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Chemistry

केशिका वैद्युतकणसंचलन-आधारित हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज टॉप-डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए

Published: June 8, 2021 doi: 10.3791/62672
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1, 3, 1
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

Summary

यहां प्रस्तुत एक केशिका वैद्युतकणसंचलन-आधारित हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज (एचडीएक्स) दृष्टिकोण के लिए एक प्रोटोकॉल है जो शीर्ष-डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित है। यह दृष्टिकोण विभिन्न प्रोटीन प्रजातियों के बीच उच्च-क्रम संरचनाओं में अंतर की विशेषता है, जिसमें विभिन्न राज्यों में प्रोटीन और विभिन्न प्रोटियोफॉर्म शामिल हैं, समवर्ती विभेदक एचडीएक्स और इलेक्ट्रोफोरेटिक अलगाव का संचालन करके।

Abstract

समाधान में सह-अस्तित्व वाले कई प्रोटीन राज्यों की संरचनात्मक विषमता को हल करना प्रोटीन चिकित्सीय के लक्षण वर्णन में मुख्य बाधाओं में से एक है और जैविक कार्यों के लिए महत्वपूर्ण संरचनात्मक संक्रमण मार्गों का निर्धारण, आणविक मान्यता से लेकर एंजाइमेटिक कटैलिसिस तक। हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज (एचडीएक्स) प्रतिक्रिया शीर्ष-डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक (एमएस) विश्लेषण के साथ मिलकर प्रोटीन उच्च-क्रम संरचनाओं और गतिशीलता को एक संरूपक-विशिष्ट तरीके से चिह्नित करने का एक साधन प्रदान करती है। इस तकनीक की संरचनात्मक समाधान शक्ति बरकरार प्रोटीन स्तर पर प्रोटीन राज्यों को अलग करने और एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं के दौरान अवशिष्ट गैर-ड्यूटेरेटेड प्रोटिक सामग्री को कम करने की क्षमता पर अत्यधिक निर्भर करती है।

यहां हम एचडीएक्स एमएस दृष्टिकोण के एक केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) -आधारित संस्करण का वर्णन करते हैं जिसका उद्देश्य संरचनात्मक संकल्प में सुधार करना है। इस दृष्टिकोण में, केशिका इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण के दौरान एक ड्यूटेरेटेड पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट समाधान (बीजीई) के माध्यम से माइग्रेट करते समय प्रोटीन एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं से गुजरते हैं। विभिन्न प्रोटीन राज्यों या proteoforms कि समाधान में सह-अस्तित्व में उनके अलग चार्ज-टू-आकार अनुपात के आधार पर कुशलतापूर्वक अलग किया जा सकता है। प्रोटीन और प्रोटिक विलायक अणुओं के बीच इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता में अंतर अवशिष्ट गैर-ड्यूटेरेटेड विलायक को कम करता है, जिसके परिणामस्वरूप एचडीएक्स प्रक्रिया के दौरान लगभग पूर्ण deuterating वातावरण होता है। प्रवाह के माध्यम से माइक्रोवियल सीई-एमएस इंटरफ़ेस स्प्रेयर के आउटलेट पर शमन और विकृत संशोधक समाधान के साथ तेजी से मिश्रण के बाद एल्यूटेड प्रोटीन प्रजातियों के कुशल इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण की अनुमति देता है। ऑनलाइन टॉप-डाउन एमएस विश्लेषण एल्यूटेड बरकरार प्रोटीन प्रजातियों के वैश्विक ड्यूटेरेशन स्तर को मापता है, और बाद में, उनके गैस-चरण के टुकड़ों का ड्यूटेरेशन। यह पेपर सिस्टम के लिए विभेदक एचडीएक्स में इस दृष्टिकोण को दर्शाता है, जिसमें दूध में सह-अस्तित्व वाले प्राकृतिक प्रोटीन वेरिएंट भी शामिल हैं।

Introduction

विभिन्न संरचनात्मक, बाध्यकारी, या संशोधन राज्यों में प्रोटीन प्रजातियों को अलग करना और उनके संरचनात्मक मतभेदों की विशेषता जैविक घटनाओं में शामिल इन प्रजातियों के बीच संक्रमण के मार्गों की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है, आणविक मान्यता से लेकर एंजाइमेटिक कटैलिसिस तक, और इन घटनाओं के अंतर्निहित तंत्र को समझना। पारंपरिक बायोफिजिकल तकनीकें अपर्याप्त संकल्प और समाधान में गतिशील जानकारी के नुकसान जैसी सीमाओं के कारण एक पूर्ण समाधान प्रदान नहीं करती हैं। हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचडीएक्स एमएस) के साथ युग्मित एक तकनीक है जो प्रोटीन के लेबिल हाइड्रोजन परमाणुओं के बीच विनिमय के माध्यम से ड्यूटेरियम (2एच) के साथ प्रोटीन की संरचनात्मक और संरचनात्मक विशेषताओं को लेबल करती है और जानबूझकर पेश किए गए 2एच 2ओ समाधान से2एच। हाइड्रोजन बॉन्डिंग में शामिल प्रोटॉन या जो प्रोटीन इंटीरियर में विलायक से अलग किए जाते हैं, वे आसानी से विनिमय नहीं करते हैं1। इस प्रकार, चूंकि एक विनिमय योग्य साइट पर विनिमय दर उच्च-क्रम संरचनाओं में इसकी भागीदारी पर अत्यधिक निर्भर है, प्रोटीन संरचनाओं को एमएस द्वारा उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर प्रकट किया जा सकता है जो 1एच और 2एच के बीच अलग-अलग परमाणु द्रव्यमान के आधार पर 2 एच-अपटेक की सीमा और दरकी जांच करता है। हाल के दशकों में, एचडीएक्स एमएस प्रोटीन संरचनाओं और गतिशीलता2 का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट रूप से सफल तकनीक बन गई है।

एचडीएक्स एमएस के शास्त्रीय बॉटम-अप दृष्टिकोण में, विभिन्न संरचनात्मक, बाध्यकारी, या संशोधन राज्यों में प्रोटीन प्रजातियों की टुकड़ी को बरकरार प्रोटीन स्तर पर अलगाव के बिना प्रोटिओलाइज्ड किया जाता है, जिससे जटिल ड्यूटेरियम सामग्री के साथ परिणामी प्रोटियोलिटिक टुकड़ों का विश्लेषण करके व्यक्तिगत प्रजातियों को चिह्नित करना असंभव हो जाता है। इसके विपरीत, टॉप-डाउन दृष्टिकोण में, विभिन्न प्रोटीन राज्यों या प्रोटियोफॉर्म्स जिन्होंने विभिन्न ड्यूटेरियम सामग्री को शामिल किया है, एमएस स्कैन में बरकरार प्रोटीन द्रव्यमान के कई वितरणों को जन्म देते हैं। यह अलग-अलग प्रजातियों को एक उचित द्रव्यमान फिल्टर (जैसे एक चतुर्भुज) का उपयोग करके प्रत्येक द्रव्यमान वितरण के अनुरूप आयनों के बड़े पैमाने पर चयन और बाद के अग्रानुक्रम एमएस विश्लेषण 3,4,5,6 में उनके संरचनात्मक मतभेदों के लक्षण वर्णन द्वारा अलग करने की अनुमति देता है। हालांकि, इस रणनीति में प्रोटीन राज्यों या प्रोटियोफॉर्मों को अलग करने की दक्षता उनके संबंधित बड़े पैमाने पर वितरण में अंतर की सीमा तक सीमित है।

केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) उच्च दक्षता 7 के साथ समाधान चरण में उनके अलग-अलग आवेशों और हाइड्रोडायनामिक आकारों के आधार पर प्रोटीन प्रजातियों को अलग करने का एक साधन प्रदान करताहै। एचडीएक्स के साथ सीई का संयोजन समाधान चरण में प्रोटीन राज्यों या प्रोटियोफॉर्म्स का अतिरिक्त पृथक्करण प्रदान करता है। इसके अलावा, सीई केशिका की छोटी मात्रा पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट समाधान (बीजीई) के रूप में एक पूरी तरह से deuterated समाधान के उपयोग की अनुमति देती है, यानी, चल रहे बफर, प्रोटीन नमूनों के लिए एक HDX रिएक्टर के रूप में केशिका को प्रस्तुत करते हैं। वैद्युतकणसंचलन प्रक्रिया में प्रोटीन और प्रोटिक अभिकर्मकों के बीच इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता में अंतर के कारण, सीई के दौरान एचडीएक्स का संचालन करने के परिणामस्वरूप न्यूनतम अवशिष्ट गैर-ड्यूटेरेटेड सामग्री के साथ प्रोटीन एनालिट्स के लिए लगभग पूर्ण डियूटेरेटिंग वातावरण होता है, जिससे एचडीएक्स डेटा का उपयोग करके संरचनात्मक विश्लेषण की संवेदनशीलता बढ़ जाती है। इस प्रकार, हमने एक सीई-आधारित विभेदक एचडीएक्स दृष्टिकोण विकसित किया है जो शीर्ष-डाउन एमएस के साथ मिलकर प्रोटीन उच्च-क्रम संरचनाओं को एक राज्य- या प्रोटिओफॉर्म-विशिष्ट तरीके सेचिह्नित करता है।

यह पेपर सामग्री की तैयारी, प्रयोगात्मक प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण के चरणों का विवरण देकर इस दृष्टिकोण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। विधि प्रदर्शन या डेटा गुणवत्ता को प्रभावित कर सकने वाले कारक छोटे नोट्स में सूचीबद्ध होते हैं. यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणामों में विभिन्न प्रोटीनों के मिश्रण के विभेदक एचडीएक्स डेटा और गोजातीय β-लैक्टोग्लोबुलिन (β-एलजी) के प्राकृतिक रूप शामिल हैं, जो दूध में मौजूद प्रमुख मट्ठा प्रोटीनहै। हम β-एलजी के दो प्रचुर मात्रा में रूपों के पृथक्करण दक्षता, पुनरुत्पादन, और 2एच-लेबलिंग प्रदर्शन का प्रदर्शन करते हैं, यानी, सीई-आधारित एचडीएक्स के दौरान ए और बी 10,11 और उनकी संरचनाओं के संस्करण-विशिष्ट लक्षण वर्णन।

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Protocol

नोट: उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) ग्रेड या एमएस ग्रेड अभिकर्मकों का उपयोग करें जब भी संभव हो संदूषकों को कम करने के लिए जो एमएस विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। इलेक्ट्रोफोरेटिक वोल्टेज या इलेक्ट्रोस्प्रे वोल्टेज के कारण बिजली के झटके की संभावना से बचने के लिए माप के दौरान नंगे हाथों से सीई-एमएस इंटरफ़ेस को न छुएं।

1. सामग्री की तैयारी

  1. सीई के लिए फ्यूज्ड सिलिका केशिका का संशोधन
    1. एचपीसी पाउडर (आणविक वजन [एमडब्ल्यू]: 100 केडीए) को पानी में भंग करके एक 5% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) हाइड्रॉक्सीप्रोपिल सेल्यूलोज (एचपीसी) समाधान तैयार करें, जिसमें ~ 12 घंटे के लिए चुंबकीय हलचल पर कमरे के तापमान पर निरंतर सरगर्मी के साथ या ठोसकणों के पूरी तरह से गायब होने तक 12। एक ultrasonicator के साथ किसी भी दृश्यमान हवा बुलबुले निकालें।
    2. एक फ्यूज्ड सिलिका ग्लास केशिका (आंतरिक व्यास [आईडी]: 50 μm, बाहरी व्यास [OD]: 360 μm) एक CE उपकरण में लगभग 85 सेमी लंबाई का माउंट करें। लगातार एक कार्बनिक विलायक infusing द्वारा केशिका कुल्ला, जैसे एसीटोन13, 10-15 मिनट के लिए 40 साई के जलसेक दबाव पर सीई के autosampler का उपयोग कर।
    3. 40 साई के जलसेक दबाव पर autosampler का उपयोग कर HPC समाधान के साथ साफ केशिका भरें (जो अक्सर ~ 40 मिनट लेता है)। केशिका में मुक्त airflow सुनिश्चित करने के लिए 40 साई पर HPC से भरे केशिका में हवा infuse, पानी में विसर्जन पर केशिका से बाहर निकाले गए हवा के बुलबुले द्वारा इंगित किया।
    4. एचपीसी-लेपित केशिका को तापमान-प्रोग्राम करने योग्य ओवन (आदर्श रूप से तापमान-क्रमादेशित गैस क्रोमैटोग्राफ के तापमान-नियंत्रित स्तंभ ओवन) में नाइट्रोजन गैस (25 साई) के साथ केशिका के माध्यम से बहने के साथ बेक करें, चित्र1 में दिखाए गए तापमान कार्यक्रम के बाद।
    5. केशिका को बाहर निकालने से पहले ओवन को कमरे के तापमान पर ठंडा करें। सीई पृथक्करण के लिए इस एचपीसी-संशोधित केशिका का उपयोग करें।

Figure 1
चित्र 1: केशिका बेकिंग के लिए एक अनुशंसित तापमान कार्यक्रम। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट (बीजीई) समाधान और संशोधक समाधान8
    1. 2H2 O में अमोनियम एसीटेट की उचित मात्रा को भंग करके वांछित एकाग्रता (जैसे, 10 mM) पर BGEके 1-10 mL तैयार करें। अलग-अलग बीजीई शीशियों में बीजीई के 200 μL-एलीकोट रखें और हवा में बीजीई और जल वाष्प के बीच HDX प्रतिक्रिया को कम करने के लिए पैराफिल्म के साथ शीशियों को सील करें।
    2. 75% (v / v) मेथनॉल और 25% (v / v) पानी के साथ एक संशोधक समाधान का 10 मिलीलीटर तैयार करें, जिसमें फॉर्मिक एसिड का उपयोग करके पीएच को 2.5 पर समायोजित किया गया है।
      नोट: 2H2O और deuterated मेथनॉल का उपयोग करें संशोधक समाधान तैयार करने के लिए यदि साइड चेन और असुरक्षित बैकबोन एमाइड्स में ड्यूटेरियम परमाणुओं को एमएस द्वारा पता लगाने के लिए बनाए रखा जाना चाहिए।
  2. प्रोटीन के नमूनों का डिसाल्टिंग
    1. वांछित एकाग्रता पर गैर-deuterated पानी में एक अमोनियम एसीटेट समाधान तैयार करें।
      नोट: वैद्युतकणसंचलन के दौरान एक उच्च विद्युत प्रवाह से बचने के लिए 100 mM से कम की एकाग्रता की सिफारिश की जाती है और परिणामस्वरूप जूल हीटिंग प्रभाव।
    2. जब आवश्यक हो, तो फॉर्मिक एसिड (पीएच < 6.8 के लिए) या अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (पीएच > 6.8 के लिए) का उपयोग करके वांछित स्तर पर अमोनियम एसीटेट समाधान के पीएच को समायोजित करें।
    3. प्रोटीन समाधान के मूल बफर को अमोनियम एसीटेट समाधान के साथ प्रतिस्थापित करें (वांछित एकाग्रता पर गैर-ड्यूटेरेटेड पानी में तैयार; पीएच अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ 7.5 तक समायोजित) कम से कम पांच अनुक्रमिक सांद्रता और एक उचित मेगावाट कटऑफ के साथ एक केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर कमजोर पड़ने के चरणों के माध्यम से।
      नोट: desalted किया जा करने के लिए प्रोटीन के नमूने या तो पूर्व उत्पादन प्रक्रियाओं (जैसे, शुद्धिकरण या सूत्रीकरण) से हो सकता है या प्रोटीन के lyophilized पाउडर को भंग करके तैयार किया जा सकता है। इस चरण में नमूना समाधानों से हटाए जाने वाले "लवण" सामान्य रूप से उन सभी छोटे आयनों या अणुओं को संदर्भित करते हैं जो गैर-वाष्पशील हैं। यद्यपि इन प्रजातियों को वैद्युतकणसंचलन प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन से कुशलतापूर्वक अलग किया जा सकता है, इस चरण को इलेक्ट्रोफोरेटिक रिज़ॉल्यूशन से समझौता करने से बचने और इस प्रकार द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के संदूषण को कम करने से बचने की सिफारिश की जाती है। जब प्रोटीन analytes विशिष्ट लवण या additives द्वारा स्थिर किया जाना चाहिए, उन्हें बीजीई में शामिल करें।
    4. एक microvolume यूवी-विज़ spectrophotometer का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।

2. सीई-आधारित HDX एमएस विश्लेषण का संचालन

नोट: इस दृष्टिकोण में उपयोग किए जाने वाले द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर को अल्ट्रा-हाई रिज़ॉल्यूशन के साथ एक बड़े पैमाने पर विश्लेषक से सुसज्जित किया जाना चाहिए, जैसे कि फूरियर-ट्रांसफॉर्म आयन साइक्लोट्रॉन अनुनाद (FTICR) या ऑर्बिटरैप, एक द्रव्यमान-फ़िल्टर, जैसे कि एक चतुर्भुज जो विखंडन के लिए अग्रदूत आयनों के बड़े पैमाने पर चयन की अनुमति देता है, और इलेक्ट्रॉन-स्थानांतरण पृथक्करण (ईटीडी) या इलेक्ट्रॉन-कैप्चर पृथक्करण (ईसीडी) कार्यों को विश्वसनीय अग्रानुक्रम एमएस डेटा (आदर्श रूप से आइसोटोपिक रूप से खंड आयनों के हल किए गए संकेतों) के साथ शीर्ष-डाउन विश्लेषण करने के लिए कार्य करता है।

  1. CE और MS सेटिंग्स का अनुकूलन
    1. एक मानक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) स्रोत का उपयोग करके एक पायलट एमएस मापन करें या तो धातु-लेपित बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका ("स्थैतिक" नैनोईएसआई योजना) से प्रीलोडेड नमूने का छिड़काव करके या धातु उत्सर्जक से लगातार संक्रमित नमूना बरकरार प्रोटीन (एमएस 1) और उनके गैस-चरण टुकड़े (एमएस 2) के माप के लिए एमएस सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए। एक एकल चार्ज राज्य में अपने आयनों के पहनावे के बड़े पैमाने पर चयन द्वारा ब्याज की प्रोटीन प्रजातियों को टुकड़ा करें, इसके बाद अग्रदूत आयनों के ईटीडी या ईसीडी।
      नोट:: आवश्यक सेटिंग्स में वे पैरामीटर शामिल हैं जो विघटन को प्रभावित करते हैं, अग्रदूत आयनों के बड़े पैमाने पर चयन (अन्य प्रजातियों से हस्तक्षेप से बचने के लिए), और विखंडन दक्षता। HDX के बाद विश्लेषक आयनों के परिणामी द्रव्यमान वितरण से मेल खाने के लिए द्रव्यमान-चयन विंडो के केंद्र और चौड़ाई दोनों को बढ़ाया जाना चाहिए। क्योंकि सीई में एक प्रोटीन प्रजाति की क्षालन खिड़की आमतौर पर 0.5 मिनट से 2 मिनट तक होती है, इसलिए तुलनात्मक समय खिड़की पर संचित एमएस 2 स्कैन के आधार पर विखंडन दक्षता का आकलन करें। इन मापदंडों के इष्टतम मूल्य प्रोटीन-विशिष्ट हैं; पाठकों को अनुकरणीय सेटिंग्स 8,14 के लिए पहले प्रकाशित रिपोर्टों के लिए संदर्भित किया जाता है।
    2. एक ऑप्टिकल डिटेक्टर से सुसज्जित सीई उपकरण का उपयोग करके एक पायलट सीई मापन करें, यानी, प्रोटीन प्रजातियों के अलगाव और माइग्रेशन समय के लिए सीई सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए एक फोटोडायोड सरणी (पीडीए) डिटेक्टर या यूवी डिटेक्टर, जो एचडीएक्स प्रतिक्रिया समय के बराबर है।
      नोट:: यह चरण CE के ऑप्टिकल डिटेक्टर की उपलब्धता के आधार पर वैकल्पिक है। ऑप्टिकल डिटेक्टर की अनुपस्थिति में, सीई सेटिंग्स को अनुभाग 2.2 के पूरा होने पर सीई-एमएस का उपयोग करके अनुकूलित किया जा सकता है, खंड 2.3 में वर्णित निर्देशों का पालन करते हुए। आवश्यक सेटिंग्स में पैरामीटर शामिल हैं जो पृथक्करण दक्षता को प्रभावित करते हैं, इलेक्ट्रोफेरोग्राम में दिखाए गए शिखर आकार, और क्षालन समय।
  2. CE-HDX सेटअप की पूर्व-कंडीशनिंग
    1. 50% मेथनॉल, 49% पानी, और 1% फॉर्मिक एसिड (v / v) के मिश्रण के साथ माइक्रोवियल सीई-एमएस इंटरफ़ेस के माध्यम से प्रवाह को साफ करें, कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए ultrasonication का उपयोग करके।
    2. एक सीई उपकरण पर एचपीसी-संशोधित केशिका के बढ़ते होने पर, 10 मिनट के लिए ऑटोसैम्पलर का उपयोग करके बीजीई के साथ केशिका को कुल्ला करें और बीजीई से भरे केशिका को छोड़ दें।
    3. संशोधक समाधान के लिए जलसेक टयूबिंग के रूप में असंशोधित फ्यूज्ड सिलिका केशिका टयूबिंग (आईडी: 50 μm, OD: 360 μm) की एक उचित लंबाई प्राप्त करें। एक संघ और उचित आस्तीन का उपयोग कर एक कुंद टिप के साथ एक गैस तंग ग्लास सिरिंज के लिए संशोधक टयूबिंग कनेक्ट करें, और कम से कम 10 मिनट के लिए एक जलसेक पंप का उपयोग कर संशोधक समाधान के साथ टयूबिंग कुल्ला।
    4. एचपीसी-लेपित सीई केशिका और संशोधक टयूबिंग के आउटलेट्स डालें, जिन्हें संबंधित समाधानों के साथ लोड किया गया है, साफ सीई-एमएस इंटरफ़ेस में, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।
    5. संशोधक जलसेक के लिए सिरिंज को या तो मैन्युअल रूप से या जलसेक पंप के साथ यह सुनिश्चित करने के लिए अग्रिम करें कि संशोधक समाधान इंटरफ़ेस की नोक तक पहुंचता है। एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के एक nanoESI स्रोत आवास पर इकट्ठे सीई-एमएस इंटरफ़ेस माउंट।

Figure 2
चित्रा 2: सीई-आधारित HDX MS सेटअप का योजनाबद्ध चित्रण. इस आंकड़े को8 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: बीजीई = पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट समाधान; CE = केशिका वैद्युतकणसंचलन; एमएस = मास स्पेक्ट्रोमेट्री; HDX = हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज; ईएसआई = इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण; FTICR = फूरियर-रूपांतरण आयन साइक्लोट्रॉन अनुनाद; ETD = इलेक्ट्रॉन-स्थानांतरण पृथक्करण; ईसीडी = इलेक्ट्रॉन-कैप्चर पृथक्करण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. एक साथ सीई पृथक्करण, एचडीएक्स प्रतिक्रिया, और एमएस विश्लेषण
    नोट:: Deuterated बीजीई unsealing के बाद 1 दिन के भीतर उपयोग किया जा करने के लिए अनुशंसित है।
    1. सीई-एमएस इंटरफ़ेस के लिए 3-5 kV का स्प्रे वोल्टेज लागू करें।
    2. 0.1 से 10 μL / मिनट तक की प्रवाह दर पर जलसेक पंप के साथ संशोधक समाधान को शामिल करना शुरू करें, और सीई-एमएस इंटरफ़ेस की नोक पर एक स्थिर इलेक्ट्रोस्प्रे सुनिश्चित करें।
    3. Autosampler में बीजीई युक्त नमूना शीशी रखें, और खाली इलेक्ट्रोफेरोग्राम और रिक्त द्रव्यमान स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए चरण 2.3.4 में इसका उपयोग करें।
    4. 2 साई पर autosampler का उपयोग कर नमूना समाधान इंजेक्ट और एक उचित अवधि के लिए नमूने की एक वांछित मात्रा के इंजेक्शन की अनुमति देने के लिए. इंजेक्शन की मात्रा और इंजेक्शन पैरामीटर15 समीकरण (1) द्वारा परिभाषित के बीच संबंध का उपयोग कर इंजेक्शन की मात्रा का अनुमान लगाएं।
      Equation 1 (1)
      जहां Vinj इंजेक्शन की मात्रा है, Πp इंजेक्शन का दबाव है, dc केशिका का आंतरिक व्यास है, A केशिका का क्रॉस-सेक्शन है, tinj इंजेक्शन की अवधि है, η केशिका में तरल की चिपचिपाहट है, और L केशिका की लंबाई है।
    5. 30 kV के एक electrophoretic वोल्टेज और 0 से 2 साई तक के जलसेक दबाव लागू करके CE पृथक्करण शुरू करें, और इलेक्ट्रोफेरोग्राम प्राप्त करें। इस बीच, क्रोमैटोग्राफिक मोड में एमएस डेटा का अधिग्रहण शुरू करें जहां आयन वर्तमान ग्राफ को समय के एक फ़ंक्शन के रूप में अधिग्रहित किया जाता है, और संबंधित एमएस स्कैन स्वचालित रूप से एकल स्पेक्ट्रम में संयुक्त नहीं होते हैं।
      नोट: प्रोटीन इस चरण में अपने इलेक्ट्रोफोरेटिक माइग्रेशन के दौरान बीजीई में 2एच2ओ अणुओं से संपर्क करने के बिंदु पर सहज एचडीएक्स प्रतिक्रिया से गुजरते हैं। सीई के लिए ऑप्टिकल डिटेक्शन का उपयोग एमएस डिटेक्शन के अलावा किया जा सकता है। चूंकि ऑन-कॉलम डिटेक्शन के लिए फ्यूज्ड सिलिका केशिका के आउटलेट छोर पर पॉलीमाइड कोटिंग की एक निश्चित लंबाई को हटाने की आवश्यकता होती है, सीई-एमएस इंटरफ़ेस की असेंबली के दौरान केशिका क्षति से बचने के लिए अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए।
    6. रिक्त इलेक्ट्रोफेरोग्राम और द्रव्यमान स्पेक्ट्रा को संदर्भ के रूप में सहेजें।
      नोट:: रिक्त डेटा आधार रेखा घटाव के बजाय समस्या निवारण के लिए उपयोग किया जा करने के लिए हैं।
    7. Autosampler में प्रोटीन नमूना समाधान की वांछित सांद्रता युक्त नमूना शीशियों जगह. 2.3.4-2.3.5 चरणों के बाद प्रोटीन नमूनों के लिए इलेक्ट्रोफेरोग्राम और द्रव्यमान स्पेक्ट्रा प्राप्त करें। Electrophoretically अलग और 2एच लेबल प्रोटीन प्रजातियों के MS1 स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए एमएस स्कैन की एक पर्याप्त संख्या एकत्र करें।
    8. ब्याज की प्रजातियों के लिए अग्रानुक्रम एमएस माप या तो एक ही रन के भीतर MS1 स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के बाद या बाद में, अलग रन में प्रदर्शन करें।
    9. जब आवश्यक हो, तो जलसेक दबाव या सीई केशिका की लंबाई को बदलकर माइग्रेशन समय / एचडीएक्स प्रतिक्रिया समय को समायोजित करें। यदि एचडीएक्स प्रतिक्रिया समय माइग्रेशन समय से कम होना चाहिए, तो पहले8 वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग करें, जो सीई प्रक्रिया के दौरान केशिका में ड्यूटेरेटेड और गैर-ड्यूटेरेटेड बीजीई दोनों को नियोजित करता है।
    10. प्रत्येक माप के बाद कम से कम 10 मिनट के लिए 20 साई के दबाव पर बीजीई के साथ सीई केशिका फ्लश करें।
    11. प्रयोगों के पूरा होने पर, सीई-एमएस इंटरफ़ेस और भंडारण के लिए सभी टयूबिंग को साफ करें।
    12. प्रत्यक्ष जलसेक मोड में एमएस के साथ HDX "समापन बिंदु" नमूने का एक डेटा सेट प्राप्त करें (जिसे पहले6,16 वर्णित दृष्टिकोणों का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है)।
      नोट:: यह चरण केवल तभी आवश्यक है जब CE-आधारित HDX के लिए कोई deuterated संशोधक समाधान का उपयोग किया जाता है।

3. डेटा विश्लेषण

  1. CE डेटा का विश्लेषण
    1. इलेक्ट्रोफोरेटिक विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए इलेक्ट्रोफेरोग्राम के रूप में निम्नलिखित भूखंडों में से एक का उपयोग करें, जिसमें चोटियों की संख्या, माइग्रेशन समय और पृथक्करण दक्षता शामिल है: (ए) यूवी अवशोषण बनाम माइग्रेशन समय, सीई उपकरण के ऑप्टिकल डिटेक्टर द्वारा अधिग्रहित (जब उपलब्ध हो); (ख) एमएस द्वारा अधिग्रहित कुल आयन धारा (टीआईसी) ग्राफ कितना है; (ग) एमएस द्वारा अधिग्रहित निकाले गए आयन धारा (ईआईसी/एक्सआईसी) ग्राफ का ब्यौरा क्या है;
      नोट: EIC / XIC इष्टतम संकेत / शोर अनुपात (एस / एन), सामान्य रूप से, इलेक्ट्रोफेरोग्राम के उपर्युक्त प्रारूपों के बीच प्रदान करता है। यह उल्लेखनीय है कि यहां तक कि किसी भी वाद्य पूर्वाग्रहों की अनुपस्थिति में, जबकि यूवी अवशोषण प्रोटीन के द्रव्यमान एकाग्रता के लिए आनुपातिक है, एमएस सिग्नल दाढ़ एकाग्रता के लिए आनुपातिक है। इसलिए, सीई- और एमएस-व्युत्पन्न इलेक्ट्रोफेरोग्राम के बीच शिखर पैटर्न में अंतर का निरीक्षण करना उचित है।
    2. अर्ध-मात्रा के लिए इलेक्ट्रोफेरोग्राम में दिखाए गए चोटियों के वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र का उपयोग करें। प्रोटीन कॉम्प्लेक्स से जुड़े नमूनों के लिए, टीआईसी / ईआईसी इलेक्ट्रोफेरोग्राम से द्रव्यमान एकाग्रता डेटा को कम करने के लिए पहले17 वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग करें।
  2. एमएस डेटा का विश्लेषण
    1. MS1 और MS2 स्पेक्ट्रा प्राप्त करें MS1 और MS2 स्कैन इसी क्षालन खिड़कियों के भीतर प्राप्त के संयोजन से, क्रमशः।
    2. निम्नलिखित दो विधियों में से किसी एक द्वारा बरकरार प्रोटीन (एम (बरकरार प्रोटीन)) और टुकड़ों के द्रव्यमान का निर्धारण करें।
      1. आइसोटोपिक रूप से हल किए गए सिग्नल क्लस्टरों को जन्म देने वाले आयनों के औसत द्रव्यमान की गणना करें।
      2. गाऊसी-जैसे वक्रों के केंद्र का उपयोग करें जो संबंधित आइसोटोपिक लिफाफे6 की फिटिंग के परिणामस्वरूप होता है।
    3. ऐसे Biopharma खोजक, ProSight18, या MASH Suite19 के रूप में सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए टुकड़ा आयनों के बड़े पैमाने पर सूची उत्पन्न करने और उन्हें पहचानने के लिए।
  3. HDX डेटा का विश्लेषण
    1. समीकरण (2) का उपयोग करके एक बरकरार प्रोटीन प्रजातियों के समग्र ड्यूटेरेशन स्तर को निर्धारित करें।
      Equation 2 (2)
      जहां M (2H) या M (1H) 2H या 1H के परमाणु भार हैं। तारांकन चिह्न 2H-लेबल नमूने के डेटा को इंगित करता है।
    2. किसी विशिष्ट खंड के बैकबोन-एमाइड्स की संचयी सुरक्षा या संचयी ड्यूटरेशन निर्धारित करें.
      1. किसी deuterated संशोधक समाधान के साथ अधिग्रहित डेटा के लिए, संचयी सुरक्षा स्तर निर्धारित करने के लिए समीकरण (3) और (4) का उपयोग करें।
        Equation 3 (3)
        Equation 4 (4)
        जहां P(Sk(N)) N-टर्मिनल खंड का कुल संरक्षण है, जो अवशेषों को 1 से k के माध्यम से फैलाता है, P(Sm(C)) C-टर्मिनल खंड का कुल संरक्षण है जिसमें m अवशेष शामिल हैं, M (2H) या M (1H) 2H या 1H के परमाणु भार हैं, और M (ci) या M (zi) ci या zi आयनों के आणविक भार हैं।
        नोट:: डबल-तारांकन चिह्न HDX "समापन बिंदु" नमूने का डेटा इंगित करता है।
      2. एक गैर-deuterated संशोधक समाधान के साथ अधिग्रहित डेटा के लिए, संचयी deuteration स्तर निर्धारित करने के लिए समीकरण (5) और (6) का उपयोग करें।
        Equation 5 (5)
        Equation 6 (6)
        जहां D(Sk(N)) N-टर्मिनल सेगमेंट का संचयी ड्यूटेरियम अपटेक है जो अवशेषों को 1 से k तक फैलाता है; D(Sm(C)) C-टर्मिनल खंड का संचयी ड्यूटेरियम अपटेक है जिसमें m अवशेष शामिल होते हैं।
    3. एक स्थानीय बैकबोन एमाइड समूह पर ड्यूटरेशन स्तर निर्धारित करें
      1. किसी deuterated संशोधक समाधान के साथ प्राप्त डेटा के लिए, स्थानीय सुरक्षा स्तर निर्धारित करने के लिए समीकरणों (7), (8), (9), (10), और (11) का उपयोग करें।
        सी-आयनों से निकाले गए आंकड़ों के लिए
        Equation 7 (7)
        z-ions से deduced डेटा के लिए
        Equation 8 (8)
        जहां पी (आरआई) अवशेषों पर एक बैकबोन एमाइड की सुरक्षा है, और सबस्क्रिप्ट "कुल" प्रोटीन की कुल अवशेष संख्या को दर्शाता है।
        अवशेष साइटों के लिए जहां बाद के टुकड़े आयन गायब थे, समीकरण (9) और (10) का उपयोग करके पी (आरआई) असाइन करें।
        सी-आयनों से निकाले गए आंकड़ों के लिए
        Equation 9 (9)
        z-ions से deduced डेटा के लिए
        Equation 10 (10)
        उसके बाद, समीकरण (11) का उपयोग कर एक स्थानीय बैकबोन एमाइड समूह पर deuteration स्तर D(Ri) निर्धारित करें।
        Equation 11(11)
      2. एक गैर-deuterated संशोधक समाधान के साथ अधिग्रहित डेटा के लिए, स्थानीय सुरक्षा स्तर निर्धारित करने के लिए समीकरणों (12), (13), (14), और (15) का उपयोग करें।
        सी-आयनों से निकाले गए आंकड़ों के लिए
        Equation 12(12)
        z-ions से deduced डेटा के लिए
        Equation 13(13)
        जहां D(Ri) अवशेष i पर एक बैकबोन एमाइड की सुरक्षा है, और सबस्क्रिप्ट "कुल" प्रोटीन की कुल अवशेष संख्या को दर्शाता है।
        अवशेष साइटों के लिए जहां बाद के टुकड़े आयन गायब थे, समीकरण (14) और (15) का उपयोग करके डी (आरआई) असाइन करें।
        सी-आयनों से निकाले गए आंकड़ों के लिए
        Equation 14 (14)
        z-ions से deduced डेटा के लिए
        Equation 15 (15)

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Representative Results

बीजीई के जलसेक दबाव को बदलने से पृथक्करण दक्षता और माइग्रेशन समय दोनों के समायोजन की अनुमति मिलती है, जो अलग होने वाले प्रोटीन के एचडीएक्स प्रतिक्रिया समय के बराबर है (चित्रा 3)। एक कम जलसेक दबाव के परिणामस्वरूप प्रयोग की अवधि की कीमत पर सीई चोटियों का बेहतर अलगाव होता है (चित्रा 3 ए)। एक लंबे समय तक माइग्रेशन / एचडीएक्स प्रतिक्रिया समय के परिणामस्वरूप प्रोटीन एनालिट्स (चित्रा 3 बी-डी) के ड्यूटेरेशन का एक उच्च स्तर होता है। मिनटों के एचडीएक्स टाइमस्केल पर, ड्यूटेरेशन अंतर को मुख्य रूप से तेजी से विनिमय योग्य साइटों के बजाय संरचनात्मक रूप से संरक्षित साइटों पर अलग-अलग विनिमय सीमाओं को प्रतिबिंबित करना चाहिए। या तो प्रोटीन प्रजातियों द्वारा दिखाए गए ड्यूटेरेशन-टाइम फ़ंक्शंस की प्रवृत्ति के अनुसार, माइग्रेशन समय अंतर ड्यूटरेशन अंतर में प्रमुख योगदानकर्ता होने की संभावना नहीं है। दरअसल, होलो- और एपो-मायोग्लोबिन (एमबी) 8 के विभेदक सीई-एचडीएक्स में, पहले के एल्यूटेड एपो-एमबी होलो-एमबी की तुलना में एक उच्च ड्यूटेरेशन स्तर दिखाता है, स्पष्ट रूप से यह सुझाव देता है कि संरचनात्मक अंतर प्राथमिक कारक है जो मापा ड्यूटेरेशन अंतर का निर्धारण करता है।

माइग्रेशन समय अंतर द्वारा पेश किए गए ड्यूटरेशन अंतर के लिए सुधार को ड्यूटेरेशन स्तर बनाम एचडीएक्स समय (चित्रा 3 डी) के डेटा के लिए वक्र-फिटिंग के माध्यम से किया जा सकता है। β-एलजी के वेरिएंट ए और बी उनके अनुक्रम (डी 64 जी और वी 118 ए) 20 में केवल दो अमीनो एसिड अवशेषों से भिन्न होते हैं। इन रूपों ने ईआईसी-व्युत्पन्न इलेक्ट्रोफेरोग्राम (चित्रा 4 ए) में दो पर्याप्त रूप से अलग चोटियों को जन्म दिया। पुनरुत्पादक पृथक्करण प्रोफाइल विभिन्न ऑपरेटरों द्वारा विभिन्न सुविधाओं पर विभिन्न उपकरणों का उपयोग करके किए गए प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे (चित्रा 4 ए)। परिणामस्वरूप आयनों के अलग-अलग द्रव्यमान वितरण विभेदक रूप से 2एच-लेबल वाले संस्करण (चित्रा 4 सी) के अनुरूप हैं, जो बाद के टॉप-डाउन एमएस विश्लेषण के लिए एक चतुर्भुज द्रव्यमान फिल्टर का उपयोग करके प्रत्येक संस्करण के द्रव्यमान-चयन की अनुमति देते हैं, अन्य संस्करण के धनायन-adduct आयनों से हस्तक्षेप के बिना।

प्रतिनिधि टुकड़ा आयनों के अग्रानुक्रम एमएस स्पेक्ट्रा चित्र 5 में दिखाया गया है। अद्वितीय डाइसल्फ़ाइड लिंकेज और β-एलजी की संरचना Cys82 और Cys176 के बीच विखंडन दक्षता को सीमित करती है क्योंकि इस क्षेत्र को14 को घेरने वाले डाइसल्फ़ाइड बांडों को बंद करने के लिए अतिरिक्त विखंडन ऊर्जा की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप सी-आयनों (एन-टर्मिनल) की तुलना में जेड-आयनों (सी-टर्मिनल) की कम संख्या और सापेक्ष बहुतायत होती है (चित्रा 5ए, बी)। इस समस्या को डाइसल्फ़ाइड में कमी के दृष्टिकोण21,22,23,24 के साथ संयोजन से हल किया जा सकता है। जबकि β-एलजी ए और β-एलजी बी से उत्पादित अधिकांश टुकड़े आयन ड्यूटेरियम अपटेक (चित्रा 5 ए, बी) की एक समान सीमा प्रदर्शित करते हैं, बड़े खंड जो अनुक्रम भिन्नता साइटों (जैसे कि सी 137 जैसे आयनों द्वारा दर्शाए गए) को कवर करते हैं, β-एलजी ए से β-एलजी बी (132 बनाम 119 2एच परमाणुओं) की तुलना में काफी अधिक हद तक डियूटेरेटेड होते हैं; चित्रा 5C)। ये परिणाम सीई प्रोफ़ाइल और इन वेरिएंट के क्रिस्टलोग्राफी लक्षण वर्णन परिणामों के साथ समझौते में हैं। सीई प्रोफ़ाइल कम संरचनात्मक लचीलेपन के कारण β-एलजी बी की उच्च इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता को इंगित करता है। इन रूपों के क्रिस्टलोग्राफी लक्षण वर्णन परिणामों से संकेत मिलता है कि रीढ़ की हड्डी की संरचना में छोटे परिवर्तन लूप सीडी (अवशेष 61-67) 11 पर D64G के आसपास के क्षेत्र में होते हैं।

Figure 3
चित्र 3: विभिन्न HDX प्रतिक्रिया समय के साथ मायोग्लोबिन और यूबिकिटिन के मिश्रण का CE-आधारित HDX MS विश्लेषण। (A) एक मिश्रण से 2 H-लेबल वाले Mb(लाल) और Ub (नीले) के इलेक्ट्रोफेरोग्राम (EIC-आधारित) एक मिश्रण से, विभिन्न BGE जलसेक दबावों के साथ अधिग्रहित। (बी) 2एच-लेबल [एमबी] 16 + (लाल) और [यूबी] 8 + (नीले) के द्रव्यमान स्पेक्ट्रा को विभिन्न एचडीएक्स समय के साथ प्राप्त किया गया है। शीर्ष पर ओवरलेड अनलेबल [Mb] 16 + और [Ub] 8 + आयनों (ग्रे) के संदर्भ स्पेक्ट्रा हैं। (सी) बीजीई जलसेक दबाव के एक समारोह के रूप में एमबी (लाल) और यूबी (नीले) का माइग्रेशन समय। (डी) HDX प्रतिक्रिया समय (माइग्रेशन समय के बराबर) के एक समारोह के रूप में Mb (लाल) और Ub (नीले) के Deuteration स्तर। एक CESI 8000 प्लस केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रणाली और एक क्यू Exactive UHMR द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के साथ अधिग्रहित डेटा। संक्षेप: बीजीई = पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट समाधान; CE = केशिका वैद्युतकणसंचलन; एमएस = मास स्पेक्ट्रोमेट्री; HDX = हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज; Mb = मायोग्लोबिन; Ub = ubiquitin; EIC = निकाले गए आयन वर्तमान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र4: गोजातीय दूध से β-एलजी ए और β-एलजी बी के प्राकृतिक मिश्रण का CE-आधारित HDX MS विश्लेषण। (A) गोजातीय दूध से 2H-लेबल वाले β-lg A (नीले) और β-lg B (लाल) के इलेक्ट्रोफेरोग्राम (EIC-आधारित) गोजातीय दूध से, विभिन्न BGE जलसेक दबावों के साथ अधिग्रहित। सीईएसआई 8000 प्लस सीई सिस्टम और एक क्यू सटीक यूएचएमआर मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ अधिग्रहित डेटा। शीर्ष पर ओवरलेड एक अलग सुविधा (ग्रे) पर किए गए माप से एक इलेक्ट्रोफेरोग्राम है, जिसमें पीए 800 प्लस फार्मास्युटिकल विश्लेषण सीई सिस्टम और एक ऑर्बिटरैप फ्यूजन लुमोस मास स्पेक्ट्रोमीटर है। (बी) 2एच-लेबल [β-एलजी ए] 14 + (नीला) और [β-एलजी बी] 14 + (लाल) का द्रव्यमान स्पेक्ट्रा 1 साई के बीजीई जलसेक दबाव के साथ अधिग्रहित किया गया। शीर्ष पर ओवरलेड अनलेबल [β-एलजी ए] 14 + और [β-एलजी बी] 14 + आयनों (ग्रे) के संदर्भ स्पेक्ट्रा हैं। संक्षेप: बीजीई = पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट समाधान; CE = केशिका वैद्युतकणसंचलन; एमएस = मास स्पेक्ट्रोमेट्री; HDX = हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज; Ig = इम्युनोग्लोबुलिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: β-एलजी ए (नीले) और β-एलजी बी (लाल) से उत्पादित प्रतिनिधि टुकड़ा आयनों के अग्रानुक्रम एमएस स्पेक्ट्रा। (ए) सी 10 आयन प्रचुर मात्रा में हैं और समान सीमा तक deuterated हैं; (बी) जेड 29 आयन कम प्रचुर मात्रा में होते हैं और समान सीमा तक ड्यूटेरेटेड होते हैं; (सी) सी 137 आयन अनुक्रम भिन्नता साइटों को कवर करते हैं और β-एलजी ए और बी में काफी अलग-अलग सीमाओं तक डियूटेरेटेड होते हैं। संबंधित खंडों के स्थानों को β-एलजी बी (पीडीबी आईडी: 5IO5) की क्रिस्टल संरचना के नारंगी रंग के हिस्सों के रूप में चित्रित किया गया है। संक्षेप: एमएस = मास स्पेक्ट्रोमेट्री; Ig = इम्युनोग्लोबुलिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सीई केशिका की आंतरिक दीवार कोटिंग के उद्देश्यों में सीई प्रक्रिया13 के दौरान इलेक्ट्रोओस्मोटिक प्रवाह और प्रोटीन अवशोषण को कम करना शामिल है। यद्यपि इलेक्ट्रोओस्मोटिक प्रवाह डिटेक्टर के लिए तटस्थ या विपरीत रूप से चार्ज की गई प्रजातियों को चलाने की अपनी क्षमता के कारण छोटे अणुओं के पारंपरिक सीई विश्लेषण के लिए फायदेमंद है, यह समाधान में समान आकार और शुद्ध शुल्क के साथ प्रोटीन प्रजातियों की पृथक्करण दक्षता से समझौता करता है। एचपीसी के साथ केशिका कोटिंग केशिका की आंतरिक दीवार पर सिलानोल समूहों के कारण इलेक्ट्रोओस्मोटिक प्रवाह को कम करती है। इसके अलावा, इन सिलानोल समूहों को मास्क करने से प्रोटीन के साथ उनकी बातचीत कम हो जाती है, धीमी गति से प्रवास से बचने या केशिका में प्रोटीन के पूर्ण प्रतिधारण से भी बचा जाता है।

वैद्युतकणसंचलन के दौरान, दोनों analytes और धनायन और बीजीई से ऋणायनों electrophoretic प्रवास से गुजरते हैं। एमएस के साथ युग्मन पर, सीई केशिका के नकारात्मक वोल्टेज पक्ष पर बीजीई के एक जलाशय को एक अलग संरचना के साथ सीई-एमएस इंटरफ़ेस के साथ बदल दिया जाता है। एक दबाव को लागू करना जो एक विशिष्ट प्रवाह दर पर सकारात्मक वोल्टेज पक्ष पर जलाशय से केशिका में ताजा बीजीई को लगातार संक्रमित करता है, पूरे केशिका में बीजीई सामग्री की एकाग्रता ढाल को कम करता है, जो अलगाव प्रदर्शन के लिए फायदेमंद है।

एचडीएक्स प्रतिक्रिया समय किसी दिए गए साइट / खंड पर विनिमय दर को निर्धारित करने और प्रोटीन की उच्च-क्रम संरचनाओं की गतिशीलता के लक्षण वर्णन में एक आवश्यक पैरामीटर है। एक सीई-आधारित एचडीएक्स योजना में, जब केशिका deuterated बीजीई से भरा होता है, तो एचडीएक्स प्रतिक्रिया समय केशिका की आंतरिक मात्रा और एनालिस्ट के माइग्रेशन वेग पर निर्भर करता है। यद्यपि केशिका की आंतरिक मात्रा को केशिका की लंबाई या आईडी को बदलकर समायोजित किया जा सकता है, इस विधि का उपयोग करके समायोजन की सीमा सीई और एमएस उपकरणों को जोड़ने के लिए आवश्यक न्यूनतम लंबाई और अतिरिक्त बैकप्रेशर और कम आईडी के कारण क्लॉगिंग के जोखिम जैसे कारकों द्वारा सीमित है।

इसके विपरीत, बीजीई जलसेक दबाव को बदलना एक विस्तृत श्रृंखला पर एचडीएक्स प्रतिक्रिया समय को समायोजित करने का एक व्यावहारिक रूप से प्रभावी तरीका है। हालांकि, यह अभी भी उप-मिनट पर मूल्यों के लिए HDX समय को कम करने के लिए चुनौतीपूर्ण है क्योंकि एक उच्च प्रवाह दर ईएसआई इंटरफ़ेस पर desolvation समझौता करती है। कम HDX समय प्राप्त करने के लिए, गैर-deuterated बीजीई की वांछित मात्रा को केशिका में इंजेक्ट किया जा सकता है जिसे नमूना इंजेक्शन से पहले deuterated BGE से भरा गया है। यह deuterated बीजीई अनुभाग की लंबाई को कम करने में मदद करेगा कि विश्लेषक प्रोटीन के माध्यम से गुजरना चाहिए और उनके प्रवास के दौरान के साथ बातचीत करनी चाहिए। यह दृष्टिकोण प्रभावी HDX समय को दूसरे पैमानेपर 8 तक कम करने की अनुमति देता है।

वेग क्षेत्र और एकाग्रता वितरण का सिमुलेशन जब विश्लेषक लगातार माइक्रोवियल में संक्रमित होता है, तो पता चलता है कि सीई-प्रवाह प्रवाह-थ्रू माइक्रोवियल पर संशोधक समाधान द्वारा कुशलतापूर्वक पतला होता है, और यह कि इस मिश्रण क्षेत्र में विश्लेषक की यात्रा अवधि इलेक्ट्रोओस्मोटिक प्रवाह25 की अनुपस्थिति में दूसरे पैमाने पर है . यद्यपि संरचनात्मक रूप से संरक्षित बैकबोन एमाइड साइटों का एचडीएक्स अम्लीकृत संशोधक के साथ मिश्रण करने पर "बुझा" जाता है, इस तरह की मिश्रण योजना के परिणामस्वरूप तेजी से विनिमय योग्य हाइड्रोजन परमाणुओं (साइड चेन पर उन लोगों सहित) पर ड्यूटेरियम लेबल का नुकसान होता है जब एक गैर-ड्यूटेरेटेड संशोधक का उपयोग किया जाता है। तदनुसार, 2एच2ओ और ड्यूटेरेटेड मेथनॉल का उपयोग माप में संशोधक तैयार करने के लिए किया जाना चाहिए, जिसके लिए एमएस विश्लेषण के लिए बनाए रखने के लिए तेजी से विनिमय योग्य साइटों पर ड्यूटेरियम लेबल की आवश्यकता होती है।

इस CE-आधारित HDX MS दृष्टिकोण की वर्तमान योजना की सीमाएं (1) HDX समय विनियमन और (2) प्रोटीन analytes और प्रवाह के माध्यम से इंटरफ़ेस पर संशोधक समाधान के बीच आगे हाइड्रोजन विनिमय के साथ जुड़ी हुई हैं। प्रभावी प्रवाह दर का निर्धारण जलसेक दबाव, केशिका पैरामीटर और समाधान पैरामीटर (चरण 2.3.4 देखें) जैसे मापदंडों के साथ अपने अनुभवजन्य सहसंबंध का उपयोग करके अनुमान पर आधारित है, इस वजह से और क्योंकि केशिका की आंतरिक मात्रा को सही ढंग से मापना संभव नहीं है (या तो संशोधित या असंशोधित, घर का बना या वाणिज्यिक), एचडीएक्स समय को जानबूझकर ऑपरेशन पैरामीटर को समायोजित करके उच्च सटीकता के साथ सेट नहीं किया जा सकता है। हालांकि, प्रयोगात्मक रूप से परिणामी एचडीएक्स समय को सटीक रूप से मापा जा सकता है।

इस दृष्टिकोण में उपयोग किए जाने वाले संशोधक समाधान में एक कार्बनिक विलायक शामिल है, जो प्रोटीन को उजागर करके अग्रानुक्रम एमएस की सुविधा प्रदान करता है, और पीएच को 2.5 तक कम करके आगे विनिमय प्रतिक्रियाओं को कम करने के लिए एसिड। क्योंकि प्रोटिक सॉल्वैंट्स का उपयोग करने से बचना संभव नहीं है, प्रोटीन और संशोधक समाधान के बीच विनिमय सीई-एमएस इंटरफ़ेस पर उनके मिश्रण पर होता है। जब एक गैर-deuterated संशोधक समाधान का उपयोग किया जाता है, तो तेजी से विनिमय योग्य साइटें इस स्तर पर अपने ड्यूटेरियम लेबल खो देती हैं, और केवल अच्छी तरह से संरक्षित साइटों को लेबल किया जाता है, जो मामूली संरचनात्मक अंतर के साथ प्रोटीन की तुलना करने में संवेदनशीलता को सीमित करता है। इस तरह के प्रभावों को आंशिक रूप से एक संदर्भ नमूने में पूरी तरह से deuterated प्रोटीन को मापने के द्वारा कैलिब्रेट किया जा सकता है।

सीई में एचडीएक्स का प्रदर्शन एचडीएक्स के दौरान समाधान में प्रोटीन प्रजातियों को अलग करने का एक साधन प्रदान करता है ताकि व्यक्तिगत प्रजातियों के शीर्ष-डाउन एमएस लक्षण वर्णन में पड़ोसी प्रजातियों के आयनों से हस्तक्षेप से बचा जा सके और एचडीएक्स प्रतिक्रिया को शुरू करने का एक दृष्टिकोण हो सके। इस HDX प्रतिक्रिया में, deuterated किया जा करने के लिए प्रोटीन पूरी तरह से उनके अलग-अलग mobilities के कारण मूल गैर deuterated वातावरण छोड़ देते हैं। यह पारंपरिक कमजोर पड़ने के ऑपरेशन के विपरीत है, जहां गैर-deuterated सामग्री (आमतौर पर 1% से 10% तक) का एक अंश बरकरार रखा जाता है। टॉप-डाउन एमएस तकनीक के हाल के विकास के फायदों को ध्यान में रखते हुए, हम इस दृष्टिकोण को और बेहतर बनाने की उम्मीद करते हैं ताकि इसे प्रोटीन उच्च-क्रम संरचनाओं के विभेदक लक्षण वर्णन के लिए विश्वसनीय टूलबॉक्स में शामिल किया जा सके।

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Disclosures

D. D. Y. Chen बायोमोलेक्यूल्स के लिए स्वास्थ्य संस्थान के लिए ज्ञान के संस्थापकों में से एक है, जो माइक्रोवियल सीई-एमएस इंटरफ़ेस के माध्यम से प्रवाह का व्यावसायीकरण कर रहा है। अन्य लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (NSFC 21974069) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। लेखकों को सेल विश्लेषण संस्थान, शेन्ज़ेन बे लैबोरेटरी, चीन से भी समर्थन मिला; Jiangsu जैव चिकित्सा कार्यात्मक सामग्री के सहयोगी नवाचार केंद्र; और नानजिंग सामान्य विश्वविद्यालय, चीन में बायोमेडिकल सामग्री की Jiangsu कुंजी प्रयोगशाला।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ammonium acetate Fisher Chemical A/3446/50 ≥99%
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system Sciex, USA
centrifuge Eppendorf 5406000097
centrifugal filter Merck UFC201024 10 kDa cutoff
deuterium oxide Energy Chemical E090001 99.9 % D
formic acid Acros Organics  270480250
fused silica glass capillary Polymicro Technologies 1068150017 ID 50μm, OD 360μm
gas chromatography Agilent GC6890N
hydrochloric acid Sigma Aldrich 258148
hydroxypropyl cellulose Aladdin H113415 MW 100000
magnetic stirrers DLAB 8030101212
methanol Fisher Chemical A456-4 MS grade
microvolume UV-Vis spectrophotometer DeNovix 84677JK7731
myoglobin Sigma Aldrich M1882
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System Beckman Coulter, USA
Q Exactive UHMR mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific, Germany
sodium hydroxide Sigma Aldrich S5881
ubiquitin Sigma Aldrich U6253
ultrasonicator SCIENTZ SB-5200
β-lactoglobulin Sigma Aldrich L0130

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References

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रसायन विज्ञान अंक 172
केशिका वैद्युतकणसंचलन-आधारित हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज टॉप-डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए
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Chaihu, L., Yao, X., Xu, X., Zhu,… More

Chaihu, L., Yao, X., Xu, X., Zhu, Z., Chen, D. D. Y., Wang, G. Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e62672, doi:10.3791/62672 (2021).

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