Summary
この記事では、3 つのクライオ EM 処理プラットフォーム (cryoSPARC v3、RELION-3、Scipion 3) を効果的に利用して、高解像度の構造決定のためのさまざまな単一粒子データセットに適用可能な単一の堅牢なワークフローを作成する方法について説明します。
Abstract
計測と画像処理ソフトウェアの両方の最近の進歩により、単一粒子クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)は、構造生物学者が多種多様な巨大分子の高解像度構造を決定するための好ましい方法となっています。画像処理と構造計算のための複数のソフトウェアスイートが新規および専門家のユーザーが利用でき、顕微鏡検出器によって取得された映画はビーム誘起運動およびコントラスト伝達関数(CTF)推定の補正を受けるという同じ基本的なワークフローを合理化します。次に、反復的な 2D および 3D 分類のために、平均化されたムービー フレームからパーティクル イメージが選択されて抽出され、その後、3D 再構成、改良、および検証が行われます。さまざまなソフトウェア パッケージが異なるアルゴリズムを採用し、操作にさまざまなレベルの専門知識を必要とするため、生成される 3D マップの品質と解像度が異なることがよくあります。したがって、ユーザーは最適な結果を得るために、さまざまなプログラム間で定期的にデータを転送します。このホワイトペーパーでは、一般的なソフトウェアパッケージである cryoSPARC v3、RELION-3、Scipion 3 を横断してワークフローをナビゲートし、アデノ随伴ウイルス (AAV) のほぼ原子分解能構造を取得するためのガイドを提供します。まず、cryoSPARC v3 を使用した画像処理パイプラインの詳細を説明します。これは、その効率的なアルゴリズムと使いやすい GUI により、ユーザーが 3D マップにすばやく到達できるためです。次のステップでは、PyEMと社内スクリプトを使用して、cryoSPARC v3で得られた最高品質の3D再構成からRELION-3およびScipion 3に粒子座標を変換および転送し、3Dマップを再計算します。最後に、RELION-3とScipion 3のアルゴリズムを統合することによって、結果の構造をさらに洗練し検証するための手順を概説します。この記事では、3つの処理プラットフォームを効果的に活用して、高解像度の構造決定のためにさまざまなデータセットに適用可能な単一の堅牢なワークフローを作成する方法について説明します。
Introduction
クライオ電子顕微鏡(クライオEM)および単粒子分析(SPA)は、水和状態の多種多様な生体分子集合体の構造決定を可能にし、これらの巨大分子の役割を原子で詳細に明らかにするのに役立ちます。顕微鏡光学系、コンピュータハードウェア、および画像処理ソフトウェアの改善により、2 Å1、2、3を超える解像度で生体分子の構造を決定することが可能になりました。2014年の192の構造と比較して、2020年には2,300以上のクライオEM構造がタンパク質データバンク(PDB)に寄託され4、クライオEMが多くの構造生物学者にとって選択の方法となっていることを示しています。ここでは、高解像度の構造決定のために3つの異なるSPAプログラムを組み合わせたワークフローについて説明します(図1)。
SPAの目標は、顕微鏡検出器によって記録されたノイズの多い2D画像から、ターゲット試料の3Dボリュームを再構築することです。検出器は、同じ視野の個々のフレームを持つムービーとして画像を収集します。サンプルを保存するために、フレームは低い電子線量で収集されるため、信号対雑音比(SNR)が低くなります。さらに、電子露光はガラス化クライオEMグリッド内で動きを誘発し、画像のぼやけをもたらす可能性がある。これらの問題を克服するために、フレームはビーム誘発運動を補正するように整列され、SNRが増加した顕微鏡写真が得られるように平均化される。これらの顕微鏡写真は、顕微鏡によって課される焦点ずれおよび収差の影響を説明するために、コントラスト伝達関数(CTF)推定を受ける。CTF補正顕微鏡写真から、個々の粒子が選択され、抽出され、ガラス質氷中の標本によって採用された異なる配向を表す2Dクラス平均にソートされる。得られた均質なパーティクルのセットは、 ab initio 3D再構成の入力として使用され、粗いモデルが生成され、その後、反復的に洗練されて1つ以上の高解像度構造が生成されます。再構成後、クライオEMマップの品質と解像度をさらに向上させるために、構造的な改良が行われます。最後に、原子モデルがマップから直接派生するか、マップが他の場所で得られた原子座標に適合されます。
Appion5、cisTEM6、cryoSPARC7、EMAN8、IMAGIC9、RELION10、Scipion11、SPIDER12、Xmipp13など、上記で概説したタスクを実行するためのさまざまなソフトウェアパッケージが利用可能です。これらのプログラムは同様の処理手順に従いますが、パーティクルの選択、初期モデルの生成、再構成の改良など、さまざまなアルゴリズムを採用しています。さらに、これらのプログラムは、新しいユーザーのハードルとして機能する可能性のあるパラメータの微調整に依存するものもあるため、動作するためにさまざまなレベルのユーザー知識と介入を必要とします。これらの不一致により、プラットフォーム間で一貫性のない品質と解像度のマップが生成されることが多く14、多くの研究者は複数のソフトウェアパッケージを使用して結果を改良および検証する必要があります。この記事では、クライオスパークv3、RELION-3、およびScipion 3を使用して、遺伝子治療に広く使用されているベクターであるAAVの高解像度3D再構成を得ることを強調します15。上記のソフトウェアパッケージは、アカデミックユーザーには無料です。cryoSPARC v3 および Scipion 3 にはライセンスが必要です。
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Protocol
1. 新しい cryoSPARC v3 プロジェクトの作成とデータのインポート
注:データは、ポートランドのオレゴン健康科学大学(OHSU)で、Falcon 3直接電子検出器を搭載した300kVタイタンクリオス電子顕微鏡を使用して取得されました。画像は、129フレームにわたって28.38e-/Å2の総線量と-0.5μm~-2.5μmのデフォーカス範囲、1.045ÅのピクセルサイズでEPUを使用して計数モードで収集された。AAV-DJのサンプルは大洲のスタッフから提供された。
- Web ブラウザーで cryoSPARC v3 を開き、「 プロジェクト」 ヘッダーをクリックします。[ + 追加 ] を選択して、新しいプロジェクトを作成します。それに応じてプロジェクトにタイトルを付け、ジョブとデータが保存される既存のディレクトリへのパスを指定します。
- プロジェクトのワークスペースを作成するには、プロジェクトを開き、[ + 追加] をクリックして、[ 新しいワークスペース] を選択します。ワークスペースにタイトルを付け、[ 作成] をクリックします。
- 新しいワークスペースに移動し、右側のパネルで ジョブビルダー を開きます。このタブには、クライオスパーク v3 で使用可能なすべての機能が表示されます。「ムービー のインポート」 をクリックし、ムービーパスを指定し、リファレンスファイルパスを取得し、集録パラメータを次のように設定します: 生ピクセルサイズ1.045 Å、 加速電圧300 kV、 球面収差 2.7 mm、 総露光量 28.38 e-/Å^2。
- 「キュー」をクリックし、ジョブを実行するレーンとワークスペースを選択して、「作成」をクリックします。
メモ:集録パラメータはサンプルと顕微鏡に依存します。
2. CryoSPARC v3 - ムービーアライメントとCTF推定
- パッチモーション補正(マルチ)を開きます。このジョブでは、ステップ 1.3 でインポートしたムービーを入力として必要とします。ワークスペースでムービーの読み込みジョブカードを開き、Imported_movies出力を新しいジョブのムービープレースホルダにドラッグします。ジョブをキューに入れます。
メモ: この記事で概説されている cryoSPARC メソッドの詳細については、cryoSPARC チュートリアル16 を参照してください。 - CTF 推定を実行するには、[ パッチ CTF 推定 (複数)] を開きます。手順 2.1 で生成された顕微鏡写真を入力し、ジョブを キュー に入れます。
- 平均顕微鏡写真とCTF補正顕微鏡写真を検査し、さらに処理するサブセットを選択するには、 Curate Exposures を開き、ステップ2.2で得られた露出を入力します。ジョブを キュー に入れます。
- ジョブが 待機 モードに入ったら、ジョブ・カードの 「対話」 タブをクリックし、パラメーターしきい値を調整し、さらに処理するために個々の顕微鏡写真を承認または拒否します。よく一致する推定CTFと実験的CTFを含む顕微鏡写真(図2)を受け入れ、高い乱視、CTF適合度が低く、厚い氷を持つものは廃棄してください。
- 現在のデータの処理中に、乱視の上限を 400 Å、CTF 適合分解能を 5 Å、相対氷厚を 2 に設定します。[ 完了 ] をクリックして、下流処理用の顕微鏡写真を選択します。
3. CryoSPARC v3 - 手動およびテンプレートベースのパーティクルピッキング
- 手動ピッカーを開き、ステップ 2.4 から 2.5 で受け入れられたエクスポージャーを入力し、ジョブをキューに入れます。[インタラクティブ]タブをクリックし、[ボックスサイズ(px)]を300に設定し、複数の顕微鏡写真で数百個の粒子をクリックし、重複する粒子を選択しないようにします。ここでは、29枚の顕微鏡写真にまたがる340個の粒子が選択された。完了したら、[ピッキング完了]をクリックします。パーティクルを抽出します。
メモ: このプロトコルは、手動パーティクルピッキングを使用して、自動選択用のテンプレートを生成します。ただし、他の方法も利用できます17。 - 自動パーティクル ピッキングのテンプレートを生成するには、[ 2D 分類] をクリックし、ステップ 3.1 で生成されたパーティクル ピックを入力します。 2D クラス の数を 10 に変更し、ジョブを キュー に入れます。
- [2D クラスの選択] を開きます。ステップ 3.2 で取得したパーティクルとクラスの平均を入力し、[インタラクティブ]タブをクリックします。SNRが良好な代表的な2Dクラスを選択し、[完了]をクリックします。
注: クラス平均は、さまざまなパーティクル ビューを反映します。各ビューを反映するクラス平均を選択します。目標は、自動ピッキングのために標本のさまざまなビューを表す明確に定義されたテンプレートを作成することです。 - テンプレートピッカーを開き、手順 3.3 で選択した 2D クラスと、手順 2.4 ~ 2.5 の顕微鏡写真を入力します。粒子径 (Å) を 220 Å に設定し、ジョブをキューに入れます。
- 自動ピックを検査するには、[ パーティクル ピックの選択] を開き、手順 3.4 で生成されたパーティクルと顕微鏡写真を入力して、ジョブを キュー に入れます。
- [パーティクル ピックの選択] ジョブ カードで、[インタラクティブ] タブをクリックし、[ボックス サイズ] (px) を 300 に設定します。個々の顕微鏡写真をクリックし、粒子がはっきりと見えるまでローパスフィルタを調整し、正規化相互相関(NCC)しきい値を0.41、電力しきい値を54000~227300に設定します。
- いくつかの顕微鏡写真を検査し、必要に応じて、ほとんどの粒子が誤検知を含めずに選択されるようにしきい値を調整します。完了したら、[ ピッキング完了] をクリックします。パーティクルを抽出します。
注: 真のパーティクルは通常、NCC と検出力スコアが高く、それぞれテンプレートに似ており、SNR が高いことを示します。 - 顕微鏡写真 から抽出を開き、 ステップ3.7の顕微鏡写真と粒子を入力します。抽出された ボックス サイズ (px) を 300 に設定し、ジョブを キュー に入れます。
4. クライオスパーク v3 - 2D 分類
- [2D 分類] をクリックし、手順 3.8 から抽出した粒子を入力します。[2D クラスの数] を 50 に設定し、ジョブをキューに入れます。
- さらに処理に最適な 2D クラスを選択するには、[ 2D クラスの選択] を開きます。ステップ 4.1 で取得したパーティクルとクラスの平均を入力します。[ インタラクティブ] タブをクリックし、クラス内の解像度とパーティクル数に基づいて2Dクラスを選択します(図3)。成果物を含むクラスは選択しないでください。選択したら、[ 完了]をクリックします。
注: 通常、パーティクルを除去するには 2D 分類を複数回行う必要がありますが、パーティクルは明確に定義された個別のクラスに収束しません。2D 分類のラウンドを必要な回数だけ実行して、このようなパーティクルをデータ セットから削除します (図 3)。
5. CryoSPARC v3 - アブ・イニティオ ・レコンストラクションと均質なリファインメント
- 初期3Dボリュームを生成するには、 Ab-initio Reconstruction を開き、ステップ4.2または最終的な2D分類から得られたパーティクルを入力します。 対称性 を二十面体に調整します。ジョブを キュー に入れます。
メモ: 対称性はサンプルに依存するため、それに応じて変更する必要があります。不明な場合は、C1 対称を使用します。 - 均質な絞り込みを開きます。ステップ 5.1 の体積と 4.2 のパーティクル、または最終的な 2D 分類を入力します。対称性を変更し、ジョブをキューに入れます。ジョブが終了したら、フーリエシェル相関(FSC)曲線を調べ、UCSF Chimera18で調べるボリュームをダウンロードします。
6. クライオスパーク v3 からパーティクル座標をエクスポートし、PyEM を使用して RELION-3 にインポートする
注: パーティクル座標は、各顕微鏡写真内の個々のパーティクルの位置に関する情報を運びます。パーティクルスタックの代わりに座標をRELION-3に転送すると、そうでなければ利用できないリファインメントステップを実行できます。たとえば、パーティクル研磨では、初期ムービーフレームにアクセスする必要があります。したがって、クライオスパーク v3 から RELION-3 にパーティクル座標をエクスポートする前に、ムービーをインポートし、RELION-3 でモーション補正と CTF 推定を実行します。詳細については、RELION-3 チュートリアル 19 を参照してください。
- RELION-3 プロジェクトディレクトリに移動し、RELION-3 を起動します。
- ジョブタイプブラウザから インポート を開き、手順1.3のようにムービーと集録パラメータへのパスを指定します。
- モーション補正を実行するには、RELION-3 GUIからUCSF MotionCor220を使用し、 モーション補正 を開き、UCSF MotionCor2マニュアル21のようにデフォルトのパラメータを設定します。手順6.2で読み込んだムービーへのパスを入力します。[ モーション] タブで、 motioncor2 実行可能ファイルへのパスを指定します。
メモ: MotionCor2 は、複数の GPU を使用して並列に実行できます。 - CTFFIND-4.122 を使用して RELION-3 GUI を使用して CTF 推定を実行します。CTF推定を開き、ステップ6.3で生成された顕微鏡写真.starを入力します。「CTFFIND-4.1」タブで、CTFFIND-4.1 実行可能ファイルへのパスを指定し、RELION-3.1 チュートリアル19 のようにパラメーターを設定します。
- パーティクルスタックを cryoSPARC v3 から RELION-3 にインポートするには、まず cryoSPARC v3 からパーティクルスタックをエクスポートする必要があります。cryoSPARC v3 で、ステップ 4.2 の 2D クラス選択 ジョブのジョブ・カードまたは最終的な 2D 分類を開きます。[ 詳細] タブで、[ ジョブのエクスポート]をクリックします。 エクスポートジョブ は、particles_exported.csファイルを出力します。
- cryoSPARC v3 から RELION-3 にパーティクル座標をインポートする前に、ステップ 6.5 のparticles_exported.csファイルを .star 形式に変換する必要があります。PyEM23 を使用して、次のコマンドを実行して、particles_exported.cs ファイルを .star 形式に変換します: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
- RELION-3 で、[手動ピッキング] タブをクリックし、[I/O] タブで、手順 6.4 で説明した CTF 絞り込みの顕微鏡写真を入力します。[表示]タブで、次のパラメータを入力します:粒子径(A):220、ローパスフィルタ(A):-1、CTF画像のスケール:0.5。 ジョブを実行します。ManualPick というディレクトリが RELION-3 ホームフォルダに生成されます。
メモ: この手順は、RELION-3 で手動ピッキングフォルダ構造を作成するために実行されます。手動ピッキングの実行中に、RELION-3 GUI でのピッキングに使用される平均顕微鏡写真ごとに、ピッキングされたパーティクルの座標を含む単一の .star ファイルが作成されます。 - ステップ 6.6 の particles_exported.star ファイルを含むフォルダーに移動し、自家製のスクリプトを実行して、クライオ SPARC v3 粒子のピッキングに使用される平均顕微鏡写真ごとに 1 つの manualpick.star ファイルを作成し、これがステップ 6.5 でエクスポートされた最終的な 2D 分類に貢献しました。結果の座標ファイルは、ManualPick/Movies フォルダーに保存されます。
- RELION-3 に戻り、 手動ピッキング ジョブを再度開きます。[ 続行]をクリックします。これにより、以前に cryoSPARC v3 で選択したパーティクルが RELION-3 GUI に表示されます。いくつかの顕微鏡写真を調べて、粒子座標の転送が達成されたかどうか、および粒子が適切に選択されているかどうかを確認します。
7. RELION-3 - 粒子抽出と2D分類
- 「粒子抽出」をクリックします。「I/O」タブで、ステップ 6.4 の CTF 補正顕微鏡写真とステップ 6.9 の座標を入力します。[抽出]タブをクリックし、[パーティクルボックスサイズ(pix)]を300に変更します。ジョブを実行します。
- 2D 分類を実行して、cryoSPARC v3 で生成されたパーティクル セットをさらにクリーニングし、高解像度の再構成を実現します。 [2D 分類] をクリックし、[ I/O ] タブで、手順 7.1 で生成された particles.star ファイルを入力します。「 最適化 」タブで、「 クラス数 」を「50」に、「 マスク直径 (A)」を「 280」に設定します。ジョブ を実行します 。
メモ: マスクはパーティクル全体を網羅する必要があります。 - 最適な 2D クラスを選択するには、[ サブセットの選択] メソッドをクリックし、手順 7.2 の _model.star ファイルを入力して、ジョブ を実行します 。手順 4.2 の説明に従ってクラスを選択します。
- 手順 7.2 と 7.3 を繰り返して、収束していないパーティクルを削除します。
8. RELION-3 - 3Dリファインメント、マスク作成、後処理
- cryoSPARC v3 で生成されたマップ (ステップ 5.2) を RELION-3 の 3D リファインメントの初期モデルとして使用します。「インポート」方法を選択し、「I/O」タブで「生のムービー/顕微鏡写真のインポート: いいえ、生の入力ファイル: ムービー/*.mrc」のパラメータを設定します。
- MTF ファイルを指定し、手順 1.3 の説明に従ってムービー集録パラメータを入力します。[ その他 ] タブで、入力ファイルとして cryoSPARC v3 マップを選択し、[ ノードの種類] を 3D 参照 (.mrc) に変更して、ジョブ を実行します 。
- 「 3D 自動調整 」を選択し、「 I/O 」タブで、「 入力イメージ」 をステップ 7.3 または最後の選択ジョブの particles.star ファイルとして設定します。クライオスパーク v3 再構築を リファレンス マップとして指定します。「 参照 」タブをクリックし、「 初期ローパス・フィルター (Å) 」を「50」に変更し、「 対称」 を「二十面体」に変更します。「 最適化 」タブで、「 マスク直径 (Å)」を「280」に変更し、ジョブ を実行します 。
- ランニングが終わったら、UCSFキメラでrun_class001.mrcを開きます。
- UCSF キメラで、[ ツール ]をクリックし、[ボリューム データ]で [ボリュームビューア]を選択します。これにより、音量設定を調整するための新しいウィンドウが開きます。 [ステップ ] を 1 に変更し、マップにノイズがないレベル値に達するまでスライダーを調整します。この値は、次のステップでマスクの作成に使用されるため、記録します。
- 自動精錬から生成されたマップは、周囲の溶媒からのノイズが解像度を低下させるため、真のFSCを反映していません。後処理の前に、試料と溶媒領域を区別するマスクを作成します。
- 「マスクの作成」をクリックし、ステップ 8.3 から入力run_class001.mrc をクリックします。
- 「マスク」タブをクリックし、次のようにパラメーターを調整します: ローパス・フィルター・マップ (Å): 10、ピクセル・サイズ (Å): 1.045、初期二値化しきい値: ステップ 8.5 で取得したレベル値、バイナリー・マップの拡張 この数ピクセル: 3、およびこのピクセル数のソフト・エッジの追加: 3. ジョブを実行します。
- UCSFキメラのマスクを調べます。マスクがきつすぎる場合は、「 バイナリマップを拡張」をこの数 ピクセル増やすか 、このピクセル数のソフトエッジを追加します。鋭いマスクはオーバーフィットにつながる可能性があるため、柔らかいエッジを持つマスクを作成することが重要です。
- 「後処理」をクリックし、「I/O」タブで、ステップ 8.3 で作成したハーフマップを入力し、8.6 からマスクします。[キャリブレーション済みピクセル サイズ] を 1.045 Å に設定します。シャープタブで、次のように入力します:B因子を自動的に推定しますか?:はい、自動B適合の最低解像度(A):10、独自のB因子を使用しますか?:いいえ。[フィルター] タブで、[FSC 重み付けをスキップしますか?] を [いいえ。ジョブを実行します] に設定します。
9. RELION-3 - 研磨トレーニングと粒子研磨
- 粒子ビームによって誘発される動きを補正する前に、まずトレーニングモードを使用してデータセットに最適なモーショントラックを特定します。 ベイジアン研磨 を開き、[ I/O ]タブで、手順6.3の動き補正顕微鏡写真、手順8.3のパーティクル、および手順8.8の後処理.starファイルを入力します。[ トレーニング ]タブをクリックし、次のパラメータを設定します: トレーニング最適パラメータ :はい、 テスト用のフーリエピクセルの割合:0.5、 この多くのパーティクルを使用:5000。ジョブ を実行します 。
メモ: このスクリプトは、次の手順opt_params_all_groups.txt実行するために必要な最適化された研磨パラメータを含む RELION-3 Polish フォルダにファイルを生成します。 - トレーニングジョブが終了したら、[ベイジアンポリッシング]をクリックします。[トレーニング]タブをクリックし、[最適なパラメータのトレーニング?]を[いいえ]に設定します。「ポーランド語」タブを選択し、「最適化されたパラメーター・ファイル」で、ステップ 9.1 のopt_params_all_groups.txtファイルへのパスを指定します。[実行]をクリックします。
- 研磨された粒子のセットで3D精錬(ステップ8.3)と後処理(ステップ8.8)を繰り返します。
10. RELION-3 - CTFおよび粒子ごとの微細化
- 高次収差を推定するには、[ CTF リファインメント ]を開き、[ I/O ]タブの[パーティクル]で、最近のリファイン3Dジョブ(run_data.star)で研磨された パーティクルを含む.starファイルへのパスを選択します。
- 「後処理 スター・ファイル」で、最新の後処理ジョブからの出力へのパスを設定します (ステップ 9.3)。
- 「適合」(Fit) タブを選択し、次のパラメータを設定します: 推定値 (異方性倍率): いいえ、CTF パラメータ適合を実行しますか?いいえ、ビームチルトを推定:はい、トレフォイルも推定しますか?はい、4次収差を推定しますか?はい。ジョブを実行します。
- 前のジョブ(particles_ctf_refine.star)で生成されたパーティクル(Refine3Dから)を入力として使用して、手順10.1を繰り返します。「適合」タブで、「推定値 (異方性倍率)」を「はい」に変更し、ジョブを実行します。
- 前のジョブ(particles_ctf_refine.star)で生成された (Refine3Dから)パーティクル を入力として使用して、手順10.2を繰り返します。[ 適合] タブで、次のパラメータを設定します: 推定値(異方性倍率):いいえ、 CTFパラメータフィッティングを実行?:はい、 フォーカスを合わせる?:パーティクルごと、 乱視をフィット? 顕微鏡写真ごと、 B因子を適合?: いいえ、 位相シフトを適合:いいえ、 ビームチルトを推定?: いいえ、 4次 収差を推定?: いいえ、 実行 します。
注記: パーティクルのコントラストが十分であれば、[ 乱視に適合? ]タブを パーティクルごとに設定できます。このデータセットでは、 パーティクルごとの 乱視の絞り込みでは、マップの品質と解像度は向上しませんでした。 - 手順 10.3 のパーティクルで 3D リファインメントを繰り返し、[I/O] タブで [ 溶剤で平坦化された FSC を使用?] を [ はい] に設定します。実行が終了したら、後処理ジョブを実行し(ステップ8.8)、UCSFキメラでマップを調べる(ステップ5.2)。
11. RELION-3 パーティクル座標と 3D マップを Scipion 3 に転送する
- RELION-3 マップをさらに絞り込んで検証するには、まず最後の後処理ジョブ (ステップ 10.4) からボリュームとパーティクルを Scipion 3 にインポートします。Scipion 3 を起動し、新しいプロジェクトを作成します。
- 左側の[プロトコル]パネルで、[インポート]ドロップダウンを選択し、[パーティクルのインポート]をクリックします。 次のパラメータを変更します: インポート元: RELION-3、スターファイル: postprocess.star、およびステップ 1.3 のように取得パラメータを指定します。「実行」をクリックします。
- [インポート]ドロップダウンをクリックし、[ボリュームのインポート]を選択します。[インポート元] で、RELION-3 マップへのパスを指定します。ピクセルサイズ(サンプリングレート)Å/pxを1.045に変更して実行します。
12. Scipion 3 - 高解像度の改良
- まず、グローバルアライメントを実行します。[プロトコル] パネルの [絞り込み] ドロップダウンを選択し、[Xmipp3 - highres24] をクリックします。ステップ 11.2 および 11.3 からインポートしたパーティクルとボリュームをそれぞれフルサイズ イメージおよび初期ボリュームとして入力し、対称グループを 2 面体に設定します。[角度割り当て]の下の[画像の配置]タブで、[グローバル]を選択し、[最大ターゲット解像度]を3 Åに設定して、ジョブを実行します。
- ジョブが終了したら、[ 結果の分析] をクリックします。新しいウィンドウで、 UCSF キメラ アイコンをクリックして、洗練されたボリュームを調べます。さらに、[ 表示解像度プロット( FSC)]をクリックして絞り込み後にFSCがどのように変化したかを確認し、[角度 変更によるヒストグラムをプロット] をクリックしてオイラー角度の割り当てが変更されたかどうかを確認します。
メモ: 入力 RELION-3 構造体の解像度によっては、[角度割り当て] タブの [最大ターゲット解像度] に異なる値を設定して、この手順を複数回繰り返すことができます。詳細については、Scipion チュートリアル25 を参照してください。 - 手順 12.1 をローカル位置合わせで繰り返します。前のジョブをコピーし 、[前の実行の選択] を [Xmipp3 - 高解像度グローバル] に変更します。[ 角度の割り当て ] タブで、[ 画像の配置 ] を [ ローカル] に変更します。 最大ターゲット解像度 を 2.1 Å に設定します。
- UCSFキメラの洗練されたマップを調べ、FSCと角度割り当ての変化を分析します(ステップ12.2)。解像度が向上しず、角度割り当てが収束するまでローカル絞り込みを繰り返し、必要に応じて 最大ターゲット解像度 を調整します。
- Scipion 3 からの出力マップは、Phenix26 でさらに密度を変更し、シャープにすることができます。
13. Scipion 3 - マップ検証
- Xmipp3 - 高解像度で生成された最終的なマップのローカル解像度を調べます。Xmipp - ローカル MonoRes27 を開き、前のジョブの最終ボリュームとステップ 8.6 で生成されたマスクを入力します。解像度範囲を1~6Å、間隔を0.1Åに設定し、ジョブを実行します。
- 実行が終了したら、[ 結果の分析] をクリックし、解像度ヒストグラムと解像度で色分けされたボリュームスライスを確認します。
- パーティクルが適切にアライメントされているかどうかを確認するには、[ マルチリファレンス アライナビリティ]28を開き 、ステップ12.3のパーティクルと体積を入力します。 結果の分析 をクリックして、検証プロットを表示します。理想的には、すべてのポイントを周囲にクラスター化する必要があります (1.0,1.0)。
- Xmipp3 - オーバーフィットの検証を開きます。ステップ 12.3 のパーティクルとボリュームを入力します。実行が終了したら、結果を分析し、オーバーフィットプロットを調べます。整列ガウスノイズと整列パーティクル曲線の交差は、オーバーフィットを示します。
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Representative Results
我々は、3つの異なる処理プラットフォーム(cryoSPARC v3、RELION-3、およびScipion 3)を使用して高解像度構造を得るための包括的なSPAパイプラインを提示した。図 1 と図 4 は一般的な処理ワークフローをまとめたもので、表 1 は改良プロトコルの詳細を示しています。これらのプロトコルは、AAVの2.3 Å構造の改良中に使用され、ナイキスト分解能に近いものを達成した。
ムービーは最初に cryoSPARC v3 にインポートされ、その後モーション補正と CTF 補正が行われ、平均顕微鏡写真が生成されました。さらなる処理のために顕微鏡写真を選択する場合、低品質の顕微鏡写真を含めると後の処理段階が妨げられ、解像度の低い再構成につながる可能性があるため、CTF適合度が高く、乱視が低いものを選択することが重要です(図2)。次いで、27,364個の粒子をピックアップし、選択された顕微鏡写真から抽出した。AAVの直径は約220 Å、ピクセルサイズは1.045 Åであるため、300 pxのボックスサイズが使用されました。次に、反復的な 2D 分類を使用して、安定したクラスに収束しないアーティファクトとパーティクルを削除しました。選択および除外された 2D クラス平均の例を 図 3 に示します。また、試料の異なる立体構造を反映したクラス平均は、複数の3D再構成を生成するために別々に精製する必要があることに注意することも重要です。このような場合は、複数の ab initio 開始ボリュームを計算する必要があります。ここでは、26,741個の粒子が選択され、 ab initio モデリングと単一の2.9Å構造の均質な微細化に使用されました。
cryoSPARC v3で選択した粒子の座標をRELION-3に転送した後、データセットが安定した2Dクラスに収束するまで、さらに4回の2D分類ラウンドを実行しました。上記の 2D 分類により、データ セットからさらに 3,154 個の粒子が削除されました。cryoSPARC v3で生成された構造を初期モデルとして使用して、RELION-3の3D改良により、ほぼ同等の解像度2.95Åの構造が生成されました。その後の構造改良により、粒子ごとの運動補正やCTFの改良などが行われ、分解能は2.61 Åに向上しました。実施した改良の完全なリストを表 1 に示します。RELION-3で計算された体積は、その後、Scipion 3で複数の高解像度精細化(Xmipp3 - 高解像度)を使用してさらに精錬されました。その後の精緻化のラウンド中に、追加の3,186個の粒子がデータセットから除去され、最終的に20,401個の粒子のセットが得られ、AAVの2.3Å再構成が生成された(図5および図6)。したがって、ピクセルサイズが1.045 Åの場合、私たちの改良はナイキスト限界にほぼ達しています。各プログラムを用いて算出した構造を表すFSC曲線を図6に示す。これらのFSC曲線は、ワークフロー全体で分解能が向上していることを示しています。解像度はマップ内のポイントによって異なる可能性があるため、FSC 曲線から単一の基準 (0.143 基準など) に従って単一の解像度推定値を報告するよりも、マップ内のローカル解像度推定値の分布を表示する方が適切であることがよくあります。したがって、我々はScipion 3のXmipp - MonoResを用いてそのような分析を行った。図 7 は、cryoSPARC v3 と Scipion 3 で取得したマップのローカル解像度推定値の比較を示しています。構造を通る4つの異なるスライスでの解像度推定値(図7A、B)と解像度ヒストグラム(図7C)は、ワークフロー全体を通してマップ間の局所解像度が徐々に向上していることを明確に示しています。プログラムXmipp3 - Scipion 3の高解像度を使用して計算されたFSC曲線は、ナイキスト限界に達したことを示しており(図6)、分解能推定値がアンダーサンプリングによって制限されている可能性が非常に高いことを示唆しています29。しかし、図7Cに示されているMonoRes解析と、EMマップの慎重な解析とAAVの原子座標とのマップフィッティング(図5)は、マップのより適切な解像度推定値が2.3Åであることを示唆しています。FSCとMonoResの解像度の推定値を調整する同様の戦略が以前に提示されています24,25。解像度の推定値は、絞り込みステップで使用されるマスクによって影響を受ける可能性があるため、マスクが密度のどの部分も除外しないようにすることが重要です。この研究で使用したマスクを3D再構成と重ね合わせたものを図7Dに示す。提示されたワークフローの解像度の段階的な増加は、高品質で高解像度の3D再構成を達成するために、複数のSPAソフトウェアパッケージのアルゴリズムを利用することの利点を強調しています。
既存の 原子モデルでマップを構築またはフィッティングするその場でのモデルの作成は、計算された構造の品質チェックとして役立ちます。我々はUCSFキメラで最終的な地図を視覚化し、以前に発表された原子モデル(PDB ID:7kfr)30を地図に当てはめました。 図5 は、AAVの原子座標を適合させたクライオEMマップの領域を示す。EM密度が明確に定義されているため、個々のアミノ酸、水分子、マグネシウムイオンの側鎖をフィッティングでき、クライオEMマップと原子モデルとの一致を確認できます。
図 1: クライオスパーク v3、RELION-3、Scipion 3、および Phenix 1.18 全体で完全な SPA ワークフロー。cryoSPARC v3、RELION-3、Scipion 3、および Phenix 1.18 で完了したステップは、それぞれ紫、オレンジ、緑、および灰色のボックスで示されます。8つのGPU、40個のCPU、750GBのRAMを搭載した処理サーバを使用して各ステップを完了するのに要する時間は、個々のボックスごとに指定されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:cryoSPARC v3における下流処理用の顕微鏡写真の選択 (A)推定および実験的なトン環がよく一致する顕微鏡写真がさらなる処理に使用され、非点収差が高く適合不良の顕微鏡写真(B)は廃棄された。5 Åを超えるCTFフィット、400 Åを超える乱視、および2未満の相対氷厚を有する顕微鏡写真、すなわち70/395顕微鏡写真をさらなる処理から除去した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:2Dクラスの選択 明確に定義されたクラスを含む 2D クラス平均が選択され (A)、低解像度、ノイズ、および部分パーティクルを持つクラス平均は拒否されます (B)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: クライオスパーク v3、RELION-3、および Scipion 3 にわたる AAV 処理のワークフローと代表的な結果。 cryoSPARC v3、RELION-3、および Scipion 3 で完了したステップは、それぞれ紫、オレンジ、および緑色の矢印で示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:AAVの高分解能構造は、異なる二次構造要素および個々のアミノ酸側鎖を表す明確に定義されたEM密度を示す。(A) AAVの最終地図。(B) AAVの原子座標(PDB ID:7kfr)30を取り付けたベータシートを表す地図の一部。(c)個々のアミノ酸を表すマップ密度。左から右へ:アルギニン、フェニルアラニン、トリプトファン。(D)マップの高解像度の特徴には、赤色で提示された水分子と緑色の球体として提示されたマグネシウムイオンが含まれる。図中に表示されるMg2+ イオンは、ヒスチジン(左)とアルギニン残基によって配位している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:クライオスパークv3、RELION-3、およびScipion 3のFSC曲線は、ワークフロー全体で解像度が向上していることを示しています。Scipion 3のプログラムXmipp3 - highresを使用して計算されたFSC曲線は、ナイキスト限界に達したことを示しており、分解能推定値がアンダーサンプリングによって制限されていることを示唆している29が、マップ解像度のより適切な分析が図7に示され、代表結果セクション24、25で議論されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: Xmipp - MonoRes を使用した Scipion 3 での最終的な再構築の検証マップの解像度は、FSC 曲線からの単一の基準による単一の解像度推定値ではなく、局所的な解像度分布を提示することによってより適切に記述されます。(A-B)パネル A とパネル B には、それぞれ cryoSPARC v3 と Scipion 3 で生成されたマップとは異なるスライスが表示されます。(C) cryoSPARC v3 (ピンク色のバー) と Scipion 3 (青いバー) で計算されたマップのローカル解像度の体系的な増加を示すヒストグラム。(D) ローカル解像度の計算に使用されるマスク (灰色) には、両方のプログラムで絞り込まれた AAV 密度のすべての部分が含まれています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| プログラム | 絞り込みタイプ | スクリプト | |||
| クライオスパーク v3 | 均質な洗練 | 均質な洗練 | |||
| 不均一な絞り込み | 不均一な絞り込み | ||||
| 異機種混在の改良 | 異機種混在の改良 | ||||
| パーティクルごとのモーション補正 | 局所運動補正 | ||||
| レリオン-3 | 3Dリファインメント | リファイン3D | |||
| 後処理 - Bファクタシャープニング、MTF補正 | リファイン3D | ||||
| パーティクルポリッシング | ベイジアン研磨 | ||||
| CTFリファインメント - ビームチルト | CtfRefine(CtfRefine) | ||||
| CTFの微細化 - 異方性倍率 | CtfRefine(CtfRefine) | ||||
| CTFの精緻化 - 粒子ごとの焦点ずれ、粒子/顕微鏡写真ごとの乱視 | CtfRefine(CtfRefine) | ||||
| エヴァルト球曲率補正 | Relion_reconstruct | ||||
| シピオン3 | 高解像度の絞り込み | Xmipp3 - 高解像度 | |||
| フェニックス1.18 | 密度修正とシャープニング | 解決クライオエム | |||
表 1: ワークフロー全体で実装された改良 特定の改良が特定のプロジェクトに適用できるかどうかは、データ品質と集録パラメータによって異なります。たとえば、エワルド球曲率補正は、すでに高解像度のマップに適用できます。
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Discussion
この記事では、さまざまなソフトウェアプラットフォーム間でクライオEMデータ処理を行い、高解像度の3D再構成を実現するための堅牢なSPAワークフローを紹介します(図1)。このワークフローは、多種多様な生物学的巨大分子に適用可能である。プロトコルの後続のステップは、ムービーの前処理、パーティクルのピッキングと分類、および構造の微細化(表1)と検証のための複数の方法を含む、図4に概説されています。cryoSPARC v3、RELION-3、およびScipion 3の処理ステップと、ソフトウェアパッケージ間でデータを転送する方法が紹介されています。プロトコル全体で得られた中間構造を、分解能を高めて示しました(図4、図6、 図7)。
この原稿で概説した方法は、異なるタンパク質および生物学的集合体の構造決定に使用することができるが、AAVは、その大きなサイズが顕微鏡において高いコントラストを生成し、二十面体対称性が60倍のサブユニット冗長性を有する粒子を生成するので、クライオEMおよびSPAによる高分解能構造決定のための理想的な候補であることに注意することが重要です。高解像度の再構成を得ることは、小型(すなわち、100kD未満)、動的、および不均一なサンプルではますます困難になる。このプロトコルを正常に実行するには、多くの高品質のムービーを処理のために収集することが重要です。低品質の生データでは、高解像度で高品質の再構成を得ることはできません。例えば、氷の厚さが構造決定に最適でない場合、または粒子が氷水界面に付着するか、または好ましい配向を示す場合、グリッド凍結条件を再検討する。
ワークフローのもう 1 つの重要なステップは、パーティクルのピッキングと抽出です。パーティクルピッキング中は、焦点ずれによって広がる高解像度の情報をキャプチャするのに十分なボックスサイズが必要なため、ボックスサイズはパーティクルの最長軸の約1.4〜2.5倍にする必要があります。ただし、ボックス サイズを大きくすると、パーティクル抽出中に生成されるファイルのサイズが大きくなるため、処理時間が長くなります。ボックスのサイズを選択するときは、粒子径とピクセルサイズを考慮してください。多くのパーティクルでは、ユーザーは初期処理のために抽出中にパーティクルをビンに入れ、最終的な改良のためにフルサイズのパーティクルを再抽出することができます。このプロトコルは、手動パーティクル ピッキングを使用して、自動選択用のテンプレートを生成します。しかし、cryoSPARC v3 では、BLOB ベースのピッカーや、ディープラーニングを利用して以前のピックに基づいてパーティクルを選択するトパーズラッパーなど、完全に自動化されたピッキング方法も提供しています。これらのアルゴリズムは非常に堅牢ですが、後で 2D および 3D 分類によってかなりの数のピックを削除する必要があります。
重要なステップには、放射線損傷粒子などのアーチファクトを除去し、サンプル中に存在する異なる構造形態の試料をそれぞれ分離するために使用される2Dおよび3D分類も含まれます。ユーザーが設定する 2D クラスの数は、顕微鏡写真から抽出された粒子の数、コントラスト、および標本の不均一性に依存する必要があります。これは、粒子の個々のビューを個別の 2D クラスに分割することが目的であるためです。一般的なルールとして、100 個のパーティクルごとに 2D クラスを追加し、多数のパーティクルを含む新しいサンプルを処理する場合は、100 個のクラスが出発点として適しています。2D および 3D 分類を何度も繰り返しても、低解像度または中程度の解像度が得られる場合は、ボックス サイズの大きいパーティクルを再抽出して、より多くの構造情報が得られるかどうかを確認します。最終的な再構成の解像度を報告する際には、ゴールドスタンダード法に従って得られたFSC曲線を、局所分解能の推定値とマップ密度の慎重な検査、ならびに原子モデルとの一致とともに分析する必要があります。
ウイルス構造の改良のために、RELION-3で実装されたエワルド球曲率補正は、高解像度での改善を実証しました31。動的マルチタンパク質複合体の構造を精製する場合は、RELION-3で実装された3Dマルチボディリファインメント、またはRELION-3およびcryoSPARC v3で実装された画像減算による集束分類を試してみてください。不均一性を計算的に解決できない場合は、サンプル調製条件を再検討する必要があります32。タンパク質分解をもたらす不十分な純度または不十分な調製は、3D再構成の品質を妨げるであろう。さらに、タンパク質を不安定化させたり凝集を促進したりするバッファー条件は、構造計算に使用できる明確に定義された粒子の数を厳しく制限します。したがって、ここで提示された方法を最も効果的に利用するためには、サンプル安定性のための最適な条件を特定することが不可欠です。クライオEMの前にサンプルをスクリーニングするために陰性染色電子顕微鏡法をお勧めします。
クライオEMがますます多くの構造生物学者にとって3D構造決定の好ましい方法になるにつれて、画像処理と構造決定のための統合的で堅牢なワークフローの必要性がより明確になっています。CryoSPARCは、使いやすいWebベースのグラフィックユーザーインターフェイス(GUI)を提供し、あらゆる経験レベルのユーザーがデータをすばやく処理し、3D構造を計算できるようにします。特に、CryoSPARCは確率的勾配降下法を利用してab initio 3D再構成を実行します。さらに、このソフトウェアは、迅速な3Dマップの改良のために分岐および束縛尤度最適化アルゴリズムを採用しています7。この記事で説明する処理パイプラインでは、cryoSPARC v3 を使用して初期 3D マップを生成します。3D再構成は、経験的なベイズアプローチを使用してユーザーのデータセットに基づいて重要なパラメータを推定する一般的なパッケージであるRELION-3で洗練され、プログラム操作のための専門知識の必要性が軽減されます10。具体的には、粒子ごとの動き補正にベイズ研磨やCTFの微細化を行い、分解能の向上を図っています。最後に、得られた構造は、Xmipp13、EMAN28、SPIDER12などを含む複数のプラットフォームからのアルゴリズムをサポートする統合PythonシェルであるScipion 311でさらに洗練され、検証されています。クライオEMユーザー向けにはさまざまなソフトウェアパッケージが用意されていますが、現在、この分野で受け入れられているユニバーサルSPAプラットフォームはありません。SPA ワークフローは、この記事で説明する 3 つのソフトウェア パッケージのいずれかで完全に実行できますが、アルゴリズムが異なると、さまざまな結果が得られる場合があります。したがって、個々のステップは、サンプルとデータの品質に応じてカスタマイズする必要があります。たとえば、現在のデータセットでは、RELION-3 の 3Drefine によって 3D 再構成の解像度が上昇しましたが、cryoSPARC v3 の不均一な絞り込みによって解像度がわずかに低下しました。したがって、最適な品質と分解能を達成し、再構成の検証を容易にするために、構造を再計算するために様々なプログラムを利用することは非常に有益である。Scipion 3 には cryoSPARC v3 および RELION-3 の多数のアルゴリズムが含まれていますが、これらのプログラムの最新の実装は Scipion ですぐには利用できません。例えば、この原稿で利用されているプログラムのうち、RELION-3だけがスクリプトRelion_reconstructを通じてエワルド球曲率補正を提供しています。この記事で紹介するパイプラインは、新規ユーザーと経験豊富なユーザーの両方が、cryoSPARC v3、RELION-3、および Scipion 3 に実装されたアルゴリズムを正常に使用して、ほぼ原子分解能で 3D 構造を計算するためのガイドを提供します。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
Scipion3のインストールに協力してくれたCarlos Oscar Sorzano氏と、異なる処理プラットフォーム間のデータ転送を支援してくれたKilian Schnelle氏とArne Moeller氏に感謝します。この研究の一部は、NIH助成金U24GM129547によって支援され、OHSUのPNCCで実施され、生物環境研究局が後援するDOE科学局ユーザー施設であるEMSL(grid.436923.9)を介してアクセスされました。この研究は、ラトガース大学からアレク・クルチクへのスタートアップ助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
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