Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63387
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

Summary

Denne artikel beskriver, hvordan man effektivt udnytter tre cryo-EM-behandlingsplatforme, dvs. cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3, til at skabe en enkelt og robust arbejdsgang, der gælder for en række enkeltpartikeldatasæt til bestemmelse af struktur i høj opløsning.

Abstract

Nylige fremskridt inden for både instrumentering og billedbehandlingssoftware har gjort enkeltpartikel kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) til den foretrukne metode for strukturbiologer til at bestemme højopløsningsstrukturer af en lang række makromolekyler. Flere softwarepakker er tilgængelige for nye og ekspertbrugere til billedbehandling og strukturberegning, som strømliner den samme grundlæggende arbejdsgang: film erhvervet af mikroskopdetektorerne gennemgår korrektion for stråleinduceret bevægelse og kontrastoverførselsfunktion (CTF) estimering. Dernæst vælges og ekstraheres partikelbilleder fra gennemsnitlige filmrammer til iterativ 2D- og 3D-klassificering efterfulgt af 3D-rekonstruktion, forfining og validering. Fordi forskellige softwarepakker anvender forskellige algoritmer og kræver forskellige niveauer af ekspertise for at fungere, varierer de 3D-kort, de genererer, ofte i kvalitet og opløsning. Således overfører brugerne regelmæssigt data mellem en række programmer for optimale resultater. Dette papir giver brugerne en vejledning til at navigere i en arbejdsgang på tværs af de populære softwarepakker: cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 for at opnå en næsten atomisk opløsningsstruktur af den adeno-associerede virus (AAV). Vi beskriver først en billedbehandlingspipeline med cryoSPARC v3, da dens effektive algoritmer og brugervenlige GUI giver brugerne mulighed for hurtigt at nå frem til et 3D-kort. I det næste trin bruger vi PyEM og interne scripts til at konvertere og overføre partikelkoordinater fra 3D-rekonstruktion af bedste kvalitet opnået i cryoSPARC v3 til RELION-3 og Scipion 3 og genberegne 3D-kort. Endelig skitserer vi trin til yderligere forfining og validering af de resulterende strukturer ved at integrere algoritmer fra RELION-3 og Scipion 3. I denne artikel beskriver vi, hvordan man effektivt udnytter tre behandlingsplatforme til at skabe en enkelt og robust arbejdsgang, der gælder for en række datasæt til bestemmelse af struktur i høj opløsning.

Introduction

Kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) og enkeltpartikelanalyse (SPA) muliggør strukturbestemmelse af en lang række biomolekylære samlinger i deres hydrerede tilstand, hvilket hjælper med at belyse disse makromolekylers roller i atomare detaljer. Forbedringer i mikroskopoptik, computerhardware og billedbehandlingssoftware har gjort det muligt at bestemme strukturer af biomolekyler ved opløsning, der når ud over 2 Å1,2,3. Mere end 2.300 cryo-EM-strukturer blev deponeret i Protein Data Bank (PDB) i 2020 sammenlignet med 192 strukturer i 20144, hvilket indikerer, at cryo-EM er blevet den valgte metode for mange strukturbiologer. Her beskriver vi en arbejdsgang, der kombinerer tre forskellige SPA-programmer til bestemmelse af struktur i høj opløsning (figur 1).

Målet med SPA er at rekonstruere 3D-volumener af en målprøve fra støjende 2D-billeder optaget af en mikroskopdetektor. Detektorer indsamler billeder som film med individuelle rammer af samme synsfelt. For at bevare prøven opsamles rammer med en lav elektrondosis og har dermed et dårligt signal-støj-forhold (SNR). Derudover kan elektroneksponering fremkalde bevægelse inden for de glaserede cryo-EM-gitre, hvilket resulterer i billedsløring. For at overvinde disse problemer justeres rammer for at korrigere for stråleinduceret bevægelse og i gennemsnit for at give en mikrograf med en øget SNR. Disse mikrografer gennemgår derefter CTF-estimering (Contrast Transfer Function) for at tage højde for virkningerne af defokusering og afvigelser, der pålægges af mikroskopet. Fra de CTF-korrigerede mikrografer udvælges, ekstraheres og sorteres individuelle partikler i 2D-klassegennemsnit, der repræsenterer forskellige retninger, der er vedtaget af prøven i glasagtig is. Det resulterende homogene sæt partikler anvendes som input til ab initio 3D-rekonstruktion for at generere en grov model eller modeller, som derefter iterativt raffineres for at producere en eller flere højopløsningsstrukturer. Efter genopbygning udføres strukturelle forbedringer for yderligere at forbedre kvaliteten og opløsningen af cryo-EM-kortet. Endelig er enten en atommodel direkte afledt af kortet, eller kortet er udstyret med atomkoordinater opnået andre steder.

Forskellige softwarepakker er tilgængelige for at udføre de opgaver, der er beskrevet ovenfor, herunder Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 og andre. Mens disse programmer følger lignende behandlingstrin, anvender de forskellige algoritmer, for eksempel til at vælge partikler, generere indledende modeller og forfine rekonstruktioner. Derudover kræver disse programmer et varierende niveau af brugerkendskab og intervention for at fungere, da nogle afhænger af finjustering af parametre, der kan fungere som en hindring for nye brugere. Disse uoverensstemmelser resulterer ofte i kort med inkonsekvent kvalitet og opløsning på tværs af platforme14, hvilket får mange forskere til at bruge flere softwarepakker til at forfine og validere resultaterne. I denne artikel fremhæver vi brugen af cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 for at opnå en 3D-rekonstruktion af AAV i høj opløsning, en meget anvendt vektor til genterapi15. De førnævnte softwarepakker er gratis for akademiske brugere; cryoSPARC v3 og Scipion 3 kræver licenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Oprettelse af et nyt cryoSPARC v3-projekt og import af data

BEMÆRK: Data blev erhvervet på Oregon Health and Science University (OHSU) i Portland ved hjælp af et 300 kV Titan Krios elektronmikroskop udstyret med en Falcon 3 direkte elektrondetektor. Billeder blev indsamlet i en tælletilstand med en samlet dosis på 28,38 e−/Å2 fordelt på 129 billeder og et defokusområde fra -0,5 μm til -2,5 μm ved en pixelstørrelse på 1,045 Å ved hjælp af EPU. Prøven af AAV-DJ blev leveret af OHSU's personale.

  1. Åbn cryoSPARC v3 i en webbrowser, og klik på overskriften Projekter . Vælg + Tilføj for at oprette et nyt projekt. Titel projektet i overensstemmelse hermed, og angiv en sti til en eksisterende mappe, hvor job og data gemmes.
  2. Opret et arbejdsområde til projektet ved at åbne projektet, klikke på + Tilføj og vælge Nyt arbejdsområde. Titel arbejdsområdet, og klik på Opret.
  3. Naviger til det nye arbejdsområde, og åbn Job Builder i højre panel. Denne fane viser alle tilgængelige funktioner i cryoSPARC v3. Klik på Importer film , og angiv filmstien, få referencefilsti, og indstil anskaffelsesparametre som følger: Rå pixelstørrelse 1.045 Å, Accelererende spænding 300 kV, Sfærisk aberration 2,7 mm, Samlet eksponeringsdosis 28,38 e-/Å^2.
  4. Klik på Kø, vælg en bane for at køre jobbet og et arbejdsområde, og klik på Opret.
    BEMÆRK: Anskaffelsesparametrene er prøve- og mikroskopafhængige.

2. CryoSPARC v3 - filmjustering og CTF-estimering

  1. Åbn Patch Motion Correction (Multi). Dette job kræver de film, der importeres i trin 1.3, som input. Åbn jobkortet Importer film i arbejdsområdet, og træk Imported_movies output til filmpladsholderen på det nye job. Sæt jobbet i kø.
    BEMÆRK: For mere information om cryoSPARC metoderne beskrevet i denne artikel, se cryoSPARC tutorial16.
  2. For at udføre CTF-estimering skal du åbne Patch CTF Estimation (Multi). Indtast de mikrografer, der er genereret i trin 2.1, og sæt jobbet i kø .
  3. For at inspicere de gennemsnitlige og CTF-korrigerede mikrografer og vælge en delmængde til videre behandling skal du åbne Curate Exposures og indtaste de eksponeringer, der er opnået i trin 2.2. Sæt jobbet i kø.
  4. Når jobbet er gået i ventetilstand , skal du klikke på fanen Interaktion på jobkortet, justere parametertærskler og acceptere eller afvise individuelle mikrografer til videre behandling. Accepter mikrografer med velmatchede estimerede og eksperimentelle CTF'er (figur 2), og kassér dem med høj bygningsfejl, dårlig CTF-pasform og tyk is.
  5. Under behandlingen af de aktuelle data skal du indstille den øvre tærskel for astigmatisme til 400 Å, CTF-tilpasningsopløsning til 5 Å og relativ istykkelse til 2. Klik på Udført for at vælge mikrograferne til downstream-behandling.

3. CryoSPARC v3 - manuel og skabelonbaseret partikelplukning

  1. Åbn Manuel vælger, indtast de accepterede eksponeringer fra trin 2.4-2.5, og sæt jobbet i kø . Klik på fanen Interaktiv , indstil Box Size (px) til 300, og klik på et par hundrede partikler på tværs af flere mikrografer og undgå at vælge overlappende partikler. Her blev 340 partikler på tværs af 29 mikrografer udvalgt. Når du er færdig, skal du klikke på Udført plukning! Uddrag partikler.
    BEMÆRK: Denne protokol bruger manuel partikelplukning til at generere skabeloner til automatisk valg. Andre metoder er dog også tilgængelige17.
  2. For at generere skabeloner til automatiseret partikelplukning skal du klikke på 2D-klassificering og indtaste de partikelvalg, der genereres i trin 3.1. Skift antallet af 2D-klasser til 10, og sæt jobbet i kø .
  3. Åbn Vælg 2D-klasser. Indtast partiklerne og klassegennemsnittet opnået i trin 3.2, og klik på fanen Interaktiv . Vælg repræsentative 2D-klasser med god SNR, og klik på Udført.
    BEMÆRK: Klassegennemsnittet afspejler forskellige partikelvisninger. Vælg klassegennemsnit, der afspejler hver visning. Målet er at producere veldefinerede skabeloner, der repræsenterer forskellige visninger af prøven til automatiseret plukning.
  4. Åbn Skabelonvælger, og indtast de 2D-klasser, der er valgt i trin 3.3, og mikrografer fra trin 2.4-2.5. Indstil partikeldiameteren (Å) til 220 Å, og sæt jobbet i kø .
  5. Hvis du vil inspicere de automatiserede pluk, skal du åbne Vælg partikelvalg, indtaste de partikler og mikrografer, der genereres i trin 3.4, og sætte jobbet i kø .
  6. På jobkortet Vælg partikelvalg skal du klikke på fanen Interaktiv og indstille boksstørrelsen (px) til 300. Klik på en individuel mikrograf, juster lowpass-filteret, indtil partikler er tydeligt synlige, og indstil NCC-tærsklen (Normalized Cross Correlation) til 0,41 og Power Threshold mellem 54000 og 227300 .
  7. Undersøg flere mikrografer, og juster om nødvendigt tærsklerne, således at de fleste partikler vælges uden at inkludere falske positiver. Når du er færdig, skal du klikke på Færdig plukning! Uddrag partikler.
    BEMÆRK: Ægte partikler har typisk en høj NCC- og effektscore, hvilket indikerer, at de ligner skabelonen og har henholdsvis en høj SNR.
  8. Åbn uddrag fra mikrografer , og indtast mikrografer og partikler fra trin 3.7. Indstil udtrukket boksstørrelse (px) til 300, og sæt jobbet i kø .

4. CryoSPARC v3 - 2D klassificering

  1. Klik på 2D-klassificering , og indtast de ekstraherede partikler fra trin 3.8. Angiv Antallet af 2D-klasser til 50, og sæt jobbet i kø .
  2. Hvis du vil vælge de bedste 2D-klasser til videre behandling, skal du åbne Vælg 2D-klasser. Indtast partiklerne og klassegennemsnittet opnået i trin 4.1. Klik på fanen Interaktiv , og vælg 2D-klasser baseret på opløsningen og antallet af partikler i klassen (figur 3). Vælg ikke klasser, der indeholder artefakter. Når du har valgt, skal du klikke på Udført.
    BEMÆRK: Normalt kræves flere runder af 2D-klassificering for at fjerne partikler, som ikke konvergerer i forskellige, veldefinerede klasser. Kør så mange runder af 2D-klassificering som nødvendigt for at fjerne sådanne partikler fra datasættet (figur 3).

5. CryoSPARC v3 - ab-initio rekonstruktion og homogen forfining

  1. For at generere et indledende 3D-volumen skal du åbne Ab-initio Reconstruction og indtaste partiklerne opnået i trin 4.2 eller fra den endelige 2D-klassificering. Juster symmetri til icosahedral. Sæt jobbet i kø.
    BEMÆRK: Symmetrien er prøveafhængig og bør ændres i overensstemmelse hermed. Hvis det er ukendt, skal du bruge C1-symmetri.
  2. Åben homogen raffinement. Indtast volumenet fra trin 5.1 og partikler fra 4.2 eller den endelige 2D-klassificering. Skift symmetri , og sæt jobbet i kø . Når jobbet er færdigt, skal du inspicere Fourier Shell Correlation (FSC) kurven og downloade lydstyrken til undersøgelse i UCSF Chimera18.

6. Eksport af partikelkoordinater fra cryoSPARC v3 og import af dem til RELION-3 ved hjælp af PyEM

BEMÆRK: Partikelkoordinater bærer information om placeringen af individuelle partikler i hver mikrograf. Overførsel af koordinater i stedet for partikelstakke til RELION-3 giver mulighed for at køre forfiningstrin, som ellers ikke ville være tilgængelige. For eksempel kræver partikelpolering adgang til indledende filmrammer. Derfor, før du eksporterer partikelkoordinater fra cryoSPARC v3 til RELION-3, skal du importere film og udføre bevægelseskorrektion og CTF-estimering i RELION-3. Se RELION-3 tutorial19 for detaljer.

  1. Naviger til RELION-3-projektmappen, og start RELION-3.
  2. Åbn Importér fra jobtypebrowseren, og angiv stien til film- og anskaffelsesparametrene som i trin 1.3.
  3. For at udføre bevægelseskorrektion skal du bruge UCSF MotionCor220 via RELION-3 GUI, åbne Bevægelseskorrektion og indstille standardparametrene som i UCSF MotionCor2-manualen21. Indtast stien til de film, der importeres i trin 6.2. På fanen Bevægelse skal du angive stien til motioncor2 eksekverbar.
    BEMÆRK: MotionCor2 kan køres parallelt ved hjælp af flere GPU'er.
  4. Udfør CTF-estimering ved hjælp af CTFFIND-4.122 gennem RELION-3 GUI. Åbn CTF Estimation og input micrographs.star genereret i trin 6.3. På fanen CTFFIND-4.1 skal du angive stien til CTFFIND-4.1 eksekverbar og indstille parametre som i RELION-3.1 tutorial19.
  5. For at importere partikelstakke fra cryoSPARC v3 til RELION-3 skal de først eksporteres fra cryoSPARC v3. I cryoSPARC v3 skal du åbne jobkortet for jobbet Vælg 2D-klasse fra trin 4.2 eller den endelige 2D-klassificering. Klik på Eksportér job under fanen Detaljer. Eksportér job udsender particles_exported.cs filen.
  6. Før partikelkoordinater importeres fra cryoSPARC v3 til RELION-3, skal den particles_exported.cs fil fra trin 6.5 konverteres til .star-format. Brug PyEM23 til at konvertere den particles_exported.cs fil til .star-format ved at udføre følgende kommando: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. I RELION-3 skal du klikke på fanen Manuel plukning og på fanen I/O indtaste mikrograferne fra CTF-raffinement beskrevet i trin 6.4. På fanen Skærm skal du indtaste følgende parametre: Partikeldiameter (A): 220, Lowpass-filter (A): -1 , Skaler til CTF-billede: 0,5. Kør jobbet. En mappe kaldet ManualPick genereres i RELION-3 hjemmemappen.
    BEMÆRK: Dette trin udføres for at oprette en manuel plukkemappestruktur i RELION-3. Under manuel plukning oprettes der en enkelt .star-fil, der indeholder koordinater for plukkede partikler, for hver gennemsnitlig mikrograf, der bruges til plukning i RELION-3 GUI.
  8. Naviger til mappen, der indeholder filen particles_exported.star fra trin 6.6, og kør et hjemmeskrevet script, der producerer en enkelt manualpick.star-fil for hver gennemsnitlig mikrograf, der bruges til plukning af cryo-SPARC v3-partikler, hvilket bidrog til den endelige 2D-klassificering, der blev eksporteret i trin 6.5. De resulterende koordinatfiler gemmes i mappen ManualPick/Movies.
  9. Vend tilbage til RELION-3, og åbn jobbet Manuel plukning igen. Klik på Fortsæt. Dette viser partikler, der tidligere er plukket i cryoSPARC v3 i RELION-3 GUI. Undersøg et par mikrografer for at kontrollere, om overførslen af partikelkoordinater er opnået, og om partikler er korrekt valgt.

7. RELION-3 - Partikelekstraktion og 2D-klassificering

  1. Klik på Partikelekstraktion. På fanen I/O skal du indtaste de CTF-korrigerede mikrografer fra trin 6.4 og koordinaterne fra trin 6.9. Klik på fanen Uddrag , og skift partikelboksstørrelsen (pix) til 300. Kør jobbet.
  2. Udfør 2D-klassificering for yderligere at rense partikelsættet genereret i cryoSPARC v3 for at opnå en rekonstruktion med højere opløsning. Klik på 2D-klassificering , og indtast filen particles.star, der blev genereret i trin 7.1, på fanen I/O . Under fanen Optimering skal du indstille Antallet af klasser til 50 og Maskediameter (A) til 280. Kør jobbet.
    BEMÆRK: Masken skal omfatte hele partiklen.
  3. For at vælge de bedste 2D-klasser skal du klikke på metoden Delmængdevalg , indtaste filen _model.star fra trin 7.2 og Kør jobbet. Vælg klasser som beskrevet i trin 4.2.
  4. Gentag trin 7.2 og 7.3 for at fjerne ikke-konvergerende partikler.

8. RELION-3 - 3D-forfining, maskeoprettelse og efterbehandling

  1. Brug det kort, der genereres i cryoSPARC v3 (trin 5.2), som en indledende model til 3D-raffinement i RELION-3. Vælg importmetoden, og indstil følgende parametre på fanen I/O : Importer raw-film/mikrografer: Nej, Raw-inputfiler: Film/*.mrc.
  2. Angiv MTF-filen, og indtast parametrene for filmanskaffelse som beskrevet i trin 1.3. På fanen Andre skal du vælge cryoSPARC v3-kortet som inputfil, ændre nodetype til 3D-reference (.mrc) og køre jobbet.
  3. Vælg 3D Auto-Refine, og indstil Inputbilleder som filen particles.star fra trin 7.3 eller det sidste valgjob under fanen I/O. Giv cryoSPARC v3-rekonstruktionen som referencekort. Klik på fanen Reference, og skift Initial Low-Pass filter (Å) til 50 og Symmetry til icosahedral. Under fanen Optimering skal du ændre maskediameteren (Å) til 280 og køre jobbet.
  4. Når løbet er afsluttet, skal du åbne run_class001.mrc i UCSF Chimera.
  5. I UCSF Chimera skal du klikke på Værktøjer og under Volumendata vælge Volume Viewer. Dette åbner et nyt vindue for at justere lydstyrkeindstillingerne. Skift trin til 1 , og juster skyderen, indtil du når niveauværdien, hvor kortet ikke har nogen støj. Optag denne værdi, da den vil blive brugt til oprettelse af masker i næste trin.
  6. Kortet, der er produceret ved automatisk raffinement, afspejler ikke den sande FSC, da støj fra det omgivende opløsningsmiddel sænker opløsningen. Før efterbehandling skal du oprette en maske for at skelne prøven fra opløsningsmiddelområdet.
    1. Klik på Maskeoprettelse og input run_class001.mrc fra trin 8.3.
    2. Klik på fanen Maske og juster parametre som følger: Lowpass Filter Map (Å): 10, Pixel Size (Å): 1.045, Initial Binarization Threshold: niveauværdien opnået i trin 8.5, Udvid binært kort så mange pixels: 3, og tilføj en Soft-Edge af så mange pixels: 3. Kør jobbet.
  7. Undersøg masken i UCSF Chimera. Hvis masken er for stram, skal du øge Extend Binary Map så mange pixels og /eller tilføje en Soft-Edge af så mange pixels. Det er vigtigt at oprette en maske med bløde kanter, da en skarp maske kan føre til overmontering.
  8. Klik på Efterbehandling og på fanen I / O , indtast de halve kort, der er oprettet i trin 8.3, og masker fra 8.6. Indstil kalibreret pixelstørrelse til 1,045 Å. På fanen Skærp skal du indtaste følgende: Estimer B-faktor automatisk?: Ja, laveste opløsning for Auto-B Fit (A): 10, Brug din egen B-faktor?: Nej. Under fanen Filter skal du angive Spring Fsc-vægtning over? til Nej .

9. RELION-3 - Poleringstræning og partikelpolering

  1. Før du korrigerer for stråleinduceret bevægelse pr. partikel, skal du først bruge træningstilstanden til at identificere optimale bevægelsesspor for datasættet. Åbn Bayesiansk polering , og indtast de bevægelseskorrigerede mikrografer fra trin 6.3, partikler fra trin 8.3 og efterbehandling .star-filen fra trin 8.8 på fanen I/O . Klik på fanen Træning , og indstil følgende parametre: Træn optimale parametre: Ja, brøkdel af Fourier-pixels til test: 0,5, Brug så mange partikler: 5000. Kør jobbet.
    BEMÆRK: Dette script producerer opt_params_all_groups.txt fil i den polske RELION-3-mappe, der indeholder optimerede poleringsparametre, der kræves for at udføre følgende trin.
  2. Når træningsjobbet er afsluttet, skal du klikke på Bayesian Polishing. Klik på fanen Træning og indstil Træn optimale parametre? til Nej. Vælg fanen Polsk , og angiv stien til den opt_params_all_groups.txt fil fra trin 9.1 i Optimeret parameterfil . Klik på Kør.
  3. Gentag 3D-raffinement (trin 8.3) og efterbehandling (trin 8.8) med et sæt polerede partikler.

10. RELION-3 - CTF og per-partikelforfininger

  1. Hvis du vil estimere afvigelser af højere orden, skal du åbne CTF-raffinement og under fanen I/O under Partikler vælge stien til .star-filen, der indeholder polerede partikler, fra det nylige Refine 3D-job (run_data.star).
    1. Under Efterbehandlingsstjernefil skal du angive stien til outputtet fra det seneste efterbehandlingsjob (trin 9.3).
    2. Vælg fanen Tilpas , og indstil følgende parametre: Estimat (anisotrop forstørrelse): Nej, Udfør CTF-parametertilpasning? Nej, estimat Beamtilt: Ja, anslår også Trefoil? Ja, anslå 4. ordens abberationer? Ja. Kør jobbet.
  2. Gentag trin 10.1 ved hjælp af partikler (fra Refine3D), der blev genereret i det forrige job (particles_ctf_refine.star). Under fanen Tilpas skal du ændre Estimat (Anisotrop forstørrelse) til Ja og Kør jobbet.
  3. Gentag trin 10.2 ved hjælp af partikler (fra Refine3D), der er produceret i det forrige job (particles_ctf_refine.star). På fanen Tilpas skal du indstille følgende parametre: Estimat (anisotrop forstørrelse): Nej, Udfør CTF-parametertilpasning?: Ja, Tilpas defokusering?: Per-partikel, Fit Astigmatism? Per-mikrograf, Fit B-faktor?: Nej, Fit Phase-Shift: Nej, Estimat Beamtilt?: Nej, Estimat 4. ordens aberrationer?: Nej.
    BEMÆRK: Da partiklen har tilstrækkelig kontrast, kan fanen Fit Astigmatism? indstilles til Per-partikel. For dette datasæt forbedrede forfining af bygningsfejl pr . partikel ikke kortets kvalitet og opløsning.
  4. Gentag 3D-raffinement med partiklerne fra trin 10.3, og på fanen I / O skal du indstille Brug opløsningsmiddel-fladede FSC'er? til ja. Når du er færdig med at køre, skal du udføre et efterbehandlingsjob (trin 8.8) og undersøge kortet i UCSF Chimera (trin 5.2).

11. Overførsel af RELION-3 partikelkoordinater og 3D-kort til Scipion 3

  1. For yderligere at forfine og validere RELION-3-kortet skal du først importere volumen og partikler fra det sidste efterbehandlingsjob (trin 10.4) til Scipion 3. Start Scipion 3 og opret et nyt projekt.
  2. I panelet Protokoller til venstre skal du vælge rullemenuen Importer og klikke på Importer partikler. Skift følgende parametre: Importer fra: RELION-3, Stjernefil: postprocess.star, og angiv anskaffelsesparametre som i trin 1.3. Klik på Udfør.
  3. Klik på rullemenuen Import, og vælg Importer mængder. Under Import fra skal du angive stien til RELION-3-kortet. Skift pixelstørrelse (samplingshastighed) Å/px til 1,045 , og udfør.

12. Scipion 3 - Forfining med høj opløsning

  1. Udfør først en global justering. Vælg rullemenuen Finjuler i panelet Protokoller, og klik på Xmipp3 - highres24. Indtast de importerede partikler og volumener fra trin 11.2 og 11.3 som henholdsvis billeder i fuld størrelse og indledende volumener, og indstil symmetrigruppen til icosahedral. Under fanen Billedjustering under Vinkeltildeling skal du vælge Global og indstille den maksimale målopløsning til 3 Å og Kør jobbet.
  2. Når jobbet er færdigt, skal du klikke på Analysér resultater. I det nye vindue skal du klikke på UCSF Chimera-ikonet for at undersøge det raffinerede volumen. Klik desuden på Display Resolution Plots (FSC) for at se, hvordan FSC har ændret sig efter forfiningen, samt Plot Histogram med Angular Changes for at se, om Euler-vinkeltildelingerne er ændret.
    BEMÆRK: Afhængigt af opløsningen af input RELION-3-strukturen kan dette trin gentages flere gange med forskellige værdier indstillet for den maksimale målopløsning under fanen Vinkeltildeling. Du kan finde flere oplysninger i Scipion-selvstudiet25.
  3. Gentag trin 12.1 med en lokal justering. Kopier det forrige job, og skift Vælg tidligere kørsel til Xmipp3 - highres Global. På fanen Vinkeltildeling skal du ændre Billedjustering til Lokal. Indstil den maksimale målopløsning til 2,1 Å.
  4. Undersøg det raffinerede kort i UCSF Chimera og analyser ændringen i FSC og vinkeltildelinger (trin 12.2). Gentag lokal forfining, indtil opløsningen ikke forbedres, og vinkeltildelingerne er konvergeret, og juster Maks. målopløsning efter behov.
  5. Outputkortet fra Scipion 3 kan desuden densitetsmodificeres og skærpes i Phoenix26.

13. Scipion 3 - Validering af kort

  1. Undersøg den lokale opløsning af det endelige kort, der er genereret i Xmipp3 - highres. Åbn Xmipp - lokal MonoRes27, og indtast den endelige lydstyrke fra det forrige job og den maske, der blev genereret i trin 8.6. Indstil Opløsningsområde fra 1 til 6 Å med et interval på 0,1 Å, og udfør jobbet.
  2. Når du er færdig med at køre, skal du klikke på Analysér resultater og undersøge opløsningshistogrammet og volumenudsnitterne farvet efter opløsning.
  3. For at se, om partiklerne er godt justeret, skal du åbne Multireference Alignability28 og indtaste partiklerne og volumenet fra trin 12.3. Klik på Analysér resultater for at få vist valideringsplottet. Ideelt set bør alle punkter grupperes rundt (1,0,1,0).
  4. Åbn Xmipp3 - Valider overmontering. Indtast partiklerne og volumenerne fra trin 12.3. Når du er færdig med at køre, skal du analysere resultaterne og inspicere overmonteringsplottet. Krydsning af den justerede gaussiske støj og justerede partikelkurver indikerer overmontering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har præsenteret en omfattende SPA-pipeline for at opnå en struktur med høj opløsning ved hjælp af tre forskellige behandlingsplatforme: cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3. Figur 1 og figur 4 opsummerer den generelle behandlingsarbejdsgang, og tabel 1 beskriver forfiningsprotokoller. Disse protokoller blev brugt under forfininger af en 2,3 Å struktur af AAV, der opnåede nær Nyquist opløsning.

Film blev først importeret til cryoSPARC v3 og efterfølgende bevægelses- og CTF-korrigeret for at generere gennemsnitlige mikrografer. Når man vælger mikrografer til videre behandling, er det vigtigt at vælge dem med en god CTF-pasform og lav astigmatisme (figur 2), da inkludering af mikrografer af dårlig kvalitet kan hindre senere behandlingsfaser, hvilket resulterer i en rekonstruktion med lavere opløsning. 27.364 partikler blev derefter plukket og ekstraheret fra de udvalgte mikrografer. Fordi diameteren på AAV er ca. 220 Å og pixelstørrelsen er 1.045 Å, blev der brugt en kassestørrelse på 300 px. Dernæst blev iterativ 2D-klassificering brugt til at fjerne artefakter og partikler, der ikke konvergerede til stabile klasser. Eksempler på udvalgte og ekskluderede gennemsnit af 2D-klasser er vist i figur 3. Det er også vigtigt at bemærke, at klassegennemsnit, der afspejler forskellige konformationer af prøven, skal raffineres separat for at give flere 3D-rekonstruktioner. I et sådant tilfælde skal der beregnes flere ab initio startmængder. Her blev 26.741 partikler udvalgt og anvendt til ab initio modellering og homogen forfining af en enkelt 2,9 Å struktur.

Efter at have overført koordinater for partikler plukket i cryoSPARC v3 til RELION-3, udførte vi yderligere fire runder med 2D-klassificering, indtil datasættet konvergerede til stabile 2D-klasser. Den ovenfor beskrevne 2D-klassificering fjernede yderligere 3.154 partikler fra datasættet. Ved hjælp af strukturen genereret i cryoSPARC v3 som en indledende model producerede 3D-raffinement i RELION-3 en struktur med en næsten ækvivalent opløsning på 2,95 Å. Efterfølgende strukturelle forbedringer, som omfattede korrektion pr. partikelbevægelse og CTF-forfininger, øgede opløsningen til 2,61 Å. En komplet liste over forbedringer, vi udførte, er præsenteret i tabel 1. Volumen beregnet i RELION-3 blev derefter yderligere raffineret i Scipion 3 ved hjælp af flere runder med højopløsningsforfining (Xmipp3 - highres). Under de efterfølgende forfiningsrunder blev yderligere 3.186 partikler fjernet fra datasættet, hvilket resulterede i et endeligt sæt på 20.401 partikler, som producerede en 2,3 Å rekonstruktion af AAV (figur 5 og figur 6). I betragtning af pixelstørrelsen på 1.045 Å har vores raffinementer således næsten nået Nyquist-grænsen. FSC-kurver, der repræsenterer strukturer beregnet ved hjælp af hvert program, er vist i figur 6. Disse FSC-kurver angiver opløsningsforøgelsen i hele arbejdsgangen. Da opløsningen kan variere fra punkt til punkt på kortet, er det ofte mere hensigtsmæssigt at præsentere fordelingen af lokale opløsningsestimater på kortet i stedet for at rapportere et enkelt opløsningsestimat i henhold til et enkelt kriterium (f.eks. 0,143-kriterium) fra FSC-kurven. Således udførte vi en sådan analyse ved hjælp af Xmipp - MonoRes i Scipion 3. Figur 7 viser en sammenligning af estimater af lokal opløsning for kort opnået med cryoSPARC v3 og Scipion 3. Opløsningsestimater ved fire forskellige udsnit gennem strukturerne (figur 7A,B) og opløsningshistogrammer (figur 7C) viser tydeligt den trinvise forbedring i lokal opløsning mellem kortene i hele arbejdsgangen. FSC-kurven beregnet ved hjælp af programmet Xmipp3 - highres i Scipion 3 indikerer, at Nyquist-grænsen er nået (figur 6), hvilket tyder på, at opløsningsestimatet med stor sandsynlighed er begrænset af undersampling29. MonoRes-analysen præsenteret i figur 7C sammen med en omhyggelig analyse af EM-kortet og kortet, der passer med atomkoordinater for AAV (figur 5), tyder imidlertid på, at et mere passende opløsningsestimat for kortet er 2,3 Å. En lignende strategi, der forener FSC- og MonoRes-afviklingsestimaterne, er blevet fremlagt tidligere24,25. Da opløsningsestimater kan påvirkes af den maske, der bruges under forfiningstrin, er det vigtigt at sikre, at masken ikke udelukker nogen del af densiteten. Masken, der blev brugt i denne undersøgelse, overlappede med 3D-rekonstruktionerne, er vist i figur 7D. Den gradvise stigning i opløsningen i den præsenterede arbejdsgang fremhæver fordelen ved at bruge algoritmer fra flere SPA-softwarepakker til at opnå en 3D-rekonstruktion af høj kvalitet og høj opløsning.

In-situ-modelbygning eller tilpasning af kortet med en allerede eksisterende atommodel kan tjene som kvalitetskontrol for den beregnede struktur. Vi har visualiseret det endelige kort i UCSF Chimera og udstyret kortet med en tidligere offentliggjort atommodel (PDB ID: 7kfr)30. Figur 5 viser områder på cryo-EM-kortet udstyret med atomare koordinater for AAV. Veldefinerede EM-tætheder giver mulighed for at montere sidekæder af individuelle aminosyrer, vandmolekyler og magnesiumioner og bekræfte kryo-EM-kortets enighed med atommodellen.

Figure 1
Figur 1: Komplet SPA-arbejdsgang på tværs af cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 og Phoenix 1.18. Trin udført i cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 og Phoenix 1.18 betegnes med henholdsvis lilla, orange, grønne og grå kasser. Den tid, der kræves for at gennemføre hvert trin ved hjælp af behandlingsserveren udstyret med 8 GPU'er, 40 CPU'er og 750 GB RAM, er angivet i hver enkelt boks. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Udvælgelse af mikrografer til downstream-behandling i cryoSPARC v3. (A) Mikrografer med velafstemte estimerede og eksperimentelle Thon-ringe blev anvendt til videre behandling, mens de med høj astigmatisme og dårlig pasform (B) blev kasseret. Mikrografer med CTF-fit over 5 Å, bygningsfejl over 400 Å og relativ istykkelse under 2 blev fjernet fra videre behandling, dvs. 70/395 mikrografer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Valg af 2D-klasser. 2D-klassegennemsnit, der indeholder veldefinerede klasser, vælges (A), og dem med lav opløsning, støj og partielle partikler afvises (B). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Arbejdsgang og repræsentative resultater for AAV-behandling på tværs af cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3. Trin udført i cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 betegnes med henholdsvis lilla, orange og grønne pile. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: AAV's højopløsningsstruktur viser veldefinerede EM-tætheder, der repræsenterer forskellige sekundære strukturelementer og individuelle aminosyresidekæder. (A) Et endeligt kort over AAV. B) En del af kortet, der repræsenterer betaark udstyret med atomare koordinater for AAV (PDB ID: 7kfr)30. (C) Korttætheder, der repræsenterer individuelle aminosyrer. Fra venstre mod højre: arginin, phenylalanin og tryptofan. (D) Kortets højopløsningsfunktioner omfatter vandmolekyler præsenteret i røde og magnesiumioner præsenteret som grønne kugler. Mg2+ ion vist i figuren koordineres af histidin (venstre) og argininrester. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: FSC-kurver fra cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 viser stigende opløsning på tværs af arbejdsgangen. Mens FSC-kurven beregnet ved hjælp af programmet Xmipp3 - highres i Scipion 3 indikerer, at Nyquist-grænsen er nået, hvilket tyder på, at opløsningsestimatet er begrænset af undersampling29, præsenteres en mere passende analyse af kortopløsningen i figur 7 og diskuteres i afsnittet Repræsentative resultater24,25. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Validering af den endelige rekonstruktion i Scipion 3 ved hjælp af Xmipp - MonoRes. Kortets opløsning beskrives bedre ved at præsentere lokale opløsningsfordelinger i stedet for et enkelt opløsningsestimat i henhold til et enkelt kriterium fra FSC-kurven. (A-B) Panel A og B viser forskellige udsnit fra kort genereret i henholdsvis cryoSPARC v3 og Scipion 3. C) Histogrammer, der viser en systematisk stigning i den lokale opløsning for kort beregnet i cryoSPARC v3 (lyserøde søjler) og Scipion 3 (blå søjler). (D) Masken (grå), der bruges til lokale opløsningsberegninger, indeholder alle dele af AAV-tæthederne, der er raffineret i begge programmer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Program Forfining type Script
cryoSPARC v3 Homogen forfining Homogen forfining
Ikke-ensartet forfining Ikke-ensform forfining
Heterogen forfining Heterogen forfining
Korrektion af bevægelse pr. partikel Lokal bevægelseskorrektion
RELION-3 3D-forfining Forfine3D
Efterbehandling - B-faktor slibning, MTF-korrektion Forfine3D
Polering af partikler Bayesisk polering
CTF-forfining - strålehældning CtfRefine
CTF-forfining - anisotrop forstørrelse CtfRefine
CTF-raffinement - defokusering pr. partikel, per-partikel/mikrograf-astigmatisme CtfRefine
Ewald kugle krumning korrektion Relion_reconstruct
Scipion 3 Forfining i høj opløsning Xmipp3 - highres
Phenix 1.18 Tæthedsmodifikation og slibning ResolveCryoEM

Tabel 1: Forbedringer implementeret i hele arbejdsgangen. Hvorvidt visse forbedringer gælder for et bestemt projekt, afhænger af datakvalitet og anskaffelsesparametre. For eksempel kan Ewald-kuglens krumningskorrektion anvendes til kort, der allerede har høj opløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel præsenterer vi en robust SPA-arbejdsgang til cryo-EM-databehandling på tværs af forskellige softwareplatforme for at opnå 3D-rekonstruktioner i høj opløsning (figur 1). Denne arbejdsgang gælder for en lang række biologiske makromolekyler. De efterfølgende trin i protokollen er skitseret i figur 4, herunder forbehandling af film, partikelplukning og klassificering og flere metoder til strukturforbedringer (tabel 1) og validering. Behandlingstrin i cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 er blevet præsenteret, samt metoder til overførsel af data mellem softwarepakkerne. Vi har vist de mellemliggende strukturer opnået i hele protokollen med stigende opløsning (figur 4, figur 6 og figur 7).

Mens de metoder, der er skitseret i dette manuskript, kan bruges til strukturbestemmelse af forskellige proteiner og biologiske samlinger, er det vigtigt at bemærke, at AAV er en ideel kandidat til højopløsningsstrukturbestemmelse ved kryo-EM og SPA, da dens store størrelse producerer høj kontrast i mikroskopet, og icosahedral symmetri giver partikler med 60 gange underenhedsredundans. Opnåelse af rekonstruktioner i høj opløsning bliver stadig vanskeligere for små (dvs. mindre end 100 kD), dynamiske og heterogene prøver. For at kunne udføre denne protokol med succes er det afgørende, at mange film af høj kvalitet indsamles til behandling. Med rådata af dårlig kvalitet er det ikke muligt at opnå en rekonstruktion af høj opløsning og høj kvalitet. Hvis istykkelsen f.eks. ikke er optimal til bestemmelse af strukturen, eller hvis partiklerne klæber til is-vand-grænsefladen eller udviser foretrukne orienteringer, skal du revidere gitterfrysningsforholdene.

Et andet vigtigt skridt i arbejdsgangen er partikelplukning og ekstraktion. Under partikelplukning skal kassestørrelsen være ca. 1,4-2,5 gange større end partiklens længste akse, da der kræves tilstrækkelig kassestørrelse til at fange information i høj opløsning spredt ud på grund af defokusering. Større kassestørrelser kræver dog længere behandlingstider på grund af den øgede størrelse af filer, der genereres under partikelekstraktion. Når du vælger en kassestørrelse, skal du overveje partikeldiameter og pixelstørrelse. Med mange partikler vil brugeren måske bin partikler under ekstraktion til indledende behandling og derefter re-ekstrahere partikler i fuld størrelse til endelige raffinementer. Denne protokol bruger manuel partikelplukning til at generere skabeloner til automatisk valg. CryoSPARC v3 tilbyder dog også fuldautomatiske plukkemetoder, herunder en blob-baseret plukker og en Topaz-indpakning, der bruger dyb læring til at vælge partikler baseret på tidligere valg. Mens disse algoritmer er meget robuste, skal et betydeligt antal valg senere fjernes ved 2D- og 3D-klassificering.

Kritiske trin omfatter også 2D- og 3D-klassificering, der bruges til at fjerne artefakter, såsom strålingsbeskadigede partikler og adskille forskellige strukturelle former for prøven, henholdsvis. Antallet af 2D-klasser, der er fastsat af brugeren, bør afhænge af antallet af partikler ekstraheret fra mikrografer, kontrast og heterogenitet i prøven, da målet er at adskille hver enkelt visning af partiklen i en separat 2D-klasse. Som hovedregel skal du tilføje en 2D-klasse for hver 100 partikler, og hvis du behandler en ny prøve med et stort antal partikler, er 100 klasser et godt udgangspunkt. Hvis der opnås en lav eller moderat opløsning, selv efter mange runder med 2D- og 3D-klassificering, kan du prøve at udvinde partikler med en større kassestørrelse for at se, om der kan opnås mere strukturel information. Mens man rapporterer opløsningen af den endelige rekonstruktion, skal man analysere FSC-kurven opnået i henhold til guldstandardmetoden sammen med de lokale opløsningsestimater og omhyggelig inspektion af korttæthederne samt deres enighed med atommodellen.

Med henblik på forbedringer af virusstrukturerne har Ewald-kuglekrumningskorrektionen, der er implementeret i RELION-3, vist forbedringer ved høj opløsning31. Hvis du forfiner strukturer af dynamiske multiproteinkomplekser, kan du prøve 3D multi-body raffinement implementeret i RELION-3 eller fokuseret klassificering med billedsubtraktion implementeret i RELION-3 og cryoSPARC v3. Hvis heterogenitet ikke kan løses beregningsmæssigt, er det nødvendigt at revidere prøveforberedelsesbetingelserne32. Utilstrækkelig renhed eller utilstrækkelig forberedelse, der resulterer i proteinnedbrydning, vil hindre kvaliteten af 3D-rekonstruktionen. Derudover begrænser bufferbetingelser, der destabiliserer proteiner eller fremmer aggregering, alvorligt antallet af veldefinerede partikler, der kan bruges til strukturberegning. For mest effektivt at udnytte de metoder, der præsenteres her, er det derfor bydende nødvendigt at identificere optimale betingelser for prøvestabilitet. Vi anbefaler elektronmikroskopi med negativ farvning for at screene prøverne før cryo-EM.

Da cryo-EM er blevet den foretrukne metode til 3D-strukturbestemmelse for et stigende antal strukturbiologer, bliver behovet for en integreret og robust arbejdsgang til billedbehandling og strukturbestemmelse mere tydelig. CryoSPARC tilbyder en brugervenlig, webbaseret grafisk brugergrænseflade (GUI), der giver brugere på alle oplevelsesniveauer mulighed for hurtigt at behandle data og beregne en 3D-struktur. Især bruger CryoSPARC en stokastisk gradientafstamning til at udføre ab initio 3D-rekonstruktion. Desuden anvender softwaren en forgrenet og bundet sandsynlighedsoptimeringsalgoritme til hurtig 3D-kortforfining7. Behandlingsrørledningen beskrevet i denne artikel bruger cryoSPARC v3 til at give et indledende 3D-kort. 3D-rekonstruktionen raffineres derefter i RELION-3, en populær pakke, der bruger en empirisk bayesiansk tilgang til at estimere kritiske parametre baseret på brugerens datasæt og derved reducere behovet for ekspertviden til programdrift10. Specifikt bruger vi Bayesiansk polering til korrektion af bevægelse pr. Partikel og CTF-forbedringer for at forbedre opløsningen. Endelig er den resulterende struktur yderligere raffineret og valideret i Scipion 311, en integreret Python-skal, der understøtter algoritmer fra flere platforme, herunder Xmipp13, EMAN28, SPIDER12 og andre. Mens mange forskellige softwarepakker er tilgængelige for cryo-EM-brugere, er der i øjeblikket ingen universel SPA-platform, der accepteres af feltet. Selvom SPA-arbejdsgangen kan udføres fuldt ud i en af de tre softwarepakker, der er beskrevet i denne artikel, kan forskellige algoritmer give forskellige resultater. Derfor skal individuelle trin tilpasses afhængigt af stikprøven og kvaliteten af dataene. For eksempel øgede 3Drefine i RELION-3 for det nuværende datasæt opløsningen af 3D-rekonstruktionen, mens uensartet raffinement i cryoSPARC v3 førte til et lille opløsningsfald. Det er således meget gavnligt at bruge en række programmer til at genberegne strukturer for at opnå optimal kvalitet og opløsning og for at lette valideringen af rekonstruktionerne. Selvom Scipion 3 indeholder adskillige algoritmer fra cryoSPARC v3 og RELION-3, er de seneste implementeringer af disse programmer ikke umiddelbart tilgængelige i Scipion. For eksempel af de programmer, der anvendes i dette manuskript, tilbyder kun RELION-3 Ewald Sphere Curvature Correction gennem scriptet Relion_reconstruct. Rørledningen, der præsenteres i denne artikel, giver en vejledning til både nye og erfarne brugere til med succes at bruge algoritmer implementeret i cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 til at beregne 3D-strukturer ved næsten atomopløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Carlos Oscar Sorzano for hjælp med Scipion3-installationen og Kilian Schnelle og Arne Møller for hjælp til dataoverførsel mellem forskellige behandlingsplatforme. En del af denne forskning blev støttet af NIH-tilskud U24GM129547 og udført på PNCC på OHSU og tilgået via EMSL (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsoreret af Office of Biological and Environmental Research. Denne undersøgelse blev støttet af et opstartstilskud fra Rutgers University til Arek Kulczyk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. https://cryosparc.com/
CTFFIND 4 Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2 UCSF Macromolecular Structure Group https://msg.ucsf.edu/software
Phenix Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) http://www.phenix-online.org/
PyEM Univerisity of California, San Francisco https://github.com/asarnow/pyem
RELION MRC Laboratory of Structural Biology https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Tags

Biokemi Udgave 179 kryo-elektronmikroskopi cryo-EM enkeltpartikelanalyse SPA cryoSPARC RELION Scipion billedbehandling strukturberegning AAV
En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A… More

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. J. Vis. Exp. (179), e63387, doi:10.3791/63387 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter