Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63387
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

Summary

В этой статье описывается, как эффективно использовать три платформы обработки крио-ЭМ, т.е. cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3, для создания единого и надежного рабочего процесса, применимого к различным наборам данных с одной частицей для определения структуры с высоким разрешением.

Abstract

Последние достижения в области как приборов, так и программного обеспечения для обработки изображений сделали криоэлектронную микроскопию одной частицы (крио-ЭМ) предпочтительным методом для структурных биологов для определения структур высокого разрешения широкого спектра макромолекул. Для новых и опытных пользователей доступно несколько пакетов программного обеспечения для обработки изображений и расчета структуры, которые оптимизируют один и тот же базовый рабочий процесс: фильмы, полученные детекторами микроскопа, проходят коррекцию для оценки движения и контрастной функции передачи луча (CTF). Затем изображения частиц выбираются и извлекаются из усредненных кадров фильма для итеративной 2D- и 3D-классификации, за которой следует 3D-реконструкция, уточнение и проверка. Поскольку различные программные пакеты используют разные алгоритмы и требуют разного уровня знаний для работы, 3D-карты, которые они генерируют, часто различаются по качеству и разрешению. Таким образом, пользователи регулярно передают данные между различными программами для достижения оптимальных результатов. Этот документ содержит руководство для пользователей по навигации по рабочему процессу в популярных программных пакетах: cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3 для получения структуры, близкой к атомному разрешению аденоассоциированного вируса (AAV). Сначала мы подробно описываем конвейер обработки изображений с помощью cryoSPARC v3, поскольку его эффективные алгоритмы и простой в использовании графический интерфейс позволяют пользователям быстро получить 3D-карту. На следующем этапе мы используем PyEM и собственные скрипты для преобразования и передачи координат частиц из 3D-реконструкции наилучшего качества, полученной в cryoSPARC v3, в RELION-3 и Scipion 3 и пересчитывают 3D-карты. Наконец, мы намечаем шаги для дальнейшего уточнения и валидации результирующих структур путем интеграции алгоритмов из RELION-3 и Scipion 3. В этой статье мы расскажем, как эффективно использовать три платформы обработки для создания единого и надежного рабочего процесса, применимого к различным наборам данных для определения структуры с высоким разрешением.

Introduction

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) и анализ одной частицы (SPA) позволяют определять структуру широкого спектра биомолекулярных сборок в их гидратированном состоянии, помогая осветить роль этих макромолекул в атомных деталях. Усовершенствования в оптике микроскопа, компьютерном оборудовании и программном обеспечении для обработки изображений позволили определить структуры биомолекул с разрешением, превышающим 2 Å1,2,3. Более 2 300 крио-ЭМ-структур были депонированы в Банке данных белка (PDB) в 2020 году по сравнению со 192 структурами в 20144 году, что указывает на то, что крио-ЭМ стал методом выбора для многих структурных биологов. Здесь мы описываем рабочий процесс, объединяющий три различные программы SPA для определения структуры с высоким разрешением (рисунок 1).

Целью SPA является реконструкция 3D-объемов целевого образца из шумных 2D-изображений, записанных детектором микроскопа. Детекторы собирают изображения в виде фильмов с отдельными кадрами одного поля зрения. Чтобы сохранить образец, кадры собираются с низкой дозой электронов и, таким образом, имеют плохое отношение сигнал/шум (SNR). Кроме того, воздействие электронов может индуцировать движение внутри остеклованных крио-ЭМ-сеток, что приводит к размытию изображения. Чтобы преодолеть эти проблемы, кадры выравниваются для корректировки движения, вызванного лучом, и усредняются, чтобы получить микрофотографию с увеличенным SNR. Эти микроснимки затем проходят оценку функции переноса контраста (CTF) для учета эффектов расфокусировки и аберраций, наложенных микроскопом. Из микроснимков, скорректированных CTF, отдельные частицы отбираются, извлекаются и сортируются в средние значения 2D-класса, представляющие различные ориентации, принятые образцом в стекловидном льду. Результирующее однородное множество частиц используется в качестве входных данных для ab initio 3D-реконструкции для создания грубой модели или моделей, которые затем итеративно уточняются для получения одной или нескольких структур с высоким разрешением. После реконструкции выполняются структурные доработки для дальнейшего улучшения качества и разрешения крио-ЭМ карты. Наконец, либо атомная модель непосредственно выводится из карты, либо карта снабжена атомными координатами, полученными в другом месте.

Для выполнения описанных выше задач доступны различные пакеты программного обеспечения, включая Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 и другие. Хотя эти программы следуют аналогичным этапам обработки, они используют разные алгоритмы, например, для выбора частиц, создания начальных моделей и уточнения реконструкций. Кроме того, эти программы требуют различного уровня пользовательских знаний и вмешательства для работы, так как некоторые из них зависят от тонкой настройки параметров, которые могут выступать в качестве препятствия для новых пользователей. Эти расхождения часто приводят к картам с несогласованным качеством и разрешением на разных платформах14, что побуждает многих исследователей использовать несколько пакетов программного обеспечения для уточнения и проверки результатов. В этой статье мы освещаем использование cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3 для получения 3D-реконструкции AAV с высоким разрешением, широко используемого вектора для генной терапии15. Вышеупомянутые пакеты программного обеспечения бесплатны для академических пользователей; cryoSPARC v3 и Scipion 3 требуют лицензий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Создание нового проекта cryoSPARC v3 и импорт данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные были получены в Орегонском университете здоровья и науки (OHSU) в Портленде с использованием электронного микроскопа Titan Krios 300 кВ, оснащенного прямым электронным детектором Falcon 3. Изображения собирались в режиме подсчета с общей дозой 28,38 e−/Å2 , дробленной на 129 кадров, и диапазоном дефокусировки от -0,5 мкм до -2,5 мкм при размере пикселя 1,045 Å с использованием EPU. Образец AAV-DJ предоставили сотрудники OHSU.

  1. Откройте cryoSPARC v3 в веб-браузере и щелкните заголовок Проекты . Выберите + Добавить , чтобы создать новый проект. Назовите проект соответствующим образом и укажите путь к существующему каталогу, в котором будут сохранены задания и данные.
  2. Создайте рабочую область для проекта, открыв проект, щелкнув + Добавить и выбрав Новая рабочая область. Назовите рабочую область и нажмите кнопку Создать.
  3. Перейдите в новую рабочую область и откройте конструктор заданий на правой панели. На этой вкладке отображаются все функции, доступные в cryoSPARC v3. Нажмите «Импорт фильмов» и укажите путь к фильмам, путь к файлу ссылки и задайте параметры получения следующим образом: Размер необработанного пикселя 1,045 Å, Ускоряющее напряжение 300 кВ, Сферическая аберрация 2,7 мм, Общая экспозиционная доза 28,38 e-/Å^2.
  4. Щелкните Очередь, выберите полосу для запуска задания и рабочей области, а затем нажмите кнопку Создать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры сбора зависят от образца и микроскопа.

2. CryoSPARC v3 - выравнивание ролика и оценка CTF

  1. Откройте исправление движения патча (Multi). Для этого задания в качестве входных данных требуются фильмы, импортированные на шаге 1.3. Откройте карточку заданий импорта фильмов в рабочей области и перетащите выходные данные Imported_movies в заполнитель фильмов в новом задании. Поставьте задание в очередь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации о методах cryoSPARC, описанных в этой статье, см. учебник cryoSPARC16.
  2. Для выполнения оценки CTF откройте Patch CTF Estimation (Multi). Введите микроснимки, созданные на шаге 2.1, и поставьте задание в очередь.
  3. Чтобы проверить усредненные и CTF-скорректированные микроснимки и выбрать подмножество для дальнейшей обработки, откройте Curate Exposures и введите экспозиции, полученные на этапе 2.2. Поставьте задание в очередь.
  4. После того, как задание перейдет в режим ожидания , перейдите на вкладку Взаимодействие на карточке задания, настройте пороговые значения параметров и примите или отклоните отдельные микроснимки для дальнейшей обработки. Принимайте микроснимки с хорошо подобранными оценочными и экспериментальными CTF (рисунок 2) и отбрасывайте снимки с высоким астигматизмом, плохой посадкой CTF и толстым льдом.
  5. При обработке текущих данных установите верхний порог астигматизма равным 400 Å, разрешением соответствия CTF 5 Å и относительной толщиной льда 2. Нажмите « Готово», чтобы выбрать микроснимки для последующей обработки.

3. CryoSPARC v3 - ручной и шаблонный отбор частиц

  1. Откройте средство выбора вручную, введите принятые экспозиции из шагов 2.4-2.5 и поставьте задание в очередь. Нажмите на вкладку «Интерактивный », установите размер коробки (px) на 300 и нажмите на несколько сотен частиц на нескольких микрофотографиях и избегайте выбора перекрывающихся частиц. Здесь было отобрано 340 частиц на 29 микроснимках. Когда закончите, нажмите Готово Выбор! Извлеките частицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует ручной отбор частиц для создания шаблонов для автоматического выбора. Однако доступны и другие методы17.
  2. Чтобы сгенерировать шаблоны для автоматического отбора частиц, нажмите на 2D-классификацию и введите выбор частиц, сгенерированные на шаге 3.1. Измените число 2D-классов на 10 и поставьте задание в очередь.
  3. Откройте Выбрать 2D-классы. Введите частицы и средние значения классов, полученные на шаге 3.2, и перейдите на вкладку Интерактивные . Выберите репрезентативные 2D-классы с хорошим SNR и нажмите готово.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средние значения класса отражают различные представления частиц. Выберите средние значения класса, отражающие каждое представление. Цель состоит в том, чтобы создать четко определенные шаблоны, представляющие различные виды образца для автоматической комплектации.
  4. Откройте средство выбора шаблонов и введите 2D-классы, выбранные на шаге 3.3, и микроснимки из шагов 2.4-2.5. Установите диаметр частицы (Å) равным 220 Å и поставьте задание в очередь.
  5. Чтобы проверить автоматические выборки, откройте Select Particle Picks, введите частицы и микроснимки, созданные на шаге 3.4, и поставьте задание в очередь.
  6. На карточке задания Выбор частиц перейдите на вкладку Интерактивные и установите размер поля (px) равным 300. Нажмите на отдельный микрофотографию, отрегулируйте фильтр нижних частот до тех пор, пока частицы не станут хорошо видны, и установите порог нормализованной перекрестной корреляции (NCC) на 0,41 и порог мощности между 54000 и 227300.
  7. Осмотрите несколько микроснимков и, при необходимости, отрегулируйте пороговые значения таким образом, чтобы большинство частиц было выбрано без включения ложных срабатываний. По завершении нажмите Готово выбор! Извлеките частицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Истинные частицы обычно имеют высокий показатель NCC и мощности, что указывает на то, что они похожи на шаблон и имеют высокий SNR, соответственно.
  8. Откройте Извлечение из микроснимков и введите микроснимки и частицы из шага 3.7. Установите для параметра Размер извлеченного поля (px) значение 300 и поставьте задание в очередь.

4. КриоСПАРК v3 - 2D классификация

  1. Нажмите на 2D Classification и введите извлеченные частицы из шага 3.8. Установите для параметра Число 2D-классов значение 50 и поставьте задание в очередь.
  2. Чтобы выбрать лучшие 2D-классы для дальнейшей обработки, откройте Выбрать 2D-классы. Введите частицы и средние значения классов, полученные на шаге 4.1. Нажмите на вкладку Interactive и выберите 2D-классы в зависимости от разрешения и количества частиц в классе (рисунок 3). Не выбирайте классы, содержащие артефакты. После выбора нажмите Готово.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для удаления частиц, которые не сходятся в отдельные, четко определенные классы, требуется несколько раундов 2D-классификации. Выполните столько раундов 2D-классификации, сколько необходимо для удаления таких частиц из набора данных (рисунок 3).

5. CryoSPARC v3 - ab-initio реконструкция и однородная доработка

  1. Чтобы сгенерировать начальный 3D-объем, откройте Ab-initio Reconstruction и введите частицы, полученные на шаге 4.2 или из окончательной 2D-классификации. Настройте симметрию на икосаэдрическую. Поставьте задание в очередь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Симметрия зависит от выборки и должна быть изменена соответствующим образом. Если неизвестно, используйте симметрию C1.
  2. Открытая однородная очистка. Введите объем из шага 5.1 и частицы из 4.2 или окончательную 2D-классификацию. Измените симметрию и поставьте задание в очередь. По завершении задания проверьте кривую корреляции оболочки Фурье (FSC) и загрузите том для изучения в UCSF Chimera18.

6. Экспорт координат частиц из cryoSPARC v3 и импорт их в RELION-3 с помощью PyEM

ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты частиц несут информацию о местоположении отдельных частиц на каждой микроснимке. Передача координат вместо стеков частиц в RELION-3 позволяет выполнять этапы уточнения, которые в противном случае были бы недоступны. Например, для полировки частиц требуется доступ к начальным кадрам фильма. Следовательно, перед экспортом координат частиц из cryoSPARC v3 в RELION-3 импортируйте фильмы и выполняйте коррекцию движения и оценку CTF в RELION-3. Подробности см. в учебнике RELION-319.

  1. Перейдите в каталог проекта RELION-3 и запустите RELION-3.
  2. Откройте импорт из браузера типа задания и укажите путь к фильмам и параметрам получения, как показано на шаге 1.3.
  3. Чтобы выполнить коррекцию движения, используйте UCSF MotionCor220 через графический интерфейс RELION-3, откройте Motion Correction и установите параметры по умолчанию, как в руководстве UCSF MotionCor222. Введите путь к фильмам, импортированным на шаге 6.2. На вкладке Движение укажите путь к исполняемому файлу motioncor2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MotionCor2 можно запускать параллельно с использованием нескольких графических процессоров.
  4. Выполните оценку CTF с использованием CTFFIND-4.122 через графический интерфейс RELION-3. Откройте оценку CTF и введите micrographs.star, сгенерированный на шаге 6.3. На вкладке CTFFIND-4.1 укажите путь к исполняемому файлу CTFFIND-4.1 и задайте параметры, как в учебнике RELION-3.119.
  5. Чтобы импортировать стеки частиц из cryoSPARC v3 в RELION-3, они сначала должны быть экспортированы из cryoSPARC v3. В cryoSPARC v3 откройте карточку заданий задания Select 2D class из шага 4.2 или окончательной 2D-классификации. На вкладке Сведения нажмите кнопку Экспорт задания. Задание экспорта выводит файл particles_exported.cs.
  6. Перед импортом координат частиц из cryoSPARC v3 в RELION-3 файл particles_exported.cs из шага 6.5 должен быть преобразован в формат .star. Используя PyEM23, преобразуйте particles_exported.cs файл в формат .star, выполнив следующую команду: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. В RELION-3 перейдите на вкладку «Ручной выбор» и на вкладке «Ввод-вывод » введите микроснимки из уточнения CTF, описанного в шаге 6.4. На вкладке Дисплей введите следующие параметры: Диаметр частиц (A): 220, Фильтр нижних частот (A): -1 , Масштаб для изображения CTF: 0,5. Запустите задание. Каталог с именем ManualPick создается в домашней папке RELION-3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для создания структуры папок ручного выбора в RELION-3. При ручном отборе для каждого усредненного микрофотографии, используемого для отбора в графическом интерфейсе RELION-3, создается один файл .star, содержащий координаты выбранных частиц.
  8. Перейдите в папку, содержащую файл particles_exported.star из шага 6.6, и запустите домашний сценарий, создающий один файл manualpick.star для каждого усредненного микрофотографии, используемого для выбора частиц cryo-SPARC v3, что способствовало окончательной 2D-классификации, экспортированной на шаге 6.5. Полученные файлы координат сохраняются в папке ManualPick/Movies.
  9. Вернитесь в RELION-3 и снова откройте задание Ручная комплектация . Нажмите продолжить. Это отобразит частицы, ранее выбранные в cryoSPARC v3, в графическом интерфейсе RELION-3. Осмотрите несколько микроснимков, чтобы убедиться, что передача координат частиц была выполнена и правильно ли выбраны частицы.

7. RELION-3 - Экстракция частиц и 2D классификация

  1. Нажмите на Извлечение частиц. На вкладке Ввод-вывод введите скорректированные микроснимки CTF из шага 6.4 и координаты из шага 6.9. Перейдите на вкладку «Извлечь» и измените размер ячейки частиц (пикс) на 300. Запустите задание.
  2. Выполните 2D-классификацию для дальнейшей очистки набора частиц, сгенерированного в cryoSPARC v3, для достижения реконструкции с более высоким разрешением. Нажмите на 2D Classification и на вкладке I/O введите файл particles.star, сгенерированный на шаге 7.1. На вкладке Оптимизация установите для параметра Количество классов значение 50, а для параметра Диаметр маски (A) — 280. Запустите задание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маска должна охватывать всю частицу.
  3. Чтобы выбрать лучшие 2D-классы, щелкните метод Выбора подмножества , введите файл _model.star из шага 7.2 и запустите задание. Выберите классы, как описано в шаге 4.2.
  4. Повторите шаги 7.2 и 7.3, чтобы удалить несходящиеся частицы.

8. RELION-3 - 3D уточнение, создание маски и постобработка

  1. Используйте карту, сгенерированную в cryoSPARC v3 (шаг 5.2), в качестве исходной модели для 3D-уточнения в RELION-3. Выберите метод Импорт и задайте следующие параметры на вкладке Ввод-вывод : Импорт необработанных фильмов/микрофотографий: Нет, Необработанные входные файлы: Фильмы/*.mrc.
  2. Введите файл MTF и введите параметры получения фильма, как описано в шаге 1.3. На вкладке Другие выберите карту cryoSPARC v3 в качестве входного файла, измените Тип узла на 3D-ссылку (.mrc) и выполните задание.
  3. Выберите 3D Auto-Refine и на вкладке Ввод-вывод установите Входные изображения в качестве файла particles.star из шага 7.3 или последнего задания выбора. Приведите реконструкцию cryoSPARC v3 в качестве справочной карты. Перейдите на вкладку Ссылка и измените начальный фильтр нижних частот (Å) на 50 и симметрию на icosahedral. На вкладке Оптимизация измените диаметр маски (Å) на 280 и выполните задание.
  4. После завершения пробега откройте run_class001.mrc в UCSF Chimera.
  5. В UCSF Chimera щелкните Инструменты и в разделе Данные тома выберите Средство просмотра томов. Откроется новое окно для настройки параметров громкости. Измените шаг на 1 и отрегулируйте ползунок до достижения значения уровня, на котором карта не имеет шума. Запишите это значение, так как оно будет использоваться для создания маски на следующем шаге.
  6. Карта, полученная в результате автоочистки, не отражает истинный FSC, так как шум от окружающего растворителя снижает разрешение. Перед последующей обработкой создайте маску, чтобы отличить образец от области растворителя.
    1. Щелкните Создание маски и введите run_class001.mrc из шага 8.3.
    2. Перейдите на вкладку Маска и настройте параметры следующим образом: Карта фильтров нижних частот (Å): 10, Размер пикселя (Å): 1,045, Начальный порог бинаризации: значение уровня, полученное на шаге 8.5, Расширить двоичную карту на это количество пикселей: 3 и Добавить мягкий край этого количества пикселей: 3. Запустите задание.
  7. Изучите маску в UCSF Chimera. Если маска слишком плотная, увеличьте На столько пикселей увеличить двоичную карту и/или добавьте мягкий край этого количества пикселей. Важно создать маску с мягкими краями, так как острая маска может привести к переподготовке.
  8. Нажмите на Постобработка и на вкладке Ввод-вывод введите полукарты, созданные на шаге 8.3, и маску из 8.6. Установите размер калиброванного пикселя равным 1,045 Å. На вкладке Резкость введите следующее: Оцените B-фактор автоматически?: Да, самое низкое разрешение для автоподгонки B (A): 10, используйте свой собственный B-фактор?: Нет. На вкладке Фильтр установите для параметра Пропустить Fsc-Weighting? значение Нет. Выполните задание.

9. RELION-3 - Обучение полировке и полировке частицами

  1. Перед корректировкой движения, вызванного пучком частицы, сначала используйте режим обучения, чтобы определить оптимальные траектории движения для набора данных. Откройте байесовскую полировку и на вкладке Ввода-вывода введите микроснимки с коррекцией движения из шага 6.3, частицы из шага 8.3 и файл .star постпроцесса из шага 8.8. Перейдите на вкладку Обучение и задайте следующие параметры: Оптимальные параметры тренировки: Да, Доля пикселей Фурье для тестирования: 0,5, Используйте это количество частиц: 5000. Запустите задание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт создаст opt_params_all_groups.txt файл в польской папке RELION-3, содержащий оптимизированные параметры полировки, необходимые для выполнения следующего шага.
  2. Как только учебная работа будет завершена, нажмите на Байесовскую полировку. Перейдите на вкладку Обучение и установите для параметра Оптимальные параметры тренировки? значение Нет. Выберите вкладку Польский и в разделе Оптимизированный файл параметров укажите путь к файлу opt_params_all_groups.txt из шага 9.1. Нажмите кнопку Выполнить.
  3. Повторите 3D-уточнение (шаг 8.3) и постобработку (шаг 8.8) с набором полированных частиц.

10. RELION-3 - Уточнения CTF и частиц

  1. Чтобы оценить аберрации более высокого порядка, откройте уточнение CTF и на вкладке Ввод-вывод в разделе Частицы выберите путь к файлу .star, содержащему отполированные частицы из недавнего задания Уточнение 3D (run_data.star).
    1. В разделе Postprocess Star File задайте путь к выходным данным последнего задания постобработки (шаг 9.3).
    2. Выберите вкладку «Подгонка» и задайте следующие параметры: Оценка (анизотропное увеличение): Нет, выполнить подгонку параметров CTF? Нет, оцените Beamtilt: Да, также оцените трилистник? Да, оценка абберации 4-го порядка? Да. Запустите задание.
  2. Повторите шаг 10.1, используя в качестве входных частиц (из Refine3D ), сгенерированных в предыдущем задании (particles_ctf_refine.star). На вкладке Соответствие измените значение параметра Оценка (анизотропное увеличение) на Да и выполните задание.
  3. Повторите шаг 10.2, используя в качестве входных частиц (из Refine3D), полученных в предыдущем задании (particles_ctf_refine.star). На вкладке Fit задайте следующие параметры: Оценка (анизотропное увеличение): Нет, Выполнить подгонку параметров CTF?: Да, Fit Defocus?: Per-particle, Fit Astigmatism? На микрофотографию, Fit B-фактор?: Нет, Fit Phase-Shift: No, Estimate Beamtilt?: No, Estimate 4th Order Aberrations?: No. Запустите его.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что частица имеет достаточную контрастность, вкладку Fit Astigmatism? можно установить в Per-particle. Для этого набора данных уточнение астигматизма на частицу не улучшило качество и разрешение карты.
  4. Повторите 3D-уточнение с частицами из шага 10.3 и на вкладке «Ввод-вывод» установите для параметра Использовать FSC с сглаженными растворителями? значение «Да». По завершении выполнения выполните задание постобработки (шаг 8.8) и изучите карту в UCSF Chimera (шаг 5.2).

11. Передача координат частиц RELION-3 и 3D карты в Сципион 3

  1. Для дальнейшего уточнения и проверки карты RELION-3 сначала импортируйте объем и частицы из последнего задания постобработки (шаг 10.4) в Scipion 3. Запустите Scipion 3 и создайте новый проект.
  2. На левой панели «Протоколы » выберите раскрывающийся список «Импорт» и нажмите « Импортировать частицы». Измените следующие параметры: Импорт из: RELION-3, Star File: postprocess.star и укажите параметры получения, как показано в шаге 1.3. Нажмите кнопку Выполнить.
  3. Щелкните раскрывающийся список Импорт и выберите Импорт томов. В разделе Импорт от укажите путь к карте RELION-3. Измените размер пикселя (частоту дискретизации) Å/px на 1,045 и выполните.

12. Scipion 3 - Уточнение высокого разрешения

  1. Во-первых, выполните глобальное выравнивание. Выберите раскрывающийся список Уточнить на панели Протоколы и нажмите на Xmipp3 - highres24. Введите импортированные частицы и тома из шагов 11.2 и 11.3 в виде полноразмерных изображений и начальных томов соответственно и установите для группы симметрии икосаэдрическое значение. На вкладке Выравнивание изображения в разделе Угловое назначение выберите Глобальный, установите для параметра Максимальное целевое разрешение значение 3 Å и выполните задание.
  2. Когда задание будет завершено, нажмите «Анализировать результаты». В новом окне нажмите на значок UCSF Chimera , чтобы просмотреть уточненный объем. Кроме того, нажмите «Графики разрешения дисплея» (FSC), чтобы увидеть, как изменился FSC после уточнения, а также «График гистограммы с угловыми изменениями», чтобы увидеть, изменились ли назначения угла Эйлера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от разрешения входной структуры RELION-3 этот шаг может быть повторен несколько раз с различными значениями, установленными для максимального целевого разрешения на вкладке Угловое назначение . Для получения дополнительной информации см. учебник Scipion25.
  3. Повторите шаг 12.1 с локальным выравниванием. Скопируйте предыдущее задание и измените Параметр Выбрать предыдущий запуск на Xmipp3 - highres Global. На вкладке Угловое назначение измените выравнивание изображения на Локальное. Установите для параметра Максимальное целевое разрешение значение 2,1 Å.
  4. Изучите уточненную карту в UCSF Chimera и проанализируйте изменение FSC и угловых присвоений (шаг 12.2). Повторяйте локальное уточнение до тех пор, пока разрешение не улучшится и угловые назначения не сойдутся, при необходимости настраивая максимальное целевое разрешение .
  5. Выходная карта из Scipion 3 может быть дополнительно модифицирована плотностью и заточена в Phenix26.

13. Scipion 3 - Проверка карты

  1. Изучите локальное разрешение окончательной карты, сгенерированной в Xmipp3 - highres. Откройте Xmipp - локальный MonoRes27 и введите окончательный том из предыдущего задания и маску, сгенерированные на шаге 8.6. Установите диапазон разрешения от 1 до 6 Å с интервалом 0,1 Å и выполните задание.
  2. Когда вы закончите работу, нажмите «Анализировать результаты» и изучите гистограмму разрешения и объемные фрагменты, окрашенные разрешением.
  3. Чтобы увидеть, хорошо ли выровнены частицы, откройте Multireference Alignability28 и введите частицы и объем с шага 12.3. Щелкните Анализ результатов, чтобы отобразить график проверки. В идеале все точки должны быть сгруппированы вокруг (1.0,1.0).
  4. Откройте Xmipp3 - Проверка перенастройки. Введите частицы и объемы из шага 12.3. Когда закончите работу, проанализируйте результаты и осмотрите график перенастройки. Пересечение выровненных кривых гауссовского шума и выровненных частиц указывает на перенастройку.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы представили комплексный конвейер SPA для получения структуры высокого разрешения с использованием трех различных платформ обработки: cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3. На рисунках 1 и 4 обобщен общий рабочий процесс обработки, а в таблице 1 подробно описаны протоколы уточнения. Эти протоколы использовались во время уточнения структуры AAV 2.3 Å, достигая разрешения, близкого к Найквисту.

Фильмы были сначала импортированы в cryoSPARC v3, а затем скорректированы движением и CTF для получения усредненных микроснимков. При выборе микроснимков для дальнейшей обработки важно выбирать снимки с хорошей CTF-посадкой и низким астигматизмом (рисунок 2), так как включение некачественных микроснимков может препятствовать более поздним стадиям обработки, что приводит к реконструкции с более низким разрешением. Затем 27 364 частицы были отобраны и извлечены из выбранных микроснимков. Поскольку диаметр AAV составляет приблизительно 220 Å, а размер пикселя составляет 1,045 Å, был использован размер коробки 300 px. Затем итеративная 2D-классификация была использована для удаления артефактов и частиц, не сходящихся к стабильным классам. Примеры выбранных и исключенных средних значений 2D-классов представлены на рисунке 3. Также важно отметить, что средние классы, отражающие различные конформации образца, должны быть уточнены отдельно, чтобы получить несколько 3D-реконструкций. В таком случае следует рассчитать несколько начальных томов ab initio . Здесь была отобрана и использована 26 741 частица для ab initio моделирования и однородного уточнения одной структуры 2,9 Å.

После передачи координат частиц, отобранных в cryoSPARC v3, в RELION-3 мы провели четыре дополнительных раунда 2D-классификации, пока набор данных не сошелся к стабильным 2D-классам. Вышеописанная 2D-классификация удалила дополнительные 3 154 частицы из набора данных. Используя структуру, сгенерированную в cryoSPARC v3 в качестве исходной модели, 3D-уточнение в RELION-3 дало структуру с почти эквивалентным разрешением 2,95 Å. Последующие структурные усовершенствования, которые включали коррекцию движения каждой частицы и уточнения CTF, увеличили разрешение до 2,61 Å. Полный перечень выполненных нами доработок представлен в таблице 1. Объем, рассчитанный в RELION-3, затем был дополнительно уточнен в Scipion 3 с использованием нескольких раундов уточнения с высоким разрешением (Xmipp3 - highres). Во время последующих раундов уточнения дополнительные 3 186 частиц были удалены из набора данных, в результате чего получился окончательный набор из 20 401 частицы, что привело к реконструкции AAV на 2,3 Å (рисунок 5 и рисунок 6). Таким образом, учитывая размер пикселя 1,045 Å, наши уточнения почти достигли предела Найквиста. Кривые FSC, представляющие структуры, рассчитанные с помощью каждой программы, показаны на рисунке 6. Эти кривые FSC указывают на увеличение разрешения на протяжении всего рабочего процесса. Поскольку разрешение может варьироваться от точки к точке на карте, часто более целесообразно представлять распределение оценок локального разрешения на карте, а не сообщать одну оценку разрешения в соответствии с одним критерием (например, критерием 0,143) из кривой FSC. Таким образом, мы провели такой анализ с помощью Xmipp - MonoRes в Scipion 3. На рисунке 7 показано сравнение оценок локального разрешения для карт, полученных с помощью cryoSPARC v3 и Scipion 3. Оценки разрешения при четырех различных срезах через структуры (рисунок 7A, B) и гистограммы разрешения (рисунок 7C) ясно демонстрируют постепенное улучшение локального разрешения между картами на протяжении всего рабочего процесса. Кривая FSC, рассчитанная с использованием программы Xmipp3 - highres в Scipion 3, указывает на то, что предел Найквиста был достигнут (рисунок 6), предполагая, что оценка разрешения, скорее всего, ограничена недодискретизацией29. Однако анализ MonoRes, представленный на рисунке 7C, наряду с тщательным анализом карты ЭМ и подгонкой карты с атомными координатами AAV (рисунок 5), предполагает, что более адекватная оценка разрешения для карты составляет 2,3 Å. Аналогичная стратегия согласования оценок резолюции FSC и MonoRes была представлена ранее24,25. Поскольку на оценку разрешения может влиять маска, используемая на этапах уточнения, важно убедиться, что маска не исключает какую-либо часть плотности. Маска, используемая в этом исследовании, перекрывающаяся с 3D-реконструкциями, представлена на рисунке 7D. Постепенное увеличение разрешения в представленном рабочем процессе подчеркивает преимущество использования алгоритмов из нескольких пакетов программного обеспечения SPA для достижения высококачественной 3D-реконструкции с высоким разрешением.

Построение модели in-situ или подгонка карты с уже существующей атомной моделью может служить проверкой качества рассчитанной структуры. Мы визуализировали окончательную карту в UCSF Chimera и оснастили карту ранее опубликованной атомной моделью (PDB ID: 7kfr)30. На рисунке 5 показаны области крио-ЭМ карты, снабженные атомными координатами AAV. Четко определенные плотности ЭМ позволяют подогнать боковые цепи отдельных аминокислот, молекул воды и ионов магния и подтвердить согласие крио-ЭМ-карты с атомной моделью.

Figure 1
Рисунок 1: Полный рабочий процесс SPA в cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 и Phenix 1.18. Этапы, выполненные в cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 и Phenix 1.18, обозначаются фиолетовыми, оранжевыми, зелеными и серыми полями соответственно. Время, необходимое для завершения каждого шага с использованием процессора, оснащенного 8 GPU, 40 CPU и 750 ГБ оперативной памяти, указывается в каждом отдельном блоке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Выбор микроснимков для последующей обработки в cryoSPARC v3. (A) Микроснимки с хорошо подобранными оценочными и экспериментальными кольцами Тона использовались для дальнейшей обработки, в то время как снимки с высоким астигматизмом и плохой посадкой (B) были отброшены. Микроснимки с CTF-посадкой выше 5 Å, астигматизмом более 400 Å и относительной толщиной льда ниже 2 были удалены из дальнейшей обработки, т. е. 70/395 микроснимков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Выбор 2D классов. Выбираются средние значения 2D-классов, содержащие четко определенные классы (A), а классы с низким разрешением, шумом и частичными частицами отклоняются (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Рабочий процесс и репрезентативные результаты для обработки AAV в cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3. Шаги, выполненные в cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3, обозначаются фиолетовыми, оранжевыми и зелеными стрелками соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Структура AAV с высоким разрешением показывает четко определенные плотности ЭМ, представляющие различные элементы вторичной структуры и отдельные боковые цепи аминокислот. (A) Окончательная карта AAV. (B) Часть карты, представляющая бета-листы, оснащенные атомными координатами AAV (PDB ID: 7kfr)30. (C) Карта плотностей, представляющих отдельные аминокислоты. Слева направо: аргинин, фенилаланин и триптофан. (D) Особенности карты с высоким разрешением включают молекулы воды, представленные в красных и ионах магния, представленных в виде зеленых сфер. Ион Mg2+ , показанный на рисунке, координируется остатками гистидина (слева) и аргинина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Кривые FSC от cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3 показывают увеличение разрешения в рабочем процессе. В то время как кривая FSC, рассчитанная с использованием программы Xmipp3 - highres в Scipion 3, указывает на то, что предел Найквиста был достигнут, предполагая, что оценка разрешения ограничена недостаточной выборкой29, более адекватный анализ разрешения карты представлен на рисунке 7 и обсуждается в разделе Репрезентативные результаты24,25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Проверка окончательной реконструкции в Scipion 3 с помощью Xmipp - MonoRes. Разрешение карты лучше описать, представив локальные распределения разрешения, а не одну оценку разрешения в соответствии с одним критерием из кривой FSC. (А-Б) Панели A и B показывают различные фрагменты из карт, сгенерированных в cryoSPARC v3 и Scipion 3 соответственно. (C) Гистограммы, демонстрирующие систематическое увеличение локального разрешения для карт, рассчитанных в криоСПАРК v3 (розовые полосы) и Scipion 3 (синие полосы). (D) Маска (серая), используемая для расчетов локального разрешения, содержит все части плотности AAV, уточненные в обеих программах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Программа Тип уточнения Сценарий
криоСПАРК v3 Однородное рафинирование Однородное рафинирование
Неравномерное уточнение Неоднородное уточнение
Гетерогенная рафинировка Гетерогенная рафинировка
Коррекция движения на частицу Коррекция локального движения
РЕЛИОН-3 3D уточнение Уточнение3D
Постобработка - B-факторная резкость, коррекция MTF Уточнение3D
Полировка частиц Байесовская полировка
Уточнение CTF - наклон луча CtfRefine
Уточнение CTF - анизотропное увеличение CtfRefine
Уточнение CTF - расфокусировка на частицу, астигматизм на частицу/микрофотографию CtfRefine
Коррекция кривизны сферы Эвальда Relion_reconstruct
Сципион 3 Уточнение высокого разрешения Xmipp3 - высокое разрешение
Феникс 1.18 Изменение плотности и резкость ResolveCryoEM

Таблица 1: Уточнения, реализованные на протяжении всего рабочего процесса. Применимость определенных уточнений к конкретному проекту зависит от качества данных и параметров сбора. Например, коррекция кривизны сферы Эвальда может быть применена для карт, которые уже имеют высокое разрешение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы представляем надежный рабочий процесс SPA для обработки крио-EM данных на различных программных платформах для достижения 3D-реконструкций с высоким разрешением (рисунок 1). Этот рабочий процесс применим к широкому спектру биологических макромолекул. Последующие этапы протокола описаны на рисунке 4, включая предварительную обработку фильма, отбор и классификацию частиц, а также несколько методов уточнения структуры (таблица 1) и валидации. Представлены этапы обработки в cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3, а также способы передачи данных между программными пакетами. Мы показали промежуточные структуры, полученные по всему протоколу с возрастающим разрешением (рисунок 4, рисунок 6 и рисунок 7).

Хотя методы, описанные в этой рукописи, могут быть использованы для определения структуры различных белков и биологических сборок, важно отметить, что AAV является идеальным кандидатом для определения структуры высокого разрешения крио-ЭМ и SPA, поскольку его большой размер создает высокую контрастность в микроскопе, а икосаэдрическая симметрия дает частицы с 60-кратной избыточностью субъединицы. Получение реконструкций с высоким разрешением становится все более трудным для небольших (т.е. менее 100 кД), динамических и гетерогенных образцов. Чтобы успешно выполнить этот протокол, очень важно, чтобы для обработки было собрано много высококачественных фильмов. При некачественных необработанных данных получение высокой разрешающей и качественной реконструкции невозможно. Например, если толщина льда не является оптимальной для определения структуры или если частицы прилипают к границе раздела лед-вода или демонстрируют предпочтительные ориентации, пересмотрите условия замерзания сетки.

Другим важным шагом в рабочем процессе является сбор и извлечение частиц. Во время отбора частиц размер коробки должен быть примерно в 1,4-2,5 раза больше самой длинной оси частицы, так как требуется достаточный размер коробки для захвата информации с высоким разрешением, распространяемой из-за расфокусировки. Однако большие размеры коробок требуют более длительного времени обработки из-за увеличения размера файлов, генерируемых во время извлечения частиц. При выборе размера коробки учитывайте диаметр частиц и размер пикселя. Со многими частицами пользователь может захотеть извлечь частицы во время экстракции для первоначальной обработки, а затем повторно извлечь частицы полного размера для окончательных уточнений. Этот протокол использует ручной отбор частиц для создания шаблонов для автоматического выбора. Тем не менее, cryoSPARC v3 также предлагает полностью автоматизированные методы сбора, включая сборщик на основе больших двоичных объектов и оболочку Topaz, которая использует глубокое обучение для выбора частиц на основе предыдущих пиков. Хотя эти алгоритмы очень надежны, значительное количество пиков должно быть позже удалено 2D и 3D классификацией.

Критические этапы также включают 2D и 3D классификацию, используемую для удаления артефактов, таких как частицы, поврежденные радиацией, и отдельные различные структурные формы образца, присутствующие в образце, соответственно. Количество 2D-классов, установленных пользователем, должно зависеть от количества частиц, извлеченных из микроснимков, контрастности и неоднородности в образце, поскольку цель состоит в том, чтобы отделить каждый отдельный вид частицы в отдельный 2D-класс. Как правило, добавляют 2D-класс на каждые 100 частиц, и при обработке нового образца с большим количеством частиц 100 классов является хорошей отправной точкой. Если низкое или умеренное разрешение получено даже после многих раундов 2D- и 3D-классификации, попробуйте повторно извлечь частицы с большим размером коробки, чтобы увидеть, можно ли получить больше структурной информации. Сообщая о разрешении окончательной реконструкции, следует проанализировать кривую FSC, полученную по методу золотого стандарта, наряду с локальными оценками разрешения и тщательным осмотром плотностей карты, а также их согласованием с атомной моделью.

Для уточнения структур вируса коррекция кривизны сферы Эвальда, реализованная в RELION-3, продемонстрировала улучшения при высоком разрешении31. При уточнении структур динамических многобелковых комплексов попробуйте 3D-многотелесную доработку, реализованную в RELION-3, или сфокусированную классификацию с вычитанием изображения, реализованную в RELION-3 и cryoSPARC v3. Если гетерогенность не может быть разрешена вычислительным путем, необходимо пересмотреть условия пробоподготовки32. Недостаточная чистота или неадекватная подготовка, приводящая к деградации белка, будет препятствовать качеству 3D-реконструкции. Кроме того, буферные условия, которые дестабилизируют белки или способствуют агрегации, серьезно ограничивают количество четко определенных частиц, которые могут быть использованы для расчета структуры. Таким образом, для наиболее эффективного использования представленных здесь методов необходимо определить оптимальные условия стабильности образца. Мы рекомендуем электронную микроскопию с отрицательным окрашиванием для скрининга образцов перед крио-ЭМ.

Поскольку крио-ЭМ стал предпочтительным методом определения 3D-структуры для все большего числа структурных биологов, потребность в интегративном и надежном рабочем процессе для обработки изображений и определения структуры становится все более очевидной. CryoSPARC предлагает простой в использовании графический веб-интерфейс пользователя (GUI), который позволяет пользователям всех уровней опыта быстро обрабатывать данные и вычислять 3D-структуру. Примечательно, что CryoSPARC использует стохастический градиентный спуск для выполнения ab initio 3D-реконструкции. Кроме того, программное обеспечение использует алгоритм оптимизации ветвей и связанных вероятностей для быстрого уточнения 3D-карты7. Конвейер обработки, описанный в этой статье, использует cryoSPARC v3 для получения исходной 3D-карты. Затем 3D-реконструкция уточняется в RELION-3, популярном пакете, который использует эмпирический байесовский подход для оценки критических параметров на основе набора данных пользователя, тем самым уменьшая потребность в экспертных знаниях для работы программы10. В частности, мы используем байесовскую полировку для коррекции движения каждой частицы и уточнения CTF для улучшения разрешения. Наконец, результирующая структура дополнительно уточнена и проверена в Scipion 311, интегративной оболочке Python, которая поддерживает алгоритмы с нескольких платформ, включая Xmipp13, EMAN28, SPIDER12 и другие. В то время как для пользователей крио-ЭМ доступно множество различных программных пакетов, в настоящее время нет универсальной платформы SPA, принятой на местах. Хотя рабочий процесс SPA может быть полностью выполнен в любом из трех пакетов программного обеспечения, описанных в этой статье, различные алгоритмы могут давать различные результаты. Следовательно, отдельные шаги должны быть настроены в зависимости от выборки и качества данных. Например, для текущего набора данных 3Drefine в RELION-3 увеличил разрешение 3D-реконструкции, в то время как Nonuniform уточнение в cryoSPARC v3 привело к небольшому снижению разрешения. Таким образом, очень полезно использовать различные программы для пересчета структур для достижения оптимального качества и разрешения и облегчения проверки реконструкций. Хотя Scipion 3 содержит многочисленные алгоритмы от cryoSPARC v3 и RELION-3, самые последние реализации этих программ не сразу доступны в Scipion. Например, из программ, используемых в этой рукописи, только RELION-3 предлагает коррекцию кривизны сферы Эвальда через сценарий Relion_reconstruct. Конвейер, представленный в этой статье, предоставляет руководство как для новых, так и для опытных пользователей по успешному использованию алгоритмов, реализованных в cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3, для расчета 3D-структур с почти атомным разрешением.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Карлоса Оскара Сорцано за помощь в установке Scipion3 и Килиана Шнелле и Арне Мёллера за помощь в передаче данных между различными платформами обработки. Часть этого исследования была поддержана грантом NIH U24GM129547 и выполнена в PNCC в OHSU и доступна через EMSL (grid.436923.9), Пользовательский объект Управления науки Министерства энергетики США, спонсируемый Управлением биологических и экологических исследований. Это исследование было поддержано грантом стартапа от Ратгерского университета Ареку Кульчику.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. https://cryosparc.com/
CTFFIND 4 Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2 UCSF Macromolecular Structure Group https://msg.ucsf.edu/software
Phenix Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) http://www.phenix-online.org/
PyEM Univerisity of California, San Francisco https://github.com/asarnow/pyem
RELION MRC Laboratory of Structural Biology https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Tags

Биохимия Выпуск 179 криоэлектронная микроскопия крио-ЭМ анализ одной частицы SPA cryoSPARC RELION Scipion обработка изображений расчет структуры AAV
Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A… More

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. J. Vis. Exp. (179), e63387, doi:10.3791/63387 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter