplement, 5 ml 1% antibioticum antimycotisch, 5 ml 1% MEM NEAA, 0,5 ml 100 μM taurine en 5 ml L-alanyl-L-glutamine.
- Bereid retinaal kweekmedium 2 (RC2) voor met 450 ml DMEM / F-12, 50 ml foetaal runderserum, 5 ml 1% N2-supplement, 5 ml 1% antibioticum antimycotisch, 0,5 ml 100 μM taurine, 5 ml 1% MEM NEAA en 5 ml 2 ml L-alnyl-L-glutamine.
OPMERKING: De RC1 en RC2 worden niet gefilterd, maar ondergaan een steriliteitstest. Haal 1 ml medium eruit, voeg het toe aan een schaal van 35 mm en kweek gedurende 3-7 dagen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2, om steriliteit voor gebruik te garanderen. Het medium kan worden bewaard bij 4 °C en moet binnen 2 weken worden gebruikt om de activiteit van de componenten te garanderen. Alle media en reagentia moeten voor gebruik gedurende 30 minuten bij RT worden voorverwarmd. - Schakel op D42 het kweekmedium over van RDM naar RC1.
- Kantel de schotels op ongeveer 30° en laat de ROs 30 s bezinken. Verwijder de oude RDM met een pipet van 10 ml en laat ongeveer 1 ml medium achter om te voorkomen dat er RO's verloren gaan. Voeg 15 ml verse RC1 toe aan elk gerecht.
- Schud de gerechten voorzichtig om de RA's gelijkmatig te verdelen. Zet de vaat terug in de couveuse. Vervang daarna twee keer per week het hele medium.
- Selecteer tijdens D50-D90 hoge kwaliteit VAN ROs voor langdurige cultuur, die rond gevormd zijn met een dikke en heldere NR. Plaats 30-40 RA's in een 100 mm lage opzetschaal met 20 ml RC1 en vervang het hele medium twee keer per week.
- Voor de langdurige suspensiecultuur van RO's pipetteert u de RO's om te voorkomen dat RO-RO opnieuw wordt vastgeklopt met behulp van een pipet. Breng ROs één keer per maand over naar nieuwe cultuurgerechten om te voorkomen dat ROs aan het oppervlak van de gerechten blijven plakken.
OPMERKING: Onder de omstandigheden van de ophangingscultuur zijn DE's rond van vorm, met een heldere en dikke NR-ring bevestigd met min of meer RPE aan één kant. Gelamineerd neuraal netvlies ontwikkelt zich en retinale celsubtypen verschijnen sequentieel met retinale ganglioncellen die eerst worden gegenereerd, gevolgd door fotoreceptorcellen, amacrinecellen en bipolaire cellen.
-
Menselijke fotoreceptorrijping met verrijking van kegels in RA's
- Schakel na D90 het medium van RC1 naar RC2, wat geschikt is voor fotoreceptorrijping.
- Wijzig het medium zoals beschreven in stappen 3.1.7-3.1.8.
OPMERKING: Onder deze kweekconditie kunnen RU's op lange termijn groeien(figuur 1G),tot D300 getest. Retinale cellen in RO's worden volwassen en alle celsubtypen van het neurale netvlies, inclusief muller gliacellen, staafjes en kegeltjes worden ook verworven. Zonder enige toevoeging van RA zijn kegelfotoreceptoren ook rijk aan ROs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het retinale inductieproces in dit protocol bootst de ontwikkeling van het menselijk foetaal netvlies na. Om de retinale differentiatie te initiëren, werden hPSC's gedissocieerd in kleine klonten en gekweekt in suspensie om de vorming van EB's te induceren. Op D1 vormden de geüniformeerde celaggregaten of EG's (figuur 1C). Het cultuurmedium werd geleidelijk overgezet naar NIM. Op D5 werden EB's op de ECM-gecoate kweekschalen geplakt. Cellen migreerden geleidelijk uit de EB's (figuur 1D). Vanaf D10, oogvelden zelfgeorganiseerd in de perifere zone van adherente EB's. Op D16 werd het inductiemedium vervangen door RDM. Daarna vormden zich geleidelijk de NR-domeinen, staken uit de schotel en zelfgevormde OV-achtige structuren omringd door de RPE-cellen (Figuur 1E). Tijdens D28-D35 werden EV's samen met de aangrenzende RPE met een scherpe naald opgetild en in suspensie gekweekt. Onder de omstandigheden van de suspensiecultuur vormden ROs zichzelf bestaande uit neural retina (NR) bevestigd met min of meer RPE-bol aan één kant (figuur 1F) en konden overleven en in de loop van de tijd rijpen zolang FBS aan het medium werden toegevoegd.
Naarmate retinale differentiatie en specificatie vorderden, produceerden hPSC's alle belangrijke retinale celsubtypen sequentieel. De subtypen van neuraal netvlies kwamen geleidelijk in lagen op een rij te staan en bootsten de architectuurkenmerken van het inheemse menselijke netvlies na(Figuur 2A-G). Retinale ganglioncellen (RGC's) werden voor het eerst gegenereerd uit retinale voorlopercellen en verzamelden zich in de basale kant van NRs. Fotoreceptorcellen aan de apicale kant, terwijl amacrinecellen, horizontale cellen, bipolaire cellen en muller gliacellen zich allemaal in de tussenlaag van NRs bevinden.
Met dit protocol ontwikkelden RO's zich tot de zeer volwassen fotoreceptoren met zowel staafjes als kegeltjes(Figuur 2G-I). Fotoreceptoren namen na week 8 snel toe in de zich ontwikkelende kernlaag (figuur 2G) en rijpten geleidelijk vanaf week 17. Vanaf week 21 kunnen alle subtypen fotoreceptoren, waaronder staafjes, rood/groene kegeltjes en blauwe kegeltjes, worden gedetecteerd in RO's. Zowel rijke staafjes als kegels kunnen in dit inductieprotocol worden verkregen zonder enige toevoeging van RA gedurende het hele differentiatieproces.
Figuur 1: Inductie en morfologische kenmerken van retinale organoïden van hPSC's. (A) Schema's van retinale inductie van hPSC's. (B) Een typische kolonie hPSC's (10x). (C) EB's op D1 (4x). (D) Op D7 werden vergulde EB's bevestigd en uitgespreid over de gerechten (4x). (E)Op D25 vormden en staken de optische blaasjesachtige structuren (OPV's) uit de schotel (aangegeven door de rode cirkel), omgeven door gepigmenteerde RPE (4x). (F) Retinale organoïden zelf gevormd nadat OK's werden opgetild en gekweekt in suspensieomstandigheden (de pijlen wezen NR en RPE (4x). (G) Een retinale organoïde bestaande uit NR (rode pijl) en RPE (zwarte pijl) op D180 (4x). Schaalbalken = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Subtypes van retinale cellen werden sequentieel gedetecteerd in driedimensionale retinale weefsels. Voorbeeldbeelden van belangrijke retinale celtypen die specifieke markers tot expressie brengen door immunofluorescente kleuring. (A-B) Retinale voorlopercellen uitgedrukt Ki67 (A) en VSX2 (B). (C)Islet1 positieve retinale ganglioncellen gelegen in de basale kant van het neurale netvlies. (D) Amacrinecellen positief voor AP2α. (E) Muller gliacellen positief voor SOX9. (F) PKCα positieve bipolaire cellen. (G) Herstel in positieve fotoreceptorcellen. (H) Rhodopsine positieve staaf fotoreceptoren. (I) L/M-opsine positieve kegelfotoreceptoren. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit multi-step retinale inductieprotocol werden hPSC's stap voor stap begeleid om het retinale lot te verkrijgen en zelf georganiseerd in retinale organoïden met gelamineerde NR en RPE. Tijdens de differentiatie hebben hPSC's alle belangrijke stappen van de menselijke retinale ontwikkeling in vivosamengevat , van EF, OV en RPE tot retinale laminatie, waarbij alle subtypen retinale cellen worden gegenereerd, inclusief retinale ganglioncellen, amacrinecellen, bipolaire cellen, staaf- en kegelfotoreceptoren en muller gliacellen in een ruimtelijke en temporele volgorde. De recapitulatie van retinale ontwikkeling zou downstream-toepassingen ten goede komen, zoals retinale ziektemodellering.
Er zijn een aantal protocollen opgesteld om retinale organoïden te genereren uit hPSCs3,4,5,6,7,8,9,10,13,14,15,16,17,18,19,20 . Afhankelijk van de kweekomstandigheden kunnen de protocollen worden ingedeeld in 2D, 3D en de combinatie van 2D en 3D benadert9,13. De 2D-benaderingen6,10,22 betekenen dat al het inductieproces plaatsvindt in de aanhankelijke kweekomstandigheden, waardoor retinale cellen zonder architectuur van hPSC's worden gegenereerd. Daarentegen betekenen de 3D-benaderingen7,11,23 dat al het inductieproces zich onder de omstandigheden van de suspensiecultuur bevindt, wat georganiseerde retinale weefsels oplevert. Sasai, Y. et al.7,24 rapporteerden bijvoorbeeld een SFEBq-methode (serumvrije zwevende cultuur van embryoïde lichaamsachtige aggregaten met snelle heraggregatie) om SER's te begeleiden om te differentiëren in optische cups in suspensiecultuur. Met behulp van de meerstaps 3D-benaderingen8,11,18,20,25 inclusief dit protocol, zijn hPSC's geïnduceerd in de richting van retinale lotgevallen en organoïden onder zowel adherente als suspensiecultuuromstandigheden.
Om hPSC's te induceren tot neuraal retinaal lot, zijn een reeks exogene factoren toegevoegd aan de media in vele protocollen. Lamba, et al.26 voegden bijvoorbeeld een combinatie toe van noggin (een remmer van de BMP-route) en Dickkopf-1 (dkk1, een antagonist van de Wnt / β-catenine-signaleringsroute) en insuline-achtige groeifactor-1 (IGF-1) om SER's naar een anterieur neuraal lot te leiden. Osakada et al.6 voegden DAPT (een Notch signaling pathways inhibitor) en Left-Right Determination Factor A (een WNT signaling pathways inhibitor) toe om rod and cone photoreceptor precursors te verkrijgen. Kuwahara et al.27 en Capowski et al.3 voegden BMP4 toe voor een korte, vroege blootstelling van hPSC-cultuur om de OV-productie te verbeteren. Daarentegen is dit geoptimaliseerde retinale inductieprotocol eenvoudig en goedkoop zonder extrinsieke signaleringsmodulatoren, behalve het basissupplement van N2 en B27.
Retinoïnezuur (RA) speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling van het netvlies en de bepaling van de fotoreceptor28,29,30. De meeste protocollen zijn ontwikkeld met het supplement van RA (0,5-1 μM) in bepaalde perioden. Onze studies hebben aangetoond dat een te hoge concentratie RA of een te lange periode van RA-behandeling resulteert in staafrijke fotoreceptoren, maar de kegeldifferentiatieremt 8,18. In dit geoptimaliseerde protocol wordt RA echter niet toegevoegd aan de kweekmedia gedurende het hele differentiatieproces18, waardoor de productie van kegelfotoreceptoren wordt bevorderd, die verantwoordelijk is voor het zicht en kleurenzicht van de mens overdag en vereist is voor celvervanging van RD-behandeling. Hoewel sommige studies onthullen dat schildklierhormoonsignalering kegelsubtypen bij muizen en menselijk netvliesregisseert 31,32, is de regulator voor kegelbetrokkenheid nog steeds onduidelijk33. In deze studies van Kim et al.34 en Lowe et al.35, de lange termijn cultuur ook zonder enige exogene retinoïnezuur gegenereerd kegel-rijke retinale organoïden, wat consistent is met dit geoptimaliseerde protocol.
De belangrijkste punten van dit protocol om te begrijpen zijn om EB's van hoge kwaliteit te maken en EB's op de juiste manier te zaaien. Cellen groeien snel tijdens vroege EB-suspensiecultuur. Het medium moet elke dag worden vervangen en voldoende zijn om overvloedige voeding te bieden. De grootte van EB's, ongeveer 200 μm in diameter, is geschikt voor de retinale differentiatie. De beplatingsdichtheid van EB's bij 2-3 EBs per cm2 is geschikt voor de meeste hPSC-lijnen. Het beste voordeel van dit geoptimaliseerde protocol is de kwantificering van EB-grootte en platingdichtheid om de efficiëntie en herhaalbaarheid van retinale inductie aanzienlijk te verbeteren. We hebben alle stappen duidelijk in detail beschreven, wat de onervaren onderzoekers grotendeels helpt om de retinale inductie te leren en te herhalen.
Bovendien hangt de efficiëntie van retinale inductie grotendeels af van de kwaliteit en differentiatiekracht van de hPSCs36,37. Verschillende hPSC's hebben verschillende efficiënties. Sommige hPSC-lijnen hebben inderdaad een slechte efficiëntie, wat te wijten kan zijn aan de herprogrammeringsmethoden, somatische cellen, enzovoort. Dit protocol is geschikt gebleken voor verschillende hPSC's om 3D retinale organoïden en de RPE te verkrijgen, waaronder verschillende hESCs en hiPSCs geherprogrammeerd uit fibroblasten, bloed- en urinecellen18,20,21. Over het algemeen kan met dit hierboven beschreven protocol één put hPSC's (ongeveer 80% samenvloeiing) in een 6-putplaat ongeveer 1.000 EB's genereren, wat ongeveer 200 RO's oplevert. Daarom is dit protocol met een hoog rendement geschikt voor grootschalige productie van retinale organoïden en komt het downstream-toepassingen ten goede, waaronder basis- en translationele studie.
Kortom, het geoptimaliseerde retinale inductieprotocol is eenvoudig en goedkoop met een hoge herhaalbaarheid en efficiëntie, biedt veelbelovende gepersonaliseerde modellen van retinale ziekten en biedt een overvloedige celbron voor celtherapie, medicijnscreening en gentherapietest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Xiufeng Zhong is de patent uitvinder met betrekking tot de generatie van retinale cellen uit menselijke pluripotente stamcellen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het National Key R & D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), het Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), het Science & Technology Project van de provincie Guangdong (2017B020230003), de Natural Science Foundation (NSF) van China (81570874, 81970842), honderd talentprogramma van Sun Yat-sen University (PT1001010) en de Fundamental Research Funds van het State Key Laboratory of Ophthalmology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
References
- Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
- Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
- Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
- Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
- Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
- Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
- da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
- Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
- Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
- Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
- Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
- DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).
