Summary
Qui, forniamo miRNA esogeni sintetizzati artificialmente al rene tramite iniezione di vena della coda di un vettore non virale e nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali. Ciò ha portato a una significativa sovraespressione del miRNA bersaglio nel rene, con conseguente progressione inibita della malattia renale in diversi modelli murini.
Abstract
I microRNA (miRNA), piccoli RNA non codificanti (21-25 basi) che non sono tradotti in proteine, inibiscono molti RNA messaggeri bersaglio (mRNA) destabilizzando e inibendo la loro traduzione in varie malattie renali. Pertanto, l'alternanza dell'espressione di miRNA da parte di miRNA esogeni sintetizzati artificialmente è un'opzione di trattamento potenzialmente utile per inibire lo sviluppo di molte malattie renali. Tuttavia, poiché la RNAasi sierica degrada immediatamente i miRNA esogeni sistematicamente somministrati in vivo, la consegna di miRNA al rene rimane una sfida. Pertanto, sono necessari vettori in grado di proteggere i miRNA esogeni dalla degradazione da parte della RNAasi e consegnarli significativamente al rene. Molti studi hanno utilizzato vettori virali per fornire miRNA esogeni o inibitori al rene. Tuttavia, i vettori virali possono causare una risposta all'interferone e/o instabilità genetica. Pertanto, lo sviluppo di vettori virali è anche un ostacolo per l'uso clinico di miRNA esogeni o inibitori. Per superare queste preoccupazioni riguardanti i vettori virali, abbiamo sviluppato un metodo vettoriale non virale per fornire miRNA imitatori al rene utilizzando l'iniezione di nanoparticelle di polietilenimina (PEI-NP), che ha portato a una significativa sovraespressione dei miRNA bersaglio in diversi modelli murini di malattia renale.
Introduction
I miRNA, piccoli RNA non codificanti (21-25 basi) che non sono tradotti in proteine, inibiscono molti RNA messaggeri bersaglio (mRNA) destabilizzandoli e inibendo la loro traduzione in varie malattie renali 1,2. Pertanto, la terapia genica che impiega miRNA esogeni sintetizzati artificialmente o inibitori è una potenziale nuova opzione per inibire lo sviluppo di molte malattie renali 3,4,5.
Nonostante la promessa di miRNA imitatori o inibitori per la terapia genica, la consegna agli organi bersaglio rimane un grosso ostacolo per gli esperimenti in vivo per sviluppare il loro potenziale clinico. Poiché i miRNA sintetizzati artificialmente o gli inibitori sono soggetti a degradazione immediata da parte della RNasi sierica, la loro emivita è ridotta dopo somministrazione sistemica in vivo6. Inoltre, l'efficienza dei miRNA imitatori o inibitori di attraversare la membrana plasmatica e trasfettare il citoplasma è generalmente molto più bassa senza vettori appropriati 7,8. Queste linee di evidenza suggeriscono che è necessario lo sviluppo di miRNA imitatori o inibitori del sistema di rilascio per il rene, per consentire il loro uso in contesti clinici e renderli una nuova opzione di trattamento per i pazienti con varie malattie renali.
I vettori virali sono stati utilizzati come vettori per fornire miRNA esogeni o inibitori al rene 9,10. Sebbene siano stati sviluppati per la biosicurezza e l'efficacia della trasfezione, i vettori virali possono ancora causare una risposta all'interferone e/o instabilità genetica11,12. Per superare queste preoccupazioni, abbiamo sviluppato un sistema di rilascio di miRNA che imita il rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina (PEI-NP), un vettore non virale, in diversi modelli murini di malattia renale13,14,15.
Le PEI-NP sono NP lineari a base di polimeri che possono effettivamente rilasciare oligonucleotidi, comprese le imitazioni dei miRNA, al rene e sono considerate preferibili per la preparazione di vettori non virali a causa della loro sicurezza e biocompatibilità a lungo termine13,16,17.
Questo studio dimostra gli effetti dei miRNA esogeni sistematici che imitano la consegna con PEI-NP tramite iniezione di vene caudali in topi modello di fibrosi renale prodotti da ostruzione unilaterale dell'uretere (UUO). Inoltre, dimostriamo gli effetti della somministrazione sistematica di miRNA esogeno con PEI-NPs tramite iniezione di vena caudale in topi modello di malattia renale diabetica (topi db / db: C57BLKS / J Iar -+ Lepr db / + Leprdb) e topi modello di danno renale acuto prodotto da danno da ischemia-riperfusione renale (IRI).
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati approvati dal comitato etico animale della Jichi Medical University ed eseguiti in conformità con le linee guida sull'uso e la cura degli animali sperimentali della Guida della Jichi Medical University per gli animali da laboratorio. Qui, abbiamo dimostrato la consegna miRNA mimica al rene con conseguente sovraespressione utilizzando topi UUO. Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico della Jichi Medical University [Approvazione n. 19-12 per la fibrosi renale, 17-024 per l'infezione renale acuta (AKI) e 19-11 per la nefropatia diabetica].
1. Preparazione del complesso PEI-NPs-miRNA-mimic
NOTA: Qui, la preparazione di PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 e PEI-NPs-control-miRNA (come controllo negativo) sono descritti per un topo.
- Preparare i seguenti elementi:
- Preparare 10 μL di PEI-NP lineari.
- Preparare 50 μL di miRNA sintetizzati artificialmente disciolti in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di 100 μM (5 nmol di miRNA disciolti in 50 μL di acqua priva di nucleasi).
- Preparare 50 μL di miRNA di controllo (non bersaglio) sintetizzati artificialmente disciolti in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di 100 μM (5 nmol miRNA disciolti in 50 μL di acqua priva di nucleasi).
- Preparare soluzioni di glucosio al 5% e al 10%. Garantire la disponibilità di provette per microcentrifuga da 1,5 ml e di un miscelatore a vortice.
- Sciogliere 10 μL di PEI-NPs in 90 μL di soluzione di glucosio al 5% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.
- Mescolare 50 μL di miRNA sintetizzati artificialmente (5 nmol) disciolti in acqua priva di nucleasi (concentrazione di 100 μM) con 50 μM di soluzione di glucosio al 10% in provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso. Questo processo produce miRNA disciolti in soluzione di glucosio al 5%.
- Mescolare 100 μL di PEI-NPs in soluzione di glucosio al 5% e 100 μL di miRNA mimic (5 nmol) in soluzione di glucosio al 5%. Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.
- Incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) per preparare un complesso stabile di PEI-NPs-miRNA-mimic. Questa soluzione contiene PEI-NPs e miRNA mimic (5 nmol) in un rapporto di azoto (N) nel polimero e fosfato (P) negli acidi nucleici (rapporto N/P) = 6 (Figura 1).
NOTA: Il complesso PEI-NPs-control-miRNA può essere preparato utilizzando lo stesso processo descritto nei passaggi 1.1-1.5 per tutti i modelli di topi con malattia renale descritti in questo manoscritto (UUO, nefropatia diabetica e AKI). Un volume di iniezione di PEI-NP-miRNAs-mimic è uguale a 5 nmol di miRNA-mimic coniugati con PEI-NPs in rapporto N/P = 6. La durata e la frequenza dell'iniezione di ciascun PEI-NP-miRNA-mimic dipendono dal modello di malattia in cui viene applicato.
2. Conferma della consegna significativa di miRNA mimic al rene in topi UUO mediante PEI-NP tramite iniezione di vene caudali mediante microscopia fluorescente
NOTA: Qui, viene elaborato il metodo di consegna del miRNA artificialmente purificato al rene, indicando l'istituzione di metodi terapeutici per varie malattie renali. In breve, ai topi UUO è stato somministrato un miRNA marcato con acido carbossilico cianina3 (Cy3) aggiunto a 100 μL di PEI-NP attraverso la vena caudale. La consegna ai reni è stata confermata con microscopia a fluorescenza. Viene descritto l'acido carbossilico (Cy3) marcato con acido carbossilico (Cy3) PEI-NPs-miRNA (oligonucleotidi) per un topo. Questo metodo può fornire significativamente miRNA mimic al rene in diversi modelli murini, come topi UUO, topi diabetici e topi AKI prodotti da IRI. Qui, abbiamo usato un modello di mouse UUO per la dimostrazione video. Il metodo di induzione di UUO è stato descritto in precedenza altrove13. Seguire questi protocolli entro sei giorni dall'intervento chirurgico UUO.
- Preparare i seguenti elementi:
- Preparare 2 μL di PEI-NPs e 100 μL di oligonucleotidi a doppio filamento marcati con Cy3 [miRNA miRNA marcati con Cy3 (1 nmol; 10 μM)].
- Preparare soluzioni di glucosio al 5% e al 10%. Garantire la disponibilità di provette per microcentrifuga da 1,5 ml e di un miscelatore a vortice.
- Utilizzare un tubo da centrifuga in plastica da 50 ml con un piccolo foro nel tappo per isolare le vene caudali dei topi UUO.
- Per la microscopia a fluorescenza, preparare un composto con temperatura di taglio ottimale (OCT), un criostato, azoto liquido, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), siringhe da 1,0 ml con un ago da 27 G e vetro rivestito di silano.
NOTA: La lectina Lotus tetragonolobus marcata con fluoresceina (un marcatore del tubulo prossimale) e il 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) possono essere preparati per la colorazione opzionale dei tubuli prossimali e dei nuclei cellulari.
- Sciogliere 2 μL di PEI-NPs in 98 μL di soluzione di glucosio al 10% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.
- Aggiungere 100 μL di miRNA marcato con Cy3 a 100 μL di PEI-NP in soluzione di glucosio al 10% (preparata nella fase 2.2). Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.
- Incubare la miscela per 15 minuti a RT per preparare un complesso stabile di PEI-NPs-Cy3-marcato-miRNA-mimic.
- Posizionare il topo UUO a testa in giù in un tubo da centrifuga da 50 ml senza anestesia, quindi posizionare la coda attraverso il foro preparato nel cappuccio.
- Riempire una siringa da 1,0 mL con un ago da 27 G con 200 μL di complesso PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimimico.
- Iniettare PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) attraverso la vena caudale del mouse utilizzando la siringa da 1,0 mL con ago da 27 G.
NOTA: Pulire la vena caudale con cotone idrofilo saturo di etanolo (70% -80%) per dilatare la vena caudale e disinfettare l'area di iniezione. - Un'ora dopo 200 μL di iniezione del complesso PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimimico, anestetizzare il topo con isoflurano (4% -5%) utilizzando un dispositivo anestetico appropriato per piccoli animali. Confermare la profondità dell'anestesia con l'assenza del riflesso del pizzico della punta. Mantenere l'anestesia con isoflurano (3%) durante l'intervento chirurgico.
- Successivamente, praticare un'incisione nella pelle, nei muscoli e nelle costole con forbici chirurgiche e pinze per esporre il cuore. Dopo aver praticato un'incisione nell'atrio destro, iniettare PBS nel ventricolo sinistro per estrarre il sangue in tutto il corpo fino a quando il colore del rene diventa giallo pallido (indicando che l'intero corpo del topo è perfuso con PBS).
NOTA: La perfusione cardiaca viene eseguita per rimuovere efficacemente il sangue in tutto il corpo. - Fermare l'isoflurano e rimuovere i reni dai topi e lavarli con PBS. Successivamente, rimuovere le capsule renali dai reni e lavare i reni due volte con PBS.
- Incorporare i campioni di tessuto renale nel composto OCT e congelare in azoto liquido.
- Utilizzare un criostato per preparare sezioni (5 μm di spessore). Montare le sezioni su vetrini rivestiti di silano e fissarle con paraformaldeide al 4%.
NOTA: I tessuti renali possono facoltativamente essere colorati con lectina Lotus tetragonolobus marcata con fluoresceina (2 mg / ml) a RT per 2 ore per i tubuli prossimali, seguita da DAPI (30 nM in PBS) a RT per 15 minuti per i nuclei cellulari. - Lavare delicatamente i vetrini due volte con PBS.
- Visualizza la colorazione a fluorescenza mediante microscopia a fluorescenza con ingrandimento 100x e 400x e software di imaging appropriato.
3. Conferma delle alterazioni dei miRNA bersaglio dopo somministrazione di miRNA mimic al rene mediante PEI-NP tramite iniezione di vena caudale
- Eseguire la reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR) per confermare le alternanze dei miRNA bersaglio.
NOTA: Fare riferimento all'articolo pubblicato in precedenza per i dettagli di qRT-PCR18,19,20. Il sistema qRT-PCR utilizzato per generare i risultati rappresentativi forniti di seguito è stato modificato dal produttore. qRT-PCR deve essere condotta in conformità con il protocollo del produttore più recente.
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Representative Results
I miRNA target per la fibrosi renale, la nefropatia diabetica e l'AKI descritti di seguito sono stati selezionati sulla base della ricerca di microarray, qRT-PCR e / o database per applicazioni di terapia genica. Per ulteriori dettagli si rimanda alle precedenti pubblicazioni13,14,15.
Rilascio ed effetti di miRNA-146a-5p-mimic utilizzando PEI-NPs in topi con fibrosi renale13
L'analisi al microscopio fluorescente ha mostrato che l'iniezione di PEI-NP nelle vene caudali potrebbe fornire la mimica miRNA allo spazio tubulointerstiziale. Nei topi con fibrosi renale prodotti da UUO, questo includeva cellule tubulari renali, che non hanno una forma regolare nel rene (freccia Figura 2A) e il glomerulo (Figura 2A). L'analisi qRT-PCR ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic ha indotto una significativa sovraespressione di miRNA-146a-5p nel rene (Figura 2B). Inoltre, l'iniezione ha inibito la progressione della fibrosi renale nei topi modello prodotti da UUO, come stimato con la colorazione rossa Sirius (il rosso indica aree fibrotiche) in vivo. L'iniezione di PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic è stata condotta 1 giorno prima, 1 giorno dopo e 3 giorni dopo il trattamento con UUO (stimato 6 giorni dopo il trattamento con UUO) (Figura 2C). L'iniezione di miRNA di controllo PEI-NPs non ha mostrato effetti preventivi sulla fibrosi renale (Figura 2B,C). La somministrazione di PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic e PEI-NPs-miRNA-control-miRNAs non ha causato una risposta IFN, come un aumento dell'espressione di 5-oligoadenilato sintasi e trasduzione del segnale e attivatore della trascrizione 1 nei topi (Figura 2D).
Consegna ed effetti di miRNA-181b-5p-mimic utilizzando PEI-NPs in topi modello di malattia renale diabetica14
Per valutare il potenziale terapeutico di miRNA-181b-5p per la malattia renale diabetica, abbiamo iniettato miRNA-181b-5p-PIE-NPs o miRNA-PIE-NPs di controllo in topi db / db di 10 settimane settimanali per 10 settimane. L'analisi al microscopio fluorescente ha mostrato che l'iniezione di PEI-NP nelle vene caudali potrebbe fornire miRNA al glomerulo e allo spazio tubulointerstiziale nei reni di topi modello renale diabetico (db / db) in vivo (Figura 3A). Inoltre, l'analisi qRT-PCR ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic ha indotto una significativa sovraespressione di miRNA-181b-5p nel rene (Figura 3B). L'analisi istologica con colorazione periodica acido-Schiff ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic una volta alla settimana da 10-20 settimane di età ha inibito la progressione della malattia renale diabetica nei topi db/db in vivo (Figura 3C). Al contrario, l'iniezione di miRNA di controllo PEI-NPs non ha prodotto effetti preventivi sulla fibrosi renale (Figura 3B,C).
Rilascio ed effetti di PEI-NPs-miRNA-5100-mimic in topi modello di danno renale acuto prodotti da IRI15
L'analisi al microscopio fluorescente ha mostrato che l'iniezione di PEI-NP nelle vene caudali potrebbe fornire miRNA al glomerulo e allo spazio tubulointerstiziale dei reni di topi modello AKI in vivo (Figura 4A). L'analisi qRT-PCR ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-5100-5p-mimic ha indotto una significativa sovraespressione di miRNA-5100 nei reni di topi AKI prodotti da IRI (Figura 3B). L'analisi istologica con colorazione ematossilina-eosina ha mostrato che una singola iniezione di PEI-NPs-miRNA-5100 ha ridotto l'apoptosi delle cellule tubulari (freccia nera), impedendo lo sviluppo di AKI nel modello di topi AKI prodotto da IRI. PEI-NPs-miRNA-5100-mimic è stato iniettato attraverso la vena caudale 2 giorni prima della procedura IRI (Figura 4B). L'iniezione di miRNA di controllo PEI-NPs-non ha mostrato effetti preventivi sulla fibrosi renale (Figura 4B,C).
Figura 1: Struttura del complesso PEI-NPs-miRNA-mimic. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Consegna ed effetti di PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic in topi con fibrosi renale . (A) Analisi al microscopio fluorescente. Barra di scala = 200 μm. (B) Analisi qRT-PCR dei livelli di espressione di miRNA-146a-5p in ciascun gruppo (n = 6 per gruppo). (C) Analisi istologica con colorazione rosso Sirio (il rosso indica l'area fibrotica, barra della scala = 100 μm). L'iniezione di PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic 1 giorno prima, 1 giorno dopo e 3 giorni dopo il trattamento con UUO ha inibito lo sviluppo della fibrosi renale nei topi in vivo. (D) analisi qRT-PCR del rene per studiare i potenziali effetti della risposta IFN a PEI-NPs-miRNA-146a-5p in topi UUO (n = 6 per gruppo). Abbreviazioni: DAPI, 4,6-diamidino-2-fenilindolo; FITC, isotiocianato di fluoresceina; qRT-PCR, reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale; NS, non significativo; PEI-NPs, nanoparticelle di polietilenimina; miRNA, microRNA; UUO, ostruzione unilaterale dell'uretere; OAS1, 5′-oligoadenilato sintasi; STAT1, trasduzione del segnale e attivatore della trascrizione 1. I valori rappresentano l'errore medio ± standard (barre di errore). *P < 0,05. Morishita et al. (International Journal of Nanomedicine 2015 10 3475-3488. Originariamente pubblicato e utilizzato con il permesso di Dove Medical Press Ltd). 13. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Consegna ed effetti di PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic in topi modello di malattia renale diabetica14. (A) Analisi al microscopio fluorescente. Barra della scala = 200 μm. (B) Analisi qRT-PCR per valutare gli effetti di sovraespressione di miRNA-181b-5p dopo iniezione di PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic (n = 3 per gruppo). (C) I cambiamenti fenotipici sono stati osservati al microscopio ottico. L'iniezione di PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic una volta alla settimana da 12-20 settimane di età ha inibito la progressione della malattia renale diabetica nei topi db/db in vivo. Barra di scala = 50 μm. Abbiamo utilizzato un'analisi della varianza (ANOVA) per test di analisi di confronto multipli tra gruppi. Se abbiamo rilevato la significatività statistica da parte dell'ANOVA, abbiamo effettuato il test della Turchia per confrontare le medie di due gruppi come analisi post hoc. Abbreviazioni: PEI-NPs, nanoparticelle di polietilenimina; qRT-PCR, reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale; miRNA, microRNA. *P < 0,05. Questa cifra è stata modificata da Ishii et al. 14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Rilascio ed effetti di PEI-NPs-miRNA-5100-mimic in topi modello di danno renale acuto prodotti da IRI . (A) Analisi al microscopio fluorescente. Barra della scala = 100 μm. (B) Analisi qRT-PCR per valutare gli effetti di sovraespressione di miRNA-5100 dopo iniezione di PEI-NPs-miRNA-5100-mimic. (C) Analisi istologica del rene colorato con ematossilina-eosina. Barra di scala = 100 μm. Le PEI-NP iniettate attraverso la vena caudale 2 giorni prima della procedura IRI impediscono la progressione dell'AKI indotta dall'IRI. Abbreviazioni: PEI-NPs, nanoparticelle di polietilenimina; qRT-PCR, reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale; miRNA, microRNA; AKI, danno renale acuto; IRI, danno da ischemia-riperfusione. **P < 0,01,*P < 0,05. Questa cifra è stata modificata da Aomatsu et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Utilizzando il protocollo presentato in questo manoscritto, le PEI-NP possono fornire miRNA imitazioni al rene per indurre la sovraespressione dei miRNA bersaglio, con conseguenti effetti del trattamento in modelli murini in vivo di diverse malattie renali, tra cui la fibrosi renale, la malattia renale diabetica e l'AKI.
Il metodo per preparare il complesso di PEI-NPs e miRNA mimic è molto semplice. La superficie caricata positivamente delle NP PEI intrappola il miRNA mimo quando sono appena mescolati 13,14,15,16,17 (Figura 1). Inoltre, come vettore non virale lineare basato sulla polietilenimina, le PEI-NP evitano problemi associati all'uso di vettori virali, come la risposta IFN e l'oncogenesi indotta dall'instabilità genetica11,15,16.
L'iniezione di PEI-NPs-mimic attraverso la vena caudale può richiedere un addestramento poiché le vene della coda dei topi con malattia renale sono talvolta difficili da perforare a causa della disidratazione, specialmente nei topi AKI e db / db obesi. Inoltre, può essere necessaria un'iniezione ripetuta di PEI-NPs-miRNA-mimic per diversi modelli di topi. Gli intervalli di iniezione devono essere determinati dalla pre-esperienza di come la sovraespressione da parte di PEI-NPs-miRNA-mimic si verifica nel contesto di ciascun modello murino di malattia renale.
I vettori virali sono frequentemente utilizzati per la trasfezione dei miRNA mimici nei reni e possono portare a una significativa trasfezione dei miRNA 9,10. Tuttavia, i vettori virali hanno potenziali problemi come causare una risposta all'interferone e/o instabilità genetica11,12. Pertanto, sono stati sviluppati diversi metodi di somministrazione alternativi che utilizzano vettori non virali, come la gelatina-NPs 21,22, l'elettroporazione23, l'iniezione idrodinamica 24,25 e la trasfezione mediante ultrasuoni 26. In questo manoscritto, abbiamo introdotto le PEI-NP come vettore non virale per il rene. Alcuni vettori non virali sono altamente invasivi (elettroporazione e iniezione idrodinamica) e pertanto possono essere difficili da applicare per uso clinico. Tuttavia, un confronto delle PEI-NP con altri vettori non virali, come le nanoparticelle a base lipidica e le NP di gelatina, dovrebbe essere valutato in ulteriori studi.
Questo protocollo presenta le seguenti limitazioni. In primo luogo, sebbene i PEI-NPs-miRNA siano adatti per i modelli murini (almeno come primo stadio), sono necessarie grandi quantità di PEI-NPs-miRNA per i modelli animali di grandi dimensioni (come ratti, conigli, scimmie e cani) utilizzati per la ricerca preclinica. Inoltre, va notato che le PEI-NP non hanno consegnato miRNA mimic specificamente al rene perché le PEI-NP, come i vettori virali, non sono un sistema di consegna mirato. Pertanto, potrebbe essere necessario studiare il fenotipo di altri organi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente supportato da JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Ringraziamo Edanz (https://jp.edanz.com/ac) per aver curato le bozze di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
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