Summary
여기서 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포주에 적합한 최적화된 망막 오르간성 유도 시스템을 설명하여 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성합니다.
Abstract
망막 퇴행성 질환은 효과적인 치료없이 돌이킬 수없는 실명의 주요 원인입니다. 망막 세포의 모든 모형으로 분화할 가능성이 있는 만능 줄기 세포, 심지어 미니 망막 조직조차, 이 질병을 가진 환자를 위한 거대한 약속을 개최하고 질병 모델링 및 약 검열에 있는 많은 기회를 보유합니다. 그러나 hPSCs에서 망막 세포에 이르는 유도 과정은 복잡하고 시간이 많이 소요됩니다. 여기서, 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포에 적합한 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성하기 위하여 최적화된 망막 유도 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 원뿔 광수용체의 농축에 유익한 망막산을 첨가하지 않고 수행됩니다. 이 프로토콜의 장점은 망막 유도의 효율성과 반복성을 크게 향상시키기 위해 EB 크기와 도금 밀도의 정량화입니다. 이 방법을 사용하면 모든 주요 망막 세포가 순차적으로 나타나고 망막 발달의 주요 단계를 다시 수거합니다. 질병 모델링 및 세포 치료와 같은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 합니다.
Introduction
노화와 관련된 황반 변성(AMD) 및 망막색색소증(RP)과 같은 망막 퇴행성 질환(RDs)은 광수용체 세포의 기능 장애 및 사망을 특징으로 하며 전형적으로 효과적인 치료 방법 없이 돌이킬 수 없는 시력 상실로이어집니다. 이러한 질병의 근본적인 기계장치는 인간 질병 모형2의부족 때문에 부분적으로 알려지지 않았습니다. 지난 수십 년 동안 줄기 세포 기술을 통해 재생 의학에서 상당한 발전이 이루어졌습니다. 우리 자신을 포함한 많은 연구자들은 인간 배아 줄기 세포 (hESC)와 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)를 포함한 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)가 모든 종류의 망막 세포로 분화 할 수 있음을 보여주었으며, 다양한 분화 접근법3,4,5,6, 7,7, 8,9, 10,10, 10 도 11,질병 모델링 및 세포 치료에서 큰 잠재력을 제공하는12,13,14.
그러나 hPSCs에서 망막 세포에 이르는 유도 과정은 매우 복잡하고 반복성이 낮은 시간이 소요되며, 풍부한 경험과 높은 기술을 가진 연구원이 필요합니다. 복잡하고 역동적인 유도 과정에서 여러 가지 요인이 망막 조직의수율(15,16,17)에영향을 미칩니다. 또한, 상이한 유도 방법은 종종 샘플 수집 및 데이터 해석3을혼동할 수 있는 망막 마커의 타이밍과 견고한 발현에 상당히 차이가 있다. 따라서 단계별 지침이 있는 hPSC에서 망막 분화의 간단한 프로토콜이 수요가 있을 것입니다.
여기서, 당사의 발표된 연구18,19,20,21을기반으로, hPSC로부터 풍부한 콘 광수용체를 가진 망막 오르가노이드(ROs)를 생성하는 최적화된 망막 유도 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 레티노산(RA)의 보충제를 필요로 하지 않는다. 이 프로토콜은 신경 망막 및 RPE를 생성하는 다단계 방법의 설명에 중점을 둡니다. EB 형성은 초기 유도 단계의 필수적인 부분입니다. EB의 크기와 도금 밀도는 정량적으로 최적화되어 있으며, 이는 망막 조직의 수율을 과학적으로 향상시키고 반복성을 촉진합니다. 유도의 두 번째 부분에서, 광학 소포(OV)는 서스펜션 문화에서 준수 문화와 RO 형태로 자체 구성; 이 부분의 시간 과정과 효율성은 hPSC 라인에서 상당히 다릅니다. ROs의 망막 세포의 성숙 및 사양은 주로 유도의 중간 및 후기 단계에서 발생합니다. RA를 첨가하지 않고, 풍부한 원콘과 막대를 모두 갖춘 성숙한 광수용체를 생산할 수 있습니다.
이 프로토콜의 목적은 경험이 부족한 연구원이 반복할 수 있도록 각 단계를 정량적으로 설명하고 자세히 설명하는 것입니다. 다양한 hPSC 라인은 콘이 풍부한 망막 조직의 강력한 수율과 높은 반복성을 가진 이 프로토콜에 의해 로오스로 성공적으로 유도되었습니다. 이 프로토콜을 가진 HPSCs 유래 RSo는 생체 내에서망막 발달의 주요 단계를 재구성하고 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 세포 치료와 같은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 하는 장기적인 생존을 할 수 있습니다.
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Protocol
1. hPSC의 문화 및 확장
- HPSC 문화
- 세포 외 매트릭스 (ECM, hESC 자격 매트릭스)와 6 웰 플레이트의 두 개의 우물을 코팅합니다. 덜벡코의 수정독수리 매체(DMEM)에서 ECM의 8-12 μg/mL를 포함하는 ECM 용액 50mL를 준비한다. DMEM의 49mL에서 해동된 ECM 스톡 솔루션(50x)의 1mL을 추가합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 ECM 용액 1mL을 추가합니다. 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO2에서1h로 배양한다.
- 제조업체의 지시에 따라 hPSC 유지 보수 매체(MM)를 준비합니다.
- 실온(RT)에서 30분 동안 미리 따뜻합니다.
- 37°C에서 37°C에서 수조에서 인큐베이션하여 액체 질소 탱크로부터 hPSC(hiPSC 또는 hESC)(약 1 x106)의극저온 바이알을 해동한다.
- 유리병을 꺼내서 75% 소독 알코올 스프레이를 사용하여 조심스럽게 소독하십시오. 생물 안전 캐비닛에 넣어.
- 유리병에서 15mL 튜브로 셀 서스펜션을 옮기고, 5mL 파이펫을 사용하여 튜브에 드롭하여 5mL의 미리 데운 MM 드롭을 추가한다. 한편, 부드럽게 hPSC를 혼합 튜브를 흔들어.
- 5 분 동안 170 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 1mL 파이펫을 사용하여 대부분의 상체를 조심스럽게 제거하고 셀을 잃지 않도록 약 50 μL의 상체를 남겨 둡니다.
- 튜브에 MM 1mL을 추가하고 1mL 파이펫으로 한두 번 부드럽게 피펫을 사용하여 펠릿을 다시 놓습니다.
참고: hPSC의 단일 세포의 생존은 낮습니다. 3-5 세포를 가진 작은 세포 덩어리는 식민지에서 성장하는 hPSC를 유지하는 것이 바람직하다. - 미리 코팅된 우물(단계 1.1.1)에서 ECM을 제거하고, 각 웰에 1.5mL의 MM을 추가한 다음 우물당 0.5mL의 셀 서스펜션을 분배한다.
- 플레이트를 부드럽게 흔들어 hPSC를 균일하게 분배하고 플레이트를 37°C 및 5% CO2에서인큐베이터에 넣습니다. 세포 준수를 촉진하기 위해 적어도 24 시간 동안 플레이트를 이동하지 마십시오.
- 매일 MM을 변경하고 합류가 약 80 %에 도달하면 hPSC를 통과합니다.
- hPSC의 패시징
참고: hPSC에서 미분화 상태의 유지 관리는 추가 응용 분야에서 매우 중요합니다. 준수 조건하에서 hPSC는 잘 정의된 테두리를 가진 식민지에서 자랍니다. 세포는 hPSC의 합류가 대략 80%에 도달할 때 통과되어야 합니다.- 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 표시 및 기계적으로 통과하기 전에 명확하게 보이는 분화 세포 (<5 %)를 제거합니다.
- 1.1.1 단계에서 설명된 대로 ECM 코팅 플레이트를 준비한다.
- CA2+ 및 RT에서 Mg2+ 없이 미리 웜 MM 및 1x 인산완충액 식염수(PBS).
- 37°C에서 수조에서 0.5mM EDTA(1x PBS)용액을 미리 데우습니다.
- 진공 포부 시스템을 사용하여 배양 플레이트에서 배지를 제거하고, 1mL 파이펫을 사용하여 세포를 세척하고 두 번 반복하기 위해 각 웰에 1x PBS의 1mL을 추가합니다.
- 37°C에서 세포 배양 인큐베이터에서 hPSC를 해리하기 위해 잘 당 EDTA 용액 1mL을 추가하고 5분 동안 5%CO2를 허용한다. 단일 셀에 대한 해리를 피하기 위해 권장 인큐베이션 시간을 초과하지 마십시오.
- 접시를 꺼내 현미경으로 세포의 분리를 확인하십시오. confluent hPSC는 느슨해지고 각 세포 테두리를 볼 수 있지만 세포판은 부드럽게 흔들어서 쉽게 벗겨질 수 없습니다.
- 1mL 파이펫으로 EDTA 용액을 제거하고 1mLMM을 추가하여 해리를 막습니다. hPSC를 1mL 파이펫으로 한두 번 부드럽게 피펫하여 세포를 다시 페일 수 있습니다. 세포를 수집하기 위해 원심 분리기가 필요하지 않습니다.
참고: 대부분의 세포가 EDTA를 가진 배양 후 플레이트에서 벗겨지면 원심분리기에 의해 세포를 수집할 수 있습니다. - 미리 코팅된 우물(1.2.2단계)에서 ECM을 제거하고 웰당 1.5mL의 MM을 추가합니다.
- 각 우물에 세포 덩어리의 150-200 μL을 전송합니다. 일반적으로 hPSC는 1:6의 비율로 통과될 수 있다. 예를 들어, 6웰 플레이트의 한 우물에서 세포를 6개의 새로운 우물에 분배할 수 있다.
- 플레이트를 부드럽게 흔들어 hPSC를 균일하게 분배하고 플레이트를 건드리지 않고 적어도 24시간 동안 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이터에서 hPSC를 배양한다.
- 1.1 단계에서 설명된 대로 격일로 MM을 변경합니다.
2. hPSC에서 망막 분화
참고: 콜로니가 ~80%합류(도 1B)에도달하면 도 1A에서스키마화된 프로토콜에 따라 망막 오르가노이드로 분화하도록 유도될 수 있다. hPSC가 고품질과 양수량을 보장하기 위해 IFC 또는 QPCR을 사용하여 OCT4 또는 NANOG와 같은 분자 마커로 정기적으로 자성을 평가합니다. 차별화된 셀이 전체 셀의 5% 이상을 차지하는 경우 HPSC를 폐기해야 합니다. 제조업체의 지침에 따라 마이코플라즈마 검출 키트로 마이코플라즈마 오염을 확인하십시오. 마이코플라즈마는 hPSC의 차별화 기능을 변경할 수 있기 때문에 마이코플라즈마가 없는 hPSC만 사용하십시오.
- 미디어 및 시약 준비
- 다음을 혼합하여 신경 유도 매체(NIM)를 준비: 500mL 의 덜벡코 의 변형 된 독수리 중간/영양 혼합물 F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL 의 1% N2 보충, 0.5 mL 0.1% heparin (1 x PBS에서 2 mg/mL), 그리고 5 mL 의 1% MEM 비 필수 아미노산 (NEAA).
- DMEM/F-12 300mL, DMEM 기본 200mL, B27 보충제 2% 10mL, 항생제 항마이코틱 5mL, 1% MEM NEAA 5mL을 함유한 망막 분화 매체(RDM)를 준비한다.
참고: NIM과 RDM 모두 필터링되지 않지만 멸균 검사가 수행됩니다. 중간 크기의 1mL를 꺼내 35mm 접시에 넣고 37°C및 5%CO2의인큐베이터에서 3-7일 동안 배양한다. 매체는 4°C에서 저장할 수 있으며 구성 요소의 활성을 보장하기 위해 2 주 이내에 사용해야합니다. - DMSO에서 10m 블레비스타틴(1,000x)을 준비합니다. 1,710 μL의 DMSO를 추가하여 10mM 스톡 용액(1,000x),10 μL/튜브에서 알리쿼트, -20°C에 저장하기 위해 Blebbistatin 5 mg을 용해합니다.
참고: 달리 언급되지 않는 한 모든 미디어 및 시약은 사용 전 30분 동안 RT에서 데워져야 합니다.
- 배아 체 (EB) 형성
- 0일(D0)에서 차별화를 시작합니다. ~80%의 합류로 성장한 6웰 플레이트에서 hPSC의 우물 하나를 꺼내십시오. 단계 1.2.1 에서 1.2.6 단계에 설명된 바와 같이 EDTA 해리 솔루션으로 세포를 수집합니다.
- EDTA 용액을 제거하고, 10 μM Blebbistatin을 함유한 MM 1mL을 추가하여 세포 해리를 중지하고, 1mL 파이펫으로 세포를 수집합니다. 세포 덩어리의 크기는 EB의 수율에 영향을 미치는 주요 요인 중 하나입니다. 대략, 덩어리 당 5개의 세포는 D5 내지 D7에 적당한 크기의 EB를 생성하는 것이 바람직하다.
참고: 이것은 중요한 단계입니다. EB와 같은 골재는 hPSC의 단일 셀에서 형성하기 어렵기 때문에 세포를 너무 여러 번 피펫하지 마십시오. - 셀 서스펜션(약 2 x 106 셀)을 100mm 초저 부착 페트리 접시에 옮기고 10μM Blebbistatin을 함유한 MM 9mL을 접시에 첨가합니다.
- 부드럽게 세포를 균일하게 분배하기 위해 접시를 두 번 흔들어 37 °C 및 5 % CO2에서인큐베이터에 접시를 넣습니다.
- D1에서, 세포가 적어도 24 시간 동안 배양 된 후, 접시를 꺼내 현미경으로 관찰하십시오. 많은 수의 소세포 응집체가 이때(도1C)에의해 자발적으로 형성될 것이다.
- 15mL 튜브에서 MM 및 NIM과 함께 12mL의 혼합물을 3:1 비율(MM 9mL 및 NIM 3mL)으로 준비합니다.
- 세포 배양을 10mL 파이펫을 수직으로 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고, 미리 데워진 혼합물의 10mL를 접시에 첨가한다.
- 튜브를 60 x g에서 3 분 동안 원심 분리하여 골재를 수집하고 5mL 파이펫을 사용하여 상퍼를 제거하고 셀을 잃지 않도록 약 500 μL을 남겨 둡니다.
- 튜브에 혼합물의 2mL를 추가하고 현탁액을 동일한 접시(2.2.7단계)로 옮기습니다.
- 접시를 부드럽게 흔들어 셀 골재를 균일하게 분배하고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- D2에서는 15mL 튜브에서 MM 및 NIM이 1:1 비율(MM 6mL, NIM 6mL)으로 12mL의 새로운 혼합물을 준비합니다. 2.2.5에서 2.2.10으로 단계를 반복하여 신선한 준비 된 혼합물로 세포 배지를 변경합니다.
- D3에서, 전술한 바와 같이 NIM의 15mL로 셀 배지를 변경한다. 정지 조건하에서 적어도 5 일 동안 세포를 배양.
참고: D1에서 D3까지의 배지는 매일 변경하여 충분한 영양을 제공해야 합니다. D3 이후 NIM은 격일로 변경할 수 있습니다. 또한, EB는 풍부한 영양을 제공하기 위해 여러 요리로 나눌 수 있습니다.
- EB 씨를 시드
참고: D5에서 D7까지의 적절한 시간 지점을 선택하여 ECM 코팅 된 접시에 EB를 적당히 접시에 담는 것은 EB의 크기에 따라 선택합니다. 약 직경 200 μm의 EB는 망막 분화에 적합합니다. 일반적으로 6웰 플레이트에 있는 hPSC의 한 우물은 약 300~1,000개의 EB를 생산할 수 있다. EB 수율의 변화는 hPSC 라인에 의해 변화된다.- D4에서는 ECM 코팅 요리를 준비하여 EB를 신봉하는 문화를 준비합니다. 각 100mm 조직 배양 접시(표면 처리)에 5mL의 ECM을 넣고 하룻밤 동안 인큐베이터에 넣습니다.
- D5에서는 코팅된 요리에서 ECM을 제거하고 각 요리에 10mL의 미리 따뜻해지는 NIM을 추가합니다.
- EB가 함유된 요리를 꺼내라. 현미경에서 EB의 품질을 확인하고 매우 밝고 둥근 모양인지 확인하십시오. EB의 크기는 직경 약 200 μm입니다. 15mL 튜브에서 모든 EB를 수집합니다. 5mL 파이펫이 있는 15mL 튜브로 EB를 옮기. EB가 5분 동안 정착하게 하십시오. 대부분의 상체를 제거하고 약 2mL의 매체를 남겨 둡다.
- 1mL 파이펫으로 10mL의 NIM 드롭을 포함하는 코팅 된 요리에 EB를 배포하십시오. CM2당약 2-3 개의 EB의 밀도로 EB를 시드하십시오. 예를 들어 약 120-180개의 EB를 100mm 접시에 넣습니다. EB 번호를 대략 판단하려면 EB 서스펜션 1방울을 커버슬립에 놓고 현미경으로 EB 수를 계산합니다.
참고: EB의 도금 밀도는 망막 유도의 효율성에 영향을 미치는 주요 요인 중 하나입니다. 밀도는 각 hPSC 라인에 의해 조정될 수도 있습니다. - 부드럽게 접시를 흔들어 EB를 균일하게 분배합니다. 37 °C 및 5 % CO2에서인큐베이터에 넣어.
참고: EB의 준수를 향상시키기 위해 최소 24시간 동안 요리를 이동하지 마십시오.
- 부착 조건에서 광학 소포 (EV) 및 망막 안료 상피 (RPE)의 유도
참고: ECM 코팅 된 표면에 EB를 시드 한 후 hPSC는 분화 후 D20으로 조기에 관찰 할 수있는 OV와 같은 구조를 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 특정 성장 인자 또는 신호 분자는 미디어에 N2 및 B27 보충제의 추가를 제외하고 망막 운명으로 hPSC를 안내 할 필요가 없습니다.- D8-D9에서, 접시를 제거하고 현미경에서 EB를 관찰. 모든 EB가 부착되어 요리에 퍼집니다(그림1D). 10mL의 오래된 미디엄을 함유한 100mm 접시에 신선한 NIM 10mL를 추가합니다. 인큐베이터에 다시 넣습니다.
참고: 이전 매체를 제거하지 마십시오. - D12에서는 10mL 파이펫을 사용하여 NIM으로 매체의 절반을 변경합니다. 인큐베이터에 문화를 유지합니다.
- D16에서는 진공 포부 시스템을 사용하여 모든 NIM을 접시에서 제거합니다. 각 접시에 20mL의 RDM을 추가합니다. RDM에서 배양을 계속하고 격일로 매체의 절반을 변경합니다.
- D10-D30 동안, 현미경하에서 일주일에 두 번 세포의 형태학적 변화를 관찰하고 망막 분화의 효율을 평가한다.
참고: D10 이후, 눈필드(EF) 도메인은 부착된 EB의 주변 영역에서 자체 조직됩니다. OV와 같은 구조는 D20에서 D25 사이에 나타나고, 점차적으로 접시에서 돌출되고, 자가 형성 된 광학 컵, 이는 색소 RPE(그림 1E)에둘러싸여 있습니다. TV는 밝고 굴절적이며 두꺼운 NR 링으로 쉽게 인식할 수 있습니다.
- D8-D9에서, 접시를 제거하고 현미경에서 EB를 관찰. 모든 EB가 부착되어 요리에 퍼집니다(그림1D). 10mL의 오래된 미디엄을 함유한 100mm 접시에 신선한 NIM 10mL를 추가합니다. 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- 망막 오르가노이드 (ROV)를 얻기 위해 현탁액의 분리 및 배양 EV 및 RPE
- D28-D35에서는 대부분의 TV가 요리에 나타납니다. 텅스텐 바늘 또는 바늘을 사용하여 1 mL 주사기를 사용하여 인접한 RPE와 함께 형태학적으로 식별 가능한 TV를 기계적으로 분리하십시오. 현탁액으로 그들을 문화.
참고: EV 및 RPE의 모양과 수율은 hPSC 라인에서 크게 다릅니다. 따라서, OV 및 RPE를 분리하는 시점은 유연하다. 인접한 RPE가 있는 명백한 TV를 분리한 다음 RDM을 포함하는 낮은 부착 배양 접시로 이동할 수 있습니다. 모든 EV와 RpEs가 들어 올릴 때까지 나머지 셀을 계속 배양하십시오. - 50-60 대의 EV를 각 100mm 저부착 배양 접시에 넣고 15mL의 RDM을 함유하여 ROs형성(도 1F)을입력합니다.
- RSo가 둥근 모양의 D42까지 2-3일마다 RDM을 변경합니다.
- D28-D35에서는 대부분의 TV가 요리에 나타납니다. 텅스텐 바늘 또는 바늘을 사용하여 1 mL 주사기를 사용하여 인접한 RPE와 함께 형태학적으로 식별 가능한 TV를 기계적으로 분리하십시오. 현탁액으로 그들을 문화.
3. 망막 발달 및 성숙
참고: 이 프로토콜에서는 장기적인 문화권에서 RSo가 성장하고 성숙하도록 하려면 혈청이 필요합니다.
-
ROs의 망막 라미네이션 및 사양
- 1x PBS에서 100mMM타우린(1,000x)의 10mL를 준비한다. 125 mg의 타우린을 계량하고 1x PBS의 10mL에 용해하십시오. 0.22 μm 주사기 필터로 용액을 필터링합니다. 500 μL/튜브에서 알리쿼트하고 -20°C에 보관하십시오.
- 망막 배양 배지 1 (RC1)을 준비합니다. 다음 구성 요소를 혼합 : DMEM / F-12의 250 mL, DMEM 베이직 175mL, 태아소 세럼 50mL, B27 보충제 10mL, 항생제 항진제 1% 5mL, MEM NEAA 5mL, 100 μM 타우린, 5mL 2mM L-alan-L-gluta.
- DMEM/F-12의 450mL를 포함하는 망막 배양 매체 2(RC2)를 준비하고, 태아 소 세럼 50mL, 1% N2 보충제 5mL, 항생제 항진제 5mL, 100 μM 타우린의 0.5mL, 1% MEM NEAA 5mL, 2m L-alnyl-L-글루타민 5mL.
참고: RC1 및 RC2는 필터링되지 않지만 불임 검사를 받습니다. 배지 1mL을 꺼내 35mm 접시에 넣고 37°C 및 5%CO2에서인큐베이터에서 3-7일 동안 배양하여 사용 전에 멸균을 보장합니다. 배지는 4°C에서 보관할 수 있으며 성분의 활성을 보장하기 위해 2주 이내에 사용해야 합니다. 모든 미디어 및 시약은 사용하기 전에 30분 동안 RT에서 미리 데워져야 합니다. - D42에서는 배양 매체를 RDM에서 RC1로 전환합니다.
- 약 30°에서 요리를 기울이고 KO가 30s로 정착하게 하십시오. 이전 RDM을 10mL 파이펫으로 제거하여 약 1mL의 중간 을 남기고 RSo를 잃지 않도록 하십시오. 각 접시에 신선한 RC1 15mL를 추가합니다.
- 부드럽게 접시를 흔들어 ROs를 균일하게 분배합니다. 인큐베이터에 다시 요리를 넣습니다. 그 후 일주일에 두 번 전체 매체를 변경합니다.
- D50-D90 동안, 두껍고 밝은 NR둥근 모양의 장기 문화를 위해 높은 품질의 로를 선택하십시오. RC1 20mL의 100mm 낮은 부착 접시에 30-40 개의 RSO를 놓고 일주일에 두 번 전체 매체를 변경합니다.
- RO의 장기 서스펜션 문화의 경우 ROV가 파이펫을 사용하여 다시 부착되는 것을 피하기 위해 ROV를 피펫합니다. 요리의 표면에 집착 하는 ROs를 피하기 위해 한 달에 한 번 새로운 문화 요리에 로스를 전송 합니다.
참고: 서스펜션 문화 조건하에서, RSo는 둥근 모양이며, 한쪽에는 밝고 두꺼운 NR 링이 부착되어 있습니다. 적층 신경 망막 개발 및 망막 세포 아류형은 광수용체 세포, 막종 세포 및 양극성 세포다음으로 먼저 생성된 망막 신경절 세포와 순차적으로 나타납니다.
-
로오스의 콘농축으로 인간의 광수용체 성숙
- D90 후, 광수용체 성숙에 적합한 RC1에서 RC2로 배지를 전환한다.
- 3.1.7-3.1.8 단계에 설명된 바와 같이 매체를 변경합니다.
참고 : 이 문화 조건하에서, RSo는 D300까지 장기(그림 1G)를성장할 수 있습니다. ROs에 있는 망막 세포는 성숙해지고, 뮬러 신경교 세포, 막대 및 콘을 포함하여 신경 망막의 모든 세포 특수형은 또한 취득됩니다. RA를 추가하지 않고 콘 광수용체는 또한 ROs가 풍부합니다.
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Representative Results
이 프로토콜의 망막 유도 과정은 인간의 태아 망막의 발달을 모방합니다. 망막 분화를 시작하기 위해 hPSC는 작은 덩어리로 해리되고 혈소액으로 배양되어 EB의 형성을 유도하였다. D1에서, 균일한 세포 응집체 또는 EB가 형성되었다(도1C). 배양 매체는 점차 NIM으로 전환되었다. D5에서는 ECM 코팅 문화 요리에 EB를 도금했습니다. 세포는 점차 적으로 EB에서 마이그레이션(그림 1D). D10에서, 눈 필드는 준수 EB의 주변 영역에서 자체 조직. D16에서 유도 매체는 RDM으로 대체되었습니다. 그 후, NR 도메인은 점차 형성되고, 접시로부터 튀어나온, 및 RPE 세포에 둘러싸인 자체 형성 된 OV와 같은 구조(도 1E). D28-D35 동안 인접한 RPE와 함께 EV를 날카로운 바늘로 들어 올려 서스펜션으로 배양했습니다. 현탁액 배양 조건 하에서,한쪽(도 1F)에다소 RPE 구체가 부착된 신경망막(NR)을 포함하는 ROs자가 형성되고 FBS가 매체에 첨가된 한 생존하고 성숙한 초과근무를 할 수 있었다.
망막 분화 및 사양이 진행됨에 따라 hPSC는 모든 주요 망막 세포 하위 유형을 순차적으로 생산했습니다. 신경 망막의 특수형은 점차적으로 층으로 줄지어 서, 네이티브 인간의 망막의 아키텍처 특징을 모방(도 2A-G). 망막 신경절 세포(RGC)는 먼저 망막 전구체로부터 생성되고 NRs의 기저측에 축적되었다.
이 프로토콜을 통해 RSo는 막대와콘(그림 2G-I)을모두 갖춘 고도로 성숙한 광수용체로 개발되었습니다. 광수용체는 개발 중 핵층(그림2G)이8주차 이후 급격히 증가하여 17주차부터 서서히 성숙하였다. 21주부터 는 막대, 적색/녹색 콘, 블루 콘을 포함한 모든 광수용체 의 모든 특수형을 ROs에서 검출할 수 있습니다. 풍부한 막대와 콘은 전체 분화 공정 전반에 걸쳐 RA를 첨가하지 않고 이 유도 프로토콜에서 얻을 수 있다.
그림 1: hPSC에서 망막 오르가노이드의 유도 및 형태학적 특징. (A)hPSC로부터 망막 유도의 회로도. (B)hPSC (10x)의 전형적인 식민지. (C)D1(4배)의 EB. (D)D7에서는 도금 된 EB를 부착하여 접시에 펴서 요리 (4 배)에 퍼졌습니다. (E)D25에서, 안료 RPE (4 x)로 둘러싸인 접시 (붉은 원으로 표시)에서 형성되고 튀어 나온 구조 (EV)와 같은 광학 소포. (F)망막 오르가노이드는 TV가 해제되고 정지 조건에서 배양된 후 자체 형성되었다(화살표는 NR과 RPE(4배)를 가리켰다. (G)D180(4x)에 NR(적색 화살표) 및 RPE(검정화)를 포함하는 망막 오르간노이드. 스케일 바 = 200 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
도 2: 망막 세포의 특수형은 3차원 망막 조직에서 순차적으로 검출되었다. 면역 형광 염색에 의해 특정 마커를 표현하는 주요 망막 세포 모형의 예 심상. (A-B) 망막 전구 세포는 Ki67(A)및 VSX2(B)를발현하였다. (C)신경망막의 기저측에 위치한 Islet1 양성 망막 신경절 세포. (D)AP2α에 대한 아막린 세포 양성. (E)SOX9에 대해 양양성 뮬러 신경교세포. (F)PKCα 양성 양극성 세포. (G)양화광수용체 세포를 회수한다. (H)로도프신 양성 로드 광수용체. (I)L/M-opsin 양성 콘 광수용체. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 다단계 망막 유도 프로토콜에서 hPSC는 망막 운명을 얻기 위해 단계적으로 안내되었고 적층 NR 및 RPE를 포함하는 망막 오르가노이드로 자체 조직되었습니다. 분화 하는 동안, hPSCs는 생체 내에서인간 망막 발달의 모든 주요 단계를 재구성, EF에서, OV, 그리고 RPE, 망막 적각에, 망막 신경절 세포를 포함 하 여 망막 세포의 모든 하위 유형을 생성, 백막 세포, 양극성 세포, 막대, 그리고 원뿔 광수용 세포, 및 cone 측세포. 망막 발달의 회수는 망막 질병 모델링과 같은 다운스트림 응용 에 도움이 될 것입니다.
몇 가지 프로토콜은 hPSC3,4,5,6,7,8,9,10,13,14,15,16,17,18,19,20에서 망막 오르가노이드를 생성하기 위해설립되었습니다. . 문화 조건에 따라, 프로토콜은 2D, 3D, 및 2D 및 3D 접근9,13의조합으로 분류될 수 있다. 상기 2D접근법6,10,22는 모든 유도 과정이 힌지 배양 조건에서 발생하며, hPSC로부터 건축없이 망막 세포를 생성한다. 대조적으로, 3D는7,11,23에 접근하여 모든 유도 과정이 정지 문화 조건 하에서 조직된 망막 조직을 산출하는 것을 의미한다. 예를 들어, Sasai, Y. et al.7,24는 SFEBq 방법(빠른 재응집을 가진 배아 체형 과 같은 골재의 혈청 없는 부동 배양)를 보고하여 ESC가 서스펜션 문화에서 광학 컵으로 분화하도록 유도하였다. 이 프로토콜을 포함하는 다단계 3D 접근법8,11,18,20, 25를 사용하여, hPSC는 부착 및 현탁액 문화 조건 하에서 망막 운명 및 오르가노이드로 유도되었다.
hPSC를 신경 망막 운명으로 유도하기 위해, 많은 프로토콜에서 일련의 외인성 요인이 미디어에 추가되었습니다. 예를 들어, 람바, 외26은 노긴(BMP 통로의 억제제)과 딕코프-1(dkk1, Wnt/β-catenin 신호 경로의 길항제) 및 인슐린과 같은 성장 인자-1(IGF-1)의 조합을 첨가하여 ESC를 전방 신경 운명으로 인도하였다. 오사카다외. 6은 Rod 및 콘 광수용체 전구체를 얻기 위해 DAPT(노치 신호 경로 억제제) 및 좌우 판정 계수 A(WNT 신호 경로 억제제)를 첨가하였다. Kuwahara 외.27 및 Capowski 외.3 OV 생산을 개선 하기 위해 hPSCs 문화의 짧은 조기 노출에 대 한 BMP4를 추가. 대조적으로, 이 최적화된 망막 유도 프로토콜은 N2및 B27의 기본 보충을 제외하고 외설적인 신호 변조기를 요구하지 않고 간단하고 저렴한 비용입니다.
망막산(RA)은 망막 발달 및 광수용체결정(28,29,30)에중요한 역할을 한다. 대부분의 프로토콜은 특정 기간에 RA(0.5-1 μM)의 보충으로 개발되었다. 우리의 연구는 RA의 너무 높은 농도 또는 RA 처리의 너무 긴 기간이 막대가 풍부한 광수용체귀착되지만 콘 분화8,18을억제한다는 것을 입증했습니다. 그러나, 이러한 최적화된 프로토콜에서 RA는 전체 분화공정(18)에걸쳐 배양 매체에 첨가되지 않으며, 인간의 주간 시력과 색 시력을 담당하고 RD 치료의 세포 교체에 필요한 콘 광수용체의 생산을 촉진한다. 일부 연구는 갑상선 호르몬 신호가 마우스와 인간 망막31,32에서콘 아류형을 지시하지만, 콘 약정에 대한 레귤레이터는 여전히 불분명하다33. 김외34및 로우 외35의이러한 연구에서, 이러한 최적화된 프로토콜과 일치하는 어떤 외인성 망막산 생성 콘이 풍부한 망막 오르가노이드가 없는 장기 배양도 있다.
이 프로토콜의 요점은 고품질 의 EB를 만들고 EB를 적절하게 시드하는 것입니다. 세포는 초기 EB 현탁액 배양 도중 빨리 증가합니다. 매체는 매일 변경되어야하며 풍부한 영양을 제공하기에 충분해야합니다. 직경 200 μm에 근사한 EB의 크기는 망막 분화에 적합합니다. CM2당 2-3 EBs에서 EB의 도금 밀도는 대부분의 hPSC 라인에 적합합니다. 이 최적화된 프로토콜의 가장 큰 장점은 EB 크기와 도금 밀도의 정량화로 망막 유도의 효율성과 반복성을 크게 향상시키는 것입니다. 우리는 경험이 부족한 연구자들이 망막 유도를 배우고 반복하는 데 크게 도움이되는 모든 단계를 자세히 설명했습니다.
또한, 망막 유도 효율은 주로 hPSC36,37의품질 및 분화 능력에 따라 달라집니다. 다른 hPSC는 다른 효율성을 가지고 있습니다. 일부 hPSC 라인은 실제로 불량 한 효율성을 가지고, 이는 다시 프로그래밍 방법 때문일 수 있습니다, 체세포, 등등. 본 프로토콜은 섬유아세포, 혈액 및 소변세포로부터 재프로그래밍된 다양한 hESC 및 hiPSC를 포함하여 3D 망막 오르가노이드 및 RPE를 얻기 위해 다양한 hPSCs에 적합한 것으로 확인되었다18,20,21. 일반적으로, 위에서 설명한 이 프로토콜을 사용하면 6웰 플레이트에서 hPSC(약 80% 합류)의 한 우물이 약 1,000개의 EB를 생성하여 약 200개의 ROs를 산출할 수 있습니다. 따라서 고효율을 가진 이 프로토콜은 망막 오르가노이드의 대규모 생산에 적합하며 기본 및 번역 연구를 포함한 다운스트림 응용 분야에 이점을 제공합니다.
요약하자면, 최적화된 망막 유도 프로토콜은 높은 반복성과 효율성을 갖춘 간단하고 저렴한 비용으로, 망막 질환의 유망한 개인화 모델을 제공하고 세포 치료, 약물 스크리닝 및 유전자 치료 시험을 위한 풍부한 세포 원천을 제공한다.
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Disclosures
Xiufeng Zhong은 인간 다능성 줄기 세포로부터망막 세포의 생성과 관련된 특허 발명자입니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국의 국가 키 R&D 프로그램 (2016YFC1101103)에 의해 지원되었다, 2017YFA0104101), 광저우 과학기술프로젝트기금(201803010078), 광동성 과학기술프로젝트(2017B020230003), 중국 자연과학재단(NSF), 중국 자연과학재단(nsF), 81570874, 81970842), 선야센대학의 100여 인재 프로그램(PT10010100), 및 기초연구기금의 기초연구기금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
References
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