Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63387
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

Summary

توضح هذه المقالة كيفية الاستخدام الفعال لثلاث منصات لمعالجة cryo-EM ، أي cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 ، لإنشاء سير عمل واحد وقوي ينطبق على مجموعة متنوعة من مجموعات بيانات الجسيمات المفردة لتحديد بنية عالية الدقة.

Abstract

جعلت التطورات الحديثة في كل من الأجهزة وبرامج معالجة الصور المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) الطريقة المفضلة لعلماء الأحياء الهيكلية لتحديد الهياكل عالية الدقة لمجموعة واسعة من الجزيئات الكبيرة. تتوفر مجموعات برامج متعددة للمستخدمين الجدد والخبراء لمعالجة الصور وحساب الهيكل ، مما يبسط نفس سير العمل الأساسي: تخضع الأفلام التي يتم الحصول عليها بواسطة كاشفات المجهر للتصحيح لتقدير وظيفة الحركة ونقل التباين (CTF) الناجم عن الحزمة. بعد ذلك ، يتم اختيار صور الجسيمات واستخراجها من إطارات الأفلام المتوسطة للتصنيف التكراري 2D و 3D ، تليها إعادة البناء ثلاثية الأبعاد والصقل والتحقق من الصحة. نظرا لأن حزم البرامج المختلفة تستخدم خوارزميات مختلفة وتتطلب مستويات مختلفة من الخبرة للعمل ، فإن خرائط 3D التي تولدها غالبا ما تختلف في الجودة والدقة. وبالتالي ، يقوم المستخدمون بنقل البيانات بانتظام بين مجموعة متنوعة من البرامج للحصول على أفضل النتائج. توفر هذه الورقة دليلا للمستخدمين للتنقل في سير العمل عبر حزم البرامج الشائعة: cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 للحصول على بنية دقة شبه ذرية للفيروس المرتبط بالغدة الدرقية (AAV). نقوم أولا بتفصيل خط أنابيب معالجة الصور باستخدام cryoSPARC v3 ، حيث تسمح خوارزمياته الفعالة وواجهة المستخدم الرسومية سهلة الاستخدام للمستخدمين بالوصول بسرعة إلى خريطة ثلاثية الأبعاد. في الخطوة التالية ، نستخدم PyEM والبرامج النصية الداخلية لتحويل ونقل إحداثيات الجسيمات من أفضل جودة لإعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها في cryoSPARC v3 إلى RELION-3 و Scipion 3 وإعادة حساب الخرائط ثلاثية الأبعاد. وأخيرا، نحدد خطوات لمزيد من التحسين والتحقق من صحة الهياكل الناتجة من خلال دمج خوارزميات من RELION-3 و Scipion 3. في هذه المقالة ، نصف كيفية الاستخدام الفعال لثلاث منصات معالجة لإنشاء سير عمل واحد وقوي ينطبق على مجموعة متنوعة من مجموعات البيانات لتحديد الهيكل عالي الدقة.

Introduction

يتيح الفحص المجهري الإلكتروني المبرد (cryo-EM) وتحليل الجسيمات المفردة (SPA) تحديد بنية مجموعة واسعة من التجمعات الجزيئية الحيوية في حالتها المائية ، مما يساعد على إلقاء الضوء على أدوار هذه الجزيئات الكبيرة بالتفصيل الذري. جعلت التحسينات في بصريات المجهر وأجهزة الكمبيوتر وبرامج معالجة الصور من الممكن تحديد هياكل الجزيئات الحيوية بدقة تتجاوز 2 Å1,2,3. تم إيداع أكثر من 2,300 هيكل من هياكل التبريد EM في بنك بيانات البروتين (PDB) في عام 2020 ، مقارنة ب 192 بنية في عام 20144 ، مما يشير إلى أن cryo-EM أصبح الطريقة المفضلة للعديد من علماء الأحياء الهيكلية. هنا ، نصف سير عمل يجمع بين ثلاثة برامج SPA مختلفة لتحديد بنية عالية الدقة (الشكل 1).

الهدف من SPA هو إعادة بناء أحجام 3D من عينة مستهدفة من صور 2D صاخبة مسجلة بواسطة كاشف المجهر. تجمع أجهزة الكشف الصور كأفلام ذات إطارات فردية من نفس مجال الرؤية. من أجل الحفاظ على العينة ، يتم جمع الإطارات بجرعة إلكترون منخفضة وبالتالي يكون لها نسبة إشارة إلى ضوضاء ضعيفة (SNR). بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي التعرض للإلكترون إلى تحفيز الحركة داخل شبكات التبريد EM المزججة، مما يؤدي إلى عدم وضوح الصورة. للتغلب على هذه المشكلات ، تتم محاذاة الإطارات لتصحيح الحركة التي يسببها الشعاع ومتوسطها لإنتاج ميكروغراف مع زيادة SNR. ثم تخضع هذه المجهر لتقدير دالة نقل التباين (CTF) لحساب آثار عدم التركيز البؤري والانحرافات التي يفرضها المجهر. من الصور المجهرية المصححة بواسطة CTF ، يتم اختيار الجسيمات الفردية واستخراجها وفرزها في متوسطات فئة 2D تمثل اتجاهات مختلفة اعتمدتها العينة في الجليد الزجاجي. يتم استخدام مجموعة الجسيمات المتجانسة الناتجة كمدخلات لإعادة بناء ab initio 3D لإنشاء نموذج أو نماذج خشنة ، والتي يتم تكريرها بعد ذلك بشكل متكرر لإنتاج واحد أو أكثر من الهياكل عالية الدقة. بعد إعادة الإعمار، يتم إجراء تحسينات هيكلية لزيادة تحسين جودة ودقة خريطة cryo-EM. وأخيرا، إما أن يكون النموذج الذري مشتقا مباشرة من الخريطة، أو أن الخريطة مزودة بإحداثيات ذرية تم الحصول عليها في مكان آخر.

تتوفر حزم برامج مختلفة لإنجاز المهام الموضحة أعلاه ، بما في ذلك Appion5 و cisTEM6 و cryoSPARC7 و EMAN8 و IMAGIC9 و RELION10 و Scipion11 و SPIDER12 و Xmipp13 وغيرها. في حين أن هذه البرامج تتبع خطوات معالجة مماثلة، فإنها تستخدم خوارزميات مختلفة، على سبيل المثال، لاختيار الجسيمات، وإنشاء نماذج أولية، وتحسين عمليات إعادة البناء. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب هذه البرامج مستوى متفاوتا من معرفة المستخدم والتدخل للعمل ، حيث يعتمد بعضها على ضبط المعلمات التي يمكن أن تكون بمثابة عقبة أمام المستخدمين الجدد. وغالبا ما تؤدي هذه التناقضات إلى خرائط ذات جودة ودقة غير متناسقتين عبر المنصات14، مما يدفع العديد من الباحثين إلى استخدام حزم برامج متعددة لتحسين النتائج والتحقق من صحتها. في هذه المقالة ، نسلط الضوء على استخدام cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 للحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة ل AAV ، وهو ناقل يستخدم على نطاق واسع للعلاج الجيني 15. حزم البرامج المذكورة أعلاه مجانية للمستخدمين الأكاديميين. يتطلب cryoSPARC v3 و Scipion 3 تراخيص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إنشاء مشروع cryoSPARC v3 جديد واستيراد البيانات

ملاحظة: تم الحصول على البيانات في جامعة أوريغون للصحة والعلوم (OHSU) في بورتلاند باستخدام مجهر إلكتروني تيتان كريوس بقوة 300 كيلو فولت مجهز بكاشف إلكترون مباشر من طراز فالكون 3. تم جمع الصور في وضع العد بجرعة إجمالية قدرها 28.38 e− / Å2 مجزأة عبر 129 إطارا ، ونطاق إلغاء التركيز من -0.5 ميكرومتر إلى -2.5 ميكرومتر ، بحجم بكسل 1.045 Å باستخدام EPU. تم تقديم عينة من AAV-DJ من قبل موظفي OHSU.

  1. افتح cryoSPARC v3 في مستعرض ويب وانقر فوق رأس المشاريع . حدد + إضافة لإنشاء مشروع جديد. قم بتسمية المشروع وفقا لذلك وتوفير مسار إلى دليل موجود حيث سيتم حفظ الوظائف والبيانات.
  2. قم بإنشاء مساحة عمل للمشروع عن طريق فتح المشروع والنقر فوق + إضافة وتحديد مساحة عمل جديدة. قم بتسمية مساحة العمل وانقر على إنشاء.
  3. انتقل إلى مساحة العمل الجديدة وافتح منشئ الوظائف على اللوحة اليمنى. تعرض علامة التبويب هذه جميع الوظائف المتوفرة في cryoSPARC v3. انقر فوق استيراد الأفلام وقم بتوفير مسار الأفلام ، واحصل على مسار ملف مرجعي ، وقم بتعيين معلمات الاكتساب على النحو التالي: حجم Raw Pixel 1.045 Å ، تسريع الجهد 300 kV ، الانحراف الكروي 2.7 مم ، إجمالي جرعة التعرض 28.38 e-/Å^2.
  4. انقر فوق قائمة الانتظار ، وحدد مسارا لتشغيل المهمة ومساحة عمل ، وانقر فوق إنشاء.
    ملاحظة: تعتمد معلمات الاقتناء على العينة والمجهر.

2. CryoSPARC v3 - محاذاة الفيلم وتقدير CTF

  1. افتح تصحيح حركة التصحيح (متعدد). تتطلب هذه المهمة الأفلام المستوردة في الخطوة 1.3 كإدخال. افتح بطاقة مهمة استيراد الأفلام في مساحة العمل واسحب مخرجات Imported_movies إلى العنصر النائب للأفلام في المهمة الجديدة. قم بانتظار الوظيفة.
    ملاحظة: لمزيد من المعلومات حول أساليب cryoSPARC الموضحة في هذه المقالة، راجع البرنامج التعليمي cryoSPARC16.
  2. لإجراء تقدير CTF، افتح تقدير CTF التصحيح (متعدد). أدخل الصور المجهرية التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.1 وقم بانتظار المهمة.
  3. لفحص الصور المجهرية المتوسطة والمصححة بواسطة CTF وتحديد مجموعة فرعية لمزيد من المعالجة، افتح تعرضات Curate وأدخل التعرضات التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2. قم بانتظار الوظيفة.
  4. بعد دخول المهمة في وضع الانتظار ، انقر فوق علامة التبويب التفاعل على بطاقة المهمة ، واضبط عتبات المعلمات ، واقبل أو رفض الرسوم البيانية الدقيقة الفردية لمزيد من المعالجة. اقبل الصور المجهرية ذات CTFs المقدرة والتجريبية المتطابقة جيدا (الشكل 2) وتخلص من تلك التي تحتوي على استجماتيزم مرتفع ، وملاءمة CTF ضعيفة ، وجليد سميك.
  5. أثناء معالجة البيانات الحالية ، اضبط العتبة العليا للاستجماتيزم على 400 Å ، ودقة تناسب CTF على 5 Å ، وسماكة الجليد النسبية على 2. انقر فوق تم لتحديد المصورات للمعالجة النهائية.

3. CryoSPARC v3 - انتقاء الجسيمات اليدوي والقائم على القالب

  1. افتح المنتقي اليدوي، وأدخل التعرضات المقبولة من الخطوات 2.4 إلى 2.5، ثم قم بانتظار المهمة. انقر فوق علامة التبويب تفاعلية ، واضبط حجم الصندوق (px) على 300 ، وانقر فوق بضع مئات من الجسيمات عبر صور مجهرية متعددة وتجنب اختيار الجسيمات المتداخلة. هنا ، تم اختيار 340 جسيما عبر 29 ميكروغرافا. عند الانتهاء ، انقر فوق تم الانتقاء! استخراج الجسيمات.
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول الانتقاء اليدوي للجسيمات لإنشاء قوالب للتحديد التلقائي. ومع ذلك ، تتوفر طرق أخرى أيضا17.
  2. لإنشاء قوالب لاختيار الجسيمات آليا ، انقر فوق تصنيف 2D وأدخل مختارات الجسيمات التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.1. تغيير عدد فئات 2D إلى 10 وقائمة انتظار المهمة.
  3. افتح تحديد فئات 2D. أدخل الجسيمات ومتوسطات الفئات التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.2 وانقر فوق علامة التبويب تفاعلية . حدد فصول 2D التمثيلية مع SNR جيدة وانقر على تم.
    ملاحظة: تعكس متوسطات الفئة طرق عرض جسيمات مختلفة. حدد متوسطات الفئات التي تعكس كل طريقة عرض. الهدف هو إنتاج قوالب محددة جيدا تمثل وجهات نظر مختلفة للعينة للانتقاء الآلي.
  4. افتح منتقي القوالب وأدخل الفئات ثنائية الأبعاد المحددة في الخطوة 3.3 والرسوم البيانية المجهرية من الخطوات 2.4-2.5. اضبط قطر الجسيمات (Å) على 220 Å وقم بانتظار المهمة.
  5. لفحص الاختيارات التلقائية، افتح Select Particle Picks، وأدخل الجسيمات والصور المجهرية التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.4، وقم بانتظار المهمة.
  6. في بطاقة مهمة تحديد اختيارات الجسيمات، انقر فوق علامة التبويب تفاعلية واضبط حجم الصندوق (px) على 300. انقر فوق مجهر فردي ، واضبط مرشح الممر المنخفض حتى تصبح الجسيمات مرئية بوضوح ، واضبط عتبة الارتباط المتقاطع العادي (NCC) على 0.41 وعتبة الطاقة بين 54000 و 227300 .
  7. افحص العديد من الصور المجهرية ، وإذا لزم الأمر ، اضبط العتبات بحيث يتم اختيار معظم الجسيمات دون تضمين إيجابيات خاطئة. عند الانتهاء، انقر فوق تم الانتقاء! استخراج الجسيمات.
    ملاحظة: عادة ما يكون للجسيمات الحقيقية درجة عالية من NCC والطاقة، مما يشير إلى أنها تشبه القالب ولها SNR عالية، على التوالي.
  8. افتح المستخلص من الميكروجرافات وأدخل الصور المجهرية والجسيمات من الخطوة 3.7. اضبط حجم المربع المستخرج (px) على 300 وقم بانتظار المهمة.

4. CryoSPARC v3 - تصنيف ثنائي الأبعاد

  1. انقر فوق تصنيف 2D وأدخل الجسيمات المستخرجة من الخطوة 3.8. تعيين عدد فئات 2D إلى 50 وقائمة انتظار المهمة.
  2. لتحديد أفضل فئات 2D لمزيد من المعالجة، افتح تحديد فئات 2D. أدخل الجسيمات ومتوسطات الفئة التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.1. انقر فوق علامة التبويب تفاعلية واختر فئات ثنائية الأبعاد بناء على الدقة وعدد الجسيمات في الفئة (الشكل 3). لا تحدد الفئات التي تحتوي على القطع الأثرية. بعد التحديد ، انقر فوق تم.
    ملاحظة: عادة ، هناك حاجة إلى جولات متعددة من التصنيف 2D لإزالة الجسيمات ، التي لا تتلاقى في فئات متميزة ومحددة جيدا. قم بتشغيل أكبر عدد ممكن من جولات التصنيف ثنائي الأبعاد حسب الحاجة لإزالة هذه الجسيمات من مجموعة البيانات (الشكل 3).

5. CryoSPARC v3 - إعادة بناء البداية والصقل المتجانس

  1. لإنشاء وحدة تخزين ثلاثية الأبعاد أولية ، افتح Ab-initio Reconstruction وأدخل الجسيمات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.2 أو من التصنيف النهائي ثنائي الأبعاد. ضبط التماثل إلى icosahedral. قم بانتظار الوظيفة.
    ملاحظة: يعتمد التماثل على العينة ويجب تغييره وفقا لذلك. إذا لم يكن معروفا، فاستخدم تناظر C1.
  2. فتح صقل متجانس. أدخل الحجم من الخطوة 5.1 والجسيمات من 4.2 أو التصنيف النهائي ثنائي الأبعاد. تغيير التماثل ووضع المهمة في قائمة الانتظار . عند الانتهاء من المهمة، افحص منحنى ارتباط Fourier Shell (FSC) وقم بتنزيل وحدة التخزين لفحصها في UCSF Chimera18.

6. تصدير إحداثيات الجسيمات من cryoSPARC v3 واستيرادها إلى RELION-3 باستخدام PyEM

ملاحظة: تحمل إحداثيات الجسيمات معلومات حول موقع الجسيمات الفردية في كل ميكروغراف. يسمح نقل الإحداثيات بدلا من مكدسات الجسيمات إلى RELION-3 بتشغيل خطوات التحسين التي لن تكون متاحة بخلاف ذلك. على سبيل المثال، يتطلب تلميع الجسيمات الوصول إلى إطارات الأفلام الأولية. وبالتالي ، قبل تصدير إحداثيات الجسيمات من cryoSPARC v3 إلى RELION-3 ، قم باستيراد الأفلام وإجراء تصحيح الحركة وتقدير CTF في RELION-3. راجع البرنامج التعليمي RELION-319 للحصول على التفاصيل.

  1. انتقل إلى دليل مشروع RELION-3 وقم بتشغيل RELION-3.
  2. افتح استيراد من المستعرض من نوع المهمة وحدد المسار إلى الأفلام ومعلمات الاكتساب كما في الخطوة 1.3.
  3. لإجراء تصحيح الحركة، استخدم UCSF MotionCor220 من خلال واجهة المستخدم الرسومية RELION-3، وافتح تصحيح الحركة واضبط المعلمات الافتراضية كما هو الحال في دليل UCSF MotionCor2222. أدخل المسار إلى الأفلام المستوردة في الخطوة 6.2. على علامة التبويب الحركة، حدد المسار إلى motioncor2 القابل للتنفيذ.
    ملاحظة: يمكن تشغيل MotionCor2 بالتوازي باستخدام وحدات معالجة رسومات متعددة.
  4. قم بإجراء تقدير CTF باستخدام CTFFIND-4.122 من خلال واجهة المستخدم الرسومية RELION-3. افتح تقدير CTF وأدخل micrographs.star الذي تم إنشاؤه في الخطوة 6.3. في علامة التبويب CTFFIND-4.1 ، حدد المسار إلى CTFFIND-4.1 القابل للتنفيذ وتعيين المعلمات كما هو الحال في البرنامج التعليمي RELION-3.1 19.
  5. من أجل استيراد مكدسات الجسيمات من cryoSPARC v3 إلى RELION-3 ، يجب أولا تصديرها من cryoSPARC v3. في cryoSPARC v3، افتح بطاقة المهمة الخاصة بمهمة فئة Select 2D من الخطوة 4.2 أو التصنيف النهائي ثنائي الأبعاد. في علامة التبويب التفاصيل ، انقر فوق تصدير المهمة. تصدير مهمة إخراج ملف particles_exported.cs.
  6. قبل استيراد إحداثيات الجسيمات من cryoSPARC v3 إلى RELION-3، يجب تحويل ملف particles_exported.cs من الخطوة 6.5 إلى تنسيق .star. باستخدام PyEM23 تحويل ملف particles_exported.cs إلى تنسيق .star عن طريق تنفيذ الأمر التالي: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. في RELION-3 ، انقر فوق علامة التبويب الانتقاء اليدوي وعلى علامة التبويب الإدخال / الإخراج ، أدخل الصور المجهرية من تحسين CTF الموضح في الخطوة 6.4. في علامة التبويب عرض، أدخل المعلمات التالية: قطر الجسيمات (A): 220، مرشح الممر المنخفض (A): -1، مقياس لصورة CTF: 0.5. قم بتشغيل المهمة. يتم إنشاء دليل يسمى ManualPick في المجلد الرئيسي RELION-3.
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لإنشاء بنية مجلد اختيار يدوي في RELION-3. أثناء تشغيل الانتقاء اليدوي، يتم إنشاء ملف .star واحد يحتوي على إحداثيات الجسيمات المنتقاة لكل ميكروغراف متوسط يستخدم للانتقاء في واجهة المستخدم الرسومية RELION-3.
  8. انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على ملف particles_exported.star من الخطوة 6.6 وقم بتشغيل برنامج نصي مكتوب في المنزل ينتج ملف manualpick.star واحد لكل رسم مجهري متوسط يستخدم لاختيار جسيمات cryo-SPARC v3 ، مما ساهم في التصنيف ثنائي الأبعاد النهائي الذي تم تصديره في الخطوة 6.5. يتم حفظ ملفات الإحداثيات الناتجة في المجلد ManualPick/Movies.
  9. ارجع إلى RELION-3 وأعد فتح مهمة الانتقاء اليدوي . انقر على متابعة. سيعرض هذا الجسيمات التي تم اختيارها مسبقا في cryoSPARC v3 في واجهة المستخدم الرسومية RELION-3. افحص بعض الصور المجهرية للتحقق مما إذا كان نقل إحداثيات الجسيمات قد تم إنجازه وما إذا كانت الجسيمات قد تم اختيارها بشكل صحيح.

7. RELION-3 - استخراج الجسيمات والتصنيف ثنائي الأبعاد

  1. انقر على استخراج الجسيمات. في علامة التبويب إدخال /إخراج ، أدخل CTF تصحيح micrographs من الخطوة 6.4 والإحداثيات من الخطوة 6.9. انقر فوق علامة التبويب استخراج وقم بتغيير حجم مربع الجسيمات (pix) إلى 300. قم بتشغيل المهمة.
  2. قم بإجراء تصنيف ثنائي الأبعاد لزيادة تنظيف مجموعة الجسيمات التي تم إنشاؤها في cryoSPARC v3 لتحقيق إعادة بناء عالية الدقة. انقر فوق تصنيف 2D وعلى علامة التبويب الإدخال / الإخراج ، أدخل ملف particles.star الذي تم إنشاؤه في الخطوة 7.1. في علامة التبويب تحسين ، اضبط عدد الفئات على 50 وقطر القناع (A) على 280. قم بتشغيل المهمة.
    ملاحظة: يجب أن يشمل القناع الجسيم بأكمله.
  3. لاختيار أفضل فئات ثنائية الأبعاد ، انقر فوق طريقة تحديد المجموعة الفرعية ، وأدخل ملف _model.star من الخطوة 7.2 ، وقم بتشغيل المهمة. حدد الفئات كما هو موضح في الخطوة 4.2.
  4. كرر الخطوتين 7.2 و7.3 لإزالة الجسيمات غير المتقاربة.

8. RELION-3 - الصقل ثلاثي الأبعاد ، وإنشاء القناع ، وما بعد المعالجة

  1. استخدم الخريطة التي تم إنشاؤها في cryoSPARC v3 (الخطوة 5.2) كنموذج أولي للتحسين ثلاثي الأبعاد في RELION-3. حدد طريقة الاستيراد وقم بتعيين المعلمات التالية في علامة التبويب إدخال/إخراج: استيراد أفلام خام/ميكروغرافات: لا، ملفات إدخال خام: أفلام/*.mrc.
  2. قم بتوفير ملف MTF وأدخل معلمات الحصول على الفيلم كما هو موضح في الخطوة 1.3. في علامة التبويب أخرى ، حدد خريطة cryoSPARC v3 كملف إدخال، وقم بتغيير نوع العقدة إلى مرجع ثلاثي الأبعاد (.mrc)، ثم قم بتشغيل المهمة.
  3. حدد 3D Auto-Refine وعلى علامة التبويب إدخال/إخراج، قم بتعيين صور الإدخال كملف particles.star من الخطوة 7.3 أو مهمة التحديد الأخيرة. قم بإعطاء إعادة بناء cryoSPARC v3 كخريطة مرجعية. انقر فوق علامة التبويب مرجع وقم بتغيير مرشح التمرير المنخفض الأولي (Å) إلى 50 والتماثل إلى icosahedral. في علامة التبويب تحسين، قم بتغيير قطر القناع (Å) إلى 280 وقم بتشغيل المهمة.
  4. بعد الانتهاء من الجري ، افتح run_class001.mrc في UCSF Chimera.
  5. في UCSF Chimera ، انقر فوق أدوات وضمن بيانات الحجم ، حدد عارض مستوى الصوت. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة جديدة لضبط إعدادات مستوى الصوت. قم بتغيير الخطوة إلى 1 واضبط شريط التمرير حتى تصل إلى قيمة المستوى حيث لا تحتوي الخريطة على ضوضاء. سجل هذه القيمة، حيث سيتم استخدامها لإنشاء قناع في الخطوة التالية.
  6. لا تعكس الخريطة الناتجة عن التحسين التلقائي FSC الحقيقي ، حيث أن الضوضاء الصادرة عن المذيب المحيط تقلل من الدقة. قبل المعالجة اللاحقة ، قم بإنشاء قناع لتمييز العينة عن منطقة المذيبات.
    1. انقر فوق إنشاء قناع وإدخال run_class001.mrc من الخطوة 8.3.
    2. انقر فوق علامة التبويب قناع واضبط المعلمات على النحو التالي: خريطة مرشح الممر المنخفض (Å): 10 ، حجم البكسل (Å): 1.045 ، عتبة Binarization الأولية: قيمة المستوى التي تم الحصول عليها في الخطوة 8.5 ، توسيع الخريطة الثنائية هذا العدد الكبير من وحدات البكسل: 3 ، وإضافة حافة ناعمة من هذا العدد الكبير من وحدات البكسل: 3. قم بتشغيل المهمة.
  7. افحص القناع في UCSF Chimera. إذا كان القناع ضيقا جدا، فقم بزيادة توسيع الخريطة الثنائية بهذا العدد الكبير من وحدات البكسل و/أو أضف حافة ناعمة من هذا العدد الكبير من وحدات البكسل. من المهم إنشاء قناع بحواف ناعمة ، لأن القناع الحاد قد يؤدي إلى الإفراط في التركيب.
  8. انقر فوق ما بعد المعالجة وعلى علامة التبويب الإدخال / الإخراج ، أدخل الخرائط النصفية التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.3 وقناع من 8.6. اضبط حجم البكسل المعاير على 1.045 Å. في علامة التبويب شحذ، أدخل ما يلي: تقدير العامل B تلقائيا؟: نعم، أدنى دقة ل Auto-B Fit (A): 10، استخدم عامل B الخاص بك؟: لا. في علامة التبويب تصفية، قم بتعيين تخطي FSC-Weighting؟ إلى لا.

9. RELION-3 - التدريب على التلميع وتلميع الجسيمات

  1. قبل تصحيح الحركة التي يسببها شعاع الجسيمات، استخدم أولا وضع التدريب لتحديد مسارات الحركة المثلى لمجموعة البيانات. افتح تلميع Bayesian وعلى علامة التبويب إدخال/إخراج ، أدخل الصور المجهرية المصححة للحركة من الخطوة 6.3 والجسيمات من الخطوة 8.3 وملف .star بعد العملية من الخطوة 8.8. انقر فوق علامة التبويب تدريب وقم بتعيين المعلمات التالية: تدريب المعلمات المثلى : نعم ، جزء من Fourier Pixels للاختبار: 0.5 ، استخدم هذا العدد الكبير من الجسيمات: 5000. قم بتشغيل المهمة.
    ملاحظة: سينتج هذا البرنامج النصي ملف opt_params_all_groups.txt في المجلد RELION-3 Polish الذي يحتوي على معلمات تلميع محسنة مطلوبة لتنفيذ الخطوة التالية.
  2. بمجرد الانتهاء من مهمة التدريب ، انقر فوق تلميع بايزيان. انقر فوق علامة التبويب التدريب واضبط معلمات القطار الأمثل؟ إلى لا. حدد علامة التبويب البولندية وفي ملف المعلمة المحسن حدد المسار إلى ملف opt_params_all_groups.txt من الخطوة 9.1. انقر فوق تشغيل.
  3. كرر الصقل ثلاثي الأبعاد (الخطوة 8.3) وما بعد المعالجة (الخطوة 8.8) مع مجموعة من الجسيمات المصقولة.

10. RELION-3 - CTF وتحسينات لكل جسيم

  1. لتقدير انحرافات الترتيب الأعلى، افتح تحسين CTF ، وفي علامة التبويب إدخال/إخراج ضمن الجسيمات، حدد المسار إلى ملف .star الذي يحتوي على جزيئات مصقولة من مهمة Refine 3D الأخيرة (run_data.star).
    1. ضمن ملف نجمة ما بعد العملية، قم بتعيين المسار إلى الإخراج من أحدث مهمة ما بعد المعالجة (الخطوة 9.3).
    2. حدد علامة التبويب احتواء وقم بتعيين المعلمات التالية: تقدير (تكبير متباين الخواص): لا، إجراء تركيب معلمة CTF؟ لا ، تقدير Beamtilt: نعم ، أيضا تقدير Trefoil؟ نعم ، تقدير 4th ترتيب الانحرافات؟ نعم. قم بتشغيل المهمة.
  2. كرر الخطوة 10.1 باستخدام جسيمات الإدخال (من Refine3D) التي تم إنشاؤها في المهمة السابقة (particles_ctf_refine.star). في علامة التبويب ملائمة ، قم بتغيير التقدير (التكبير غير المتجانس) إلى نعم وقم بتشغيل المهمة.
  3. كرر الخطوة 10.2 باستخدام جسيمات الإدخال (من Refine3D) المنتجة في المهمة السابقة (particles_ctf_refine.star). في علامة التبويب Fit ، قم بتعيين المعلمات التالية: تقدير (التكبير غير المتجانس): لا ، إجراء تركيب معلمة CTF؟: نعم ، Fit Defocus?: لكل جسيم ، Fit Astigmatism؟ لكل مجهر ، تناسب B-factor؟: لا ، تناسب المرحلة التحول: لا ، تقدير Beamtilt؟: لا ، تقدير انحرافات الترتيب 4th؟: لا.
    ملاحظة: نظرا لأن الجسيم يحتوي على تباين كاف، يمكن تعيين علامة التبويب Fit Astigmatism؟ إلى كل جسيم. بالنسبة لمجموعة البيانات هذه، لم يؤد تحسين الاستجماتيزم لكل جسيم إلى تحسين جودة الخريطة ودقتها.
  4. كرر الصقل ثلاثي الأبعاد مع الجسيمات من الخطوة 10.3 وفي علامة التبويب الإدخال / الإخراج ، اضبط استخدام FSCs المسطحة بالمذيبات؟ إلى نعم. عند الانتهاء من التشغيل، قم بتنفيذ مهمة ما بعد المعالجة (الخطوة 8.8) وفحص الخريطة في UCSF Chimera (الخطوة 5.2).

11. نقل إحداثيات جسيمات RELION-3 وخريطة ثلاثية الأبعاد إلى Scipion 3

  1. لمزيد من التحسين والتحقق من صحة خريطة RELION-3، قم أولا باستيراد الحجم والجزيئات من آخر مهمة ما بعد المعالجة (الخطوة 10.4) إلى Scipion 3. قم بتشغيل Scipion 3 وإنشاء مشروع جديد.
  2. في لوحة البروتوكولات اليمنى، حدد القائمة المنسدلة الواردات وانقر على استيراد الجسيمات. تغيير المعلمات التالية: استيراد من: RELION-3، ملف النجمة: postprocess.star، وتحديد معلمات الاستحواذ كما في الخطوة 1.3. انقر على تنفيذ.
  3. انقر على القائمة المنسدلة واردات وحدد استيراد مجلدات. ضمن استيراد من إعطاء المسار إلى خريطة RELION-3. تغيير حجم البكسل (معدل أخذ العينات) Å/px إلى 1.045 والتنفيذ.

12. Scipion 3 - عالية الدقة - صقل

  1. أولا، قم بإجراء محاذاة شاملة. حدد القائمة المنسدلة تنقيح في لوحة البروتوكولات وانقر على Xmipp3 - highres24. أدخل الجسيمات والأحجام المستوردة من الخطوتين 11.2 و11.3 كصور كاملة الحجم ووحدات تخزين أولية، على التوالي واضبط مجموعة التماثل على icosahedral. على علامة التبويب محاذاة الصورة ضمن تعيين زاوي، اختر عمومي واضبط الحد الأقصى لدقة الهدف على 3 Å، ثم قم بتشغيل المهمة.
  2. عند الانتهاء من المهمة ، انقر فوق تحليل النتائج. في النافذة الجديدة ، انقر فوق رمز UCSF Chimera لفحص مستوى الصوت المكرر. بالإضافة إلى ذلك ، انقر فوق مخططات دقة العرض ( FSC) لمعرفة كيفية تغير FSC بعد التحسين ، بالإضافة إلى الرسم البياني للرسم مع التغييرات الزاوية لمعرفة ما إذا كانت تعيينات زاوية أويلر قد تغيرت.
    ملاحظة: استنادا إلى دقة بنية RELION-3 المدخلة، قد تتكرر هذه الخطوة عدة مرات بقيم مختلفة تم تعيينها لدقة الهدف الأقصى ضمن علامة التبويب تعيين الزاوي . لمزيد من المعلومات، راجع البرنامج التعليمي Scipion25.
  3. كرر الخطوة 12.1 مع محاذاة محلية. انسخ الوظيفة السابقة وقم بتغيير تحديد تشغيل سابق إلى Xmipp3 - highres Global. على علامة التبويب تعيين زاوي، قم بتغيير محاذاة الصورة إلى محلي. اضبط الحد الأقصى لدقة الهدف على 2.1 Å.
  4. افحص الخريطة المنقحة في UCSF Chimera وقم بتحليل التغيير في FSC والتعيينات الزاوية (الخطوة 12.2). كرر التحسين المحلي حتى لا تتحسن الدقة وتتلاقى التعيينات الزاوية، مع ضبط الدقة القصوى المستهدفة حسب الحاجة.
  5. يمكن تعديل خريطة الإخراج من Scipion 3 بالإضافة إلى ذلك من خلال الكثافة وشحذها في Phenix26.

13. Scipion 3 - التحقق من صحة الخريطة

  1. فحص الدقة المحلية للخريطة النهائية التي تم إنشاؤها في Xmipp3 - Highres. افتح Xmipp - MonoRes27 المحلي وأدخل وحدة التخزين النهائية من المهمة السابقة والقناع الذي تم إنشاؤه في الخطوة 8.6. اضبط نطاق الدقة من 1 إلى 6 Å بفاصل زمني 0.1 Å وقم بتنفيذ المهمة.
  2. عند الانتهاء من التشغيل ، انقر فوق تحليل النتائج وفحص الرسم البياني للدقة وشرائح الحجم الملونة حسب الدقة.
  3. لمعرفة ما إذا كانت الجسيمات محاذاة بشكل جيد، افتح قابلية المحاذاة متعددة المراجع28 وأدخل الجسيمات والحجم من الخطوة 12.3. انقر فوق تحليل النتائج لعرض مخطط التحقق من الصحة. من الناحية المثالية ، يجب تجميع جميع النقاط حول (1.0 ، 1.0).
  4. افتح Xmipp3 - التحقق من صحة التركيب الزائد. أدخل الجسيمات والأحجام من الخطوة 12.3. عند الانتهاء من الجري ، قم بتحليل النتائج وفحص المؤامرة الزائدة. يشير عبور الضوضاء الغاوسية المحاذاة ومنحنيات الجسيمات المحاذاة إلى الإفراط في التركيب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لقد قدمنا خط أنابيب SPA شامل للحصول على هيكل عالي الدقة باستخدام ثلاث منصات معالجة مختلفة: cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3. يلخص الشكل 1 والشكل 4 سير عمل المعالجة العام، ويفصل الجدول 1 بروتوكولات التحسين. تم استخدام هذه البروتوكولات أثناء تحسينات هيكل 2.3 Å من AAV ، مما حقق دقة قريبة من Nyquist.

تم استيراد الأفلام لأول مرة إلى cryoSPARC v3 وبعد ذلك تم تصحيح الحركة و CTF لإنشاء صور مجهرية متوسطة. عند اختيار المجهر لمزيد من المعالجة ، من المهم اختيار تلك التي تحتوي على تناسب CTF جيد والاستجماتيزم المنخفض (الشكل 2) ، لأن تضمين الصور المجهرية ذات الجودة الرديئة يمكن أن يعيق مراحل المعالجة اللاحقة ، مما يؤدي إلى إعادة بناء أقل دقة. ثم تم اختيار 27,364 جسيما واستخراجها من المجهر المختار. نظرا لأن قطر AAV يبلغ حوالي 220 Å وحجم البكسل هو 1.045 Å ، فقد تم استخدام حجم صندوق 300 بكسل. بعد ذلك ، تم استخدام تصنيف 2D التكراري لإزالة القطع الأثرية والجسيمات التي لا تتقارب مع فئات مستقرة. وترد أمثلة على متوسطات فئة 2D المختارة والمستبعدة في الشكل 3. من المهم أيضا ملاحظة أن متوسطات الفئة التي تعكس التكوينات المختلفة للعينة يجب تكريرها بشكل منفصل لإنتاج عمليات إعادة بناء 3D متعددة. في مثل هذه الحالة ، يجب حساب أحجام بدء متعددة من ab initio . هنا ، تم اختيار 26،741 جسيما واستخدامها لنمذجة ab initio والصقل المتجانس لبنية واحدة 2.9 Å.

بعد نقل إحداثيات الجسيمات المنتقاة في cryoSPARC v3 إلى RELION-3 ، قمنا بإجراء أربع جولات إضافية من التصنيف ثنائي الأبعاد حتى تقاربت مجموعة البيانات إلى فئات ثنائية الأبعاد مستقرة. أزال تصنيف 2D الموصوف أعلاه 3,154 جسيما إضافيا من مجموعة البيانات. باستخدام الهيكل الذي تم إنشاؤه في cryoSPARC v3 كنموذج أولي ، أنتج الصقل ثلاثي الأبعاد في RELION-3 بنية بدقة مكافئة تقريبا تبلغ 2.95 Å. وأدت التحسينات الهيكلية اللاحقة، التي شملت تصحيح الحركة لكل جسيم وتحسينات CTF، إلى زيادة الاستبانة إلى 2.61 Å. وترد في الجدول 1 قائمة كاملة بالتحسينات التي أجريناها. ثم تم تحسين الحجم المحسوب في RELION-3 في Scipion 3 باستخدام جولات متعددة من التحسين عالي الدقة (Xmipp3 - highres). وخلال جولات الصقل اللاحقة، تمت إزالة 3,186 جسيما إضافيا من مجموعة البيانات، مما أدى إلى مجموعة نهائية من 20,401 جسيم، مما أدى إلى إعادة بناء 2.3 Å ل AAV (الشكل 5 والشكل 6). وبالتالي ، بالنظر إلى حجم البكسل البالغ 1.045 Å ، فقد وصلت تحسيناتنا تقريبا إلى حد Nyquist. يتم عرض منحنيات FSC التي تمثل الهياكل المحسوبة باستخدام كل برنامج في الشكل 6. تشير منحنيات FSC هذه إلى زيادة الدقة طوال سير العمل. نظرا لأن الاستبانة قد تختلف من نقطة إلى أخرى في الخريطة، غالبا ما يكون من الأنسب تقديم توزيع تقديرات الاستبانة المحلية في الخريطة بدلا من الإبلاغ عن تقدير استبانة واحد وفقا لمعيار واحد (على سبيل المثال، معيار 0.143) من منحنى FSC. وبالتالي ، أجرينا مثل هذا التحليل باستخدام Xmipp - MonoRes في Scipion 3. ويبين الشكل 7 مقارنة بين تقديرات الاستبانة المحلية للخرائط التي تم الحصول عليها باستخدام الإصدار 3 من نظام التبريد SPARC ومعيار Scipion 3. وتبين تقديرات الاستبانة في أربع شرائح مختلفة من خلال الهياكل (الشكل 7 ألف وباء) والرسوم البيانية للدقة (الشكل 7 جيم) بوضوح التحسن التدريجي في الاستبانة المحلية بين الخرائط طوال سير العمل. يشير منحنى FSC المحسوب باستخدام برنامج Xmipp3 - الارتفاعات في Scipion 3 إلى أنه تم الوصول إلى حد Nyquist (الشكل 6) ، مما يشير إلى أن تقدير الدقة محدود على الأرجح بسبب أخذ العينات الناقصة29. ومع ذلك ، فإن تحليل MonoRes المقدم في الشكل 7C ، إلى جانب تحليل دقيق لخريطة EM والخريطة المناسبة للإحداثيات الذرية ل AAV (الشكل 5) يشير إلى أن تقدير الدقة الأكثر ملاءمة للخريطة هو 2.3 Å. تم تقديم استراتيجية مماثلة للتوفيق بين تقديرات قرار FSC و MonoRes في وقت سابق24,25. نظرا لأن تقديرات الدقة يمكن أن تتأثر بالقناع المستخدم أثناء خطوات الصقل ، فمن المهم التأكد من أن القناع لا يستبعد أي جزء من الكثافة. يتم عرض القناع المستخدم في هذه الدراسة المتداخل مع عمليات إعادة البناء 3D في الشكل 7D. تسلط الزيادة التدريجية في الدقة في سير العمل المقدم الضوء على ميزة استخدام الخوارزميات من حزم برامج SPA متعددة لتحقيق إعادة بناء 3D عالية الجودة وعالية الدقة.

يمكن أن يكون بناء النموذج في الموقع أو تركيب الخريطة مع نموذج ذري موجود مسبقا بمثابة فحص الجودة للهيكل المحسوب. لقد تصورنا الخريطة النهائية في UCSF Chimera وقمنا بتجهيز الخريطة بنموذج ذري منشور سابقا (PDB ID: 7kfr)30. ويبين الشكل 5 مناطق خريطة cryo-EM المزودة بإحداثيات ذرية ل AAV. تسمح كثافات EM المحددة جيدا بتركيب سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية الفردية وجزيئات الماء وأيونات المغنيسيوم وتؤكد اتفاق خريطة cryo-EM مع النموذج الذري.

Figure 1
الشكل 1: إكمال سير عمل SPA عبر cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 و Phenix 1.18. تتم الإشارة إلى الخطوات المكتملة في cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 و Phenix 1.18 بمربعات أرجوانية وبرتقالية وخضراء ورمادية ، على التوالي. يتم تحديد الوقت اللازم لإكمال كل خطوة باستخدام خادم المعالجة المجهز ب 8 وحدات معالجة رسومات و 40 وحدة معالجة مركزية و 750 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي في كل مربع على حدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: اختيار الصور المجهرية للمعالجة النهائية في cryoSPARC v3. (A) تم استخدام الصور المجهرية ذات حلقات Thon المقدرة والتجريبية المتطابقة جيدا لمزيد من المعالجة ، في حين تم التخلص من تلك التي تعاني من الاستجماتيزم العالي والملاءمة الضعيفة (B). تمت إزالة الرسوم البيانية المجهرية ذات CTF-fit فوق 5 Å ، والاستجماتيزم فوق 400 Å ، وسماكة الجليد النسبية أقل من 2 من المعالجة الإضافية ، أي 70/395 micrographs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: اختيار فئات 2D. يتم اختيار متوسطات فئة 2D التي تحتوي على فئات محددة جيدا (A) ، ويتم رفض تلك ذات الدقة المنخفضة والضوضاء والجسيمات الجزئية (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: سير العمل والنتائج التمثيلية لمعالجة AAV عبر cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3. تتم الإشارة إلى الخطوات المكتملة في cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 بأسهم أرجوانية وبرتقالية وخضراء ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: يظهر الهيكل عالي الدقة ل AAV كثافات EM محددة جيدا تمثل عناصر بنية ثانوية مختلفة وسلاسل جانبية فردية من الأحماض الأمينية. (أ) خريطة نهائية ل AAV. (ب) جزء من الخريطة يمثل صفائح بيتا مزودة بإحداثيات ذرية ل AAV (PDB ID: 7kfr)30. (ج) خريطة الكثافات التي تمثل الأحماض الأمينية الفردية. من اليسار إلى اليمين: أرجينين ، فينيل ألانين ، وتريبتوفان. (د) تشمل السمات العالية الاستبانة للخريطة جزيئات الماء المعروضة في أيونات حمراء وأيونات المغنيسيوم المقدمة ككرات خضراء. يتم تنسيق أيون Mg2+ المعروض في الشكل بواسطة بقايا الهيستيدين (يسار) والأرجينين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تظهر منحنيات FSC من cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 دقة متزايدة عبر سير العمل. في حين أن منحنى FSC المحسوب باستخدام البرنامج Xmipp3 - الارتفاعات في Scipion 3 يشير إلى أنه تم الوصول إلى حد Nyquist ، مما يشير إلى أن تقدير الدقة محدود بأخذ العينات الناقصة29 ، يتم تقديم تحليل أكثر ملاءمة لدقة الخريطة في الشكل 7 ويناقش في قسم النتائج التمثيلية 24,25. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: التحقق من صحة إعادة البناء النهائية في Scipion 3 باستخدام Xmipp - MonoRes. يتم وصف دقة الخريطة بشكل أفضل من خلال تقديم توزيعات الاستبانة المحلية بدلا من تقدير دقة واحد وفقا لمعيار واحد من منحنى FSC. (أ-ب) تعرض اللوحتان A وB شرائح مختلفة عن الخرائط التي تم إنشاؤها في cryoSPARC v3 وScipion 3 على التوالي. (ج) تظهر الرسوم البيانية زيادة منهجية في الاستبانة المحلية للخرائط المحسوبة في cryoSPARC v3 (الأشرطة الوردية) و Scipion 3 (الأشرطة الزرقاء). (د) يحتوي القناع (الرمادي) المستخدم في حسابات الاستبانة المحلية على جميع أجزاء كثافات AAV المكررة في كلا البرنامجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

برنامج نوع الصقل خط
cryoSPARC v3 صقل متجانس صقل متجانس
صقل غير موحد صقل غير منتظم
صقل غير متجانس صقل غير متجانس
تصحيح الحركة لكل جسيم تصحيح الحركة المحلية
ريليون-3 صقل 3D Refine3D
المعالجة اللاحقة - شحذ العامل B ، تصحيح MTF Refine3D
تلميع الجسيمات تلميع بايزي
تحسين CTF - إمالة الشعاع CtfRefine
صقل CTF - تكبير متباين الخواص CtfRefine
تحسين CTF - إلغاء التركيز البؤري لكل جسيم ، الاستجماتيزم لكل جسيم / مجهري CtfRefine
تصحيح انحناء الكرة Ewald Relion_reconstruct
سكيبيون 3 دقة عالية Xmipp3 - هايريس
فينيكس 1.18 تعديل الكثافة وشحذها ResolveCryoEM

الجدول 1: التحسينات المنفذة طوال سير العمل. يعتمد ما إذا كانت بعض التحسينات قابلة للتطبيق على مشروع معين على جودة البيانات ومعلمات الاقتناء. على سبيل المثال، يمكن تطبيق تصحيح انحناء كرة Ewald على الخرائط ذات الدقة العالية بالفعل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة ، نقدم سير عمل SPA قويا لمعالجة بيانات cryo-EM عبر منصات برمجية مختلفة لتحقيق عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة (الشكل 1). ينطبق سير العمل هذا على مجموعة واسعة من الجزيئات البيولوجية الكبيرة. وترد الخطوات اللاحقة للبروتوكول في الشكل 4، بما في ذلك المعالجة المسبقة للأفلام، وانتقاء الجسيمات وتصنيفها، والطرق المتعددة لتحسين البنية (الجدول 1) والتحقق من صحتها. تم تقديم خطوات المعالجة في cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 ، بالإضافة إلى طرق لنقل البيانات بين حزم البرامج. لقد أظهرنا الهياكل الوسيطة التي تم الحصول عليها في جميع أنحاء البروتوكول بدقة متزايدة (الشكل 4 والشكل 6 والشكل 7).

في حين يمكن استخدام الطرق الموضحة في هذه المخطوطة لتحديد بنية البروتينات المختلفة والتجميعات البيولوجية، من المهم ملاحظة أن AAV هو مرشح مثالي لتحديد البنية عالية الدقة بواسطة cryo-EM و SPA، حيث أن حجمه الكبير ينتج تباينا عاليا في المجهر وينتج عن تناظر icosahedral جسيمات مع تكرار وحدة فرعية 60 ضعفا. يصبح الحصول على عمليات إعادة بناء عالية الدقة أمرا صعبا بشكل متزايد بالنسبة للعينات الصغيرة (أي أقل من 100 كيلو ديسي) والديناميكية وغير المتجانسة. من أجل تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح ، من الأهمية بمكان أن يتم جمع العديد من الأفلام عالية الجودة للمعالجة. مع البيانات الخام ذات الجودة الرديئة ، لا يمكن الحصول على إعادة بناء عالية الدقة وعالية الجودة. على سبيل المثال ، إذا لم يكن سمك الجليد مثاليا لتحديد الهيكل أو إذا التزمت الجسيمات بواجهة الماء المثلج أو أظهرت اتجاهات مفضلة ، فأعد النظر في ظروف تجميد الشبكة.

خطوة أخرى مهمة في سير العمل هي اختيار الجسيمات واستخراجها. أثناء انتقاء الجسيمات، يجب أن يكون حجم الصندوق أكبر بنحو 1.4-2.5 مرة من أطول محور للجسيم، حيث يلزم حجم صندوق كاف لالتقاط معلومات عالية الدقة منتشرة بسبب عدم التركيز البؤري. ومع ذلك ، تتطلب أحجام الصناديق الأكبر أوقات معالجة أطول بسبب زيادة حجم الملفات التي تم إنشاؤها أثناء استخراج الجسيمات. عند اختيار حجم مربع، ضع في اعتبارك قطر الجسيمات وحجم البكسل. مع العديد من الجسيمات ، قد يرغب المستخدم في تخزين الجسيمات أثناء الاستخراج للمعالجة الأولية ثم إعادة استخراج الجسيمات كاملة الحجم للتنقيحات النهائية. يستخدم هذا البروتوكول الانتقاء اليدوي للجسيمات لإنشاء قوالب للتحديد التلقائي. ومع ذلك ، يوفر cryoSPARC v3 أيضا طرق انتقاء مؤتمتة بالكامل ، بما في ذلك منتقي قائم على الفقاعات وغلاف توباز ، والذي يستخدم التعلم العميق لاختيار الجسيمات بناء على الاختيارات السابقة. في حين أن هذه الخوارزميات قوية للغاية ، إلا أن عددا كبيرا من اللقطات ستحتاج إلى إزالتها لاحقا بواسطة تصنيف 2D و 3D.

وتشمل الخطوات الحرجة أيضا تصنيف 2D و 3D المستخدم لإزالة القطع الأثرية ، مثل الجسيمات التالفة بالإشعاع وفصل الأشكال الهيكلية المختلفة للعينة الموجودة في العينة ، على التوالي. يجب أن يعتمد عدد فئات 2D التي حددها المستخدم على عدد الجسيمات المستخرجة من الصور المجهرية والتباين وعدم التجانس في العينة ، حيث أن الهدف هو فصل كل عرض فردي للجسيم إلى فئة 2D منفصلة. كقاعدة عامة ، أضف فئة 2D لكل 100 جسيم ، وإذا كانت معالجة عينة جديدة مع عدد كبير من الجسيمات ، فإن 100 فئة هي نقطة انطلاق جيدة. إذا تم الحصول على دقة منخفضة أو معتدلة حتى بعد العديد من جولات التصنيف 2D و 3D ، فحاول إعادة استخراج الجسيمات بحجم صندوق أكبر لمعرفة ما إذا كان يمكن الحصول على مزيد من المعلومات الهيكلية. أثناء الإبلاغ عن دقة إعادة الإعمار النهائية ، يجب على المرء تحليل منحنى FSC الذي تم الحصول عليه وفقا لطريقة معيار الذهب ، إلى جانب تقديرات الدقة المحلية والفحص الدقيق لكثافات الخريطة ، وكذلك اتفاقها مع النموذج الذري.

ومن أجل تحسين هياكل الفيروسات، أظهر تصحيح انحناء الكرة Ewald الذي تم تنفيذه في RELION-3 تحسينات بدقة عالية31. في حالة تكرير هياكل المجمعات الديناميكية متعددة البروتينات، جرب الصقل ثلاثي الأبعاد متعدد الأجسام المنفذ في RELION-3 أو التصنيف المركز مع طرح الصور المنفذ في RELION-3 و cryoSPARC v3. إذا تعذر حل عدم التجانس حسابيا، فمن الضروري إعادة النظر في ظروف إعداد العينة32. النقاء غير الكافي أو التحضير غير الكافي مما يؤدي إلى تدهور البروتين سوف يعيق جودة إعادة الإعمار 3D. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ظروف التخزين المؤقت التي تزعزع استقرار البروتينات أو تعزز التجميع تحد بشدة من عدد الجسيمات المحددة جيدا التي يمكن استخدامها لحساب الهيكل. وبالتالي ، للاستفادة بشكل أكثر فعالية من الأساليب المعروضة هنا ، من الضروري تحديد الظروف المثلى لاستقرار العينة. نوصي بإجراء المجهر الإلكتروني السلبي التلطيخ لفحص العينات قبل التبريد EM.

نظرا لأن cryo-EM أصبح الطريقة المفضلة لتحديد هيكل 3D لعدد متزايد من علماء الأحياء الهيكليين ، فإن الحاجة إلى سير عمل تكاملي وقوي لمعالجة الصور وتحديد الهيكل تصبح أكثر وضوحا. يوفر CryoSPARC واجهة مستخدم رسومية سهلة الاستخدام وقائمة على الويب (GUI) تسمح للمستخدمين من جميع مستويات الخبرة بمعالجة البيانات بسرعة وحساب بنية 3D. والجدير بالذكر أن CryoSPARC يستخدم نزولا متدرج عشوائيا لإجراء إعادة بناء 3D في البداية. علاوة على ذلك ، يستخدم البرنامج خوارزمية تحسين الاحتمال الفرعي والمرتبط بها لتحسين خريطة 3D بسرعة 7. يستخدم خط أنابيب المعالجة الموضح في هذه المقالة cryoSPARC v3 لإنتاج خريطة ثلاثية الأبعاد أولية. ثم يتم تحسين إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد في RELION-3 ، وهي حزمة شائعة تستخدم نهجا بايزي تجريبيا لتقدير المعلمات الحرجة بناء على مجموعة بيانات المستخدم ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى معرفة الخبراء لتشغيل البرنامج 10. على وجه التحديد ، نستخدم تلميع Bayesian لتصحيح الحركة لكل جسيم وتحسينات CTF لتحسين الدقة. أخيرا ، تم تحسين البنية الناتجة والتحقق من صحتها في Scipion 311 ، وهي قذيفة بايثون تكاملية تدعم الخوارزميات من منصات متعددة ، بما في ذلك Xmipp13 و EMAN28 و SPIDER12 وغيرها. في حين أن العديد من حزم البرامج المختلفة متاحة لمستخدمي cryo-EM ، لا توجد حاليا منصة SPA عالمية مقبولة من قبل هذا المجال. على الرغم من أنه يمكن تنفيذ سير عمل SPA بالكامل في أي من حزم البرامج الثلاثة الموضحة في هذه المقالة، إلا أن الخوارزميات المختلفة قد تسفر عن نتائج مختلفة. وبالتالي ، يجب تخصيص الخطوات الفردية اعتمادا على عينة البيانات وجودتها. على سبيل المثال ، بالنسبة لمجموعة البيانات الحالية ، زادت 3Drefine في RELION-3 من دقة إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد ، في حين أدى التحسين غير المنتظم في cryoSPARC v3 إلى انخفاض طفيف في الدقة. وبالتالي ، من المفيد للغاية استخدام مجموعة متنوعة من البرامج لإعادة حساب الهياكل لتحقيق الجودة والدقة المثلى وتسهيل التحقق من صحة عمليات إعادة الإعمار. على الرغم من أن Scipion 3 يحتوي على العديد من الخوارزميات من cryoSPARC v3 و RELION-3 ، إلا أن أحدث تطبيقات هذه البرامج ليست متاحة على الفور في Scipion. على سبيل المثال ، من بين البرامج المستخدمة في هذه المخطوطة ، يقدم RELION-3 فقط تصحيح انحناء Ewald Sphere من خلال البرنامج النصي Relion_reconstruct. يوفر خط الأنابيب المقدم في هذه المقالة دليلا لكل من المستخدمين الجدد وذوي الخبرة لاستخدام الخوارزميات المنفذة بنجاح في cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 لحساب الهياكل ثلاثية الأبعاد بدقة قريبة من الذرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر كارلوس أوسكار سورزانو على المساعدة في تثبيت Scipion3 وكيليان شنيل وآرني مولر للمساعدة في نقل البيانات بين منصات المعالجة المختلفة. تم دعم جزء من هذا البحث من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة U24GM129547 وتم إجراؤه في PNCC في OHSU وتم الوصول إليه من خلال EMSL (grid.436923.9) ، وهو مرفق مستخدم تابع لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة برعاية مكتب البحوث البيولوجية والبيئية. تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة بدء التشغيل من جامعة روتجرز إلى Arek Kulczyk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. https://cryosparc.com/
CTFFIND 4 Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2 UCSF Macromolecular Structure Group https://msg.ucsf.edu/software
Phenix Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) http://www.phenix-online.org/
PyEM Univerisity of California, San Francisco https://github.com/asarnow/pyem
RELION MRC Laboratory of Structural Biology https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 179 ، المجهر الإلكتروني المبرد ، cryo-EM ، تحليل الجسيمات المفردة ، SPA ، cryoSPARC ، RELION ، Scipion ، معالجة الصور ، حساب الهيكل ، AAV
سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A… More

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. J. Vis. Exp. (179), e63387, doi:10.3791/63387 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter