Summary
इस्केमिक हृदय रोग के लिए मायोकार्डियल जीन थेरेपी भविष्य के चिकित्सीय के लिए बहुत वादा रखती है। यहां, हम इस्केमिक हृदय में जीन थेरेपी की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक बड़ा पशु मॉडल पेश करते हैं।
Abstract
कोरोनरी धमनी रोग दुनिया भर में मृत्यु दर और रुग्णता के महत्वपूर्ण कारणों में से एक है। वर्तमान चिकित्सीय की प्रगति के बावजूद, कोरोनरी धमनी रोग के रोगियों का काफी अनुपात रोगसूचक रहता है। जीन थेरेपी-मध्यस्थता चिकित्सीय एंजियोजेनेसिस मायोकार्डियल छिड़काव में सुधार और लक्षणों से राहत के लिए एक नई चिकित्सीय विधि प्रदान करता है। विभिन्न एंजियोजेनिक कारकों के साथ जीन थेरेपी का अध्ययन कुछ नैदानिक परीक्षणों में किया गया है। विधि की नवीनता के कारण, मायोकार्डियल जीन थेरेपी की प्रगति बेंच से बेडसाइड तक एक निरंतर मार्ग है। इसलिए, सुरक्षा और प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए बड़े पशु मॉडल की आवश्यकता होती है। जितना अधिक बड़ा पशु मॉडल मूल बीमारी और क्लीनिकों में उपयोग किए जाने वाले समापन बिंदुओं की पहचान करता है, उतना ही अनुमानित परिणाम नैदानिक परीक्षणों से होते हैं। यहां, हम इस्केमिक पोर्सिन दिल में जीन थेरेपी की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक बड़ा पशु मॉडल पेश करते हैं। हम नैदानिक रूप से प्रासंगिक इमेजिंग विधियों जैसे अल्ट्रासाउंड इमेजिंग और 15एच2ओ-पीईटी का उपयोग करते हैं। वांछित क्षेत्र में जीन स्थानांतरण को लक्षित करने के लिए, इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मैपिंग का उपयोग किया जाता है। इस पद्धति का उद्देश्य है: (1) पुरानी कोरोनरी धमनी रोग की नकल करना, (2) हृदय के हाइपोक्सिक क्षेत्रों में चिकित्सीय एंजियोजेनेसिस को प्रेरित करना, और (3) प्रासंगिक समापन बिंदुओं का उपयोग करके जीन थेरेपी की सुरक्षा और प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना।
Introduction
कोरोनरी धमनीरोग दुनिया भर में मृत्यु दर और बीमारी के बोझ के विशाल अनुपात के लिए जिम्मेदार है। वर्तमान उपचार रणनीतियों में पर्क्यूटेनियस हस्तक्षेप, औषधीय उपचार और बाईपास सर्जरी2 हैं। हालांकि, इन वर्तमान उपचारों की प्रगति के बावजूद, कई रोगी तथाकथित दुर्दम्य एनजाइना से पीड़ित हैं, जो नएउपचार दृष्टिकोणों की अपूर्ण आवश्यकता को रेखांकित करते हैं। जीन थेरेपी-मध्यस्थता चिकित्सीय एंजियोजेनेसिस इस रोगी समूह को लक्षित कर सकता है।
मायोकार्डियल जीन थेरेपी अक्सर विभिन्न वायरल वैक्टर का उपयोग करके वितरित की जाती है, आमतौर पर प्रतिकृति-कमी वाले एडेनोवायरस4। चिकित्सीय जीन के रूप में, विभिन्न एंजियोजेनिक विकास कारकों का उपयोग किया जाता है। सबसे अधिक अध्ययन किए गए एंजियोजेनिक विकास कारक संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) हैं जो संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर्स (वीईजीएफआर) और उनके सह-रिसेप्टर्स5 के माध्यम से अपने एंजियोजेनिक सिग्नलिंग को मध्यस्थ करते हैं। कई नैदानिक परीक्षणों ने कार्डियक जीन थेरेपी के लाभ और सुरक्षा को साबित कर दिया है और इस नवीन उपचार पद्धति को इस्केमिक हृदय रोगों के इलाजके लिए एक यथार्थवादी विकल्प बना दिया है। हालांकि, इस अवधारणा को अभी भी क्लीनिक में प्रवेश करने से पहले बड़े पशु मॉडल में परीक्षण के लिए रखे गए चिकित्सीय जीन और वायरल वैक्टर को बढ़ाने की आवश्यकता है। सुअर को अक्सर प्रयोगशाला जानवर के रूप में उपयोग किया जाता है क्योंकि इसका दिल मानव हृदय के समान होता है। एक सुअर की कार्डियोवैस्कुलर प्रणाली का आकार मनुष्यों में उपयोग किए जाने वाले समान कैथेटर आविष्कारों के उपयोग की अनुमति देता है। मनुष्यों के लिए उपलब्ध सभी इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग सूअरोंमें किया जा सकता है।
क्रोनिक इस्किमिया के लिए कई बड़े पशु मॉडल हैं। सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला एमेरॉइड कॉन्स्ट्रिक्टर मॉडल 9,10,11 है। इस विधि का नकारात्मक पक्ष इनवेसिवनेस है क्योंकि कोरोनरी वास्कुलचर तक पहुंचने के लिए थोराकोटॉमी की आवश्यकता होती है। पहले हमारे समूह में, क्रोनिक मायोकार्डियल इस्किमिया के लिए एक मिनी-इनवेसिव अड़चन स्टेंटमॉडल विकसित किया गया है। इस पद्धति का उपयोग इस पांडुलिपि में मायोकार्डियल इस्किमिया को प्रेरित करने के लिए भी किया जाता है।
इमेजिंग पद्धति की उम्र के बावजूद अल्ट्रासाउंड इमेजिंग की प्रयोज्यता काफी हद तक विकसित हुई है। उदाहरण के लिए, मायोकार्डियल तनाव अभी भी मुख्य रूप से इसकी नवीनता के कारण अनुसंधान उपयोग में है। मायोकार्डियल तनाव पारंपरिक एम-मोड इजेक्शन अंश माप13 की तुलना में दिल के सिकुड़ा हुआ कार्य में परिवर्तन को दर्शाता है। इस प्रकार, यहां बड़े पशु मॉडल में, मायोकार्डियल तनाव माप का उपयोग किया जाता है। हृदय के कार्य का मूल्यांकन करने के लिए, एंजियोग्राफी के दौरान बाएं वेंट्रिकल की सिने इमेजिंग द्वारा कार्डियक आउटपुट को भी मापा जाता है। तनाव के तहत मायोकार्डियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए कार्डियक आउटपुट को आराम और डोबुटामाइन-प्रेरित तनाव दोनों के तहत मापा जाता है।
हृदय समारोह के माप के अलावा, चिकित्सीय एंजियोजेनेसिस के उद्देश्य से जीन थेरेपी अध्ययनों में मायोकार्डियल छिड़काव पर जानकारी आवश्यक है। इस पशु मॉडल में, जानवरों को 15 ओ-लेबल रेडियोवाटर पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (15एच2ओ-पीईटी) के साथ चित्रित किया जाता है क्योंकि यह मायोकार्डियल छिड़काव को मापने के लिए सुनहरा मानक है। 15एच2ओ-पीईटी को पहले इस्केमिक पोर्सिन हार्ट14 के छिड़काव को मापने के लिए मान्य किया गया है।
इस प्रकार, ऊपर वर्णित तरीके और तौर-तरीके इस्केमिक हृदय में जीन थेरेपी की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक उत्कृष्ट परिप्रेक्ष्य का गठन करते हैं।
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Protocol
यहां प्रस्तुत प्रयोग लगभग 10 सप्ताह की मादा घरेलू सूअरों का उपयोग करके किए जाते हैं और फिनलैंड में पशु प्रयोग बोर्ड द्वारा अनुमोदित हैं। प्रोटोकॉल की शुरुआत में जानवरों का वजन 30-40 किलोग्राम होता है, जिससे मनुष्यों के लिए समान प्रक्रियात्मक उपकरण और इमेजिंग तौर-तरीके संभव होते हैं। क्रोनिक इस्किमिया जीन स्थानांतरण से 14 दिन पहले प्रेरित होता है, और जीन स्थानांतरण के बाद अनुवर्ती समय उपयोग किए गए वायरल वेक्टर पर निर्भर करता है। अध्ययन प्रोटोकॉल चित्रा 1 में दिखाया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग एडेनोवायरल या एएवी-मध्यस्थता जीन थेरेपी इंजेक्शन करने के लिए किया जा सकता है। नमूना संग्रह के समय को ट्रांसजीन अभिव्यक्ति शिखर पर समायोजित किया जाना है, जो उपयोग किए गए वायरल वेक्टर पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, एडेनोवायरल जीन स्थानांतरण करते समय, नमूना संग्रह का समय जीन हस्तांतरण के 6 दिन बाद सेट किया जाता है।
1. दवा
- घातक वेंट्रिकुलर अतालता को रोकने के लिए 200 मिलीग्राम एमियोडेरोन और 2.5 मिलीग्राम बिसोप्रोलोल की दैनिक खुराक दें। दवा इस्किमिया ऑपरेशन से 1 सप्ताह पहले शुरू होती है और फॉलो-अप तक दैनिक जारी रखी जाती है।
- इसके अलावा, स्टेंट प्लेसमेंट के बाद तीव्र इन-स्टेंट थ्रोम्बोसिस को रोकने के लिए इस्किमिया ऑपरेशन से 1 दिन पहले जानवरों को क्लोपिडोग्रेल (300 मिलीग्राम) और एसिटाइलसैलिसिलिक एसिड (300 मिलीग्राम) की पेरोरल खुराक दें।
- वेंट्रिकुलर अतालता को रोकने के लिए इस्किमिया ऑपरेशन की शुरुआत में जानवरों को 100 मिलीग्राम लिडोकेन और 2.5 मिलीलीटर (246 मिलीग्राम / एमएल) एमजीएसओ4 का अंतःशिरा रूप से प्रशासित करें।
- संक्रमण प्रोफिलैक्सिस के लिए प्रत्येक ऑपरेशन की शुरुआत में सेफ्यूरोक्सीम (500 मिलीग्राम) के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन का प्रबंधन करें।
- इस्किमिया ऑपरेशन की शुरुआत में और थ्रोम्बोसिस की रोकथाम के लिए ऑपरेशन प्रक्रिया के बाद 30 मिलीग्राम एनॉक्सापैरिन को अंतःशिरा रूप से प्रशासित करें।
- संज्ञाहरण और एनाल्जेसिया के लिए, 1.5 एमएल एट्रोपिन, 6 एमएल एज़ेपरोन (40 मिलीग्राम / एमएल), प्रोपोफोल 20 मिलीग्राम / एमएल, 15 मिलीग्राम / किग्रा / घंटा की दर से, और फेंटानिल 50 μg / mL 10 μg / kg / h की दर से प्रशासित करें। प्रत्येक सुअर के लिए दवा की खुराक समान थी। खुराक प्रशासन के लिए स्थानीय पशु उपयोग दिशानिर्देशों को देखें।
- सभी कार्यों के दौरान जानवरों को एनेस्थेटाइज करें। सभी ऑपरेशन एक बाँझ तकनीक का उपयोग करके बाँझ वातावरण में किए जाने चाहिए।
2. ट्रांसथोरेसिक इकोकार्डियोग्राफी
- इस्किमिया ऑपरेशन, जीन ट्रांसफर और इच्छामृत्यु से पहले ट्रांसथोरेसिक इकोकार्डियोग्राफी करें ताकि किसी भी पता लगाने योग्य पेरिकार्डियल द्रव का मूल्यांकन किया जा सके और मायोकार्डियल तनाव का निर्धारण किया जा सके।
- ट्रांसड्यूसर को सुअर के बगल के नीचे तीसरे या चौथे इंटरकोस्टल स्पेस में रखें ताकि माइट्रल वाल्व स्तर, पैपिलरी मांसपेशी और एपिकल स्तरों पर पैरास्टर्नल शॉर्ट-एक्सिस व्यू तक पहुंच सकें (वीडियो 1)। ट्रांसड्यूसर के मार्कर को सुअर के उरोस्थि को इंगित करना चाहिए। किसी क्लिप को सहेजने के लिए, अधिग्रहण दबाएँ.
3. फ्लोरोस्कोपिक मार्गदर्शन के तहत एंडोवास्कुलर ऑपरेशन।
- इस्किमिया ऑपरेशन, जीन ट्रांसफर और ऊतक संग्रह से पहले कोरोनरी एंजियोग्राम के बाद बाएं वेंट्रिकल सिने इमेजिंग करें।
- ऑपरेशन की तैयारी
- 1.5 एमएल एट्रोपिन और 6 एमएल एज़ापेरोन के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ सूअरों को बेहोश करके ऑपरेशन के लिए तैयार करें।
- बेहोश करने की क्रिया के बाद, सूअरों को एंजियोग्राफिक प्रक्रियाओं के लिए सामान्य प्रोपोफोल और फेंटेनाइल एनेस्थीसिया को क्रमशः 15 मिलीग्राम / किग्रा / घंटा और 10 μg / kg / h की खुराक के साथ प्रेरित करें।
नोट: सूअरों को पूरी प्रक्रिया के लिए एनेस्थेटाइज किया जाता है। - इंटुबैशन और वेंटिलेटर द्वारा वेंटिलेशन का समर्थन करें और ईसीजी और श्वसन मापदंडों जैसे महत्वपूर्ण शारीरिक मापदंडों की निगरानी करें।
- परिचयकर्ता शीथ प्लेसमेंट
- कार्डियोलॉजी में मानक अभ्यास के रूप में सभी ऑपरेशनों के लिए सही ऊरु धमनी में एक परिचयकर्ता म्यान रखें। ऊरु धमनी को ट्रैक करने के लिए अल्ट्रासाउंड का उपयोग करें और इसे प्रवेश सुई (18 ग्राम) से छेदें।
नोट: इंट्रामायोकार्डियल जीन ट्रांसफर के लिए 8 एफ इंट्रोड्यूसर शीथ और अन्य सभी ऑपरेशनों के लिए 6 एफ शीथ का उपयोग करें। धमनी को पिरोने के लिए सुई के माध्यम से म्यान के गाइडवायर का परिचय दें और सुई को हटाते समय गाइडवायर को स्थिर रखें। - गाइडवायर के साथ परिचयकर्ता म्यान डालें, और जब रखा जाए, तो गाइडवायर को हटा दें और कोरोनरी वासोडिलेशन को प्रेरित करने के लिए सुअर को 1.25 मिलीग्राम सबलिंगुअल डाइनाइट्रेट दें।
- कार्डियोलॉजी में मानक अभ्यास के रूप में सभी ऑपरेशनों के लिए सही ऊरु धमनी में एक परिचयकर्ता म्यान रखें। ऊरु धमनी को ट्रैक करने के लिए अल्ट्रासाउंड का उपयोग करें और इसे प्रवेश सुई (18 ग्राम) से छेदें।
- कोरोनरी एंजियोग्राफी
- इस्किमिया ऑपरेशन, जीन ट्रांसफर और ऊतक संग्रह से पहले सीधे कोरोनरी एंजियोग्राफी करें। एंजियोग्राम के लिए आवश्यक मशीनरी चित्रा 2 में दिखाया गया है।
- दाईं कोरोनरी धमनी और बाईं आरोही कोरोनरी धमनी (वीडियो 2) की छवि बनाने के लिए आयोडीन कंट्रास्ट एजेंट के साथ फ्लोरोस्कोपिक मार्गदर्शन के तहत 6 एफ कैथेटर का उपयोग करें।
- आराम और डोबुटामाइन तनाव के तहत बाएं वेंट्रिकल सिने इमेजिंग।
- ऑटो-इंजेक्टर का उपयोग करके 5 एफ पिगटेल कैथेटर के माध्यम से बाएं वेंट्रिकल में आयोडीन कंट्रास्ट एजेंट के 21 एमएल बोलस का प्रबंधन करें। सबसे पहले, बोलस अवधि 3 सेकंड और कुल मात्रा 21 एमएल के लिए सेट करें। फिर, एकल और हाँ दबाएँ।
- एंजियोग्राफिक वर्कस्टेशन के माप सॉफ्टवेयर द्वारा इजेक्शन अंश की गणना करें। गणना करने के लिए, प्रश्न में छवि के वेंट्रिकुलर विश्लेषण का चयन करें। एक समय सीमा का चयन करने के लिए छवि को स्क्रॉल करें, एक डायस्टोलिक में और एक सिस्टोल में। प्रत्येक समय सीमा की वेंट्रिकुलर रूपरेखा खींचने के लिए एक उपकरण का चयन करें।
नोट: सॉफ्टवेयर अब सिम्पसन की विधि द्वारा इजेक्शन अंश और स्ट्रोक वॉल्यूम की गणना करता है। इजेक्शन अंश माप आराम के दौरान और डोबुटामाइन-प्रेरित तनाव के तहत किया जाता है।
- तनाव इमेजिंग
- डोबुटामाइन-प्रेरित तनाव इमेजिंग के लिए डोबुटामाइन को 10 μg / kg / min से 20 μg / kg/ min तक बढ़ाने वाली खुराक में अंतःशिरा रूप से खुराक दें जब तक कि 160 बीपीएम की लक्षित हृदय गति तक नहीं पहुंच जाती। फिर, सिने इमेजिंग करें।
- इस्किमिया ऑपरेशन
- क्रोनिक मायोकार्डियल इस्किमिया को प्रेरित करने के लिए जीन स्थानांतरण से 14 दिन पहले बाएं कोरोनरी धमनी (एलएडी) में एक अड़चन स्टेंट रखें। अड़चन स्टेंट प्लेसमेंट के बाद, जांचें कि क्या अड़चन स्टेंट सही ढंग से रखा गया है, कोरोनरी रक्त प्रवाह को प्रतिबंधित करता है।
नोट: अड़चन स्टेंट को एक फैलाव कैथेटर पर रखा जाता है और इसमें कोरोनरीरक्त प्रवाह को कम करने के लिए एक अड़चन आकार में गठित पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन ट्यूब द्वारा कवर किया गया एक नंगे-धातु स्टेंट होता है।
- क्रोनिक मायोकार्डियल इस्किमिया को प्रेरित करने के लिए जीन स्थानांतरण से 14 दिन पहले बाएं कोरोनरी धमनी (एलएडी) में एक अड़चन स्टेंट रखें। अड़चन स्टेंट प्लेसमेंट के बाद, जांचें कि क्या अड़चन स्टेंट सही ढंग से रखा गया है, कोरोनरी रक्त प्रवाह को प्रतिबंधित करता है।
- स्टेंट के आकार को परिभाषित करना
- एंजियोग्राफिक वर्कस्टेशन (वीडियो 3)12 में स्वचालित माप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एंजियोग्राम में बाईं आरोही कोरोनरी धमनी के आकार के अनुसार स्टेंट का आकार चुनें, या तो 3.0/3.5/4.0 x 8 मिमी।
- स्टेंट प्लेसमेंट
- बाईं कोरोनरी धमनी पर एक कुंडल रखें और अड़चन स्टेंट को एलएडी में घुमाएं, इसे पहले विकर्ण से दूर रखें।
- स्टेंट को 1.3 के स्टेंट-टू-लुमेन अनुपात के साथ इन-डिफ्लेटर का उपयोग करके धमनी में नाममात्र दबाव में फुलाएं, जिससे अड़चन को जगह पर लंगर डाला जा सके। अतिरिक्त 15 सेकंड के बाद, स्टेंट को निष्क्रिय करें और धमनी से उपकरण को वापस ले लें।
नोट: एंजियोग्राम द्वारा अड़चन स्टेंट के सही प्लेसमेंट की पुष्टि करें।
4. पीईटी इमेजिंग
नोट: जीन हस्तांतरण से एक दिन पहले, आराम करें और 15ओ-लेबल रेडियोवाटर पीईटी / सीटी स्कैन करें (अस्पताल के वातावरण और रेडियोलॉजिकल तकनीशियनों की आवश्यकता होती है)।
- संदर्भ इमेजिंग
- आराम और तनाव इमेजिंग से पहले कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) स्कैन करें। क्षीणन सुधार के लिए सीटी जानकारी का उपयोग करें।
- 15ओ-लेबल रेडियोवाटर इमेजिंग
- 800 एमबीक्यू 15एच2ओ बोलस का उपयोग करके आराम और तनाव इमेजिंग करें।
- तनाव इमेजिंग
- 12 मिनट के उपयुक्त रेडियोधर्मी क्षय के बाद एक और 800 एमबीक्यू 15ओ-वॉटर बोलस के साथ तनाव इमेजिंग करें।
नोट: हाइपरमिया एडेनोसिन (200 μg / kg / min अंतःशिरा) द्वारा प्रेरित है, जैसा कि पहले वर्णित है12.
- 12 मिनट के उपयुक्त रेडियोधर्मी क्षय के बाद एक और 800 एमबीक्यू 15ओ-वॉटर बोलस के साथ तनाव इमेजिंग करें।
5. जीन स्थानांतरण
- इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मैपिंग
- कोरोनरी एंजियोग्राम और कार्यात्मक माप (इकोकार्डियोग्राफी, एलवी सिने इमेजिंग) के बाद इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मैपिंग के लिए आगे बढ़ें।
- फ्लोरोस्कोपिक मार्गदर्शन में ऊरु म्यान के माध्यम से बाएं वेंट्रिकल में एक मैपिंग कैथेटर पेश करें।
नोट: इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मैप बनाने के लिए मैपिंग कैथेटर के साथ बाएं वेंट्रिकल के आसपास लगभग 100-150 अंक पंजीकृत करें।
- इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मानचित्र को समाप्त करना
- बाएं वेंट्रिकल के अधिक विश्वसनीय इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मानचित्र को सुनिश्चित करने के लिए आउटलायर बिंदुओं को हटा दें।
- मानचित्र के क्लिप प्लेन का चयन करके ऐसा करें और वेंट्रिकुलर आकार बनाने वाले बिंदुओं से भिन्न बिंदुओं को हटा दें। इसके बाद, मानचित्र दृश्य के लिए प्रक्षेपपथ का चयन करें और उन बिंदुओं को हटा दें जिन्होंने बिंदु पंजीकरण के दौरान क्षैतिज रूप से यात्रा की है।
नोट: सुनिश्चित करें कि शेष बिंदु बाएं वेंट्रिकल को कवर करते हैं और यदि आवश्यक हो तो अधिक अंक दर्ज करें।
- जीन ट्रांसफर इंजेक्शन
- फ्लोरोस्कोपिक मार्गदर्शन के तहत ऊरु म्यान के माध्यम से बाएं वेंट्रिकल में एक इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन कैथेटर पेश करें। इंजेक्शन सुई की लंबाई 3 मिमी पर सेट करें।
- इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन के लिए मानदंड
- इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मैपिंग सिस्टम द्वारा जीन स्थानांतरण का मार्गदर्शन करें और इंजेक्शन को बाएं वेंट्रिकल के व्यवहार्य लेकिन हाइपोकाइनेटिक क्षेत्रों में लक्षित करें।
नोट: व्यवहार्यता के लिए, एक मानदंड के रूप में 5 एमवी से अधिक एकध्रुवीय वोल्टेज का उपयोग करें। हाइपोकिनेसिया के लिए, स्थानीय रैखिक शॉर्टनिंग (एलएलएस) का चयन करें जितना उपलब्ध हो, कम से कम 12% से कम लेकिन अधिमानतः 6% 13 से नीचे।
- इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मैपिंग सिस्टम द्वारा जीन स्थानांतरण का मार्गदर्शन करें और इंजेक्शन को बाएं वेंट्रिकल के व्यवहार्य लेकिन हाइपोकाइनेटिक क्षेत्रों में लक्षित करें।
- इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन
- 30 सेकंड के दौरान, वेक्टर सामग्री को चयन के बिंदु (चरण 5.4) में इंजेक्ट करें और बाएं वेंट्रिकल में बैकफ्लो को रोकने के लिए पीछे हटने से पहले अतिरिक्त 5 सेकंड के लिए मायोकार्डियम के अंदर इंजेक्शन सुई रखें।
6. इच्छामृत्यु और नमूना संग्रह
नोट: कोरोनरी एंजियोग्राम और इजेक्शन अंश माप के बाद क्रमशः चरण 3.4.1 और 3.5.2 में वर्णित है, एनेस्थेटाइज्ड सुअर को अंतःशिरा रूप से संतृप्त पोटेशियम क्लोराइड के 50 मिलीलीटर का प्रबंधन करें।
- हृदय का छिड़काव निर्धारण।
- वक्ष गुहा से दिल की कटाई करें। पानी से धो लें। महाधमनी वाल्व के ऊपर एक 18 ग्राम सुई रखें और सुई को छिड़काव पंप से जोड़ें। 1% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 750 एमएल के साथ दिल को शुद्ध करें।
- नमूना संग्रह
- एक तेज रसोई चाकू का उपयोग करके दिल को 1 सेमी मोटी स्लाइस में स्लाइस करें। जीन स्थानांतरण क्षेत्र से नमूने 4% पीएफए और तरल नाइट्रोजन में एकत्र करें।
नोट: नकारात्मक नियंत्रण की कटाई के लिए, बाएं वेंट्रिकल की पीछे की दीवार से एक नियंत्रण नमूना एकत्र करें।
- एक तेज रसोई चाकू का उपयोग करके दिल को 1 सेमी मोटी स्लाइस में स्लाइस करें। जीन स्थानांतरण क्षेत्र से नमूने 4% पीएफए और तरल नाइट्रोजन में एकत्र करें।
- सुरक्षा ऊतक संग्रह
- फेफड़े, यकृत, गुर्दे, प्लीहा और अंडाशय जैसे दूरस्थ ऊतकों से नमूने की कटाई करें। नमूने 4% पीएफए और तरल नाइट्रोजन में लें।
7. नमूना भंडारण
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए 4% पीएफए में धुंधला होने के लिए नमूने स्टोर करें।
नोट: पीएफए को दैनिक रूप से एक ताजा तरल के साथ बदलें।- 48 घंटे के बाद, विआयनीकृत पानी में 15% सुक्रोज के साथ पीएफए को बदलें। नमूने को पैराफिन ब्लॉक में एम्बेड करने से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए स्टोर करें। स्नैप जमे हुए नमूने -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं।
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Representative Results
इस्किमिया ऑपरेशन की सफलता की पुष्टि कोरोनरी एंजियोग्राम द्वारा इस प्रोटोकॉल के साथ और जीन वितरण के लिए आगे बढ़ने से पहले ट्रांसथोरेसिक अल्ट्रासाउंड (चित्रा 1) द्वारा हाइपोकाइनेटिक क्षेत्र का निर्धारण करके की जा सकती है। कोरोनरी रोड़ा की स्थिति का मूल्यांकन कोरोनरी एंजियोग्राम द्वारा किया जा सकता है, और इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मैपिंग इस्केमिक और हाइबरनेटिंग क्षेत्रों को सुनिश्चित करता है।
जीन थेरेपी की प्रभावकारिता का विश्लेषण परिधीय तनाव, इजेक्शन अंश और मायोकार्डियल छिड़काव को 15एच2ओ-पीईटी (चित्रा 3) द्वारा मापकर किया जा सकता है। ऊतक के नमूने सीधे जीन स्थानांतरण क्षेत्र से हृदय की तुलना इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मानचित्र से करके एकत्र किए जा सकते हैं। ट्रांसजेन अभिव्यक्ति और चिकित्सीय एंजियोजेनेसिस (चित्रा 4) का मूल्यांकन इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के माध्यम से बीटा-गैलेक्टोसिडेस धुंधला होने के बाद सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या का विश्लेषण करके और सीडी 31 धुंधला होने के बाद मायोकार्डियल केशिका क्षेत्र का विश्लेषण करके किया जा सकता है। इसके अलावा, जीन थेरेपी की सुरक्षा का मूल्यांकन नैदानिक इमेजिंग (इकोकार्डियोग्राफी द्वारा पेरिकार्डियम इफ्यूजन मूल्यांकन), इम्यूनोहिस्टोलॉजी और वितरण विश्लेषण द्वारा किया जा सकता है।
चित्र 1: अध्ययन प्रोटोकॉल। इस्किमिया जीन स्थानांतरण से 14 दिन पहले प्रेरित होता है। 15एच2ओ-पीईटी इमेजिंग जीन ट्रांसफर से 1 दिन पहले और इच्छामृत्यु और नमूना संग्रह से पहले की जाती है। नमूना संग्रह का समय वायरल वेक्टर और उपयोग किए गए चिकित्सीय जीन पर निर्भर करता है। एडेनोवायरल वैक्टर का उपयोग करते समय, दूसरा 15एच2ओ-पीईटी 5 वें दिन होता है, और नमूना संग्रह का समय क्रमशः 6वें दिन होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: एंजियोलेबोरेटरी सेटअप। कोरोनरी हस्तक्षेप के लिए आवश्यक मशीनें: अल्ट्रासाउंड मशीन, वेंटिलेटर, और एंजियोग्राफिक स्टेशन, बाएं से दाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: परिधीय तनाव की प्रतिनिधि छवि, और 15एच2ओ-पीईटी और इस्केमिक दिल से एक इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मानचित्र। 15एच2ओ-पीईटी: लाल रंग अधिकतम छिड़काव के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है, और नीला हाइपोपरफ्यूजन के क्षेत्र को इंगित करता है। इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मैप: इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मैप में ब्राउन डॉट्स इंजेक्शन साइटों का प्रतिनिधित्व करते हैं। लाल रंग बाएं वेंट्रिकल के हाइपोकाइनेटिक क्षेत्रों को इंगित करता है, जबकि बैंगनी सामान्य संविदात्मकता के क्षेत्र को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: β-गैलेक्टोसिडेस और पीईसीएएम -1 धुंधला होने की प्रतिनिधि छवि। β-गैलेक्टोसिडेज़ को AdLacZ ट्रांसड्यूस्ड हार्ट में व्यक्त किया जाता है और इसका उपयोग ट्रांसजीन अभिव्यक्ति दिखाने के लिए किया जा सकता है। पीईसीएएम -1 धुंधला का उपयोग मायोकार्डियल केशिकाओं का पता लगाने और केशिका क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। निचली पंक्ति जीन स्थानांतरण से दूर के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करती है। β-गैलेक्टोसिडेस धुंधला होने में स्केल बार: 200 μm। पीईसीएएम -1 धुंधला में स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
वीडियो 1: ट्रांसथोरेसिक इकोकार्डियोग्राफी शॉर्ट-एक्सिस व्यू। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
वीडियो 2: जीन ट्रांसफर से पहले एलएडी का कोरोनरी एंजियोग्राम। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
वीडियो 3: बाएं पूर्ववर्ती अवरोही धमनी व्यास माप। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल के टाइमपॉइंट्स को इस्तेमाल किए गए वायरल वेक्टर के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल विश्लेषण चिकित्सीय जीन के अनुसार चुना जा सकता है। यदि आवश्यक हो तो प्रोटोकॉल में अधिक टाइमपॉइंट और एंडपॉइंट जोड़ना भी संभव है।
इस प्रोटोकॉल में चरण शामिल हैं, जो सफल होने के लिए आवश्यक हैं और बाद में सही करना असंभव है। सबसे पहले, यदि कोई उचित इस्किमिया को प्रेरित करने में विफल रहता है, तो जानवर को आगे की प्रक्रियाओं और विश्लेषणों से बाहर रखा जाना चाहिए। विधियों और इमेजिंग का मानकीकरण महत्वपूर्ण है ताकि परिणाम टाइमपॉइंट और जानवरों के बीच तुलनीय हों। दूसरा, नमूने सटीक जीन हस्तांतरण क्षेत्र से एकत्र किए जाने चाहिए और आगे के विश्लेषण करने के लिए सफलतापूर्वक संसाधित किए जाने चाहिए। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को एंजियोग्राफिक प्रक्रियाओं और विभिन्न इमेजिंग तौर-तरीकों के साथ गहन परिचितता की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, कोरोनरी एंजियोग्राम और धड़कते दिल के वायरल इंजेक्शन के लिए व्यापक प्रशिक्षण के साथ-साथ सही ट्रांसथोरेसिक इकोकार्डियोग्राफी करने की आवश्यकता होती है। फिर भी, ये इमेजिंग तौर-तरीके आगे के अध्ययन के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करने के लिए मायोकार्डियल फ़ंक्शन और छिड़काव को मापते हैं।
एक सुअर की हृदय प्रणाली अपनी शारीरिक और शारीरिक समानता के कारण मानव जैसा दिखता है, और इसलिए, सूअरों का उपयोग अक्सर हृदय रोग यांत्रिकी और प्रक्रियाओं को मॉडल करने के लिए किया जाता है। हालांकि, पशु के तेजी से विकास के कारण अनुवर्ती समय लगभग 6 महीने तक सीमित है। 6 महीने के बाद, जानवर की हैंडलिंग चुनौतीपूर्ण हो जाती है, और इमेजिंग गुणवत्ता बिगड़ जाती है।
इसके अलावा, सूअर एथेरोस्क्लेरोसिस के लिए काफी प्रतिरोधी हैं, जिससे आहार-प्रेरित एथेरोस्क्लेरोसिस सूअरों में मॉडलकरने के लिए जटिल हो जाता है। हालांकि, मूल बीमारी की नकल करने के लिए क्रोनिक इस्किमिया मॉडल विकसित किए गए हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अड़चन स्टेंट इस्किमिया मॉडल का महत्वपूर्ण लाभ यह है कि स्टेंट का क्रमिक रोड़ा अचानक रोड़ा से बेहतर कोरोनरी धमनी रोग का प्रतिनिधित्व करता है। अमेरॉइड कॉन्स्ट्रिक्टर मॉडल की तुलना में, यह विधि कम आक्रामक है। दूसरे, पर्क्यूटेनियस बॉटलनेक स्टेंट प्लेसमेंट प्रदर्शन करने के लिए एक त्वरित प्रक्रिया है। इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मैपिंग सिस्टम का उपयोग करने से जीन स्थानांतरण को हाइबरनेटिंग मायोकार्डियम में लक्षित करने में सक्षम बनाता है, न कि इन्फ्रैक्ट क्षेत्र में, जो एक संभावित परिणाम है जब इंजेक्शन को लक्षित करने के लिए अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन का उपयोग किया जाता है। हालांकि, इलेक्ट्रोएनाटोमिकल मैपिंग का नकारात्मक पक्ष प्रक्रिया की लंबाई है। इसके अलावा, चूंकि सुअर का दिल वेंट्रिकुलर अतालता के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है, मैपिंग मैपिंग प्रक्रिया के दौरान वेंट्रिकुलर फाइब्रिलेशन को प्रेरित कर सकती है। हालांकि, ये अतालता आसानी से डिफिब्रिलेट हो जाती हैं।
इस बड़े पशु मॉडल में उपयोग किए जाने वाले समापन बिंदु नैदानिक परीक्षणों में उपयोग किए जाने वाले लोगों की पहचान करते हैं, क्लीनिकों में संक्रमण को बढ़ाते हैं। इसके अलावा, ये विधियां इस मॉडल में वर्णित लोगों के अलावा विभिन्न अनुवर्ती समय और अन्य सहायक समापन बिंदुओं के साथ मायोकार्डियल जीन थेरेपी की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने वाले बड़े जानवरों के अध्ययन के लिए लागू होती हैं। इस प्रोटोकॉल को बड़े जानवरों के प्रयोगों के विशाल अनुभव के बाद मानकीकृत किया गया है। भविष्य में, यह प्रोटोकॉल क्लीनिकों में अनुवाद से पहले मायोकार्डियल जीन थेरेपी की सुरक्षा और प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए लागू होता है।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
लेखक कुओपियो यूनिवर्सिटी अस्पताल में 15ओ-पीईटी इमेजिंग की सहायता और अनुमति देने के लिए मारिया हेडमैन, टिइना लैटिनेन, टोमी लैटिनेन, पेक्का पाउटियानेन, अन्निका विरेन और सेवेरी सोरमुनेन को धन्यवाद देना चाहते हैं; और पशु कार्य में उनकी सहायता के लिए राष्ट्रीय प्रयोगशाला पशु केंद्र से हेइक्की करहुनेन, मिन्ना टोरोनेन, और रिक्का वेनेन।
यह अध्ययन फिनिश अकादमी, ईआरसी और कार्डियोरेजेनिक्स ईयू क्षितिज 2020 अनुदान से अनुदान द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 15 % sucrose | VWR | VWRC27480.294 | Prepared from solid sucrose |
| 4% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 5 F pigtail catheter | Cordis | 534-550S | |
| 6 F catheter AR2 | Cordis | 670-112-00 | |
| 6 F introducer sheath | Cordis | 504-606X | |
| 8 F introducer sheath | Cordis | 504-608X | |
| Acetylsalicylic acid | Varying producer | ||
| Amiodarone | Varying producer | ||
| Angiographic station | GE Healthcare | ||
| Angiolaboratory set | Mölnlycke | designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs | |
| Bisoprolol | Varying producer | ||
| Cefuroxime | Varying producer | ||
| Clopidogrel | Varying producer | ||
| Coroflex Blue stent | B.Braun Medical | 5029012 | Catalog number depends on stent size |
| Crile forceps | |||
| Cyclotron | GE Healthcare | ||
| Dobutamine | Varying producer | ||
| Electroanatomical mapping system | Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company | ||
| Enoxaparin | Varying producer | ||
| Fentanyl | Varying producer | ||
| Intramyocardial injection catheter | Johnson & Johnson | ||
| Iodine contrast agent | Iomeron | ||
| Kitchen knife | Varying producer | ||
| Lidocaine | Varying producer | ||
| Liquid nitrogen | Varying producer | ||
| MgSO4 | Varying producer | ||
| Needle 18 G | Cordis | 12-004943 | |
| Perfusion pump | |||
| PET-CT scanner | Siemens Healthcare | ||
| Polytetrafluoroethylene tube | |||
| Propofol | Varying producer | ||
| Scalpel no 11 | VWR | SWAN0503 | |
| Sublingual dinitrate | Takeda | ||
| Ultrasound machine | Philips |
References
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