Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

توصيل miRNA الخارجي المركب صناعيا إلى الكلى باستخدام جسيمات البولي إيثيلينيمين النانوية في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63302
Automatic Translation
*1, 1, 1, 1, *1
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، نقدم محاكاة miRNA الخارجية المركبة صناعيا إلى الكلى عن طريق حقن الوريد الخلفي لناقل غير فيروسي وجسيمات نانوية بولي إيثيلينيمين في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى. أدى ذلك إلى إفراط كبير في التعبير عن miRNA المستهدف في الكلى ، مما أدى إلى تثبيط تطور مرض الكلى في العديد من نماذج الفئران.

Abstract

الحمض النووي الريبي الصغير (miRNAs) ، الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (21-25 قاعدة) التي لا تترجم إلى بروتينات ، تمنع الكثير من الحمض النووي الريبي المرسال المستهدف (mRNAs) عن طريق زعزعة استقرار وتثبيط ترجمتها في أمراض الكلى المختلفة. لذلك ، فإن تناوب تعبير miRNA عن طريق محاكاة miRNA الخارجية المركبة صناعيا هو خيار علاجي مفيد محتمل لتثبيط تطور العديد من أمراض الكلى. ومع ذلك ، نظرا لأن الحمض النووي الريبي في المصل يتحلل على الفور من محاكاة miRNA الخارجية التي يتم تناولها بشكل منهجي في الجسم الحي ، فإن توصيل miRNA إلى الكلى لا يزال يمثل تحديا. لذلك ، فإن النواقل التي يمكن أن تحمي محاكاة miRNA الخارجية من التدهور بواسطة RNAase وتوصيلها بشكل كبير إلى الكلى ضرورية. استخدمت العديد من الدراسات النواقل الفيروسية لتوصيل محاكيات أو مثبطات miRNA الخارجية إلى الكلى. ومع ذلك ، قد تسبب النواقل الفيروسية استجابة للإنترفيرون و / أو عدم الاستقرار الجيني. لذلك ، فإن تطوير النواقل الفيروسية هو أيضا عقبة أمام الاستخدام السريري لمحاكاة أو مثبطات miRNA الخارجية. للتغلب على هذه المخاوف المتعلقة بالنواقل الفيروسية ، قمنا بتطوير طريقة ناقل غير فيروسي لتوصيل محاكاة miRNA إلى الكلى باستخدام حقن الوريد الذيلي لجسيمات البولي إيثيلين النانوية (PEI-NPs) ، مما أدى إلى إفراط كبير في التعبير عن miRNAs المستهدفة في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى.

Introduction

miRNAs ، الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (21-25 قاعدة) التي لا تترجم إلى بروتينات ، تمنع الكثير من الحمض النووي الريبي المرسال المستهدف (mRNAs) عن طريق زعزعة استقرارها وتثبيط ترجمتها في أمراض الكلى المختلفة 1,2. لذلك ، فإن العلاج الجيني الذي يستخدم مقلدات أو مثبطات miRNA الخارجية المركبة صناعيا هو خيار جديد محتمل لتثبيط تطور العديد من أمراض الكلى3،4،5.

على الرغم من الوعد بمحاكاة أو مثبطات miRNA للعلاج الجيني ، إلا أن توصيله إلى الأعضاء المستهدفة لا يزال يمثل عقبة كبيرة أمام التجارب في الجسم الحي لتطوير إمكاناتها السريرية. نظرا لأن محاكيات أو مثبطات miRNA المركبة صناعيا تخضع للتدهور الفوري بواسطة مصل RNase ، يتم تقصير عمر النصف عند الإدارة الجهازية في الجسم الحي6. بالإضافة إلى ذلك ، فإن كفاءة miRNA تحاكي أو مثبطات عبور غشاء البلازما والسيتوبلازم المنقول بشكل عام أقل بكثير بدون ناقلات مناسبة 7,8. تشير خطوط الأدلة هذه إلى أن تطوير نظام توصيل miRNA يحاكي أو مثبطات الكلى مطلوب ، لتمكين استخدامها في الإعدادات السريرية وجعلها خيارا علاجيا جديدا للمرضى الذين يعانون من أمراض الكلى المختلفة.

تم استخدام النواقل الفيروسية كناقلات لتوصيل محاكيات miRNA الخارجية أو مثبطات إلى الكلى 9,10. على الرغم من أنها قد تم تطويرها من أجل السلامة الأحيائية وفعالية النقل ، إلا أن النواقل الفيروسية قد تسبب استجابة للإنترفيرون و / أو عدم الاستقرار الجيني11,12. للتغلب على هذه المخاوف ، قمنا بتطوير miRNA يحاكي نظام توصيل الكلى باستخدام جسيمات البولي إيثيلين النانوية (PEI-NPs) ، وهو ناقل غير فيروسي ، في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى13،14،15.

PEI-NPs هي NPs خطية قائمة على البوليمر يمكنها توصيل قليل النيوكليوتيدات بشكل فعال ، بما في ذلك محاكاة miRNA ، إلى الكلى ، وتعتبر مفضلة لإعداد النواقل غير الفيروسية بسبب سلامتها على المدى الطويل وتوافقها الحيوي13،16،17.

توضح هذه الدراسة آثار محاكاة miRNA الخارجية المنهجية للتوصيل باستخدام PEI-NPs عن طريق حقن الوريد الذيل في الفئران النموذجية للتليف الكلوي التي ينتجها انسداد الحالب أحادي الجانب (UUO). بالإضافة إلى ذلك ، نوضح آثار محاكاة miRNA الخارجية المنهجية للتوصيل باستخدام PEI-NPs عبر حقن الوريد الذيل في الفئران النموذجية لمرض الكلى السكري (الفئران db / db: C57BLBS / J Iar - + Leprdb / + Leprdb) والفئران النموذجية لإصابة الكلى الحادة التي تنتجها إصابة نقص التروية الكلوية (IRI).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة جيتشي الطبية وتم إجراؤها وفقا لإرشادات استخدام ورعاية التجارب من دليل جامعة جيتشي الطبية لحيوانات المختبر. هنا ، أظهرنا أن miRNA يحاكي التوصيل إلى الكلى مما أدى إلى الإفراط في التعبير باستخدام الفئران UUO. تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة جيتشي الطبية [الموافقة رقم 19-12 للتليف الكلوي ، 17-024 لعدوى الكلى الحادة (AKI) ، و 19-11 لاعتلال الكلية السكري].

1. إعداد مركب تقليد PEI-NPs-miRNA

ملاحظة: هنا ، يتم وصف تحضير PEI-NPs-miRNA-mimic13،14،15 و PEI-NPs-control-miRNA (كعنصر تحكم سلبي) لفأر واحد.

  1. قم بإعداد العناصر التالية:
    1. تحضير 10 ميكرولتر من PEI-NPs الخطية.
    2. تحضير 50 ميكرولتر من miRNAs المركبة صناعيا المذابة في الماء الخالي من النيوكلياز بتركيز 100 ميكرومتر (5 نانومول miRNA مذاب في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز).
    3. تحضير 50 ميكرولتر من الرنا المصهر المركب صناعيا (غير المستهدف) المذاب في الماء الخالي من النيوكلياز بتركيز 100 ميكرومتر (5 نانومول miRNA مذاب في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز).
    4. تحضير 5 ٪ و 10 ٪ حلول الجلوكوز. تأكد من توفر أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وخلاط دوامة.
  2. قم بإذابة 10 ميكرولتر من PEI-NPs في 90 ميكرولتر من محلول الجلوكوز 5٪ في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. ثم ، دوامة الأنبوب بلطف وتدور لأسفل.
  3. امزج 50 ميكرولتر من miRNAs المركبة صناعيا (5 نانومول) المذابة في ماء خال من النيوكلياز (تركيز 100 ميكرومتر) مع 50 ميكرومتر من محلول الجلوكوز 10٪ في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. ثم ، دوامة الأنبوب بلطف وتدور لأسفل. هذه العملية تنتج miRNA المذاب في محلول الجلوكوز 5 ٪.
  4. امزج 100 ميكرولتر من PEI-NPs في محلول جلوكوز 5٪ و 100 ميكرولتر من miRNA مقلد (5 نانومول) في محلول جلوكوز 5٪. ثم ، دوامة الأنبوب بلطف وتدور لأسفل.
  5. احتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لإعداد مركب مستقر من محاكاة PEI-NPs-miRNA. يحتوي هذا المحلول على PEI-NPs وتقليد miRNA (5 نانومول) بنسبة النيتروجين (N) في البوليمر إلى الفوسفات (P) في الأحماض النووية (نسبة N / P) = 6 (الشكل 1).
    ملاحظة: يمكن تحضير مركب PEI-NPs-control-miRNA باستخدام نفس العملية الموضحة في الخطوات 1.1-1.5 لجميع نماذج الفئران المصابة بأمراض الكلى الموصوفة في هذه المخطوطة (UUO ، اعتلال الكلية السكري ، و AKI). حجم حقن واحد من محاكاة PEI-NP-miRNAs هو نفسه 5 نانومول من تقليد miRNAs المترافق مع PEI-NPs عند نسبة N / P = 6. تعتمد مدة الحقن وتواتر كل محاكاة ل PEI-NP-miRNAs على نموذج المرض الذي يتم تطبيقه فيه.

2. تأكيد التسليم الكبير لمحاكاة miRNA إلى الكلى في الفئران UUO بواسطة PEI-NP عن طريق حقن الوريد الذيل باستخدام المجهر الفلوري

ملاحظة: هنا ، يتم وضع طريقة توصيل miRNA المنقى صناعيا إلى الكلى ، مما يشير إلى إنشاء طرق علاجية لأمراض الكلى المختلفة. باختصار ، تم إعطاء الفئران UUO حمض الكربوكسيل السيانين 3 (Cy3) المسمى miRNA مقلد يضاف إلى 100 ميكرولتر من PEI-NPs عبر الوريد الذيل. تم تأكيد التسليم إلى الكلى باستخدام الفحص المجهري الفلوري. تم وصف حمض الكربوكسيل PEI-NPs-cyanine3 (Cy3) المسمى miRNA (قليل النيوكليوتيدات) لفأر واحد. يمكن لهذه الطريقة توصيل تقليد miRNA بشكل كبير إلى الكلى في العديد من نماذج الفئران ، مثل الفئران UUO ، والفئران المصابة بأمراض الكلى السكرية ، وفئران AKI التي تنتجها IRI. هنا ، استخدمنا نموذج ماوس UUO لعرض الفيديو. تم وصف طريقة تحريض UUO سابقا في مكان آخر13. اتبع هذه البروتوكولات في غضون ستة أيام بعد جراحة UUO.

  1. قم بإعداد العناصر التالية:
    1. تحضير 2 ميكرولتر من PEI-NPs و 100 ميكرولتر من قليل النيوكليوتيدات مزدوجة الخيوط المسمى Cy3 [تقليد miRNA المسمى Cy3 (1 نانومول ؛ 10 ميكرومتر)].
    2. تحضير 5 ٪ و 10 ٪ حلول الجلوكوز. تأكد من توفر أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وخلاط دوامة.
    3. استخدم أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 50 مل مع وجود ثقب صغير في الغطاء لعزل أوردة الذيل لفئران UUO.
    4. بالنسبة للفحص المجهري الفلوري ، قم بإعداد مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، و cryostat ، والنيتروجين السائل ، والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، ومحاقن 1.0 مل بإبرة 27 جم ، والزجاج المطلي بالسيلان.
      ملاحظة: يمكن تحضير Lotus tetragonolobus lectin المسمى بالفلورسين (علامة النبيبات القريبة) و 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) للتلطيخ الاختياري للأنابيب القريبة ونوى الخلية.
  2. قم بإذابة 2 ميكرولتر من PEI-NPs في 98 ميكرولتر من محلول الجلوكوز 10٪ في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. ثم ، دوامة الأنبوب بلطف وتدور لأسفل.
  3. أضف 100 ميكرولتر من محاكاة miRNA المسمى Cy3 إلى 100 ميكرولتر من PEI-NPs في محلول جلوكوز 10٪ (محضر في الخطوة 2.2). ثم ، دوامة الأنبوب بلطف وتدور لأسفل.
  4. احتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في RT لإعداد مركب مستقر من PEI-NPs-Cy3-المسمى miRNA-miRNA-mimic.
  5. ضع رأس ماوس UUO أولا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل بدون تخدير ، ثم ضع الذيل من خلال الفتحة المعدة في الغطاء.
  6. املأ حقنة سعة 1.0 مل بإبرة 27 جم مع 200 ميكرولتر من مركب تقليد PEI-NPs-Cy3-miRNA.
  7. حقن PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 ميكرولتر) عبر الوريد الخلفي للفأر باستخدام حقنة 1.0 مل مع إبرة 27 جرام.
    ملاحظة: امسح وريد الذيل بصوف قطني مشبع بالإيثانول (70٪ -80٪) لتوسيع وريد الذيل وتطهير منطقة الحقن.
  8. بعد ساعة واحدة من 200 ميكرولتر من الحقن المركب PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic ، قم بتخدير الماوس باستخدام الأيزوفلوران (4٪ -5٪) باستخدام جهاز مخدر مناسب للحيوانات الصغيرة. تأكيد عمق التخدير مع عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم. الحفاظ على التخدير مع إيزوفلوران (3 ٪) طوال الجراحة.
  9. بعد ذلك ، قم بعمل شق في الجلد والعضلات والأضلاع بالمقص الجراحي والملقط لكشف القلب. بعد إجراء شق في الأذين الأيمن ، قم بحقن PBS في البطين الأيسر لسحب الدم في جميع أنحاء الجسم حتى يتغير لون الكلى إلى اللون الأصفر الباهت (مما يشير إلى أن جسم الفأر بالكامل يتخلل مع برنامج تلفزيوني).
    ملاحظة: يتم إجراء التروية القلبية لإزالة الدم بكفاءة في جميع أنحاء الجسم .
  10. وقف isoflurane وإزالة الكلى من الفئران وغسلها مع برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، قم بإزالة الكبسولات الكلوية من الكلى وغسل الكلى مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني.
  11. قم بتضمين عينات أنسجة الكلى في مركب OCT وقم بتجميدها في النيتروجين السائل.
  12. استخدم جهاز التبريد لتحضير المقاطع (بسمك 5 ميكرومتر). قم بتركيب الأقسام على شرائح زجاجية مطلية بالسيلان وقم بتثبيتها بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد.
    ملاحظة: يمكن اختياريا تلطيخ أنسجة الكلى باستخدام Lotus tetragonolobus lectin المسمى بالفلوريسئين (2 مجم / مل) عند RT لمدة 2 ساعة للأنابيب القريبة ، يليه DAPI (30 نانومتر في PBS) في RT لمدة 15 دقيقة لنوى الخلية.
  13. اغسل الشرائح برفق مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني.
  14. تصور تلطيخ التألق بواسطة المجهر الفلوري عند تكبير 100x و 400x وبرنامج التصوير المناسب.

3. تأكيد تغيرات miRNA المستهدفة بعد تسليم تقليد miRNA إلى الكلى بواسطة PEI-NP عن طريق حقن الوريد الذيل

  1. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) لتأكيد تناوب miRNA المستهدف.
    ملاحظة: راجع المقالة المنشورة مسبقا للحصول على تفاصيل qRT-PCR18،19،20. تم تغيير نظام qRT-PCR المستخدم لإنشاء النتائج التمثيلية الواردة أدناه من قبل الشركة المصنعة. يجب إجراء qRT-PCR وفقا لأحدث بروتوكول للشركة المصنعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم اختيار miRNAs المستهدفة للتليف الكلوي واعتلال الكلية السكري و AKI الموصوفة أدناه بناء على المصفوفة الدقيقة و qRT-PCR و / أو أبحاث قاعدة البيانات لتطبيقات العلاج الجيني. لمزيد من التفاصيل ، راجع المنشورات السابقة13،14،15.

توصيل وتأثيرات miRNA-146a-5p-mimic باستخدام PEI-NPs في فئران التليف الكلوي13
أظهر التحليل المجهري الفلوري أن حقن الوريد الذيلي ل PEI-NPs يمكن أن ينقل محاكاة miRNA إلى الفضاء الخلالي الأنبوبي. في فئران التليف الكلوي التي تنتجها UUO ، شمل ذلك الخلايا الأنبوبية الكلوية ، التي ليس لها شكل منتظم في الكلى (سهم الشكل 2A) ، والكبيبة (الشكل 2A). أظهر تحليل qRT-PCR أن حقن PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic تسبب في فرط تعبير كبير عن miRNA-146a-5p في الكلى (الشكل 2B). علاوة على ذلك ، منع الحقن تطور التليف الكلوي في الفئران النموذجية التي تنتجها UUO ، كما هو مقدر مع تلطيخ سيريوس الأحمر (يشير اللون الأحمر إلى المناطق الليفية) في الجسم الحي. تم إجراء حقن PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic قبل يوم واحد ، وبعد يوم واحد ، وبعد 3 أيام من العلاج UUO (يقدر بعد 6 أيام من علاج UUO) (الشكل 2C). لم يظهر حقن الحمض النووي الريبوزي المرسال المضاد ل PEI-NPs آثارا وقائية على التليف الكلوي (الشكل 2B ، C). لم يتسبب إعطاء PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic و PEI-NPs-miRNA-control-miRNAs في استجابة IFN ، مثل زيادة التعبير عن سينسيز 5-oligoadenylate ونقل الإشارة ومنشط النسخ 1 في الفئران (الشكل 2D).

توصيل وتأثيرات miRNA-181b-5p-mimic باستخدام PEI-NPs في الفئران النموذجية لمرض الكلى السكري14
لتقييم الإمكانات العلاجية ل miRNA-181b-5p لمرض الكلى السكري ، قمنا بحقن miRNA-181b-5p-PIE-NPs أو التحكم في miRNA-PIE-NPs في الفئران db / db البالغة من العمر 10 أسابيع أسبوعيا لمدة 10 أسابيع. أظهر التحليل المجهري الفلوري أن حقن الوريد الذيل ل PEI-NPs يمكن أن ينقل miRNA مقلدا إلى الكبيبة والفضاء الخلالي الأنبوبي في كلى الفئران نموذج الكلى السكري (db / db) في الجسم الحي (الشكل 3A). بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تحليل qRT-PCR أن حقن PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic تسبب في إفراط كبير في التعبير عن miRNA-181b-5p في الكلى (الشكل 3B). أظهر التحليل النسيجي مع تلطيخ حمض شيف الدوري أن حقن PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic مرة واحدة في الأسبوع من 10-20 أسبوعا من العمر يثبط تطور مرض الكلى السكري في الفئران ديسيبل / ديسيبل في الجسم الحي (الشكل 3C). في المقابل ، لم يسفر حقن الحمض النووي الريبي المرسال المضاد ل PEI-NPs عن تأثيرات وقائية على التليف الكلوي (الشكل 3B ، C).

تسليم وآثار PEI-NPs-miRNA-5100-تقليد في الفئران النموذجية لإصابة الكلى الحادة التي تنتجها IRI15
أظهر تحليل الفحص المجهري الفلوري أن حقن الوريد الذيلي ل PEI-NPs يمكن أن ينقل محاكاة miRNA إلى الكبيبة والفضاء الأنبوبي الخلالي لكلى الفئران النموذجية AKI في الجسم الحي (الشكل 4A). أظهر تحليل qRT-PCR أن حقن PEI-NPs-miRNA-5100-5p-mimic تسبب في فرط كبير في التعبير عن miRNA-5100 في كلى فئران AKI التي تنتجها IRI (الشكل 3B). أظهر التحليل النسيجي مع تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين أن حقنة واحدة من PEI-NPs-miRNA-5100 قللت من موت الخلايا المبرمج الأنبوبي (السهم الأسود) ، مما منع تطور AKI في نموذج الفئران AKI الذي أنتجته IRI. تم حقن PEI-NPs-miRNA-5100-mimic عبر الوريد الذيل قبل يومين من إجراء IRI (الشكل 4B). لم يظهر حقن PEI-NPs - التحكم في miRNA - تأثيرات وقائية على التليف الكلوي (الشكل 4B ، C).

Figure 1
الشكل 1: هيكل مركب محاكاة PEI-NPs-miRNA. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: توصيل وتأثيرات محاكاة PEI-NPs-miRNA-146a-5p-في فئران التليف الكلوي . (أ) التحليل المجهري الفلوري. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (B) تحليل qRT-PCR لمستويات تعبير miRNA-146a-5p في كل مجموعة (n = 6 لكل مجموعة). (ج) التحليل النسيجي مع تلطيخ سيريوس الأحمر (يشير اللون الأحمر إلى المنطقة الليفية ، شريط المقياس = 100 ميكرومتر). حقن PEI-NPs-miRNA-146a-5p-تقليد 1 يوم قبل ، 1 يوم بعد ، و 3 أيام بعد العلاج UUO تثبيط تطور التليف الكلوي في الفئران في الجسم الحي. (د) تحليل qRT-PCR للكلى للتحقيق في تأثيرات استجابة IFN المحتملة ل PEI-NPs-miRNA-146a-5p في الفئران UUO (n = 6 لكل مجموعة). الاختصارات: DAPI ، 4،6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ FITC ، فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ qRT-PCR ، تفاعل البلمرة الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي ؛ NS ، ليست كبيرة ؛ PEI-NPs ، جسيمات البولي إيثيلين النانوية ؛ ميرنا ، ميكرورنا. UUO ، انسداد الحالب من جانب واحد ؛ OAS1 ، 5 ′-أوليغوأدينيلات سينسيز ؛ STAT1 ، نقل الإشارة ومنشط النسخ 1. تمثل القيم متوسط ± الخطأ القياسي (أشرطة الخطأ). *P < 0.05. موريشيتا وآخرون (المجلة الدولية للطب النانوي 2015 10 3475-3488. نشرت في الأصل واستخدمت بإذن من Dove Medical Press Ltd). 13. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توصيل وتأثيرات محاكاة PEI-NPs-miRNA-181b-5p-في الفئران النموذجية لمرض الكلىالسكري 14. أ: التحليل المجهري الفلوري. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (B) تحليل qRT-PCR لتقييم آثار التعبير المفرط ل miRNA-181b-5p بعد حقن PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic (n = 3 لكل مجموعة). (ج) لوحظت تغيرات في النمط الظاهري بواسطة المجهر الضوئي. حقن PEI-NPs-miRNA-181b-5p-تقليد مرة واحدة في الأسبوع من 12-20 أسبوعا من العمر يمنع تطور مرض الكلى السكري في الفئران ديسيبل / ديسيبل في الجسم الحي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. استخدمنا تحليل التباين (ANOVA) لاختبار تحليل المقارنة المتعددة بين المجموعات. إذا اكتشفنا دلالة إحصائية من قبل ANOVA ، فقد أجرينا اختبار تركيا لمقارنة وسائل مجموعتين كتحليل لاحق. الاختصارات: PEI-NPs ، جسيمات البولي إيثيلينيمين النانوية ؛ qRT-PCR ، تفاعل البلمرة الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي ؛ miRNA ، microRNA. *P < 0.05. تم تعديل هذا الرقم من Ishii et al. 14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توصيل وتأثيرات محاكاة PEI-NPs-miRNA-5100 في الفئران النموذجية لإصابة الكلى الحادة التي ينتجها IRI . (أ) التحليل المجهري الفلوري. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (B) تحليل qRT-PCR لتقييم تأثيرات التعبير الزائد ل miRNA-5100 بعد حقن PEI-NPs-miRNA-5100-mimic. ج: التحليل النسيجي للكلية المصبوغة بالهيماتوكسيلين-يوزين. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. PEI-NPs التي يتم حقنها عبر الوريد الذيل قبل 2 أيام من إجراء IRI تمنع تقدم AKI الناجم عن IRI. الاختصارات: PEI-NPs ، جسيمات البولي إيثيلينيمين النانوية ؛ qRT-PCR ، تفاعل البلمرة الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي ؛ ميرنا ، ميكرورنا. AKI ، إصابة الكلى الحادة. IRI ، إصابة نقص التروية. ** P < 0.01 ، * P < 0.05. تم تعديل هذا الرقم من Aomatsu et al.15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

باستخدام البروتوكول المقدم في هذه المخطوطة ، يمكن ل PEI-NPs توصيل محاكاة miRNA إلى الكلى للحث على الإفراط في التعبير عن miRNAs المستهدفة ، مما يؤدي إلى تأثيرات علاجية في نماذج الفئران في الجسم الحي للعديد من أمراض الكلى ، بما في ذلك التليف الكلوي ومرض الكلى السكري و AKI.

طريقة تحضير مجمع PEI-NPs وتقليد miRNA بسيطة للغاية. يحبس السطح الموجب الشحنة ل PEI-NPs محاكاة miRNA عندما يتم خلطها فقط13،14،15،16،17 (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، كناقل خطي غير فيروسي قائم على البولي إيثيلين ، تتجنب PEI-NPs المشكلات المرتبطة باستخدام النواقل الفيروسية ، مثل استجابة IFN وتكوين الأورام الناجم عن عدم الاستقرار الجيني11،15،16.

قد يتطلب حقن PEI-NPs المحاكي عبر الوريد الذيل تدريبا لأن الأوردة الذيل للفئران المصابة بأمراض الكلى يصعب أحيانا ثقبها بسبب الجفاف ، خاصة في AKI والفئران البدينة ديسيبل / ديسيبل. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون هناك حاجة للحقن المتكرر لتقليد PEI-NPs-miRNA للعديد من نماذج الفئران. يجب تحديد فترات الحقن من خلال التجربة المسبقة لكيفية حدوث التعبير المفرط بواسطة محاكاة PEI-NPs-miRNA في سياق كل نموذج فأر لمرض الكلى.

كثيرا ما تستخدم النواقل الفيروسية لنقل محاكاة miRNA في الكلى ويمكن أن تؤدي إلى نقل كبير ل miRNAs 9,10. ومع ذلك ، فإن النواقل الفيروسية لديها مشاكل محتملة مثل التسبب في استجابة الإنترفيرون و / أو عدم الاستقرار الجيني11,12. لذلك ، تم تطوير العديد من طرق التوصيل البديلة باستخدام النواقل غير الفيروسية ، مثل Gelatin-NPs 21,22 ، والتثقيب الكهربائي23 ، والحقن الهيدروديناميكي 24,25 ، والنقل باستخدام الموجات فوق الصوتية 26. في هذه المخطوطة ، قدمنا PEI-NPs كناقل غير فيروسي للكلى. بعض النواقل غير الفيروسية شديدة التوغل (التثقيب الكهربائي والحقن الهيدروديناميكي) ، وبالتالي قد يكون من الصعب تطبيقها للاستخدام السريري. ومع ذلك ، يجب تقييم مقارنة PEI-NPs مع النواقل غير الفيروسية الأخرى ، مثل الجسيمات النانوية القائمة على الدهون والجيلاتين-NPs ، في مزيد من الدراسات.

يحتوي هذا البروتوكول على القيود التالية. أولا ، على الرغم من أن PEI-NPs-miRNAs مناسبة لنماذج الفئران (على الأقل كمرحلة أولى) ، إلا أن كميات كبيرة من PEI-NPs-miRNAs مطلوبة للنماذج الحيوانية الكبيرة (مثل الجرذان والأرانب والقرود والكلاب) المستخدمة في الأبحاث قبل السريرية. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن PEI-NPs لم تقدم تقليد miRNA على وجه التحديد إلى الكلى لأن PEI-NPs ، مثل النواقل الفيروسية ، ليست نظام توصيل مستهدف. لذلك ، قد يلزم فحص النمط الظاهري للأعضاء الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JSPS KAKENHI (المنحة رقم 21K08233). نشكر Edanz (https://jp.edanz.com/ac) على تحرير مسودات هذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus Thermo Fisher Scientific D-1306
Buffer RPE Qiagen 79216 Wash buffer 2
Buffer RWT Qiagen 1067933 Wash buffer 1
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) Thermo Fisher Scientific Not assigned 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense)
5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense)
Cy3-labeled double-strand oligonucleotides Takara Bio Inc. MIR7900
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin Vector Laboratories Inc FL-1321
In vivo-jetPEI Polyplus 101000021
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR Thermo Fisher Scientific 4316813 96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) Thermo Fisher Scientific Not assigned 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU
UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense)
miRNA-146a-5p primer Qiagen MS00001638 Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) Gene design Not assigned 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG
GUU-3’
miRNA-181b-5p primer Qiagen MS00006083 Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) Gene design Not assigned 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primer Qiagen MS00042952 Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube
miScript II RT kit Qiagen 218161 Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miScript SYBR Green PCR kit Qiagen 218073 Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
QIA shredder Qiagen 79654 Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube
QIAzol Lysis Reagent Qiagen 79306 Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4472380 Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. Thermo Fisher Scientific 4472380 Real-time PCR instrument software
RNase-free water Qiagen 129112
RNU6-2 primer Qiagen MS00033740 Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. Not assigned

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
  2. Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
  3. Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy. Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).
  4. Yheskel, M., Patel, V. Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).
  5. Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
  6. Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic. Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).
  7. Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
  8. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
  9. Deng, M., et al. Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).
  10. Zhou, Y., et al. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy. Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).
  11. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).
  12. Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives. Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).
  13. Morishita, Y., et al. Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo. International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).
  14. Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).
  15. Aomatsu, A., et al. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).
  16. Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
  17. Swami, A., et al. A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).
  18. Kaneko, S., et al. Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).
  19. Yanai, K., et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).
  20. Aomatsu, A., et al. A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).
  21. Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).
  22. Xia, Z., et al. Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47. American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).
  23. Tanaka, T., et al. In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).
  24. Hamar, P., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).
  25. Ma, D., et al. Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).
  26. Wei, S., et al. Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).

Tags

الطب ، العدد 183 ، العلاج الجيني ، التسليم ، أمراض الكلى ، الحمض النووي الريبي الدقيق ، ناقل غير فيروسي ، جسيمات نانوية بولي إيثيلينيمين
توصيل miRNA الخارجي المركب صناعيا إلى الكلى باستخدام جسيمات البولي إيثيلينيمين النانوية في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yanai, K., Kaneko, S., Ishii, H.,… More

Yanai, K., Kaneko, S., Ishii, H., Aomatsu, A., Morishita, Y. Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models. J. Vis. Exp. (183), e63302, doi:10.3791/63302 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter