Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kapillärelektroforesbaserat väte/deuteriumutbyte för konformationskarakterisering av proteiner med masspektrometri uppifrån och ner

Published: June 8, 2021 doi: 10.3791/62672
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1, 3, 1
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

Summary

Här presenteras ett protokoll för en kapillärelektroforesbaserad väte/deuteriumutbytesmetod (HDX) i kombination med masspektrometri uppifrån och ner. Detta tillvägagångssätt karakteriserar skillnaden i högre ordningsstrukturer mellan olika proteinarter, inklusive proteiner i olika tillstånd och olika proteoformer, genom att genomföra samtidig differentiell HDX och elektroforetisk separation.

Abstract

Att lösa konformationsheterogenitet av flera proteintillstånd som samexisterar i lösning är fortfarande ett av de största hindren vid karakteriseringen av proteinterapier och bestämningen av de konformationsövergångsvägar som är kritiska för biologiska funktioner, allt från molekylärt erkännande till enzymatisk katalys. Väte / deuteriumutbyte (HDX) reaktion i kombination med top-down masspektrometrisk (MS) analys ger ett sätt att karakterisera protein högre ordning strukturer och dynamik på ett konformerande specifikt sätt. Den konformationella upplösningskraften hos denna teknik är starkt beroende av effektiviteten av att separera proteintillstånd på intakt proteinnivå och minimera det återstående icke-deutererade protiska innehållet under HDX-reaktionerna.

Här beskriver vi en kapillärelektrofores (CE) -baserad variant av HDX MS-metoden som syftar till att förbättra konformationsupplösningen. I detta tillvägagångssätt genomgår proteiner HDX-reaktioner medan de migrerar genom en deutererad bakgrundselektrolytlösning (BGE) under kapillärelektroforetisk separation. Olika proteintillstånd eller proteoformer som samexisterar i lösning kan effektivt separeras baserat på deras olika laddnings-till-storlek-förhållanden. Skillnaden i elektroforetisk rörlighet mellan proteiner och protiska lösningsmedelsmolekyler minimerar det återstående icke-deutererade lösningsmedlet, vilket resulterar i en nästan fullständig deuterating miljö under HDX-processen. Det genomströmningsmikroviala CE-MS-gränssnittet möjliggör effektiv elektrosprayjonisering av de eluerade proteinarterna efter en snabb blandning med den släckande och denaturerande modifierarlösningen vid sprutans utlopp. Online-top-down MS-analysen mäter den globala deuterationsnivån för de eluerade intakta proteinarterna och därefter deuterationen av deras gasfasfragment. Detta dokument visar detta tillvägagångssätt i differentiell HDX för system, inklusive de naturliga proteinvarianterna som samexisterar i mjölk.

Introduction

Att skilja proteinarter i olika konformations-, bindnings- eller modifieringstillstånd och karakterisera deras strukturella skillnader är viktiga för att övervaka vägarna för övergångar mellan dessa arter som är involverade i biologiska händelser, allt från molekylärt erkännande till enzymatisk katalys och förstå mekanismerna bakom dessa händelser. Konventionella biofysiska tekniker ger inte en komplett lösning på grund av begränsningar som otillräcklig upplösning och förlust av dynamisk information i lösning. Väte / deuteriumutbyte i kombination med masspektrometri (HDX MS) är en teknik som märker de strukturella och konformationella egenskaperna hos proteiner med deuterium (2H) via utbytet mellan labila väteatomer av proteiner och 2H från den avsiktligt införda2H2O-lösningen. Protoner som är involverade i vätebindning eller som är sekvestrerade från lösningsmedlet i proteinets inre utbyter inte lätt1. Eftersom växelkursen på en utbytbar plats är starkt beroende av dess inblandning i strukturer av högre ordning, kan proteinstrukturerna avslöjas vid hög rumslig upplösning av MS som undersöker omfattningen och hastigheten av 2H-upptag baserat på de olika atommassorna mellan 1H och 2H. Under de senaste decennierna har HDX MS blivit en utomordentligt framgångsrik teknik för att studera proteinkonformationer och dynamik2.

I den klassiska bottom-up-metoden för HDX MS proteolyseras ensemblen av proteinarter i olika konformations-, bindnings- eller modifieringstillstånd utan separation på intakt proteinnivå, vilket gör det omöjligt att karakterisera enskilda arter genom att analysera de resulterande proteolytiska fragmenten med invecklat deuteriuminnehåll. Däremot ger olika proteintillstånd eller proteoformer som har införlivat olika deuteriuminnehåll i top-down-metoden upphov till flera fördelningar av intakta proteinmassor i en MS-skanning. Detta gör det möjligt för enskilda arter att separeras genom massselektion av joner som motsvarar varje massfördelning med användning av ett korrekt massfilter (såsom en kvadrupol) och karakteriseringen av deras konformationsskillnader i den efterföljande tandem MS-analysen 3,4,5,6. Effektiviteten av att separera proteintillstånd eller proteoformer i denna strategi begränsas emellertid av omfattningen av skillnaden i deras motsvarande massfördelningar.

Kapillärelektrofores (CE) ger ett sätt att separera proteinarter baserat på deras olika laddningar och hydrodynamiska storlekar i lösningsfasen med hög effektivitet7. Att kombinera CE med HDX erbjuder ytterligare separation av proteintillstånd eller proteoformer i lösningsfasen. Dessutom möjliggör den lilla volymen av CE-kapillären användningen av en helt deutererad lösning som bakgrundselektrolytlösning (BGE), dvs den löpande bufferten, vilket gör kapillären till en HDX-reaktor för proteinprover. På grund av skillnaden i elektroforetisk rörlighet mellan proteiner och protiska reagenser i elektroforesprocessen resulterar ledande HDX under CE i en nästan fullständig deuterating miljö för proteinanalyterna med minimalt kvarvarande icke-deutererat innehåll, vilket ökar känsligheten för strukturanalysen med hjälp av HDX-data. Som sådan utvecklade vi en CE-baserad differentiell HDX-metod i kombination med top-down MS för att karakterisera proteinstrukturer av högre ordning på ett tillstånds- eller proteoformspecifikt sätt8.

Detta dokument beskriver protokoll för detta tillvägagångssätt genom att beskriva stegen för materialberedning, experimentell procedur och dataanalys. Faktorer som kan påverka metodens prestanda eller datakvalitet listas i korta anteckningar. De representativa resultaten som presenteras här inkluderar differentiella HDX-data för blandningar av olika proteiner och naturliga varianter av nötkreatur β-laktoglobulin (β-lg), det viktigaste vassleproteinet som finns i mjölk9. Vi demonstrerar separationseffektivitet, reproducerbarhet och 2H-märkningsprestanda för de två rikliga varianterna av β-lg, dvs A och B10,11 under CE-baserad HDX och variantspecifik karakterisering av deras konformationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Använd högpresterande vätskekromatografi (HPLC) eller MS-klassade reagenser när det är möjligt för att minimera de föroreningar som kan störa MS-analysen. Vidrör inte CE-MS-gränssnittet med bara händer under mätningen för att undvika risken för en elektrisk stöt orsakad av antingen den elektroforetiska spänningen eller elektrosprayspänningen.

1. Beredning av material

  1. Modifiering av smält kiseldioxidkapillär för CE
    1. Bered en 5 % (vikt/vikt) hydroxipropylcellulosalösning (HPC) genom att lösa upp HPC-pulver (molekylvikt [MW]: 100 kDa) i vatten under kontinuerlig omrörning vid rumstemperatur på en magnetisk omrörare i ~12 timmar eller tills dess att fasta partiklarhelt försvinner 12. Ta bort alla synliga luftbubblor med en ultrasonicator.
    2. Montera en kapillär av smält kiseldioxidglas (innerdiameter [ID]: 50 μm, ytterdiameter [OD]: 360 μm) med en längd på cirka 85 cm i ett CE-instrument. Skölj kapillären genom att kontinuerligt infusera ett organiskt lösningsmedel, såsom aceton13, med autosampler av CE vid ett infusionstryck på 40 psi i 10-15 min.
    3. Fyll den rengjorda kapillären med HPC-lösning med autosampler vid ett infusionstryck på 40 psi (vilket ofta tar ~ 40 minuter). Infusera luft i den HPC-fyllda kapillären vid 40 psi för att säkerställa fritt luftflöde i kapillären, vilket indikeras av luftbubblorna som matas ut från kapillären vid nedsänkning i vatten.
    4. Grädda den HPC-belagda kapillären i en temperaturprogrammerbar ugn (helst den temperaturkontrollerade kolonnugnen i en temperaturprogrammerad gaskromatograf) med kvävgas (25 psi) som strömmar genom kapillären, enligt temperaturprogrammet som visas i figur 1.
    5. Kyl ugnen till rumstemperatur innan du tar ut kapillären. Använd denna HPC-modifierade kapillär för CE-separation.

Figure 1
Figur 1: Ett rekommenderat temperaturprogram för kapillärbakning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Bakgrundselektrolytlösning (BGE) och modifierarlösning8
    1. Förbered 1-10 ml BGE vid önskad koncentration (t.ex. 10 mM) genom att lösa upp lämplig mängd ammoniumacetat i 2H2O. Placera 200 μL-alikvoter BGE i separata BGE-injektionsflaskor och försegla injektionsflaskorna med parafilm för att minimera HDX-reaktionen mellan BGE och vattenånga i luften.
    2. Förbered 10 ml av en modifierarlösning med 75 % (v/v) metanol och 25 % (v/v) vatten, med pH justerat till 2,5 med myrsyra.
      OBS: Använd 2H2Ooch deuterad metanol för att förbereda modifierarlösningen om deuteriumatomerna i sidokedjorna och oskyddade ryggradsammider ska behållas för detektion av MS.
  2. Avsaltning av proteinprover
    1. Förbered en ammoniumacetatlösning i icke-deuterat vatten vid önskad koncentration.
      OBS: En koncentration mindre än 100 mM rekommenderas för att undvika en hög elektrisk ström under elektrofores och den resulterande Joule-uppvärmningseffekten.
    2. Justera vid behov pH-värdet i ammoniumacetatlösningen till önskad nivå med myrsyra (för pH < 6,8) eller ammoniumhydroxid (för pH > 6,8).
    3. Ersätt proteinlösningens ursprungliga buffertar med en ammoniumacetatlösning (framställd i icke-deutererat vatten i önskad koncentration; pH justerat till 7,5 med ammoniumhydroxid) genom minst fem sekventiella koncentrationer och utspädningssteg vid 4 °C med användning av ett centrifugalfilter med en korrekt MW-cutoff.
      OBS: De proteinprover som ska avsaltas kan antingen vara från tidigare produktionsförfaranden (t.ex. rening eller formulering) eller beredda genom upplösning av det lyofiliserade proteinpulvret. De "salter" som ska avlägsnas från provlösningarna i detta steg avser i allmänhet alla små joner eller molekyler som är icke-flyktiga. Även om dessa arter effektivt kan separeras från proteiner under elektroforesprocessen, rekommenderas detta steg för att undvika att äventyra den elektroforetiska upplösningen och därmed minimera föroreningen av masspektrometern. När proteinanalyter ska stabiliseras av specifika salter eller tillsatser, inkludera dem i BGE.
    4. Bestäm proteinkoncentrationen med hjälp av en mikrovolym UV-Vis-spektrofotometer.

2. Drift av CE-baserad HDX MS-analys

OBS: Masspektrometern som används i detta tillvägagångssätt bör vara utrustad med en massanalysator med ultrahög upplösning, såsom en Fourier-transformjoncyklotronresonans (FTICR) eller orbitrap, ett massfilter, såsom en kvadrupol som möjliggör massval av prekursorjoner för fragmentering och elektronöverföringsdissociation (ETD) eller elektroninfångningsdissociationsfunktioner (ECD) för att utföra top-down-analys med tillförlitliga tandem MS-data (helst isotopiskt upplösta signaler om fragmentjoner).

  1. Optimering av CE- och MS-inställningar
    1. Utför en pilot-MS-mätning med hjälp av en standardkälla för elektrosprayjonisering (ESI) genom att spruta antingen det förinstallerade provet från en metallbelagd borosilikatglaskapillär (det "statiska" nanoESI-schemat) eller det kontinuerligt infunderade provet från en metallsändare för att optimera MS-inställningarna för mätning av intakta proteiner (MS1) och deras gasfasfragment (MS2). Fragmentera de proteinarter som är av intresse genom massurval av ensemblen av dess joner i ett enda laddningstillstånd, följt av ETD eller ECD för prekursorjonerna.
      OBS: De väsentliga inställningarna inkluderar de parametrar som påverkar desolvation, massval av prekursorjoner (för att undvika störningar från andra arter) och fragmenteringseffektivitet. Både mitten och bredden på massvalsfönstret bör ökas för att matcha den resulterande massfördelningen av analytjonerna efter HDX. Eftersom elueringsfönstret för en proteinart i CE vanligtvis sträcker sig från 0,5 min till 2 min, bedöma fragmenteringseffektiviteten baserat på MS2-skanningar som ackumulerats under ett jämförbart tidsfönster. De optimala värdena för dessa parametrar är proteinspecifika; läsare hänvisas till tidigare publicerade rapporter för exemplifierande inställningar 8,14.
    2. Utför en pilot CE-mätning med hjälp av ett CE-instrument utrustat med en optisk detektor, dvs en fotodiodmatrisdetektor (PDA) eller en UV-detektor för att optimera CE-inställningarna för separation av proteinarterna och migrationstiderna, vilket motsvarar HDX-reaktionstiderna.
      OBS: Detta steg är valfritt beroende på tillgängligheten av den optiska detektorn för CE. I avsaknad av en optisk detektor kan CE-inställningarna optimeras med CE-MS när avsnitt 2.2 har slutförts, enligt instruktionerna i avsnitt 2.3. De väsentliga inställningarna inkluderar parametrar som påverkar separationseffektiviteten, toppformer som visas i elektroferogram och elueringstider.
  2. Förkonditionering av CE-HDX-installationen
    1. Rengör genomströmningsmikrovial CE-MS-gränssnittet med en blandning av 50% metanol, 49% vatten och 1% myrsyra (v / v) med ultraljud i minst 30 min vid rumstemperatur.
    2. Vid montering av den HPC-modifierade kapillären på ett CE-instrument, skölj kapillären med BGE med autosampler i 10 minuter och låt kapillären fyllas med BGE.
    3. Få en korrekt längd av omodifierad smält kiseldioxidkapillärslang (ID: 50 μm, OD: 360 μm) som infusionsslang för modifierarlösningen. Anslut modifierarslangen till en gastät glasspruta med en trubbig spets med en koppling och korrekt hylsa och skölj slangen med modifierarlösningen med en infusionspump i minst 10 minuter.
    4. Sätt i utloppen på den HPC-belagda CE-kapillären och modifierarslangen, som har laddats med motsvarande lösningar, i det rengjorda CE-MS-gränssnittet, som illustreras i figur 2.
    5. Avancera sprutan för modifierarinfusionen antingen manuellt eller med infusionspumpen för att säkerställa att modifierarlösningen når spetsen på gränssnittet. Montera det monterade CE-MS-gränssnittet på ett nanoESI-källhus på en masspektrometer.

Figure 2
Figur 2: Schematisk illustration av den CE-baserade HDX MS-inställningen. Denna siffra har ändrats från8. Förkortningar: BGE = bakgrundselektrolytlösning; CE = kapillärelektrofores; MS = masspektrometri; HDX = utbyte av väte/deuterium, ESI = elektrosprayjonisering; FTICR = Fourier-transform joncyklotronresonans; ETD = dissociation av elektronöverföring; ECD = elektroninfångningsdissociation. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Samtidig CE-separation, HDX-reaktion och MS-analys
    OBS: Deutererad BGE rekommenderas att användas inom 1 dag efter avförsegling.
    1. Applicera en sprayspänning på 3-5 kV på CE-MS-gränssnittet.
    2. Börja infusera modifierarlösningen med infusionspumpen med en flödeshastighet från 0,1 till 10 μL/min och säkerställ en stabil elektrospray vid spetsen av CE-MS-gränssnittet.
    3. Placera provflaskan som innehåller BGE i autosamplern och använd den i steg 2.3.4 för att förvärva tomma elektroferogram och tomma massspektra.
    4. Injicera provlösningen med autosampler vid 2 psi och under en lämplig varaktighet för att möjliggöra injektion av en önskad mängd av provet. Uppskatta injektionsvolymen med hjälp av förhållandet mellan injektionsvolym och injektionsparametrar15 definierade av ekvation (1).
      Equation 1 (1)
      Där Vinj är injektionsvolymen, Δp är injektionstrycket, dc är kapillärens innerdiameter, A är kapillärens tvärsnitt, tinj är injektionstiden, η är vätskans viskositet i kapillären och L är kapillärens längd.
    5. Starta CE-separationen genom att applicera en elektroforetisk spänning på 30 kV och infusionstryck från 0 till 2 psi och förvärva elektroferogrammet. Under tiden börjar du förvärva MS-data i det kromatografiska läget där jonströmsgrafen förvärvas som en funktion av tiden, och motsvarande MS-skanningar kombineras inte automatiskt till ett enda spektrum.
      OBS: Proteiner genomgår spontan HDX-reaktion vid kontaktpunkten för 2H2O-molekyleri BGE under deras elektroforetiska migration i detta steg. Den optiska detektionen för CE kan användas utöver MS-detekteringen. Eftersom detektion på kolonnen kräver avlägsnande av en viss längd av polyimidbeläggning vid utloppsänden av den smälta kiseldioxidkapillären, bör ytterligare försiktighet iakttas för att undvika kapillärskador under monteringen av CE-MS-gränssnittet.
    6. Spara det tomma elektroferogrammet och massspektra som referenser.
      OBS: Tomma data ska användas för felsökning snarare än baslinjesubtraktion.
    7. Placera provflaskorna som innehåller de önskade koncentrationerna av proteinprovlösningarna i autosampleren. Förvärva elektroferogrammen och massspektra för proteinproverna enligt steg 2.3.4-2.3.5. Samla in ett tillräckligt antal MS-skanningar för att erhålla MS1-spektra av de elektroforetiskt separerade och 2H-märkta proteinarterna.
    8. Utför tandem-MS-mätningar för de arter som är av intresse antingen efter att ha förvärvat MS1-spektra inom samma körning eller i en efterföljande, separat körning.
    9. Justera vid behov migrationstiderna/HDX-reaktionstiderna genom att ändra infusionstrycket eller längden på CE-kapillären. Om HDX-reaktionstiden måste vara kortare än migreringstiden, använd den metod som beskrivits tidigare8, som använder både deutererad och icke-deutererad BGE i kapillären under CE-processen.
    10. Spola CE-kapillären med BGE vid ett tryck av 20 psi i minst 10 minuter efter varje mätning.
    11. När experimenten är klara, rengör CE-MS-gränssnittet och alla slangar för förvaring.
    12. Skaffa en datauppsättning av HDX"endpoint"-provet (som kan framställas med hjälp av metoder som beskrivits tidigare 6,16) med MS i direkt infusionsläge.
      OBS: Detta steg krävs endast när en deutererad modifierarlösning används för CE-baserad HDX.

3. Dataanalys

  1. Analys av CE-data
    1. Använd ett av följande diagram som elektroferogram för att bestämma de elektroforetiska egenskaperna, inklusive antalet toppar, migrationstider och separationseffektivitet: (a) UV-absorbans kontra migrationstid, förvärvad av den optiska detektorn för CE-instrumentet (om tillgängligt); b) Grafen över total jonström (TIC) som förvärvats av medlemsstaterna. c) Grafen över extraherad jonström (EIC/XIC) som förvärvats av medlemsstaterna.
      OBS: EIC / XIC ger det optimala signal- / brusförhållandet (S / N), i allmänhet, bland de ovan nämnda formaten för elektroferogram. Det är anmärkningsvärt att även i avsaknad av några instrumentella fördomar, medan UV-absorbansen är proportionell mot masskoncentrationen av protein, är MS-signalen proportionell mot den molära koncentrationen. Därför är det rimligt att observera skillnader i toppmönster mellan CE- och MS-härledda elektroferogram.
    2. Använd arean under kurvan (AUC) för topparna som visas i elektroferogrammen för halvkvantitation. För prover som involverar proteinkomplex, använd den metod som beskrivits tidigare17 för att härleda masskoncentrationsdata från TIC/EIC-elektroferogrammen.
  2. Analys av ms-data
    1. Få MS1- och MS2-spektra genom att kombinera MS1- och MS2-skanningarna som förvärvats inom motsvarande elueringsfönster.
    2. Bestäm massorna av det intakta proteinet (M (intakt protein)) och fragment med någon av följande två metoder.
      1. Beräkna de genomsnittliga massorna av jonerna som ger upphov till de isotopiskt upplösta signalklusterna.
      2. Använd mitten av de Gaussian-liknande kurvorna som härrör från montering av motsvarande isotophöljen6.
    3. Använd programvara som Biopharma Finder, ProSight18 eller MASH Suite19 för att generera masslistan över fragmentjonerna och identifiera dem.
  3. Analys av HDX-data
    1. Bestäm den totala deuterationsnivån för en intakt proteinart med hjälp av ekvation (2).
      Equation 2 (2)
      där M (2H) eller M (1H) är atomvikter på 2H eller 1H. Asterisken anger data för det 2H-märkta provet.
    2. Bestäm det kumulativa skyddet eller den kumulativa deuterationen av ryggradsamider i ett visst segment.
      1. För data som förvärvats med en deutererad modifierarlösning, använd ekvationerna (3) och (4) för att bestämma den kumulativa skyddsnivån.
        Equation 3 (3)
        Equation 4 (4)
        Där P(Sk(N)) är det totala skyddet för det N-terminala segmentet som spänner över resthalterna 1 till k, är P(Sm(C)) det totala skyddet för C-terminalsegmentet som består av m-rester , M (2H) eller M (1H) är atomvikter på 2H eller 1H och M (ci) eller M (zi) är molekylvikterna för ci eller zi joner.
        OBS: Dubbelasterisken anger data för HDX-"slutpunkt" -provet.
      2. För data som förvärvats med en icke-deutererad modifierarlösning, använd ekvationerna (5) och (6) för att bestämma den kumulativa deuterationsnivån.
        Equation 5 (5)
        Equation 6 (6)
        Där D(Sk(N)) är det kumulativa deuteriumupptaget av N-terminalsegmentet som spänner över resthalterna 1– k. D(Sm(C)) är det kumulativa deuteriumupptaget av C-terminalsegmentet bestående av m-rester .
    3. Bestäm deuterationsnivån vid en lokal ryggradsamidgrupp
      1. För data som förvärvats med en deutererad modifierarlösning använder du ekvationerna (7), (8), (9), (10) och (11) för att bestämma den lokala skyddsnivån.
        för data härledda från c-joner
        Equation 7 (7)
        för data härledda från z-joner
        Equation 8 (8)
        Där P(Ri) är skyddet av en ryggradsamid vid restprodukt i, och prenumerationen "total" betecknar proteinets totala restantal.
        För restplatser där efterföljande fragmentjoner saknades, tilldela P(Ri) med hjälp av ekvationerna (9) och (10).
        för data härledda från c-joner
        Equation 9 (9)
        för data härledda från z-joner
        Equation 10 (10)
        Bestäm sedan deuterationsnivån D (Ri) vid en lokal ryggradsamidgrupp med hjälp av ekvation (11).
        Equation 11(11)
      2. För data som förvärvats med en icke-deutererad modifierarlösning, använd ekvationerna (12), (13), (14) och (15) för att bestämma den lokala skyddsnivån.
        för data härledda från c-joner
        Equation 12(12)
        för data härledda från z-joner
        Equation 13(13)
        Där D(Ri) är skyddet av en ryggradsamid vid restprodukt i, och prenumerationen "total" betecknar proteinets totala restantal.
        För restplatser där efterföljande fragmentjoner saknades, tilldela D(Ri) med hjälp av ekvationerna (14) och (15).
        för data härledda från c-joner
        Equation 14 (14)
        för data härledda från z-joner
        Equation 15 (15)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ändring av infusionstrycket för BGE möjliggör justering av både separationseffektivitet och migrationstid, vilket motsvarar HDX-reaktionstiden för de proteiner som ska separeras (figur 3). Ett lägre infusionstryck resulterar i bättre separation av CE-toppar på bekostnad av experimentets varaktighet (figur 3A). En längre migration/HDX-reaktionstid resulterar i en högre nivå av deuteration av proteinanalyterna (figur 3B-D). Vid HDX-tidsskalan på minuter bör deuterationsskillnaden i första hand återspegla de olika utbytesomfattningarna på de strukturellt skyddade platserna i stället för de snabbt utbytbara platserna. Enligt trenden för deuterationstidsfunktioner som visas av någon av proteinarterna är det osannolikt att migrationstidsskillnaden är den största bidragsgivaren till deuterationsskillnaden. Faktum är att i differentiell CE-HDX av holo- och apo-myoglobin (Mb)8 visar den tidigare eluerade apo-Mb en högre deuterationsnivå än holo-Mb, vilket tydligt tyder på att konformationsskillnaden är den primära faktorn som bestämmer den uppmätta deuterationsskillnaden.

Korrigering för deuterationsskillnaden som introduceras av migrationstidsskillnaden kan göras via kurvanpassning för data för deuterationsnivån kontra HDX-tiden (figur 3D). Varianterna A och B av β-lg skiljer sig åt med endast två aminosyrarester i sin sekvens (D64G och V118A)20. Dessa varianter gav upphov till två tillräckligt åtskilda toppar i det EIC-härledda elektroferogrammet (figur 4A). Reproducerbara separationsprofiler erhölls från experiment utförda av olika operatörer med olika instrument vid olika anläggningar (figur 4A). De resulterande distinkta massfördelningarna av joner som motsvarar den differentiellt 2H-märkta varianten (figur 4C) möjliggör massval av varje variant med användning av ett fyrpoligt massfilter för den efterföljande MS-analysen uppifrån och ner, utan störningar från katjon-adduktionerna i den andra varianten.

Tandem MS-spektra av representativa fragmentjoner visas i figur 5. Den unika disulfidbindningen och konformationen av β-lg begränsar fragmenteringseffektiviteten mellan Cys82 och Cys176 eftersom ytterligare fragmenteringsenergi krävs för att klyva disulfidbindningarna som omsluter denna region14, vilket resulterar i ett lägre antal och relativ överflöd av z-joner (C-terminal) än c-joner (N-terminal) (Figur 5A,B). Detta problem kan lösas genom att kombinera med disulfidreduktionsmetoder 21,22,23,24. Medan de flesta fragmentjoner som produceras från β-lg A och β-lg B uppvisar en liknande utsträckning av deuteriumupptag (figur 5A,B), deutereras större segment som täcker sekvensvariationsställena (representerade av joner som c137) från β-lg A i betydligt större utsträckning än β-lg B (132 vs. 119 2H-atomer; Figur 5C). Dessa resultat är i överensstämmelse med CE-profilen och kristallografikarakteriseringsresultaten för dessa varianter. CE-profilen indikerar högre elektroforetisk rörlighet hos β-lg B på grund av lägre strukturell flexibilitet. Kristallografikarakteriseringsresultaten för dessa varianter indikerar att små förändringar i ryggradskonformationen sker i närheten av D64G på loop-CD (rester 61-67)11.

Figure 3
Figur 3: CE-baserad HDX MS-analys av en blandning av myoglobin och ubiquitin med olika HDX-reaktionstider. (A) Elektroferogram (EIC-baserade) av 2H-märkta Mb (röd) och Ub (blå) från en blandning, förvärvade med olika BGE-infusionstryck. (B) Massspektra av 2H-märkta [Mb]16+ (röda) och [Ub]8+ (blå) förvärvade med olika HDX-tider. Överlagda ovanpå är referensspektra av omärkta [Mb]16+ och [Ub]8+ joner (grå). (C) Migrationstid för Mb (röd) och Ub (blå) som en funktion av BGE-infusionstrycket. (D) Deuterationsnivå på Mb (röd) och Ub (blå) som en funktion av HDX-reaktionstiden (motsvarande migreringstiden). Data som erhållits med ett CESI 8000 plus kapillärelektroforessystem och en Q Exactive UHMR masspektrometer. Förkortningar: BGE = bakgrundselektrolytlösning; CE = kapillärelektrofores; MS = masspektrometri; HDX = utbyte av väte/deuterium, Mb = myoglobin; Ub = ubiquitin; EIC = extraherad jonström. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: CE-baserad HDX MS-analys av en naturlig blandning av β-lg A och β-lg B från mjölk från nötkreatur. (A) Elektroferogram (EIC-baserade) av 2H-märkta β-lg A (blå) och β-lg B (röd) från mjölk från nötkreatur, förvärvade med olika BGE-infusionstryck. Data som erhållits med ett CESI 8000 plus CE-system och en Q Exactive UHMR-masspektrometer. Överlagrat på toppen är ett elektroferogram från en mätning utförd vid en annan anläggning (grå), med ett PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE-system och en Orbitrap Fusion Lumos masspektrometer. (B) Massspektra av 2H-märkta [β-lg A]14+ (blå) och [β-lg B]14+ (röda) förvärvade med BGE-infusionstryck på 1 psi. Ovanpå är referensspektra av omärkta [β-lg A]14+ och [β-lg B]14+ joner (grå). Förkortningar: BGE = bakgrundselektrolytlösning; CE = kapillärelektrofores; MS = masspektrometri; HDX = utbyte av väte/deuterium, Ig = immunglobulin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Tandem MS-spektra av representativa fragmentjoner framtjänta av β-lg A (blå) och β-lg B (röd). (A) c10 joner är rikliga och deutererade i liknande utsträckning, B) z29-joner är mindre rikliga och deutererade i liknande utsträckning, (C) c137-joner täcker sekvensvariationsställena och deuteras i väsentligt olika utsträckning i β-lg A och B. Placeringen av motsvarande segment illustreras som orangefärgade delar av kristallstrukturen hos β-lg B (PDB-ID: 5IO5). Förkortningar: MS = masspektrometri; Ig = immunglobulin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målen med att belägga CE-kapillärens innervägg innefattar minimering av det elektroosmotiska flödet och proteinabsorptionen under CE-processen13. Även om elektroosmotiskt flöde är fördelaktigt för konventionell CE-analys av små molekyler på grund av dess förmåga att driva neutrala eller motsatt laddade arter till detektorn, äventyrar det separationseffektiviteten hos proteinarter med liknande storlekar och nettoladdningar i lösning. Beläggning av kapillären med HPC minimerar det elektroosmotiska flödet som orsakas av silanolgrupperna på kapillärens innervägg. Dessutom minskar maskering av dessa silanolgrupper deras interaktion med proteiner, vilket undviker långsam migration eller till och med fullständig retention av proteiner i kapillären.

Under elektroforesen genomgår både analyterna och katjonerna och anjonerna från BGE elektroforetisk migration. Vid koppling till MS ersätts en behållare av BGE vid negativspänningssidan av CE-kapillären med ett CE-MS-gränssnitt med en annan sammansättning. Genom att applicera ett tryck som kontinuerligt infunderar färsk BGE i kapillären från behållaren vid den positiva spänningssidan vid en specifik flödeshastighet minimeras koncentrationsgradienten för BGE-halten i hela kapillären, vilket är fördelaktigt för separationsprestandan.

HDX-reaktionstid är en väsentlig parameter för att bestämma växelkursen vid en given plats / segment och karakterisering av dynamiken i proteiners högre ordningsstrukturer. I ett CE-baserat HDX-schema, när kapillären är fylld med deutererad BGE, är HDX-reaktionstiden beroende av kapillärens inre volym och analyternas migrationshastighet. Även om kapillärens inre volym kan justeras genom att kapillärens längd eller ID ändras, begränsas omfattningen av justeringen med denna metod av faktorer som den minsta längd som krävs för att ansluta CE- och MS-instrumenten och det ytterligare mottrycket och risken för igensättning orsakad av det minskade ID.

Däremot är förändring av BGE-infusionstrycket ett praktiskt effektivt sätt att justera HDX-reaktionstiden över ett brett spektrum. Det är dock fortfarande utmanande att sänka HDX-tiden till värden vid sub-min eftersom en hög flödeshastighet äventyrar desolvationen vid ESI-gränssnittet. För att uppnå en lägre HDX-tid kan den önskade mängden icke-deuterad BGE injiceras i kapillären som har fyllts med deutererad BGE före provinjektion. Detta kommer att bidra till att minska längden på den deutererade BGE-sektionen som analytproteinerna ska passera genom och interagera med under sin migration. Detta tillvägagångssätt möjliggör minskning av den effektiva HDX-tiden till den andra skalan8.

Simulering av hastighetsfältet och koncentrationsfördelningen när analyten ständigt infunderas i mikrovialen avslöjar att CE-flödet effektivt späds ut av modifierarlösningen vid genomströmningsmikrovialen och att analytens färdtid i detta blandningsområde är på andra skalan i frånvaro av elektroosmotiskt flöde25 . Även om HDX av de strukturellt skyddade ryggradsamidplatserna "släcks" vid blandning med den surgjorda modifieraren, resulterar ett sådant blandningsschema i förlust av deuteriumetiketter vid de snabbt utbytbara väteatomerna (inklusive de vid sidokedjorna) när en icke-deutererad modifierare används. Följaktligen bör 2H2Ooch deuterad metanol användas för att bereda modifieraren i mätningar som kräver att deuteriumetiketterna på de snabbt utbytbara platserna behålls för MS-analys.

Begränsningarna i det nuvarande systemet för denna CE-baserade HDX MS-metod är förknippade med (1) HDX-tidsregleringen och (2) ytterligare väteutbyte mellan proteinanalyterna och modifierarlösningen vid genomströmningsgränssnittet. Bestämningen av den effektiva flödeshastigheten baseras på uppskattningen med hjälp av dess empiriska korrelation med parametrar som infusionstryck, kapillärparametrar och lösningsparametrar (se steg 2.3.4), På grund av detta och eftersom det inte är möjligt att noggrant mäta kapillärens inre volym (antingen modifierad eller omodifierad, hemlagad eller kommersiell), kan HDX-tiden inte avsiktligt ställas in med hög noggrannhet genom att justera driftsparametrarna. Den experimentellt resulterande HDX-tiden kan emellertid mätas exakt.

Modifierarlösningen som används i detta tillvägagångssätt innefattar ett organiskt lösningsmedel, vilket underlättar tandem MS genom att utveckla proteinerna och syra för att minimera ytterligare utbytesreaktioner genom att sänka pH till 2,5. Eftersom det inte är möjligt att undvika att använda protiska lösningsmedel sker utbyte mellan proteiner och modifierarlösningen vid deras blandning vid CE-MS-gränssnittet. När en icke-deutererad modifierarlösning används, förlorar snabbt utbytbara platser sina deuteriumetiketter i detta skede, och endast välskyddade platser förblir märkta, vilket begränsar känsligheten vid jämförelse av proteiner med mindre konformationsskillnader. Sådana effekter kan delvis kalibreras genom att mäta det fullständigt deutererade proteinet i ett referensprov.

Att utföra HDX i CE ger ett sätt att separera proteinarter i lösning under HDX för att undvika störningar från joner av angränsande arter i top-down MS-karakterisering av enskilda arter och ett tillvägagångssätt för att initiera HDX-reaktionen. I denna HDX-reaktion lämnar proteinerna som ska deutereras helt den ursprungliga icke-deutererade miljön på grund av deras olika mobiliteter. Detta står i kontrast till den konventionella utspädningsoperationen, där en bråkdel av icke-deutererat innehåll (vanligtvis från 1% till 10%) bibehålls. Med tanke på fördelarna med den senaste utvecklingen av den uppifrån och ner MS-tekniken förväntar vi oss att förbättra detta tillvägagångssätt ytterligare så att det kan inkluderas i den tillförlitliga verktygslådan för differentiell karakterisering av proteinstrukturer av högre ordning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D. D. Y. Chen är en av grundarna av Knowledge for Health Institute for Biomolecules, som kommersialiserar det genomströmningsmikroviala CE-MS-gränssnittet. Andra författare har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Författarna fick också stöd från Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Kina; Jiangsu Collaborative Innovation Center för biomedicinska funktionella material; och Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials vid Nanjing Normal University, Kina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ammonium acetate Fisher Chemical A/3446/50 ≥99%
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system Sciex, USA
centrifuge Eppendorf 5406000097
centrifugal filter Merck UFC201024 10 kDa cutoff
deuterium oxide Energy Chemical E090001 99.9 % D
formic acid Acros Organics  270480250
fused silica glass capillary Polymicro Technologies 1068150017 ID 50μm, OD 360μm
gas chromatography Agilent GC6890N
hydrochloric acid Sigma Aldrich 258148
hydroxypropyl cellulose Aladdin H113415 MW 100000
magnetic stirrers DLAB 8030101212
methanol Fisher Chemical A456-4 MS grade
microvolume UV-Vis spectrophotometer DeNovix 84677JK7731
myoglobin Sigma Aldrich M1882
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System Beckman Coulter, USA
Q Exactive UHMR mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific, Germany
sodium hydroxide Sigma Aldrich S5881
ubiquitin Sigma Aldrich U6253
ultrasonicator SCIENTZ SB-5200
β-lactoglobulin Sigma Aldrich L0130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
  2. Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
  3. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
  4. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
  5. Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
  6. Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
  7. Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
  8. Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
  9. Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
  10. Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
  11. Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
  12. Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
  13. Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
  14. Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
  15. Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille's law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
  16. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  17. Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
  18. Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
  19. Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
  20. Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
  21. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  22. Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
  23. Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
  24. Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
  25. Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).

Tags

Kemi utgåva 172
Kapillärelektroforesbaserat väte/deuteriumutbyte för konformationskarakterisering av proteiner med masspektrometri uppifrån och ner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chaihu, L., Yao, X., Xu, X., Zhu,… More

Chaihu, L., Yao, X., Xu, X., Zhu, Z., Chen, D. D. Y., Wang, G. Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e62672, doi:10.3791/62672 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter