Summary
Здесь мы доставляем экзогенные искусственно синтезированные имитаторы микроРНК в почки посредством инъекции в хвостовую вену невирусного вектора и наночастиц полиэтиленимина в нескольких моделях мышей с заболеваниями почек. Это привело к значительной сверхэкспрессии мишени микроРНК в почках, что привело к ингибированию прогрессирования заболевания почек на нескольких моделях мышей.
Abstract
микроРНК (миРНК), малые некодирующие РНК (21-25 оснований), которые не транслируются в белки, ингибируют множество целевых матричных РНК (мРНК), дестабилизируя и ингибируя их трансляцию при различных заболеваниях почек. Таким образом, чередование экспрессии микроРНК экзогенными искусственно синтезированными мимиками микроРНК является потенциально полезным вариантом лечения для ингибирования развития многих заболеваний почек. Однако, поскольку сывороточная РНКаза немедленно разлагает систематически вводимые экзогенные имитаторы микроРНК in vivo, доставка микроРНК в почки остается проблемой. Поэтому необходимы векторы, способные защитить экзогенные мимики микроРНК от деградации РНКазой и значительно доставить их в почку. Во многих исследованиях использовались вирусные векторы для доставки экзогенных имитаторов или ингибиторов микроРНК в почки. Однако вирусные векторы могут вызывать интерфероновый ответ и/или генетическую нестабильность. Таким образом, разработка вирусных векторов также является препятствием для клинического использования экзогенных имитаторов или ингибиторов микроРНК. Чтобы преодолеть эти опасения в отношении вирусных векторов, мы разработали метод невирусного вектора для доставки имитаторов микроРНК в почку с использованием инъекции наночастиц полиэтиленимина (PEI-NP) в хвостовую вену, что привело к значительной сверхэкспрессии мишенных микроРНК в нескольких мышиных моделях заболевания почек.
Introduction
микроРНК, небольшие некодирующие РНК (21-25 оснований), которые не транслируются в белки, ингибируют множество целевых матричных РНК (мРНК), дестабилизируя их и ингибируя их трансляцию при различных заболеваниях почек 1,2. Таким образом, генная терапия с использованием экзогенных искусственно синтезированных имитаторов или ингибиторов микроРНК является потенциальным новым вариантом ингибирования развития многих заболеваний почек 3,4,5.
Несмотря на перспективность имитаторов или ингибиторов микроРНК для генной терапии, доставка в органы-мишени остается большим препятствием для экспериментов in vivo по развитию их клинического потенциала. Поскольку искусственно синтезированные мимики или ингибиторы микроРНК подвержены немедленной деградации сывороточной РНКазой, их период полувыведения сокращается при системном введении in vivo6. Кроме того, эффективность имитаторов или ингибиторов микроРНК для пересечения плазматической мембраны и трансфекции цитоплазмы, как правило, намного ниже без соответствующих векторов 7,8. Эти линии доказательств свидетельствуют о том, что требуется разработка системы доставки мимиков или ингибиторов микроРНК для почек, чтобы обеспечить их использование в клинических условиях и сделать их новым вариантом лечения пациентов с различными заболеваниями почек.
Вирусные векторы использовались в качестве носителей для доставки экзогенных имитаторов или ингибиторов микроРНК в почки 9,10. Несмотря на то, что они были разработаны для обеспечения биобезопасности и эффективности трансфекции, вирусные векторы все же могут вызывать интерфероновый ответ и/или генетическую нестабильность11,12. Чтобы преодолеть эти опасения, мы разработали систему доставки миРНК, имитирующую почку, с использованием наночастиц полиэтиленимина (PEI-NP), невирусного вектора, на нескольких мышиных моделях заболевания почек13,14,15.
PEI-NP представляют собой линейные НУП на основе полимеров, которые могут эффективно доставлять олигонуклеотиды, включая мимики микроРНК, в почки и считаются предпочтительными для получения невирусных векторов из-за их долгосрочной безопасности и биосовместимости13,16,17.
Это исследование демонстрирует эффекты систематической экзогенной миРНК, имитирующей доставку PEI-NP посредством инъекции в хвостовую вену у мышей модели почечного фиброза, полученной при односторонней обструкции мочеточника (UUO). Кроме того, мы демонстрируем эффекты систематической экзогенной мимической доставки микроРНК с помощью PEI-NP посредством инъекции в хвостовую вену у мышей модели диабетической болезни почек (мышей db / db: C57BLKS / J Iar - + Lepr db / + Leprdb) и модельных мышей с острым повреждением почек, вызванных ишемией-реперфузионным повреждением почек (IRI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы экспериментов на животных были одобрены комитетом по этике животных Медицинского университета Джичи и выполнены в соответствии с рекомендациями по использованию и уходу за экспериментальными животными из Руководства Медицинского университета Джичи для лабораторных животных. Здесь мы продемонстрировали мимическую доставку микроРНК в почку, что приводит к ее сверхэкспрессии с помощью мышей UUO. Это исследование было одобрено Комитетом по этике Медицинского университета Джичи [Одобрение NoNo 19-12 для фиброза почек, 17-024 для острой почечной инфекции (ОПП) и 19-11 для диабетической нефропатии].
1. Получение ПЭИ-НПс-миРНК-мимического комплекса
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описан препарат PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 и PEI-NPs-control-miRNA (в качестве отрицательного контроля) для одной мыши.
- Подготовьте следующие предметы:
- Приготовьте 10 мкл линейных PEI-NP.
- Приготовьте 50 мкл искусственно синтезированных микроРНК, растворенных в безнуклеазной воде в концентрации 100 мкМ (5 нмоль микроРНК, растворенных в 50 мкл безнуклеазной воды).
- Готовят 50 мкл искусственно синтезированных контрольных (нецелевых) микроРНК, растворенных в безнуклеазной воде в концентрации 100 мкМ (5 нмоль микроРНК растворяют в 50 мкл безнуклеазной воды).
- Готовят 5% и 10% растворы глюкозы. Обеспечьте наличие микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл и вихревого смесителя.
- Растворите 10 мкл ПЭИ-НЧ в 90 мкл 5% раствора глюкозы в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Затем осторожно вкрутите трубку и вращайтесь вниз.
- Смешайте 50 мкл искусственно синтезированных микроРНК (5 нмоль), растворенных в безнуклеазной воде (концентрация 100 мкМ), с 50 мкМ 10% раствора глюкозы в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл. Затем осторожно вкрутите трубку и вращайтесь вниз. В результате этого процесса получается микроРНК, растворенная в 5% растворе глюкозы.
- Смешайте 100 мкл ПЭИ-НЧ в 5% растворе глюкозы и 100 мкл мимической микроРНК (5 нмоль) в 5% растворе глюкозы. Затем осторожно вкрутите трубку и вращайтесь вниз.
- Инкубируйте смесь в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) для получения стабильного комплекса PEI-NPs-miRNA-имитирующей. Этот раствор содержит ПЭИ-НП и мимическую микроРНК (5 нмоль) при соотношении азота (N) в полимере к фосфату (P) в нуклеиновых кислотах (отношение N/P) = 6 (рис. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Комплекс PEI-NPs-control-miRNA может быть получен с использованием того же процесса, который описан на этапах 1.1-1.5 для всех моделей мышей с заболеваниями почек, описанных в этой рукописи (UUO, диабетическая нефропатия и ОПП). Один объем инъекции PEI-NP-miRNAs-имитирует такие же, как 5 нмоль miRNAs-mimic, конъюгированных с PEI-NPs, при соотношении N / P = 6. Продолжительность инъекции и частота каждого имитатора PEI-NP-miRNA зависит от модели заболевания, в которой он применяется.
2. Подтверждение значимой доставки мимической микроРНК в почку у мышей UUO с помощью PEI-NP путем инъекции в хвостовую вену с использованием флуоресцентной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь разработан способ доставки искусственно очищенной мимики микроРНК в почку, что свидетельствует о создании терапевтических методов при различных заболеваниях почек. Короче говоря, мышам UUO вводили мимическую микроРНК, меченную цианином3-карбоновой кислотой (Cy3), добавленную к 100 мкл PEI-NP через хвостовую вену. Доставка в почки была подтверждена флуоресцентной микроскопией. Описана ПЭИ-NPs-цианин3 карбоновая кислота (Cy3)-меченная мимическая микроРНК (олигонуклеотиды) для одной мыши. Этот метод может значительно доставить мимическую микроРНК в почки на нескольких моделях мышей, таких как мыши UUO, мыши с диабетической болезнью почек и мыши с ОПП, полученные IRI. Здесь мы использовали модель мыши UUO для демонстрации видео. Индукционный метод UUO был описан ранее в другом месте13. Следуйте этим протоколам в течение шести дней после операции UUO.
- Подготовьте следующие предметы:
- Приготовьте 2 мкл PEI-NP и 100 мкл меченных Cy3 двухцепочечных олигонуклеотидов [Cy3-меченая миРНК имитирует (1 нмоль; 10 мкМ)].
- Готовят 5% и 10% растворы глюкозы. Обеспечьте наличие микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл и вихревого смесителя.
- Используйте пластиковую центрифужную пробирку объемом 50 мл с небольшим отверстием в крышке, чтобы изолировать хвостовые вены мышей UUO.
- Для флуоресцентной микроскопии подготовьте компаунд оптимальной температуры резки (OCT), криостат, жидкий азот, фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), шприцы объемом 1,0 мл с иглой 27 G и стекло с силановым покрытием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Меченный флуоресцеином лектин Lotus tetragonolobus (маркер проксимальных канальцев) и 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) могут быть получены для дополнительного окрашивания проксимальных канальцев и ядер клеток.
- Растворите 2 мкл ПЭИ-НЧ в 98 мкл 10% раствора глюкозы в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Затем осторожно вкрутите трубку и вращайтесь вниз.
- Добавьте 100 мкл мимической миРНК, меченной Cy3, к 100 мкл PEI-NP в 10% растворе глюкозы (приготовленном на этапе 2.2). Затем осторожно вкрутите трубку и вращайтесь вниз.
- Инкубируйте смесь в течение 15 мин при RT для получения стабильного комплекса PEI-NPs-Cy3-меченого-миРНК-мимика.
- Поместите мышь UUO головой вперед в центрифужную пробирку объемом 50 мл без анестезии, а затем поместите хвост через подготовленное отверстие в крышке.
- Наполните шприц объемом 1,0 мл иглы 27 г 200 мкл имитирующего комплекса PEI-NPs-Cy3-miRNA.
- Вводите PEI-NPs-Cy3-miRNA-имитатор (200 мкл) через хвостовую вену мыши с помощью шприца объемом 1,0 мл с иглой 27 г.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протрите хвостовую вену ватой, пропитанной этанолом (70% -80%), чтобы расширить хвостовую вену и продезинфицировать область инъекции. - Через час после инъекции 200 мкл комплекса PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic обезболите мышь изофлураном (4-5%) с помощью соответствующего анестезирующего устройства для мелких животных. Подтверждают глубину анестезии отсутствием рефлекса защемления пальцев ног. Поддерживайте анестезию изофлураном (3%) на протяжении всей операции.
- Затем сделайте разрез на коже, мышцах и ребрах хирургическими ножницами и щипцами, чтобы обнажить сердце. Сделав разрез в правом предсердии, введите PBS в левый желудочек, чтобы вытянуть кровь по всему телу, пока цвет почек не изменится на бледно-желтый (что указывает на то, что все тело мыши перфузируется PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сердечная перфузия выполняется для эффективного удаления крови по всему телу. - Прекратите прием изофлурана, удалите почки у мышей и промойте их PBS. После этого извлеките почечные капсулы из почек и дважды промойте почки PBS.
- Поместите образцы почечной ткани в соединение OCT и заморозьте в жидком азоте.
- Используйте криостат для приготовления срезов (толщиной 5 мкм). Установите секции на предметные стекла с силановым покрытием и закрепите их 4% параформальдегидом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани почек могут быть дополнительно окрашены меченным флуоресцеином лектином Lotus tetragonolobus (2 мг / мл) при RT в течение 2 ч для проксимальных канальцев, а затем DAPI (30 нМ в PBS) при RT в течение 15 мин для клеточных ядер. - Аккуратно промойте предметные стекла дважды с помощью PBS.
- Визуализируйте флуоресцентное окрашивание с помощью флуоресцентной микроскопии при 100-кратном и 400-кратном увеличении и соответствующего программного обеспечения для визуализации.
3. Подтверждение целевых изменений микроРНК после доставки имитатора микроРНК в почку с помощью PEI-NP путем инъекции в хвостовую вену
- Выполните количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (qRT-PCR), чтобы подтвердить изменение миРНК-мишени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к ранее опубликованной статье для получения подробной информации о qRT-PCR18,19,20. Система qRT-PCR, используемая для получения репрезентативных результатов, приведенных ниже, была изменена производителем. qRT-PCR следует проводить в соответствии с последним протоколом производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мишени для фиброза почек, диабетической нефропатии и ОПП, описанные ниже, были выбраны на основе микрочипов, qRT-ПЦР и/или исследований баз данных для применения в генной терапии. Более подробную информацию см. в предыдущих публикациях13,14,15.
Доставка и эффекты миРНК-146a-5p-имитатора с использованием PEI-NP у мышей с фиброзом почек13
Анализ флуоресцентной микроскопии показал, что инъекция PEI-NP в хвостовую вену может доставить имитатор микроРНК в тубулоинтерстициальное пространство. У мышей с почечным фиброзом, продуцируемых UUO, это включало клетки почечных канальцев, которые не имеют регулярной формы в почках (стрелка рис. 2А), и клубочки (рис. 2А). Анализ qRT-PCR показал, что инъекция PEI-NPs-miRNA-146a-5p-мимически индуцировала значительную сверхэкспрессию miRNA-146a-5p в почке (рис. 2B). Кроме того, инъекция ингибировала прогрессирование фиброза почек у модельных мышей, продуцированных UUO, что оценивалось с помощью красного окрашивания Sirius (красный цвет указывает на фиброзные участки) in vivo. Инъекцию PEI-NPs-miRNA-146a-5p-имитатора проводили за 1 день до, через 1 день после и через 3 дня после лечения UUO (по оценкам, через 6 дней после лечения UUO) (рис. 2C). Инъекция контрольной микроРНК PEI-NPs не оказывала профилактического воздействия на фиброз почек (рис. 2B, C). Введение PEI-NPs-miRNA-146a-5p-мимических и PEI-NPs-miRNA-контрольных миРНК не вызывало ответа ИФН, такого как повышенная экспрессия 5-олигоаденилатсинтазы и сигнальная трансдукция и активатор транскрипции 1 у мышей (рис. 2D).
Доставка и эффекты miRNA-181b-5p-имитатора с использованием PEI-NP у мышей с диабетической болезнью почек14
Чтобы оценить терапевтический потенциал miRNA-181b-5p при диабетической болезни почек, мы вводили miRNA-181b-5p-PIE-NP или контрольные miRNA-PIE-NP 10-недельным мышам db /db еженедельно в течение 10 недель. Анализ флуоресцентной микроскопии показал, что инъекция PEI-NP в хвостовую вену может доставлять мимическую микроРНК в клубочек и тубулоинтерстициальное пространство в почках мышей диабетической модели почек (db / db) in vivo (рис. 3A). Кроме того, анализ qRT-ПЦР показал, что инъекция PEI-NPs-miRNA-181b-5p-имитатора индуцировала значительную сверхэкспрессию miRNA-181b-5p в почке (рис. 3B). Гистологический анализ с периодическим окрашиванием кислотой Шиффа показал, что инъекция PEI-NPs-miRNA-181b-5p-имитатора один раз в неделю с 10-20-недельного возраста ингибировала прогрессирование диабетической болезни почек у мышей db / db in vivo (рис. 3C). Напротив, инъекция контрольной микроРНК PEI-NPs не оказывала профилактического воздействия на фиброз почек (рис. 3B, C).
Доставка и эффекты PEI-NPs-miRNA-5100-mimic у мышей с острым повреждением почек, полученных IRI15
Анализ флуоресцентной микроскопии показал, что инъекция PEI-NP в хвостовую вену может доставлять мимическую микроРНК в клубочковое и тубулоинтерстициальное пространство почек мышей модели ОПП in vivo (рис. 4А). Анализ qRT-ПЦР показал, что инъекция PEI-NPs-miRNA-5100-5p-mimic индуцировала значительную сверхэкспрессию miRNA-5100 в почках мышей с ОПП, продуцируемых IRI (рис. 3B). Гистологический анализ с окрашиванием гематоксилин-эозином показал, что однократная инъекция PEI-NPs-miRNA-5100 снижала апоптоз канальцевых клеток (черная стрелка), что предотвращало развитие ОПП в модели мышей ОПП, полученной IRI. PEI-NPs-miRNA-5100-mimic вводили через хвостовую вену за 2 дня до процедуры IRI (рис. 4B). Инъекция ПЭИ-НП - контрольной микроРНК - не показала профилактического эффекта на фиброз почек (рис. 4B, C).
Рисунок 1: Структура мимического комплекса PEI-NPs-miRNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Доставка и эффекты PEI-NPs-miRNA-146a-5p-имитатора у мышей с фиброзом почек . (A) Анализ флуоресцентной микроскопии. Масштабная линейка = 200 мкм. (B) qRT-ПЦР-анализ уровней экспрессии miRNA-146a-5p в каждой группе (n = 6 в группе). (C) Гистологический анализ с окрашиванием в красный цвет по шкале Сириуса (красным цветом обозначена фиброзная область, масштабная линейка = 100 мкм). Инъекция PEI-NPs-miRNA-146a-5p-имитатора за 1 день до, через 1 день после и через 3 дня после лечения UUO ингибировала развитие фиброза почек у мышей in vivo. (D) qRT-ПЦР-анализ почек для изучения потенциальных эффектов ответа ИФН на PEI-NPs-miRNA-146a-5p у мышей UUO (n = 6 в группе). Сокращения: DAPI, 4,6-диамидино-2-фенилиндол; FITC, флуоресцеин изотиоцианат; qRT-PCR, количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; НС, не значимые; PEI-NPs, наночастицы полиэтиленимина; микроРНК, микроРНК; УУО, односторонняя обструкция мочеточника; OAS1, 5'-олигоаденилатсинтаза; STAT1, передача сигнала и активатор транскрипции 1. Значения представляют собой среднюю ± стандартную ошибку (полосы ошибок). *P < 0,05. Morishita et al. (International Journal of Nanomedicine, 2015, 10, 3475-3488. Первоначально опубликовано и используется с разрешения Dove Medical Press Ltd). 13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Доставка и эффекты PEI-NPs-miRNA-181b-5p-имитатора у мышей с диабетической болезнью почек14. (A) Анализ флуоресцентной микроскопии. Масштабная линейка = 200 мкм. (B) анализ qRT-ПЦР для оценки эффектов сверхэкспрессии miRNA-181b-5p после инъекции PEI-NPs-miRNA-181b-5p-имитатора (n = 3 на группу). (C) Фенотипические изменения наблюдались с помощью световой микроскопии. Инъекция PEI-NPs-miRNA-181b-5p-имитатора один раз в неделю с 12-20-недельного возраста ингибировала прогрессирование диабетической болезни почек у мышей db / db in vivo. Масштабная линейка = 50 мкм. Мы использовали дисперсионный анализ (ANOVA) для тестирования множественного сравнительного анализа между группами. Если мы обнаружили статистическую значимость с помощью ANOVA, мы провели тест Турции для сравнения средних значений двух групп в качестве анализа post hoc. Аббревиатуры: ПЭИ-НП, наночастицы полиэтиленимина; qRT-PCR, количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; микроРНК, микроРНК. *P < 0,05. Эта цифра была изменена по сравнению с Ishii et al. 14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Доставка и эффекты имитации PEI-NPs-miRNA-5100 у мышей с острым повреждением почек, полученных IRI . (A) Анализ флуоресцентной микроскопии. Масштабная линейка = 100 мкм. (B) анализ qRT-PCR для оценки эффектов сверхэкспрессии miRNA-5100 после инъекции PEI-NPs-miRNA-5100-mimic. (C) Гистологический анализ почек, окрашенных гематоксилин-эозином. Масштабная линейка = 100 мкм. PEI-NP, вводимые через хвостовую вену за 2 дня до процедуры IRI, предотвращают прогрессирование ОПП, вызванное IRI. Аббревиатуры: ПЭИ-НП, наночастицы полиэтиленимина; qRT-PCR, количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; микроРНК, микроРНК; ОПП, острое поражение почек; ИРИ, ишемия-реперфузионное повреждение. **P < 0,01,*P < 0,05. Эта цифра была изменена по сравнению с Aomatsu et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя протокол, представленный в этой рукописи, PEI-NP могут доставлять мимики микроРНК в почку, чтобы индуцировать сверхэкспрессию мишенных микроРНК, что приводит к лечебным эффектам на мышиных моделях in vivo нескольких заболеваний почек, включая фиброз почек, диабетическую болезнь почек и ОПП.
Способ получения комплекса ПЭИ-НП и мимика микроРНК очень прост. Положительно заряженная поверхность PEI-NP захватывает мимику микроРНК, когда они просто смешиваются 13,14,15,16,17 (рис. 1). Кроме того, как линейный невирусный вектор на основе полиэтиленимина, PEI-NP избегают проблем, связанных с использованием вирусных векторов, таких как ответ ИФН и онкогенез, вызванный генетической нестабильностью11,15,16.
Инъекция PEI-NPs-имитатора через хвостовую вену может потребовать обучения, поскольку хвостовые вены мышей с заболеванием почек иногда трудно проколоть из-за обезвоживания, особенно у мышей с ОПП и ожирением db / db. Кроме того, для нескольких моделей мышей может потребоваться повторная инъекция PEI-NPs-miRNA-mimic. Интервалы инъекций должны определяться предварительным опытом того, как происходит сверхэкспрессия PEI-NPs-miRNA-mimic в контексте каждой мышиной модели заболевания почек.
Вирусные векторы часто используются для трансфекции мимики микроРНК в почках и могут приводить к значительной трансфекции микроРНК 9,10. Однако вирусные векторы имеют потенциальные проблемы, такие как реакция интерферона и/или генетическая нестабильность11,12. Поэтому было разработано несколько альтернативных методов доставки с использованием невирусных векторов, таких как желатин-NPs 21,22, электропорация23, гидродинамическая инъекция 24,25 и трансфекция с использованием ультразвука 26. В этой рукописи мы представили PEI-NPs в качестве невирусного вектора для почек. Некоторые невирусные векторы являются высокоинвазивными (электропорация и гидродинамическая инъекция), и поэтому их может быть трудно применять для клинического применения. Тем не менее, сравнение PEI-NP с другими невирусными векторами, такими как наночастицы на основе липидов и желатиновые NP, должно быть оценено в дальнейших исследованиях.
Этот протокол имеет следующие ограничения. Во-первых, хотя PEI-NPs-miRNA подходят для мышиных моделей (по крайней мере, в качестве первого этапа), большое количество PEI-NPs-miRNA требуется для крупных моделей животных (таких как крысы, кролики, обезьяны и собаки), используемых для доклинических исследований. Кроме того, следует отметить, что PEI-NP не доставляли мимику микроРНК конкретно в почку, потому что PEI-NP, как и вирусные векторы, не являются целевой системой доставки. Поэтому может потребоваться исследование фенотипа других органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана JSPS KAKENHI (грант No 21K08233). Мы благодарим Edanz (https://jp.edanz.com/ac) за редактирование черновиков этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
- Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy. Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).
- Yheskel, M., Patel, V. Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic. Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Deng, M., et al. Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).
- Zhou, Y., et al. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy. Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).
- Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives. Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).
- Morishita, Y., et al. Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo. International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).
- Aomatsu, A., et al. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Swami, A., et al. A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).
- Kaneko, S., et al. Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).
- Yanai, K., et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).
- Aomatsu, A., et al. A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).
- Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).
- Xia, Z., et al. Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47. American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).
- Tanaka, T., et al. In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).
- Hamar, P., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).
- Ma, D., et al. Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).
- Wei, S., et al. Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).
