Summary
In dieser Arbeit bringen wir exogene künstlich synthetisierte miRNA-Nachahmungen in die Niere durch Schwanzveneninjektion eines nicht-viralen Vektors und Polyethylenimin-Nanopartikel in verschiedenen Mausmodellen für Nierenerkrankungen. Dies führte zu einer signifikanten Überexpression der Ziel-miRNA in der Niere, was in mehreren Mausmodellen zu einer Hemmung des Fortschreitens der Nierenerkrankung führte.
Abstract
microRNAs (miRNAs), kleine nicht-kodierende RNAs (21-25 Basen), die nicht in Proteine übersetzt werden, hemmen viele Target Messenger-RNAs (mRNAs), indem sie ihre Translation bei verschiedenen Nierenerkrankungen destabilisieren und hemmen. Daher ist die Abwechslung der miRNA-Expression durch exogene, künstlich synthetisierte miRNA-Nachahmer eine potenziell nützliche Behandlungsoption, um die Entwicklung vieler Nierenerkrankungen zu hemmen. Da die Serum-RNAase jedoch systematisch verabreichte exogene miRNA-Nachahmer in vivo sofort abbaut, bleibt die Abgabe von miRNA an die Niere eine Herausforderung. Daher sind Vektoren notwendig, die exogene miRNA-Nachahmer vor dem Abbau durch RNAase schützen und sie signifikant an die Niere abgeben können. In vielen Studien wurden virale Vektoren verwendet, um exogene miRNA-Nachahmungen oder -Inhibitoren an die Niere abzugeben. Virale Vektoren können jedoch eine Interferonantwort und/oder genetische Instabilität hervorrufen. Daher ist die Entwicklung viraler Vektoren auch eine Hürde für den klinischen Einsatz exogener miRNA-Mimics oder -Inhibitoren. Um diese Bedenken hinsichtlich viraler Vektoren auszuräumen, haben wir eine nicht-virale Vektormethode entwickelt, um miRNA-Nachahmungen durch Schwanzveneninjektion von Polyethylenimin-Nanopartikeln (PEI-NPs) in die Niere zu bringen, was zu einer signifikanten Überexpression von Ziel-miRNAs in mehreren Mausmodellen für Nierenerkrankungen führte.
Introduction
miRNAs, kleine nicht-kodierende RNAs (21-25 Basen), die nicht in Proteine übersetzt werden, hemmen viele Zielboten-RNAs (mRNAs), indem sie sie destabilisieren und ihre Translation bei verschiedenen Nierenerkrankungen hemmen 1,2. Daher ist die Gentherapie mit exogenen, künstlich synthetisierten miRNA-Nachahmungen oder -Inhibitoren eine potenzielle neue Option, um die Entwicklung vieler Nierenerkrankungen zu hemmen 3,4,5.
Trotz des Versprechens von miRNA-Nachahmungen oder -Inhibitoren für die Gentherapie bleibt die Verabreichung an Zielorgane eine große Hürde für In-vivo-Experimente, um ihr klinisches Potenzial zu entwickeln. Da künstlich synthetisierte miRNA-Nachahmer oder -Inhibitoren einem sofortigen Abbau durch die Serum-RNase unterliegen, verkürzt sich ihre Halbwertszeit bei systemischer Verabreichung in vivo6. Darüber hinaus ist die Effizienz von miRNA-Nachahmungen oder -Inhibitoren, die Plasmamembran zu durchdringen und Zytoplasma zu transfizieren, ohne geeignete Vektoren im Allgemeinen viel geringer zu sein 7,8. Diese Evidenzlinien deuten darauf hin, dass die Entwicklung des miRNA-Nachahmungs- oder Inhibitor-Verabreichungssystems für die Niere erforderlich ist, um ihren Einsatz im klinischen Umfeld zu ermöglichen und sie zu einer neuen Behandlungsoption für Patienten mit verschiedenen Nierenerkrankungen zu machen.
Virale Vektoren wurden als Träger verwendet, um exogene miRNA-Nachahmungen oder -Inhibitoren an die Niere zu liefern 9,10. Obwohl sie im Hinblick auf biologische Sicherheit und Transfektionswirksamkeit entwickelt wurden, können virale Vektoren dennoch eine Interferonantwort und/oder genetische Instabilität verursachen11,12. Um diese Bedenken auszuräumen, haben wir ein miRNA-Nachahmungssystem für die Niere entwickelt, bei dem Polyethylenimin-Nanopartikel (PEI-NPs), ein nichtviraler Vektor, in mehreren Mausmodellen für Nierenerkrankungen verwendetwerden 13,14,15.
PEI-NPs sind lineare polymerbasierte NPs, die Oligonukleotide, einschließlich miRNA-Nachahmungen, effektiv an die Niere abgeben können und aufgrund ihrer langfristigen Sicherheit und Biokompatibilität als bevorzugt für die Herstellung nichtviraler Vektoren angesehen werden13,16,17.
Diese Studie demonstriert die Effekte einer systematischen exogenen miRNA-Nachahmung der Verabreichung mit PEI-NPs durch Schwanzveneninjektion in Nierenfibrose-Modellmäusen, die durch einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) erzeugt wurden. Darüber hinaus zeigen wir die Effekte der systematischen exogenen miRNA-Mimikabgabe mit PEI-NPs mittels Schwanzveneninjektion in Modellmäusen für diabetische Nierenerkrankungen (db/db-Mäuse: C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Leprdb) und Modellmäusen mit akutem Nierenversagen, die durch renale Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) hervorgerufen wurden.
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Protocol
Alle Tierversuchsprotokolle wurden von der Tierethikkommission der Medizinischen Universität Jichi genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren aus dem Leitfaden für Labortiere der Medizinischen Universität Jichi durchgeführt. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass miRNA die Abgabe an die Niere nachahmt, was zu einer Überexpression mit UUO-Mäusen führt. Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Jichi Medical University genehmigt [Zulassung Nr. 19-12 für Nierenfibrose, 17-024 für akute Niereninfektion (AKI) und 19-11 für diabetische Nephropathie].
1. Herstellung des PEI-NPs-miRNA-Mimic-Komplexes
HINWEIS: Hier wird die Herstellung von PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 und PEI-NPs-control-miRNA (als Negativkontrolle) für eine Maus beschrieben.
- Bereiten Sie die folgenden Elemente vor:
- Bereiten Sie 10 μl lineare PEI-NPs vor.
- Präparation von 50 μl künstlich synthetisierter miRNAs, gelöst in nukleasefreiem Wasser in einer Konzentration von 100 μM (5 nmol miRNA gelöst in 50 μl nukleasefreiem Wasser).
- Präparation von 50 μl künstlich synthetisierter Kontroll-miRNAs (Nicht-Ziel-miRNAs), gelöst in nukleasefreiem Wasser in einer Konzentration von 100 μM (5 nmol miRNA gelöst in 50 μl nukleasefreiem Wasser).
- Bereiten Sie 5%ige und 10%ige Glukoselösungen vor. Stellen Sie die Verfügbarkeit von 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und einem Wirbelmischer sicher.
- Lösen Sie 10 μl PEI-NPs in 90 μl 5%iger Glukoselösung in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Wirbeln Sie dann das Rohr vorsichtig und drehen Sie es nach unten.
- Mischen Sie 50 μl künstlich synthetisierte miRNAs (5 nmol), gelöst in nukleasefreiem Wasser (100 μM Konzentration) mit 50 μM 10%iger Glukoselösung in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Wirbeln Sie dann das Rohr vorsichtig und drehen Sie es nach unten. Bei diesem Prozess wird miRNA in 5%iger Glukoselösung gelöst.
- Mischen Sie 100 μl PEI-NPs in 5%iger Glukoselösung und 100 μl miRNA-Mimic (5 nmol) in 5%iger Glukoselösung. Wirbeln Sie dann das Rohr vorsichtig und drehen Sie es nach unten.
- Inkubieren Sie das Gemisch für 15 min bei Raumtemperatur (RT), um einen stabilen Komplex aus PEI-NPs-miRNA-Mimic herzustellen. Diese Lösung enthält PEI-NPs und miRNA-Nachahmung (5 nmol) in einem Verhältnis von Stickstoff (N) im Polymer zu Phosphat (P) in Nukleinsäuren (N/P-Verhältnis) = 6 (Abbildung 1).
HINWEIS: Der PEI-NPs-Kontroll-miRNA-Komplex kann mit dem gleichen Verfahren hergestellt werden, das in den Schritten 1.1-1.5 für alle in diesem Manuskript beschriebenen Mäusemodelle für Nierenerkrankungen beschrieben ist (UUO, diabetische Nephropathie und AKI). Ein Injektionsvolumen von PEI-NP-miRNAs-mimic entspricht 5 nmol miRNAs-mimic konjugiert mit PEI-NPs bei einem N/P-Verhältnis = 6. Die Injektionsdauer und -häufigkeit jedes PEI-NP-miRNAs-Mimiks hängt vom Krankheitsmodell ab, in dem es angewendet wird.
2. Bestätigung der signifikanten Abgabe von miRNA-Mimik an die Niere in UUO-Mäusen durch PEI-NP mittels Schwanzveneninjektion mittels Fluoreszenzmikroskopie
HINWEIS: Hier wird die Verabreichungsmethode der künstlich gereinigten miRNA-Nachahmung in die Niere ausgearbeitet, was auf die Etablierung therapeutischer Methoden für verschiedene Nierenerkrankungen hinweist. Kurz gesagt, UUO-Mäusen wurde Cyanin-3-Carbonsäure (Cy3)-markierte miRNA-Mimik verabreicht, die über die Schwanzvene zu 100 μl PEI-NPs hinzugefügt wurde. Die Abgabe an die Nieren wurde fluoreszenzmikroskopisch bestätigt. PEI-NPs-Cyanin-3-Carbonsäure (Cy3)-markierte miRNA-Mimik (Oligonukleotide) für eine Maus wird beschrieben. Diese Methode kann miRNA-Nachahmung in mehreren Mausmodellen, wie z. B. UUO-Mäusen, Mäusen mit diabetischer Nierenerkrankung und AKI-Mäusen, die durch IRI hergestellt wurden, signifikant an die Niere abgeben. Hier haben wir ein UUO-Mausmodell für die Videodemonstration verwendet. Das Induktionsverfahren von UUO wurde bereits an anderer Stellebeschrieben 13. Befolgen Sie diese Protokolle innerhalb von sechs Tagen nach der UUO-Operation.
- Bereiten Sie die folgenden Elemente vor:
- Präparation von 2 μl PEI-NPs und 100 μl Cy3-markierten Doppelstrang-Oligonukleotiden [Cy3-markierte miRNA-Nachahmung (1 nmol; 10 μM)].
- Bereiten Sie 5%ige und 10%ige Glukoselösungen vor. Stellen Sie die Verfügbarkeit von 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und einem Wirbelmischer sicher.
- Verwenden Sie ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff mit einem kleinen Loch in der Kappe, um die Schwanzvenen von UUO-Mäusen zu isolieren.
- Für die Fluoreszenzmikroskopie bereiten Sie eine optimale Schnitttemperatur (OCT), einen Kryostaten, flüssigen Stickstoff, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1,0-ml-Spritzen mit einer 27-G-Nadel und silanbeschichtetes Glas vor.
HINWEIS: Fluorescein-markiertes Lotus-tetragonolobus-Lektin (ein proximaler Tubulusmarker) und 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) können für die optionale Färbung von proximalen Tubuli und Zellkernen hergestellt werden.
- Lösen Sie 2 μl PEI-NPs in 98 μl 10%iger Glukoselösung in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Wirbeln Sie dann das Rohr vorsichtig und drehen Sie es nach unten.
- 100 μl Cy3-markierte miRNA-Nachahmung zu 100 μl PEI-NPs in 10%iger Glukoselösung (hergestellt in Schritt 2.2) zugeben. Wirbeln Sie dann das Rohr vorsichtig und drehen Sie es nach unten.
- Die Mischung wird für 15 min bei RT inkubiert, um einen stabilen Komplex aus PEI-NPs-Cy3-markierten-miRNA-Mimic herzustellen.
- Legen Sie die UUO-Maus ohne Betäubung kopfüber in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und stecken Sie den Schwanz dann durch das vorbereitete Loch in der Kappe.
- Füllen Sie eine 1,0-ml-Spritze mit einer 27-g-Nadel mit 200 μl PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic-Komplex.
- Injizieren Sie PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) über die Schwanzvene der Maus mit der 1,0 mL Spritze mit 27 G Nadel.
Anmerkungen: Wischen Sie die Schwanzvene mit Watte ab, die mit Ethanol (70%-80%) gesättigt ist, um die Schwanzvene zu erweitern und den Injektionsbereich zu desinfizieren. - Eine Stunde nach der Injektion von 200 μl PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic-Komplex wird die Maus mit Isofluran (4%-5%) unter Verwendung eines für Kleintiere geeigneten Anästhetikums anästhesiert. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie ohne Zehenquetschreflex. Halten Sie die Anästhesie mit Isofluran (3%) während der gesamten Operation aufrecht.
- Machen Sie als Nächstes mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette einen Schnitt in Haut, Muskeln und Rippen, um das Herz freizulegen. Nachdem Sie einen Schnitt in den rechten Vorhof gemacht haben, injizieren Sie PBS in die linke Herzkammer, um Blut durch den Körper zu ziehen, bis sich die Nierenfarbe in blassgelb ändert (was darauf hinweist, dass der gesamte Mauskörper mit PBS durchblutet ist).
Anmerkungen: Die kardiale Perfusion wird durchgeführt, um das Blut im ganzen Körper effizient zu entfernen. - Stoppen Sie Isofluran und entfernen Sie die Nieren von den Mäusen und waschen Sie sie mit PBS. Entfernen Sie danach Nierenkapseln aus den Nieren und waschen Sie die Nieren zweimal mit PBS.
- Betten Sie die Nierengewebeproben in OCT-Verbindung ein und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein.
- Verwenden Sie einen Kryostaten, um Schnitte (5 μm dick) vorzubereiten. Montieren Sie die Profile auf silanbeschichtete Glasobjektträger und fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd.
HINWEIS: Nierengewebe kann optional mit Fluorescein-markiertem Lotus-tetragonolobus-Lektin (2 mg/ml) bei RT für 2 h für proximale Tubuli gefärbt werden, gefolgt von DAPI (30 nM in PBS) bei RT für 15 min für Zellkerne. - Waschen Sie die Objektträger vorsichtig zweimal mit PBS.
- Visualisieren Sie die Fluoreszenzfärbung durch Fluoreszenzmikroskopie bei 100- und 400-facher Vergrößerung und geeigneter Bildgebungssoftware.
3. Bestätigung von Target-miRNA-Veränderungen nach Abgabe von miRNA-Mimik an die Niere durch PEI-NP mittels Schwanzveneninjektion
- Führen Sie eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) durch, um die miRNA-Alternationen des Ziels zu bestätigen.
HINWEIS: Weitere Informationen zu qRT-PCR18,19,20 finden Sie im zuvor veröffentlichten Artikel. Das qRT-PCR-System, das zur Generierung der unten angegebenen repräsentativen Ergebnisse verwendet wird, wurde vom Hersteller geändert. Die qRT-PCR sollte in Übereinstimmung mit dem neuesten Protokoll des Herstellers durchgeführt werden.
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Representative Results
Die unten beschriebenen Ziel-miRNAs für Nierenfibrose, diabetische Nephropathie und akute Niereninsuffizienz wurden auf der Grundlage von Microarray-, qRT-PCR- und/oder Datenbankforschung für gentherapeutische Anwendungen ausgewählt. Weitere Einzelheiten finden Sie in den vorangegangenen Veröffentlichungen13,14,15.
Verabreichung und Wirkung von miRNA-146a-5p-Mimik unter Verwendung von PEI-NPs in Nierenfibrose-Mäusen13
Fluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten, dass die Injektion von PEI-NPs in die Schwanzvene die miRNA-Nachahmung in den tubulointerstitiellen Raum abgeben kann. Bei Nierenfibrose-Mäusen, die durch UUO produziert wurden, umfasste dies renale Tubuluszellen, die keine regelmäßige Form in der Niere (Abbildung 2A-Pfeil) und im Glomerulus (Abbildung 2A) haben. Die qRT-PCR-Analyse zeigte, dass die Injektion von PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic eine signifikante Überexpression von miRNA-146a-5p in der Niere induzierte (Abbildung 2B). Darüber hinaus hemmte die Injektion das Fortschreiten der Nierenfibrose in den von UUO produzierten Modellmäusen, wie mit der Sirius-Rotfärbung in vivo geschätzt wurde (Rot zeigt fibrotische Bereiche an). Die Injektion von PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic erfolgte 1 Tag vor, 1 Tag nach und 3 Tage nach der UUO-Behandlung (schätzungsweise 6 Tage nach der UUO-Behandlung) (Abbildung 2C). Die Injektion von PEI-NPs-Kontroll-miRNA zeigte keine präventiven Effekte auf die Nierenfibrose (Abbildung 2B,C). Die Verabreichung von PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic und PEI-NPs-miRNA-control-miRNAs führte nicht zu einer IFN-Antwort, wie z.B. einer erhöhten Expression der 5-Oligoadenylat-Synthase und der Signaltransduktion und des Aktivators der Transkription 1 in Mäusen (Abbildung 2D).
Verabreichung und Wirkung von miRNA-181b-5p-Mimik unter Verwendung von PEI-NPs in Modellmäusen mit diabetischer Nierenerkrankung14
Um das therapeutische Potenzial von miRNA-181b-5p bei diabetischer Nierenerkrankung zu bewerten, injizierten wir 10 Wochen lang wöchentlich miRNA-181b-5p-PIE-NPs oder KontrollmiRNA-PIE-NPs in 10 Wochen alte db/db-Mäuse. Fluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten, dass die Schwanzveneninjektion von PEI-NPs miRNA-Mimik in den Glomerulus und den tubulointerstitiellen Raum in Nieren von diabetischen Nierenmodellmäusen (db/db) in vivo abgeben konnte (Abbildung 3A). Darüber hinaus zeigte die qRT-PCR-Analyse, dass die Injektion von PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic eine signifikante Überexpression von miRNA-181b-5p in der Niere induzierte (Abbildung 3B). Die histologische Analyse mit periodischer Säure-Schiff-Färbung zeigte, dass die Injektion von PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic einmal pro Woche im Alter von 10-20 Wochen das Fortschreiten der diabetischen Nierenerkrankung bei db/db-Mäusen in vivo hemmte (Abbildung 3C). Im Gegensatz dazu zeigte die Injektion von PEI-NPs-Kontroll-miRNA keine präventiven Effekte auf die Nierenfibrose (Abbildung 3B,C).
Verabreichung und Wirkung von PEI-NPs-miRNA-5100-mimic in Modellmäusen mit akutem Nierenversagen, die mit IRI 15 hergestellt wurden
Fluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten, dass die Schwanzveneninjektion von PEI-NPs miRNA-Mimik in den Glomerulus und den tubulointerstitiellen Raum von Nieren von AKI-Modellmäusen in vivo abgeben kann (Abbildung 4A). Die qRT-PCR-Analyse zeigte, dass die Injektion von PEI-NPs-miRNA-5100-5p-mimic eine signifikante Überexpression von miRNA-5100 in Nieren von AKI-Mäusen induzierte, die durch IRI produziert wurden (Abbildung 3B). Die histologische Analyse mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigte, dass eine einzige Injektion von PEI-NPs-miRNA-5100 die tubuläre Zellapoptose reduzierte (schwarzer Pfeil), was die Entwicklung von AKI in dem von IRI hergestellten AKI-Mäusemodell verhinderte. PEI-NPs-miRNA-5100-mimic wurde 2 Tage vor dem IRI-Verfahren über die Schwanzvene injiziert (Abbildung 4B). Die Injektion von PEI-NPs-Kontroll-miRNA zeigte keine präventiven Effekte auf die Nierenfibrose (Abbildung 4B,C).
Abbildung 1: Struktur des PEI-NPs-miRNA-mimic-Komplexes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Verabreichung und Wirkung von PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic in Nierenfibrose-Mäusen . (A) Fluoreszenzmikroskopische Analyse. Maßstabsbalken = 200 μm. (B) qRT-PCR-Analyse der miRNA-146a-5p-Expressionsniveaus in jeder Gruppe (n = 6 pro Gruppe). (C) Histologische Analyse mit Sirius-Rotfärbung (rot zeigt die fibrotische Fläche an, Maßstabsbalken = 100 μm). Die Injektion von PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic 1 Tag vor, 1 Tag nach und 3 Tage nach der UUO-Behandlung hemmte die Entwicklung einer Nierenfibrose bei Mäusen in vivo. (D) qRT-PCR-Analyse der Niere zur Untersuchung möglicher IFN-Antworteffekte auf PEI-NPs-miRNA-146a-5p in UUO-Mäusen (n = 6 pro Gruppe). Abkürzungen: DAPI, 4,6-Diamidino-2-phenylindol; FITC, Fluorescein-Isothiocyanat; qRT-PCR, quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion; NS, nicht signifikant; PEI-NPs, Polyethylenimin-Nanopartikel; miRNA, microRNA; UUO, einseitige Harnleiterobstruktion; OAS1,5′-Oligoadenylat-Synthase; STAT1, Signaltransduktion und Aktivator der Transkription 1. Die Werte stellen Mittelwert ± Standardfehler (Fehlerbalken) dar. *P < 0,05. Morishita et al. (International Journal of Nanomedicine, 2015, 10: 3475-3488. Ursprünglich veröffentlicht von und verwendet mit Genehmigung von Dove Medical Press Ltd). 13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Verabreichung und Wirkung von PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic in Modellmäusen für diabetische Nierenerkrankungen14. (A) Fluoreszenzmikroskopische Analyse. Maßstabsbalken = 200 μm. (B) qRT-PCR-Analyse zur Bewertung von Überexpressionseffekten von miRNA-181b-5p nach Injektion von PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic (n = 3 pro Gruppe). (C) Phänotypische Veränderungen wurden lichtmikroskopisch beobachtet. Die Injektion von PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic einmal pro Woche im Alter von 12-20 Wochen hemmte das Fortschreiten der diabetischen Nierenerkrankung in db/db-Mäusen in vivo. Maßstabsbalken = 50 μm. Wir verwendeten eine Varianzanalyse (ANOVA) für Mehrfachvergleichsanalysen zwischen Gruppen. Wenn wir eine statistische Signifikanz durch die ANOVA feststellen konnten, führten wir den türkischen Test durch, um die Mittelwerte zweier Gruppen als Post-hoc-Analyse zu vergleichen. Abkürzungen: PEI-NPs, Polyethylenimin-Nanopartikel; qRT-PCR, quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion; miRNA, microRNA. *P < 0,05. Diese Abbildung wurde von Ishii et al. 14. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Verabreichung und Wirkung von PEI-NPs-miRNA-5100-mimic in Modellmäusen mit akutem Nierenversagen, die mit IRI hergestellt wurden . (A) Fluoreszenzmikroskopische Analyse. Maßstabsbalken = 100 μm. (B) qRT-PCR-Analyse zur Bewertung der Überexpressionseffekte von miRNA-5100 nach Injektion von PEI-NPs-miRNA-5100-mimic. (C) Histologische Analyse einer Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Niere. Maßstabsleiste = 100 μm. PEI-NPs, die 2 Tage vor dem IRI-Verfahren über die Schwanzvene injiziert werden, verhindern eine durch IRI induzierte AKI-Progression. Abkürzungen: PEI-NPs, Polyethylenimin-Nanopartikel; qRT-PCR, quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion; miRNA, microRNA; AKI, akutes Nierenversagen; IRI, Ischämie-Reperfusions-Schädigung. **P < 0,01,*P < 0,05. Diese Abbildung wurde von Aomatsu et al.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Mit Hilfe des in diesem Manuskript vorgestellten Protokolls können PEI-NPs miRNA-Nachahmungen an die Niere abgeben, um eine Überexpression von Ziel-miRNAs zu induzieren, was zu Behandlungseffekten in In-vivo-Mausmodellen verschiedener Nierenerkrankungen führt, darunter Nierenfibrose, diabetische Nierenerkrankung und AKI.
Die Methode zur Herstellung des Komplexes aus PEI-NPs und miRNA-Mimik ist sehr einfach. Die positiv geladene Oberfläche von PEI-NPs fängt die miRNA-Nachahmung ein, wenn sie nur gemischt werden 13,14,15,16,17 (Abbildung 1). Darüber hinaus vermeiden PEI-NPs als linearer nichtviraler Vektor auf Polyethylenimin-Basis Probleme, die mit der Verwendung viraler Vektoren verbunden sind, wie z. B. IFN-Antwort und Onkogenese, die durch genetische Instabilität induziert werden11,15,16.
Die Injektion von PEI-NPs-mimic über die Schwanzvene kann ein Training erfordern, da die Schwanzvenen von Mäusen mit Nierenerkrankungen aufgrund von Dehydratation manchmal schwer zu punktieren sind, insbesondere bei AKI- und adipösen db/db-Mäusen. Zusätzlich kann eine wiederholte Injektion von PEI-NPs-miRNA-mimic für mehrere Mäusemodelle erforderlich sein. Die Injektionsintervalle sollten anhand der Vorerfahrungen bestimmt werden, wie die Überexpression durch PEI-NPs-miRNA-mimic im Kontext des jeweiligen Mausmodells für Nierenerkrankungen auftritt.
Virale Vektoren werden häufig für die Transfektion von miRNA-Nachahmungen in Nieren verwendet und können zu einer signifikanten Transfektion von miRNAs führen 9,10. Virale Vektoren haben jedoch potenzielle Probleme, wie z. B. die Verursachung einer Interferonantwort und/oder genetischer Instabilität11,12. Daher wurden mehrere alternative Verabreichungsmethoden unter Verwendung nichtviraler Vektoren, wie z. B. Gelatine-NPs 21,22, Elektroporation 23, hydrodynamische Injektion 24,25 und Transfektion mit Ultraschall 26, entwickelt. In diesem Manuskript stellten wir PEI-NPs als nicht-viralen Vektor für die Niere vor. Einige nichtvirale Vektoren sind hochinvasiv (Elektroporation und hydrodynamische Injektion) und können daher für den klinischen Einsatz schwierig zu applizieren sein. Ein Vergleich von PEI-NPs mit anderen nichtviralen Vektoren, wie z.B. lipidbasierten Nanopartikeln und Gelatine-NPs, sollte jedoch in weiteren Studien evaluiert werden.
Für dieses Protokoll gelten die folgenden Einschränkungen. Erstens: Obwohl PEI-NPs-miRNAs für Mausmodelle geeignet sind (zumindest in der ersten Stufe), werden große Mengen an PEI-NPs-miRNAs für große Tiermodelle (wie Ratten, Kaninchen, Affen und Hunde) benötigt, die für die präklinische Forschung verwendet werden. Darüber hinaus sollte beachtet werden, dass PEI-NPs miRNA-Nachahmungen nicht spezifisch an die Niere abgeben, da PEI-NPs, wie virale Vektoren, kein gezieltes Verabreichungssystem sind. Daher muss möglicherweise der Phänotyp anderer Organe untersucht werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI unterstützt (Förderkennzeichen 21K08233). Wir danken Edanz (https://jp.edanz.com/ac) für die Bearbeitung der Entwürfe dieses Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
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- Bushati, N., Cohen, S. M.
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