Summary
本文介绍了如何有效利用三种冷冻电镜处理平台，即 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3，创建适用于各种单颗粒数据集的单一且强大的工作流程，以实现高分辨率结构测定。
Abstract
仪器和图像处理软件的最新进展使单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）成为结构生物学家确定各种大分子高分辨率结构的首选方法。多个软件套件可供新手和专家用户使用，用于图像处理和结构计算，从而简化了相同的基本工作流程：显微镜探测器采集的电影将进行光束诱导运动和对比度传递函数（CTF）估计的校正。接下来，从平均电影帧中选择并提取粒子图像以进行迭代 2D 和 3D 分类，然后进行 3D 重建、细化和验证。由于各种软件包采用不同的算法，并且需要不同程度的专业知识才能运行，因此它们生成的3D地图在质量和分辨率上通常不同。因此，用户定期在各种程序之间传输数据以获得最佳结果。本文为用户提供了在流行的软件包中导航工作流程的指南：cryoSPARC v3，RELION-3和Scipion 3，以获得腺相关病毒（AAV）的近原子分辨率结构。我们首先详细介绍了使用 cryoSPARC v3 的图像处理管道，因为它的高效算法和易于使用的 GUI 使用户能够快速获得 3D 地图。在下一步中，我们使用 PyEM 和内部脚本将粒子坐标从 cryoSPARC v3 中获得的最高质量的 3D 重建转换和传输到 RELION-3 和 Scipion 3，并重新计算 3D 贴图。最后，我们概述了通过集成RELION-3和Scipion 3的算法来进一步改进和验证所得结构的步骤。在本文中，我们将介绍如何有效地利用三个处理平台来创建适用于各种数据集的单一且强大的工作流程，以实现高分辨率结构确定。
Introduction
冷冻电子显微镜（cryo-EM）和单颗粒分析（SPA）能够确定各种生物分子组件在其水合状态下的结构，有助于阐明这些大分子在原子细节中的作用。显微镜光学，计算机硬件和图像处理软件的改进使得在分辨率超过2 Å1，2，3的情况下确定生物分子的结构成为可能。2020年，蛋白质数据库（PDB）中沉积了超过2，300个冷冻电镜结构，而2014年为192个4，这表明冷冻电镜已成为许多结构生物学家的首选方法。在这里，我们描述了一个结合三种不同的SPA程序进行高分辨率结构测定的工作流程（图1）。
SPA的目标是从显微镜检测器记录的嘈杂的2D图像中重建目标标本的3D体积。探测器将图像收集为具有相同视场的单个帧的短片。为了保存样品，以低电子剂量收集帧，因此具有较差的信噪比（SNR）。此外，电子暴露可以在玻璃化的冷冻电镜网格内诱导运动，导致图像模糊。为了克服这些问题，对帧进行对齐以校正光束诱导的运动，并进行平均以产生具有增加SNR的显微照片。然后，这些显微照片进行对比度传递函数（CTF）估计，以解释显微镜施加的散焦和像差的影响。从CTF校正的显微照片中，选择，提取单个颗粒并将其分类为2D级平均值，代表样品在玻璃冰中采用的不同取向。生成的齐次粒子集用作 从头开始3D重建的输入，以生成一个或多个粗略模型，然后迭代细化以产生一个或多个高分辨率结构。重建后，进行结构细化以进一步提高冷冻电镜图的质量和分辨率。最后，要么直接从映射中导出原子模型，要么映射拟合从其他地方获得的原子坐标。
不同的软件包可用于完成上述任务，包括Appion5，cisTEM6，cryoSPARC7，EMAN8，IMAGIC9，RELION10，Scipion11，SPIDER12，Xmipp13等。虽然这些程序遵循类似的处理步骤，但它们采用不同的算法，例如，选择粒子，生成初始模型和优化重建。此外，这些程序需要不同程度的用户知识和干预才能运行，因为有些程序依赖于参数的微调，这些参数可能会成为新用户的障碍。这些差异通常会导致跨平台的地图质量和分辨率不一致14，促使许多研究人员使用多个软件包来优化和验证结果。在本文中，我们将重点介绍使用 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 获得 AAV 的高分辨率 3D 重建，AAV 是基因治疗广泛使用的载体15。上述软件包对学术用户免费;cryoSPARC v3 和 Scipion 3 需要许可证。
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Protocol
1. 创建新的 cryoSPARC v3 项目并导入数据
注：数据是在波特兰的俄勒冈健康与科学大学（OHSU）使用配备Falcon 3直接电子探测器的300 kV Titan Krios电子显微镜获取的。在计数模式下收集图像，总剂量为28.38 e−/Å2 ，分频129帧，散焦范围为-0.5μm至-2.5μm，使用EPU的像素尺寸为1.045 Å。AAV-DJ的样本由OHSU的工作人员提供。
- 在 Web 浏览器中打开 cryoSPARC v3，然后单击“ 项目 ”标头。选择“ + 添加” 以创建新项目。相应地为项目命名，并提供将保存作业和数据的现有目录的路径。
- 为项目创建工作区，方法是打开项目，单击“ + 添加”，然后选择“ 新建工作区”。为工作区添加标题，然后单击“ 创建”。
- 导航到新工作区，然后在右侧面板上打开 作业生成器 。此选项卡显示 cryoSPARC v3 中可用的所有功能。单击“ 导入短片” 并提供短片路径、增益参考文件路径，并按如下方式设置采集参数： 原始像素尺寸 1.045 Å、 加速电压 300 kV、 球面像差 2.7 mm、 总曝光剂量 28.38 e-/Å^2。
- 单击“ 队列”，选择运行作业的通道和工作区，然后单击“ 创建”。
注：采集参数取决于样品和显微镜。
2. CryoSPARC v3 - 短片对准和CTF估计
- 打开 贴片运动校正（多）。此作业需要将步骤 1.3 中导入的电影作为输入。在工作区中打开导入电影作业卡，然后将 Imported_movies 输出拖动到新作业上的电影占位符。 对 作业进行排队。
注意：有关本文中概述的 cryoSPARC 方法的详细信息，请参阅 cryoSPARC 教程16。 - 要执行 CTF 估计，请打开 修补程序 CTF 估计（多重）。输入在步骤 2.1 中生成的显微照片，并将作业 排入队列 。
- 要检查平均和CTF校正的显微照片并选择子集进行进一步处理，请打开 “策划曝光” 并输入在步骤2.2中获得的曝光。 对 作业进行排队。
- 作业进入 等待 模式后，单击作业卡上的 交互 选项卡，调整参数阈值，并接受或拒绝单个显微照片以进行进一步处理。接受具有良好匹配的估计和实验CTF的显微照片（图2），并丢弃散光度高，CTF拟合不良和厚冰的显微照片。
- 在处理当前数据时，将散光的上限阈值设置为 400 Å，将 CTF 拟合分辨率设置为 5 Å，将相对冰层厚度设置为 2。单击“ 完成 ”以选择要进行下游处理的显微照片。
3. CryoSPARC v3 - 手动和基于模板的颗粒拣选
- 打开 手动选取器，输入步骤 2.4-2.5 中接受的公开，然后将作业 排队 。单击“ 交互式 ”选项卡，将 “框大小（px） ”设置为300，然后单击多个显微照片中的几百个粒子，避免选择重叠的粒子。在这里，选择了29张显微照片中的340个颗粒。完成后，单击“ 完成拣选！提取颗粒。
注意：此协议使用手动粒子拾取来生成用于自动选择的模板。但是，也可以使用其他方法17。 - 要生成用于自动颗粒拣选的模板，请单击 2D 分类 并输入在步骤 3.1 中生成的颗粒拣选。将 2D 类 的数量更改为 10，然后对作业进行 排队 。
- 打开 选择 2D 类。输入在步骤3.2中获得的粒子和类平均值，然后单击 “交互式 ”选项卡。选择具有良好SNR的代表性2D类，然后单击 完成。
注意：类平均值反映了不同的粒子视图。选择反映每个视图的类平均值。目标是生成定义明确的模板，代表样品的不同视图，以便自动拣选。 - 打开 模板选取器 并输入步骤 3.3 中选择的 2D 类和步骤 2.4-2.5 中的显微照片。将 “粒子直径 （Å）”设置为 220 Å，然后对作业进行 排队 。
- 要检查自动拣选，请打开 “选择粒子选取”，输入步骤 3.4 中生成的粒子和显微照片，然后对作业进行 排队 。
- 在“选择粒子选取”作业卡上，单击“交互”选项卡，然后将“框大小（px）”设置为 300。单击单个显微照片，调整低通滤波器，直到颗粒清晰可见，并将归一化互相关（NCC）阈值设置为0.41，功率阈值设置为54000和227300。
- 检查几张显微照片，并在需要时调整阈值，以便在不包含假阳性的情况下选择大多数颗粒。完成后，单击 “完成拣选！提取颗粒。
注意：真实粒子通常具有较高的NCC和功率分数，表明它们分别与模板相似并具有高SNR。 - 打开显微照片的提取，并输入步骤3.7中的显微照片和颗粒。将“提取的框大小（px）”设置为 300，并对作业进行排队。
4. CryoSPARC v3 - 2D 分类
- 单击 2D 分类 并输入步骤 3.8 中提取的粒子。将 2D 类数 设置为 50 并将作业 排入队列 。
- 要选择最佳 2D 类以进行进一步处理，请打开 选择 2D 类。输入在步骤4.1中获得的粒子和类平均值。单击“ 交互 ”选项卡，然后根据类中的分辨率和粒子数选择 2D 类（图 3）。不要选择包含工件的类。选择后，单击“ 完成”。
注意：通常，需要多轮2D分类来去除颗粒，这些颗粒不会收敛成不同的，定义明确的类别。根据需要运行任意多轮 2D 分类，以从数据集中删除此类粒子（图 3）。
5. CryoSPARC v3 - 从头开始 重建和均匀细化
- 要生成初始 3D 体积，请打开 Ab-initio 重建 并输入在步骤 4.2 或从最终 2D 分类中获得的粒子。将 对称性 调整为二十面体。 对 作业进行排队。
注意：对称性与样品相关，应相应地进行更改。如果未知，请使用 C1 对称性。 - 开放式 同质细化。输入步骤 5.1 中的体积和 4.2 中的颗粒或最终的 2D 分类。更改 “对称性” 并将作业 排队 。作业完成后，检查傅里叶壳相关 （FSC） 曲线并下载卷以在 UCSF Chimera18 中进行检查。
6. 从 cryoSPARC v3 导出粒子坐标，并使用 PyEM 将其导入 RELION-3
注：粒子坐标携带有关每个显微照片中单个粒子位置的信息。将坐标而不是粒子堆栈传输到RELINE-3允许运行否则不可用的优化步骤。例如，粒子抛光需要访问初始影片帧。因此，在将粒子坐标从 cryoSPARC v3 导出到 RELION-3 之前，请导入影片并在 RELION-3 中执行运动校正和 CTF 估计。有关详细信息，请参阅 RELION-3 教程19。
- 导航到 RELION-3 项目目录并启动 RELION-3。
- 从作业类型浏览器打开 “导入” ，并指定电影和采集参数的路径，如步骤 1.3 所示。
- 要执行运动校正，请通过 RELION-3 GUI 使用 UCSF MotionCor220，打开 运动校正 并设置 UCSF MotionCor2 手册中的默认参数21。输入在步骤 6.2 中导入的电影的路径。在“ 运动 ”选项卡上，指定 motioncor2 可执行文件的路径。
注意：MotionCor2 可以使用多个 GPU 并行运行。 - 通过 RELION-3 GUI 使用 CTFFIND-4.122 执行 CTF 估计。打开 CTF 估计并输入在步骤 6.3 中生成的 micrographs.star。在 CTFFIND-4.1 选项卡上，指定 CTFFIND-4.1 可执行文件的路径并设置参数，如 RELION-3.1 教程19 中所示。
- 为了将粒子堆栈从 cryoSPARC v3 导入到 RELION-3，首先必须从 cryoSPARC v3 导出。在 cryoSPARC v3 中，打开步骤 4.2 中选择 2D 类 作业的作业卡或最终的 2D 分类。在 “详细信息 ”选项卡上，单击“ 导出作业”。 导出作业 输出particles_exported.cs文件。
- 在将粒子坐标从 cryoSPARC v3 导入到 RELION-3 之前，步骤 6.5 中的particles_exported.cs文件必须转换为 .star 格式。使用 PyEM23，通过执行以下命令，将particles_exported.cs文件转换为 .star 格式： csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
- 在 RELION-3 中，单击手动 拣选 选项卡，然后在 I/O 选项卡上，输入步骤 6.4 中描述的 CTF 细化显微照片。在“ 显示 ”选项卡上，输入以下参数： 粒径（A）： 220，低通滤波器（A）： -1， CTF图像的比例尺： 0.5。 运行 作业。在 RELION-3 主文件夹中生成一个名为 ManualPick 的目录。
注意：执行此步骤是为了在 RELION-3 中创建手动领料文件夹结构。在运行手动拾取时，将为 RELION-3 GUI 中用于拾取的每个平均显微照片创建一个包含已拾取粒子坐标的 .star 文件。 - 导航到包含步骤 6.6 中particles_exported.star 文件的文件夹，然后运行一个家庭编写的脚本，为用于选取冷冻 SPARC v3 颗粒的每个平均显微照片生成一个 manualpick.star 文件，这有助于在步骤 6.5 中导出最终的 2D 分类。生成的坐标文件保存在“手动选择/影片”文件夹中。
- 返回到 RELION-3 并重新启动 手动拣选 作业。单击“ 继续”。这将在 RELION-3 GUI 中显示之前在 cryoSPARC v3 中选取的粒子。检查一些显微照片，以验证粒子坐标的转移是否已完成，以及是否正确选择了粒子。
7. RELION-3 - 颗粒提取和二维分类
- 单击 “粒子提取”。在 I/O 选项卡上，输入步骤 6.4 中的 CTF 校正显微照片和步骤 6.9 中的坐标。单击“ 提取 ”选项卡，然后将 “粒子框大小（像素）” 更改为 300。 运行 作业。
- 执行 2D 分类以进一步清洁在 cryoSPARC v3 中生成的粒子集，以实现更高分辨率的重建。单击 “2D 分类 ”，然后在“ I/O ”选项卡上，输入在步骤 7.1 中生成的 particles.star 文件。在 优化 选项卡上，将 类数 设置为 50， 将掩码直径 （A） 设置为 280。 运行 作业。
注意：掩码应包含整个粒子。 - 要选择最佳的 2D 类，请单击 子集选择 方法，输入步骤 7.2 中的 _model.star 文件，然后 运行 作业。按步骤 4.2 中所述选择类。
- 重复步骤 7.2 和 7.3 以删除非收敛粒子。
8. RELION-3 - 3D细化、蒙版创建和后期处理
- 使用在 cryoSPARC v3（步骤 5.2）中生成的地图作为 RELION-3 中 3D 细化的初始模型。选择 导入 方法并在 I/O 选项卡上设置以下参数： 导入原始影片/缩微照片：否， 原始输入文件： 电影/*.mrc。
- 提供MTF文件并输入短片采集参数，如步骤1.3中所述。在“ 其他 ”选项卡上，选择 cryoSPARC v3 映射作为输入文件，将 “节点类型” 更改为“3D 参考 （.mrc）”，然后 运行 作业。
- 选择“ 3D 自动优化 ”，然后在“ I/O ”选项卡上，将 “输入图像” 设置为步骤 7.3 或上一个选择作业中的 particles.star 文件。给出 cryoSPARC v3 重建作为 参考图。单击“ 参考 ”选项卡，将 初始低通滤波器 （Å） 更改为 50，将 “对称性” 更改为二十面体。在 “优化 ”选项卡上，将 “蒙版直径 （Å）”更改为 280 并 运行 作业。
- 运行完成后，在UCSF Chimera中打开run_class001.mrc。
- 在 UCSF Chimera 中，单击“ 工具 ”，然后在“ 体积数据”下，选择“ 体积查看器”。这将打开一个新窗口来调整音量设置。将 步长 更改为 1 并调整滑块，直到达到地图没有杂色的级别值。记录此值，因为它将在下一步中用于创建掩码。
- 自动细化生成的地图不能反映真实的FSC，因为周围溶剂的噪声会降低分辨率。在后处理之前，创建一个掩模以将试样与溶剂区域区分开来。
- 单击步骤 8.3 中掩 码创建 和输入run_class001.mrc。
- 单击“掩码”选项卡并按如下方式调整参数：低通滤波器贴图 （Å）：10，像素大小 （Å）：1.045，初始二值化阈值：在步骤 8.5 中获得的级别值，扩展二进制映射这么多像素：3，以及添加这么多像素的软边：3。
- 在UCSF Chimera中检查面具。如果遮罩太紧，请 增加“扩展二进制映射”这么多像素 和/或 添加此多个像素的软边。创建具有柔软边缘的蒙版非常重要，因为锋利的蒙版可能会导致过度拟合。
- 单击“ 后处理 ”，然后在“ I/O ”选项卡上，输入在步骤 8.3 中创建的半映射和从 8.6 开始掩码的半映射。将 校准像素大小 设置为 1.045 Å。在锐 化 选项卡上，输入以下内容： 自动估计 B 因子？：是， 自动 B 拟合的最低分辨率 （A）：10， 使用您自己的 B 因子？： 否。在“ 筛选器 ”选项卡上，将“ 跳过 Fsc 加权？” 设置为“否 ”。运行 作业。
9. RELION-3 - 抛光训练和颗粒抛光
- 在校正每个粒子束引起的运动之前，首先使用训练模式来确定数据集的最佳运动轨迹。打开 贝叶斯抛光 ，在 I/O 选项卡上，输入步骤 6.3 中的运动校正显微照片、步骤 8.3 中的粒子和步骤 8.8 中的后处理 .star 文件。单击 训练选项卡 并设置以下参数： 训练最佳参数： 是， 用于测试的傅里叶像素分数：0.5， 使用这么多粒子：5000。 运行 作业。
注意：此脚本将在 RELION-3 波兰语文件夹中生成opt_params_all_groups.txt文件，其中包含执行以下步骤所需的优化抛光参数。 - 训练作业完成后，单击贝 叶斯抛光。单击 训练选项卡， 并将 训练最佳参数？ 设置为否。选择“ 波兰语 ”选项卡，然后在“ 优化的参数文件” 中指定步骤 9.1 中opt_params_all_groups.txt文件的路径。单击“ 运行”。
- 使用一组抛光颗粒重复3D细化（步骤8.3）和后处理（步骤8.8）。
10. RELION-3 - CTF和每颗粒细化
- 要估计高阶像差，请打开 CTF 细化 ，然后在“ I/O ”选项卡上的“ 粒子”下，选择包含最近“细化 3D 作业”（run_data.star） 中抛光粒子的 .star 文件的路径。
- 在“ 后处理星形文件”下，设置最新后处理作业输出的路径（步骤 9.3）。
- 选择 “拟合 ”选项卡并设置以下参数： 估计（各向异性放大倍率）： 否， 执行 CTF 参数拟合？ 否， 估计光束： 是的， 也估计三叶草？ 是的， 估计第四 阶缩写？ 是的。 运行 作业。
- 使用上一个作业（particles_ctf_refine.star）中生成的 粒子（来自Refine3D） 作为输入重复步骤10.1。在 “适合 ”选项卡上，将“ 估计值（各向异性放大倍率）” 更改为“是 ”并运行 作业。
- 使用上一个作业（particles_ctf_refine.star）中生成的粒子（来自Refine3D）作为输入重复步骤10.2。在“拟合”选项卡上，设置以下参数： 估计值（各向异性放大倍率）： 否，执行 CTF 参数拟合？： 是，拟合散焦？： 按粒子，拟合散光？每张显微照片，拟合 B 因子？：否，拟合相移：否，估计光束漂移？：否，估计 4 阶像差？：否。
注意：如果粒子具有足够的对比度，则可以将 “拟合散光？” 选项卡设置为 “每粒子”。对于此数据集， 每粒子 散光细化并未提高地图的质量和分辨率。 - 对步骤 10.3 中的颗粒重复 3D 细化，然后在“I/O”选项卡上， 将“使用溶剂压平的 FSC？” 设置为“是”。完成运行后，执行后处理作业（步骤 8.8）并在 UCSF Chimera 中检查映射（步骤 5.2）。
11. 将 RELION-3 粒子坐标和 3D 贴图传输到 Scipion 3
- 要进一步完善和验证 RELION-3 图谱，请首先将上一个后处理作业（步骤 10.4）中的体积和颗粒导入 Scipion 3。启动 Scipion 3 并创建一个新项目。
- 在左侧 的“协议 ”面板上，选择“ 导入 ”下拉列表，然后单击“ 导入粒子”。更改以下参数： 导入自：RELION-3， 星号文件：postprocess.star，并指定获取参数，如步骤 1.3 所示。单击“ 执行”。
- 单击导入下拉列表 ， 然后选择 导入卷。在 “导入自” 下，给出 RELION-3 地图的路径。将 像素大小（采样率）Å/px 更改为 1.045 并执行。
12. 沉淀 3 - 高分辨率细化
- 首先，执行全局对齐。选择“协议”面板上的“优化”下拉列表，然后单击“Xmipp3 - highres24”。将步骤 11.2 和 11.3 中导入的粒子和体积分别输入为全尺寸图像和初始体积，并将对称组设置为二十面体。在“图像对齐”选项卡上的“角度分配”下，选择“全局”并将“最大目标分辨率”设置为 3 Å，然后运行作业。
- 作业完成后，单击“ 分析结果”。在新窗口中，单击 UCSF Chimera 图标以检查优化的体积。此外，单击“ 显示分辨率图（FSC） ”以查看FSC在优化后的变化情况，以及“ 具有角度变化的图块直方图” 以查看欧拉角分配是否已更改。
注意：根据输入 RELION-3 结构的分辨率，此步骤可能会重复多次，并在“角度分配”选项卡下的“最大目标分辨率”下设置不同的值。有关详细信息，请参阅 Scipion 教程25。 - 重复步骤 12.1 并进行局部对齐。复制上一个作业，并将 “选择上一个运行” 更改为 “Xmipp3 - 全局高分辨率”。在 “角度分配 ”选项卡上，将 “图像对齐方式” 更改为 “本地”。将 最大目标分辨率 设置为 2.1 Å。
- 检查UCSF Chimera中的优化映射并分析FSC和角度分配的变化（步骤12.2）。重复局部细化，直到分辨率没有提高并且角度分配收敛，根据需要调整 最大目标分辨率 。
- Scipion 3的输出图可以在Phenix26中进行额外的密度修改和锐化。
13. Scipion 3 - 地图验证
- 检查在 Xmipp3 中生成的最终映射的局部分辨率 - 高分辨率。打开 Xmipp - 本地 MonoRes27 并输入步骤 8.6 中生成的上一个作业的最终卷和掩码。设置分辨率范围从 1 到 6 Å，间隔为 0.1 Å，然后执行作业。
- 完成运行后，单击“ 分析结果 ”并检查分辨率直方图和按分辨率着色的体积切片。
- 要查看粒子是否对齐良好，请打开 多参考对齐性28 ，然后输入步骤 12.3 中的粒子和体积。单击“ 分析结果” 以显示验证图。理想情况下，所有点都应围绕 （1.0，1.0） 进行聚类。
- 打开 Xmipp3 - 验证过拟合。输入步骤12.3中的颗粒和体积。完成运行后，分析结果并检查过拟合图。对齐的高斯噪声和对齐粒子曲线的交叉表示过度拟合。
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Representative Results
我们提出了一个全面的SPA管道，使用三种不同的处理平台获得高分辨率结构：cryoSPARC v3，RELION-3和Scipion 3。 图 1 和 图 4 总结了常规处理工作流， 表 1 详细介绍了精简协议。这些协议用于改进AAV的2.3 Å结构，达到接近奈奎斯特分辨率。
电影首先被导入到cryoSPARC v3中，随后经过运动和CTF校正以生成平均显微照片。在选择用于进一步处理的显微照片时，选择具有良好CTF拟合和低散光的显微照片非常重要（图2），因为包括低质量的显微照片可能会阻碍后期处理阶段，从而导致较低的分辨率重建。然后从选定的显微照片中选取并提取27，364个颗粒。由于 AAV 的直径约为 220 Å，像素尺寸为 1.045 Å，因此使用了 300 px 的框尺寸。接下来，使用迭代2D分类来去除不收敛到稳定类的伪影和粒子。 图 3 显示了所选和排除的 2D 类平均值的示例。同样重要的是要注意，反映标本不同构象的类平均值应单独细化，以产生多个3D重建。在这种情况下，应计算多个 起始 体积。在这里，选择了26，741个粒子，用于从 头到尾 建模和均匀细化单个2.9 Å结构。
在将cryoSPARC v3中拾取的颗粒的坐标转移到RELION-3之后，我们进行了另外四轮2D分类，直到数据集收敛到稳定的2D类。上述2D分类从数据集中删除了另外3，154个粒子。使用cryoSPARC v3中生成的结构作为初始模型，RELION-3中的3D细化产生了一个几乎等效分辨率为2.95 Å的结构。随后的结构改进，包括每个粒子的运动校正和CTF细化，将分辨率提高到2.61 Å。 表 1 中列出了我们执行的优化的完整列表。在RELION-3中计算的体积随后在Scipion 3中使用多轮高分辨率细化（Xmipp3 - highres）进一步细化。在随后的几轮细化中，从数据集中删除了另外3，186个粒子，最终产生了20，401个粒子，从而产生了AAV的2.3 Å重建（图5 和 图6）。因此，考虑到1.045 Å的像素尺寸，我们的改进几乎达到了奈奎斯特极限。表示使用每个程序计算的结构的FSC曲线如图 6所示。这些 FSC 曲线表示整个工作流程中的分辨率增加。由于地图中的分辨率可能因点而异，因此通常更合适的做法是在地图中显示局部分辨率估计值的分布，而不是根据FSC曲线中的单个标准（例如，0.143标准）报告单个分辨率估计值。因此，我们使用Scipion 3中的 Xmipp - MonoRes 进行了这样的分析。 图7显示了使用cryoSPARC v3和Scipion 3获得的地图的局部分辨率估计值的比较。通过结构（图7A，B）和分辨率直方图（图7C）在四个不同切片处的分辨率估计清楚地表明，在整个工作流程中，地图之间的局部分辨率得到了逐步提高。使用程序 Xmipp3计算 的FSC曲线 - Scipion 3中的高值表明已达到奈奎斯特极限（图6），表明分辨率估计很可能受到采样不足29的限制。然而， 图7C中所示的MonoRes分析，以及对EM图和与AAV原子坐标拟合的图的仔细分析（图5）表明，图谱更合适的分辨率估计值为2.3 Å。在早些时候已经提出了一种类似的策略，可以调和FOSH和MonoRes的分辨率估计值24，25。由于分辨率估计值可能会受到优化步骤中使用的掩模的影响，因此确保掩模不排除密度的任何部分非常重要。本研究中使用的掩模与3D重建重叠， 如图7D所示。所呈现的工作流程中分辨率的逐渐提高凸显了利用来自多个SPA软件包的算法来实现高质量和高分辨率3D重建的优势。
原位 模型构建或使用预先存在的原子模型拟合地图可以作为计算结构的质量检查。我们已经在UCSF Chimera中可视化了最终的地图，并使用先前发布的原子模型（PDB ID：7kfr）30拟合了该地图。 图5 显示了装有AAV原子坐标的冷冻电镜图的区域。明确定义的EM密度允许拟合单个氨基酸，水分子和镁离子的侧链，并确认冷冻电镜图与原子模型的一致性。
图 1：跨 cryoSPARC v3、RELION-3、Scipion 3 和 Phenix 1.18 的完整 SPA 工作流程。在 cryoSPARC v3、RELION-3、Scipion 3 和 Phenix 1.18 中完成的步骤分别用紫色、橙色、绿色和灰色框表示。使用配备 8 个 GPU、40 个 CPU 和 750 GB RAM 的处理服务器完成每个步骤所需的时间在每个单独的框中指定。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：选择用于cryoSPARC v3下游处理的显微照片 （A）具有良好匹配的估计和实验Thon环的显微照片用于进一步处理，而具有高散光和拟合差（B）的显微照片被丢弃。CTF拟合度高于5 Å，散光超过400 Å，相对冰厚度低于2的显微照片从进一步处理中移除，即70/395显微照片。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：选择 2D 类。 选择包含明确定义类的 2D 类平均值 （A），并拒绝具有低分辨率、噪声和部分粒子的 2D 类平均值 （B）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：跨 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 进行 AAV 处理的工作流程和代表性结果。 在 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 中完成的步骤分别用紫色、橙色和绿色箭头表示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：AAV的高分辨率结构显示了明确定义的EM密度，代表不同的二级结构元素和单个氨基酸侧链。（A） AAV的最终地图。（B） 地图的一部分，代表装有AAV原子坐标的beta张（PDB ID：7kfr）30。（C）表示单个氨基酸的映射密度。从左到右：精氨酸，苯丙氨酸和色氨酸。（D）地图的高分辨率特征包括以红色表示的水分子和以绿色球体表示的镁离子。图中显示的Mg2 + 离子由组氨酸（左）和精氨酸残基协调。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 6：来自 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 的 FSC 曲线显示，整个工作流程的分辨率不断提高。虽然使用程序Xmipp3计算的FSC曲线 - Scipion 3中的高光位表明已达到奈奎斯特极限，这表明分辨率估计值受到采样不足29的限制，但图7中提供了对地图分辨率的更充分分析，并在代表性结果部分24，25中进行了讨论。请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：使用 Xmipp - MonoRes 验证 Scipion 3 中的最终重建。通过显示局部分辨率分布而不是根据FSC曲线中的单个标准进行单个分辨率估计，可以更好地描述地图的分辨率。（A-B）图 A 和 B 分别显示了与 cryoSPARC v3 和 Scipion 3 中生成的地图不同的切片。（C） 直方图显示，在 cryoSPARC v3（粉红色条形）和 Scipion 3（蓝色条形图）中计算的地图的局部分辨率系统性提高。（D） 用于局部分辨率计算的掩模（灰色）包含两个程序中优化的 AAV 密度的所有部分。请点击此处查看此图的放大版本。
| 程序 | 细化类型 | 脚本 | |||
| cryoSPARC v3 | 均匀细化 | 均匀细化 | |||
| 非均匀细化 | 非均匀细化 | ||||
| 异构细化 | 异构细化 | ||||
| 每个粒子的运动校正 | 局部运动校正 | ||||
| 瑞能-3 | 3D 细化 | 精炼3D | |||
| 后处理 - B 因子锐化，MTF 校正 | 精炼3D | ||||
| 颗粒抛光 | 贝叶斯抛光 | ||||
| CTF 细化 - 光束倾斜 | CtfRefine | ||||
| CTF 细化 - 各向异性放大倍率 | CtfRefine | ||||
| CTF 细化 - 每颗粒散焦、每颗粒/显微照片散光 | CtfRefine | ||||
| 埃瓦尔德球曲率校正 | Relion_reconstruct | ||||
| 西皮翁 3 | 高分辨率细化 | Xmipp3 - 高空 | |||
| 凤凰 1.18 | 密度修改和锐化 | ResolveCryoEM | |||
表 1：在整个工作流中实施的改进。 某些改进是否适用于特定项目取决于数据质量和采集参数。例如，Ewald 球体曲率校正可应用于已具有高分辨率的地图。
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Discussion
在本文中，我们介绍了一个强大的SPA工作流程，用于跨各种软件平台进行冷冻电镜数据处理，以实现高分辨率的3D重建（图1）。该工作流程适用于各种生物大分子。图4概述了该协议的后续步骤，包括电影预处理，颗粒拾取和分类，以及用于结构细化（表1）和验证的多种方法。已经介绍了 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 中的处理步骤，以及在软件包之间传输数据的方法。我们已经以越来越高的分辨率展示了在整个协议中获得的中间结构（图4，图6和图7）。
虽然本文概述的方法可用于不同蛋白质和生物组装体的结构测定，但重要的是要注意，AAV是通过冷冻电镜和SPA进行高分辨率结构测定的理想候选者，因为它的大尺寸在显微镜中产生高对比度，二十面体对称性产生具有60倍亚基冗余的颗粒。对于小型（即小于 100 kD）、动态和非均质样品，获得高分辨率重建变得越来越困难。为了成功执行此协议，收集许多高质量的电影进行处理至关重要。对于质量较差的原始数据，无法获得高分辨率和高质量的重建。例如，如果冰层厚度不是结构测定的最佳条件，或者如果颗粒粘附在冰水界面上或表现出首选方向，请重新访问网格冻结条件。
工作流程中的另一个重要步骤是颗粒拾取和提取。在颗粒拾取过程中，盒子尺寸应比颗粒的最长轴大约1.4-2.5倍，因为需要足够的盒子尺寸来捕获由于散焦而散布的高分辨率信息。然而，由于颗粒提取过程中生成的文件大小增加，较大的盒子尺寸需要更长的处理时间。选择盒子尺寸时，请考虑颗粒直径和像素尺寸。对于许多颗粒，用户可能希望在提取过程中对颗粒进行箱处理以进行初始处理，然后重新提取全尺寸颗粒以进行最终细化。此协议使用手动粒子拾取来生成用于自动选择的模板。然而，cryoSPARC v3还提供了全自动的拣选方法，包括基于斑点的拾取器和Topaz包装器，它利用深度学习根据以前的拾取来选择颗粒。虽然这些算法非常可靠，但随后需要通过2D和3D分类删除大量拾取。
关键步骤还包括用于去除伪影的2D和3D分类，例如辐射损坏的颗粒以及分别存在于样品中的标本的不同结构形式。用户设置的 2D 类的数量应取决于从显微照片中提取的粒子数量、对比度和标本中的异质性，因为目标是将粒子的每个单独视图分离成单独的 2D 类。作为一般规则，每100个粒子添加一个2D类，如果处理具有大量粒子的新样品，则100类是一个很好的起点。如果即使在多轮2D和3D分类后仍获得低分辨率或中等分辨率，请尝试重新提取具有较大盒子尺寸的颗粒，以查看是否可以获得更多的结构信息。在报告最终重建的分辨率时，应分析根据黄金标准方法获得的FSC曲线，以及局部分辨率估计值和仔细检查地图密度，以及它们与原子模型的一致性。
为了改进病毒结构，RELION-3中实施的Ewald球体曲率校正在高分辨率31下得到了改进。如果优化动态多蛋白复合物的结构，请尝试在RELION-3中实现的3D多体细化或在RELINE-3和cryoSPARC v3中实现图像减法的聚焦分类。如果无法通过计算解决异质性，则有必要重新审视样品制备条件32。纯度不足或制备不足导致蛋白质降解将阻碍3D重建的质量。此外，破坏蛋白质稳定性或促进聚集的缓冲条件严重限制了可用于结构计算的明确定义的颗粒的数量。因此，为了最有效地利用这里介绍的方法，必须确定样品稳定性的最佳条件。我们建议在冷冻电镜检查之前使用负染色电子显微镜对样品进行筛选。
随着冷冻电镜已成为越来越多的结构生物学家首选的3D结构测定方法，对图像处理和结构测定的综合和强大工作流程的需求变得更加明显。CryoSPARC提供了一个易于使用的，基于Web的图形用户界面（GUI），允许所有经验水平的用户快速处理数据并计算3D结构。值得注意的是，CryoSPARC利用随机梯度下降来执行从头开始的3D重建。此外，该软件采用分支和绑定似然优化算法，用于快速3D地图细化7。本文中描述的处理管道使用 cryoSPARC v3 生成初始 3D 映射。然后，在 RELION-3 中对 3D 重建进行了改进，RELION-3 是一个流行的软件包，它使用经验贝叶斯方法根据用户的数据集估计关键参数，从而减少了对程序操作的专业知识的需求10。具体而言，我们利用贝叶斯抛光进行每个粒子的运动校正和CTF细化以提高分辨率。最后，在Scipion 311中进一步完善和验证了所得结构，Scipion 311是一个集成的Python shell，支持来自多个平台的算法，包括Xmipp13，EMAN28，SPIDER12等。虽然冷冻电镜用户可以使用许多不同的软件包，但目前该领域尚未接受通用SPA平台。尽管 SPA 工作流可以在本文所述的三个软件包中的任何一个中完全执行，但不同的算法可能会产生不同的结果。因此，必须根据数据的样本和质量定制各个步骤。例如，对于当前的数据集，RELION-3中的3Drefine提高了3D重建的分辨率，而cryoSPARC v3中的Nonuniform细化导致分辨率略有下降。因此，利用各种程序重新计算结构以实现最佳质量和分辨率并促进重建的验证是非常有益的。虽然 Scipion 3 包含来自 cryoSPARC v3 和 RELION-3 的众多算法，但这些程序的最新实现在 Scipion 中并未立即可用。例如，在本手稿中使用的程序中，只有RELION-3通过脚本Relion_reconstruct提供了Ewald Sphere曲率校正。本文介绍的管道为新手和有经验的用户提供了一个指南，以成功使用在 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 中实现的算法来计算近原子分辨率的 3D 结构。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Carlos Oscar Sorzano 在 Scipion3 安装方面的帮助，以及 Kilian Schnelle 和 Arne Moeller 在不同处理平台之间传输数据方面的帮助。这项研究的一部分得到了NIH拨款U24GM129547的支持，并在OHSU的PNCC进行，并通过EMSL（grid.436923.9）访问，EMSL是由生物和环境研究办公室赞助的DOE科学用户设施办公室。这项研究得到了罗格斯大学（Rutgers University）向Arek Kulczyk提供的启动资金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
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