Summary
Bu protokol, kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını incelemek için Na + 'nın varlığında veya yokluğunda mitokondriyal karmaşık aktiviteler CI + CIII ve CII + CIII kullanan karşılaştırmalı bir tahlili tanımlar.
Abstract
İç mitokondriyal membrandaki (IMM) ubikinon (CoQ) havuzları kısmen kompleks I veya FAD'ye bağımlı enzimlere bölünmüştür. Bu tür bir alt bölüm, sitokrom c (cyt c) indirgemesinin ölçüldüğü dondurulmuş çözülmüş mitokondride elektron donörü olarak NADH veya süksinat kullanılarak karşılaştırmalı bir tahlil ile kolayca değerlendirilebilir. Tahlil, Na+'nın İBB üzerindeki etkisine dayanıyor ve akışkanlığını azaltıyor. Burada, NaCl veya KCl varlığında NADH-cyt c oksidoredüktaz aktivitesini ve süksinat-cyt c oksidoredüktaz aktivitelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bir küvetteki reaktiflerin karışımına kademeli olarak dayanan reaksiyonlar, Na + veya K + varlığında 4 dakika boyunca spektrofotometrik olarak ölçülür. Aynı karışım, absorbanstaki spesifik olmayan değişikliği çıkarmak için spesifik enzim inhibitörlerinin varlığında paralel olarak gerçekleştirilir. NADH-cyt c oksidoredüktaz aktivitesi bu katyonların hiçbirinin varlığında azalmaz. Bununla birlikte, süksinat-sit-c oksidoredüktaz aktivitesi NaCl varlığında azalır. Bu basit deney şunları vurgulamaktadır: 1) Na+'nın İBB akışkanlığını ve CoQ transferini azaltmadaki etkisi; 2) süperkompleks I+III2'nin ubikinon (CoQ) transferini İBB akışkanlığını düşürerek etkilenmekten koruduğunu; 3) CI ve CIII arasındaki CoQ transferinin işlevsel olarak CII ve CIII arasındaki CoQ transferinden farklı olması. Bu gerçekler, İBB'de işlevsel olarak farklılaşmış CoQ havuzlarının varlığını desteklemekte ve mitokondrinin değişen Na + ortamı tarafından düzenlenebileceğini göstermektedir.
Introduction
Mitokondriyal oksidatif fosforilasyon sistemi (OXPHOS), adenozin trifosfat (ATP) sentezini, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini ve nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) veya süksinat gibi indirgeyici eşdeğerlerin mitokondri ile tüketimini yönlendiren ana yoldur. OXPHOS sistemi beş protein kompleksinden oluşur: Kompleks I (CI) NADH'yi oksitler ve CoQ'yu ubikinol (CoQH2) içine indirir. Kompleks II (CII), süksinatı fumarata oksitler ve CoQ'yu CoQH2'ye düşürür. Kompleks III (CIII), CoQH 2'yi tekrar CoQ'ya oksitleyerek sitokromc'yi (cyt c) azaltır. Son olarak, kompleks IV (CIV) cyt c'yi oksitler ve suya giden oksijeni azaltır. Elektron taşıma zinciri (mETC) olarak adlandırılan bu oksidoredüksiyon zinciri, adenozin difosfatı (ADP) ATP'ye fosforile etmek için kompleks V (CV) tarafından kullanılan bir elektrokimyasal gradyan oluşturan İBB boyunca H + 'nın pompalanmasıyla birleştirilir.
mETC kompleksleri İBB'de tek başına olabilir veya süperkompleksler adı verilen kuaterner yapılara toplanabilir. CIV CIV ile birleşerek III2+IV veya Q-solunum solunumu oluşturabilir (CoQH 2 varlığında yeniden canlanabildiği için)1,2,3 veya homodimerler veya homooligomerleroluşturabilir 4. CIII CI ile etkileşime girerek süperkompleks I+III2 5'i oluşturabilir. Son olarak, CI ayrıca Q-solunum ile etkileşime girebilir, I + III2 + IV veya N-solunum solunumu (NADH'yi tüketerek nefes alabildiği için) 1,6,7,8,9,10'u inşa edebilir.
CoQ ve cyt c, sırasıyla CI / CII'den CIII'ye ve CIII'den CIV'ye elektron aktarmaktan sorumlu mobil elektron taşıyıcılarıdır. Süper komplekslerin bu taşıyıcılar için işlevsel bir yerel kısıtlama getirip getirmediği, son yirmi yılda 2,7,11,12,13,14,15,16,17 tarihinde yoğun bir tartışma konusu olmuştur. Bununla birlikte, birkaç bağımsız grup, CoQ ve cyt c'nin İBB'deki havuzlara işlevsel olarak bölünebileceğini göstermiştir. CoQ ile ilgili olarak, işlevsel olarak CI için belirli bir CoQ havuzuna (CoQNAD) ve FAD'ye bağımlı enzimlere (CoQFAD) adanmış başka bir havuza ayrılabilir 1,7,12,18,19. Bununla birlikte, kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını ayırt etmek için, alternatif oksidazın (AOX) aşırı ekspresyonu ve CIII'nin yokluğunda CI'yi bir araya getirebilen spesifik mtDNA mutantlarının üretilmesi gerekiyordu 1,19,20.
Hipoksi sırasında reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretim mekanizması yakın zamana kadar bilinmiyordu. Akut hipoksi üzerine, CI, H + pompalama NADH-CoQ oksidoredüktaz aktivitesindeki azalmayı içeren aktif / deaktif (A / D) geçişine uğrar. H + pompalamadaki böyle bir azalma, mitokondriyal matrisi asitleştirir ve mitokondriyal matristeki kalsiyum-fosfat çökeltilerini kısmen çözer ve çözünür Ca2 + 'yı serbest bırakır. Çözünür Ca 2+'daki bu artış, Na+ karşılığında Ca 2+'yı ekstrüzyon yapan Na+/Ca 2+ eşanjörünü (NCLX) aktive eder. Mitokondriyal Na + artışı, İBB'nin iç tarafındaki fosfolipitlerle etkileşime girerek akışkanlığını ve CII ile CIII arasındaki CoQ transferini azaltır ve sonunda bir redoks sinyali21 olan süperoksit anyonu üretir. İlginç bir şekilde, CoQ transferi sadece CII ve CIII arasında azaldı, ancak CI ve CIII arasında değil, 1) Na + 'nın mitokondrideki mevcut CoQ havuzlarından sadece birini modüle edebildiğini; 2) İBB'de işlevsel olarak farklılaştırılmış CoQ havuzları var. Bu nedenle, mitokondriyal enzim aktivitelerinin incelenmesi için yaygın olarak kullanılan bir protokol, söz konusu CoQ havuzlarının varlığını değerlendirmek için kullanılabilir.
Mevcut protokol, CIII'in substratı olan oksitlenmiş cyt c'nin, süksinat (yani CII substratı) veya NADH (yani CI substratı) varlığında absorbans yoluyla indirgenmesinin ölçülmesine dayanmaktadır. Aynı numune, biri KCl ile, diğeri aynı NaCl konsantrasyonuna sahip olacak şekilde ikiye ayrılır. Bu şekilde, Na+'nın İBB akışkanlığını azalttığı göz önüne alındığında, CoQ İBB'de benzersiz bir havuzda var olsaydı, hem CI+CIII hem de CII+CIII Na+'nın varlığında azalırdı. Bununla birlikte, CoQ kısmen segmentlere ayrılmış fonksiyonel CoQ havuzlarında mevcut olsaydı, Na + 'nın etkisi çoğunlukla (veya sadece) CII + CIII aktivitesi üzerinde belirgin olurdu, ancak CI + CIII üzerinde belirgin olmazdı. Yakın zamanda yayınlanan21 gibi, Na+ sadece CII ve CIII arasındaki CoQ transferini etkiler (Şekil 1C,D), ancak CI ve CIII arasında etkilemez (Şekil 1A,B).
Bu protokol, bir dizi teknikle birlikte, İBB'de kısmen parçalanmış fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını doğrulamak için kullanılmıştır, biri CI'ye (yani, CoQNAD) ve diğeri FAD'ye bağlı enzimlere (yani, CoQFAD) adanmıştır 1,3,7; 22 tartışılmaya devam etmesine rağmen, birkaç grup tarafından bağımsız olarak doğrulanan bir gözlem 7,19. Bu nedenle, CI'nin süperkomplekslere üst montajı, CoQ'nun yerel hareketliliğini etkiler ve CIII tarafından 1,7,13,14,23,24,25 süperkompleksi içinde kullanımını kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve 22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Birliği Direktifi (2010/63/UE) ve 1 Şubat 2013 tarihli İspanya Kraliyet Kararnamesi (53/2013) uyarınca İspanya'nın Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) kurumsal etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Kullanılan hayvan sayısını ve acılarını en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.
NOT: Mitokondriyal CoQ havuzlarının segmentasyonunu incelemek için yapılan bu karşılaştırmalı test aşağıdaki gibi açıklanmaktadır:
1. Protein niceliği
- Organelleri reaksiyon substratlarına geçirgen hale getirmek için deneyden önce izole edilmiş mitokondri26'yı vahşi tip bir fare karaciğerinden üç kez (yani mitokondriyal membranlar) dondurun ve çözün.
- İzole edilmiş mitokondri örneğinin protein miktarını Bradford veya Bicinchoninic acid (BCA) yöntemleriyle sayısallaştırın. Bradford durumunda, 1 mL 1x Bradford reaktifine 2 μL numune ekleyin.
- Numuneyi her biri 20 μg'lık dört alt örneğe bölün (yani: A, B, C, D; Şekil 2A).
2. CI+CIII aktivitesinin ölçülmesi
NOT: Protokolün bu bölümü, CI+CIII aktivitesini ölçmek için A ve B örneklerini kullanır (Şekil 2B).
- A ve B örneklerini her biri 10 μg'lik iki alt örneğe bölün (yani A1, A2, B1 ve B2). Alt numunelerin her birini 1 mL'lik bir küvette 30 μL cyt c (10 mg / mL), 10 μL 100 mM malonat ile karıştırın ve 37 °C'de 980 μL'ye (A2 ve B2 küvetleri için 979 μL) kadar önceden ısıtılmış C1 / C2 tamponu (Tablo 1) ekleyin.
DİKKAT: Bu adım, toksik reaktiflerin malonat ve potasyum siyanürün kullanımını içerir.
NOT: cyt c (10 mg/mL), 10 mM K 2 HPO4 çözeltisinin 1 mL'sinde 10 mg cyt c karıştırılarak taze hazırlanmalı, pH7.2'yeayarlanmalı ve deney boyunca buzda tutulmalıdır. - A1 ve A2 küvetlerine 10 μL 1 M KCl ekleyin ve B1 ve B2 küvetlerine 10 μL 1 M NaCl ekleyin.
- A2 ve B2 alt örneklerini içeren küvete 1 μL 1 mM rotenon ekleyin.
DİKKAT: Bu adım toksik reaktif rotenonun kullanımını içerir. - Ölçümden hemen önce, tüm küvetlere 10 μL NADH (10 mM) ekleyin.
NOT: 10 μL tercihen küvetin basamağına eklenir, bu nedenle reaksiyon karıştırma üzerine başlar. - Küveti dikkatlice üç kez çevirerek karıştırın. Emici küvet okuyucusuna (UV/VISJASCO spektrofotometre) yerleştirin.
- Genel > Parametreleri Ölç>e tıklayın ve ölçüm parametrelerini Dalga Boyu: 550 nm ve Zaman: 4 dakikalık okuma olarak ayarlayın; denemeyi başlatmak için Kabul Et ve Başlat düğmelerine basın.
- Ölçümün sonunda, Dosya ve Farklı Kaydet'e tıklayarak emilimin doğrusal artışını içeren eğimi kaydedin. Eğim manuel olarak da toplanabilir.
3. CII + CIII aktivitesinin ölçülmesi
NOT: Protokolün bu bölümü, CII + CIII aktivitesini ölçmek için C ve D örneklerini kullanır (Şekil 2C).
- C ve D örneklerini her biri 10 μg'lik iki alt örneğe bölün (yani C1, C2, D1 ve D2). Alt numunelerin her birini 1 mL'lik bir küvette 30 μL cyt c (10 mg / mL), 1 μL 1 mM rotenon ile karıştırın ve 37 ° C'de 980 μL'ye (C2 ve D2 küvetleri için 970 μL) önceden ısıtılmış C1 / C2 tamponu ekleyin.
DİKKAT: Bu adım, toksik reaktifler potasyum siyanür ve rotenonun kullanımını içerir.
NOT: cyt c (10 mg/mL), 10 mM K 2 HPO4 çözeltisinin 1 mL'sinde 10 mg cyt c karıştırılarak taze hazırlanmalı, pH7.2'yeayarlanmalı ve deney boyunca buzda tutulmalıdır. - C1 ve C2 küvetlerine 10 μL 1 M KCl ekleyin ve D1 ve D2 küvetlerine 10 μL 1 M NaCl ekleyin.
- C2 ve D2 alt örneklerini içeren küvete 1 μL 1 mM antimisin A ekleyin.
DİKKAT: Bu adım, toksik reaktif antimisin A'nın kullanımını içerir. - Ölçümden hemen önce, tüm küvetlere 10 μL süksinat (1 M) ekleyin.
NOT: 10 μL tercihen küvetin basamağına eklenir, bu nedenle reaksiyon karıştırma üzerine başlar. - Küveti dikkatlice karıştırın, üç kez çevirin. Emici küvet okuyucusuna (UV/VIS spektrofotometre) yerleştirin.
- Genel > Parametreleri Ölç>e tıklayın ve ölçüm parametrelerini Dalga Boyu: 550 nm ve Zaman: 4 dakikalık okuma olarak ayarlayın; denemeyi başlatmak için Kabul Et ve Başlat düğmelerine basın.
- Ölçümün sonunda, Dosya ve Farklı Kaydet'e tıklayarak emilimin doğrusal artışını içeren eğimi kaydedin. Eğim manuel olarak da toplanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolden elde edilen tipik sonuçlar aşağıda gösterilmiştir (Şekil 3). Azalmış cyt c absorbansı 550 nm'de bulunduğundan, tüm inhibe edilmemiş alt numuneler 550 nm'de absorbansta bir artış göstermelidir. İnhibe edilmiş alt örnekler ideal olarak düz bir çizgi veya biraz artan bir eğim gösterir (Şekil 3). İnhibe edilmiş alt örneklerden eğimler, inhibe edilmemiş alt numunelerden çıkarılmalıdır.
Her ikisi de karşılık gelen inhibisyonları ile düzeltilen ve NADH: cyt c oksidoredüktaz aktivitesini temsil eden A ve B örnekleri benzer bir eğime sahiptir (Şekil 3A). Bununla birlikte, her ikisi de karşılık gelen inhibisyonu ile düzeltilen ve süksinat:cyt c oksidoredüktaz aktivitesini temsil eden C ve D alt örnekleri, alt numune C'nin aktivitesinin alt numune D'nin aktivitesinden daha yüksek olması bakımından farklıdır (Şekil 3B). Bazal absorbansın numuneler arasında biraz farklı olabileceğini unutmayın (Şekil 3A).
Bu sonuçlar (yani, inhibitörleri tarafından zaten düzeltilmiş eğimler; Tablo 2) kullanılan protein miktarının (0.01 mg) a.u./min/mg protein olarak bölünmesiyle temsil edilebilir. Bu değerden, cyt c indirgeme oranı, Lamber-Beer yasası21 kullanılarak daha da hesaplanabilir.
Önemli olarak, bu sonuçlar birkaç faktöre göre değişebilir: (i) Numunelerin kökeni. Farklı dokuların ve hücre tiplerinin değişken bir OXPHOS kompleksleri ve süperkompleksleri bileşimine sahip olduğu göz önüne alındığında, mutlak değerler ve göreceli değişiklikler numuneler arasında değişebilir. (ii) Farklı dokuların değişken bir OXPHOS kompleksleri ve süperkompleks bileşimine sahip olabileceği göz önüne alındığında, reaksiyon karışımına daha fazla dondurulmuş çözülmüş mitokondri (belirli bir dokunun daha düşük mutlak değerlerini telafi etmek için) eklenmesi, numunedeki mg protein / fosfolipid başına Na + veya K + oranının azalması olan ikincil bir etkiye sahip olabilir. Bu nedenle, mitokondri miktarını veya numuneye eklenen Na + / K + konsantrasyonunu değiştirirken dikkatli olunmalıdır. (iii) Deneyler arası varyasyon, donma-çözülme döngülerinin süresi ve sıcaklığından, reaktiflerin ticari partisinden veya izole mitokondrinin değişen depolama tamponundan kaynaklanabilir.
Şekil 1: Na +, CII ve CIII arasındaki elektron transferini özellikle azaltır, ancak CI ile CIII arasında değil. (A) NADH ve cyt c arasındaki elektron transferinin şematik gösterimi, süperkompleks I + III2'deki CoQNAD aracılığıyla gerçekleşir. (B) Süperkompleks I+III2'deki CoQ NAD aracılığıyla meydana gelenNADH ve cyt c arasındaki elektron transferi, intramitokondriyal Na+'dan etkilenmez. (C) CII'deki CoQFAD aracılığıyla meydana gelen süksinat ve cyt c arasındaki elektron transferinin şematik gösterimi. (D) Süperkompleks I+III2'deki CoQFAD yoluyla meydana gelen NADH ve cyt c arasındaki elektron transferi, yüksek intramitokondriyal Na+ ile azalır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Orijinal numunenin alt bölümünden kinetik ölçüme protokolün şematik gösterimi . (A) Tüm alt örneklerin aynı kökenini vurgulayan alt örneklem bölümünün şematik gösterimi. (B) A1 ve B1 alt örneklerinde CI+CIII aktivitesi için reaktif ilavelerinin ardışık adımlarının şeması. Kırmızı daire, NADH'nin ideal olarak eklenmesi gereken yeri temsil eder. A2 ve B2 alt örnekleriyle arasındaki tek farkın, ikincisine fazladan rotenon eklenmesi olduğunu unutmayın. (C) C1 ve D1 alt örneklerinde CII+CIII aktivitesi için reaktif ilavelerinin ardışık adımlarının şeması. Kırmızı daire, süksinatın ideal olarak eklenmesi gereken yeri temsil eder. C2 ve D2 alt örnekleriyle olan tek farkın, ikincisine antimisin A'nın ekstra eklenmesi olduğunu unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Na+' nın fare karaciğeri mitokondriyal membranları ile cyt c indirgemesi üzerine NADH veya süksinat ilavesi üzerine etkisi. (A) NADH'yi oksitleyen fare karaciğeri mitokondriyal membranları tarafından Na+' nın cyt c indirgemesi üzerindeki etkisini gösteren temsili izler. (B) Na+ 'nın sinsüzanatı oksitleyen fare karaciğeri mitokondriyal membranları tarafından cyt c indirgemesi üzerindeki etkisini gösteren temsili izler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Bileşik | Konsantrasyon |
| K2HPO4 | 25 mM |
| MgCl2 | 5 mM |
| cesaret | 3 mM |
| Sığır Serum Albümini (BSA) | 2.5 mg/mL |
Tablo 1: C1/C2 tamponunun bileşimi. Tampon bileşimi molar konsantrasyonlarda sunulur.
| Beklenen oranlar | +KCl (Ortalama) | +KCl (SD) | +NaCl (Ortalama) | +NaCl (SD) | Mann-Whitney P değeri |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| Bireysel değerler | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| Bireysel değerler | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
Tablo 2: Beklenen kur aralıkları. Her etkinlik için beklenen değerler rasgele birimler halinde sunulur. +KCl ve +NaCl arasındaki karşılık gelen istatistiksel test de sunulmuştur. "n", çoğaltma sayısını temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, kısmen bölümlere ayrılmış CoQ havuzlarının varlığını tanımlamak için çok basit bir prosedürü temsil etse de, dikkate alınması gereken birkaç kritik adım vardır. Substratlar (yani, NADH veya süksinat), bu bileşiklerin otooksidasyonu meydana gelebileceğinden, tercihen en son eklenir. Cuvette'in çevirmesi, okumaya müdahale edebilecek kabarcıkların oluşumunu önlemek için dikkatli olmalıdır.
Ek olarak, mevcut teknik, bahsetmeye değer birkaç sınırlama sunmaktadır. Ölçümler sağlam mitokondride yapılmaz. Bu nedenle, tamponun yapay içeriği ve oranı, mitokondrinin doğal ortamı ile farklılıklara neden olabilir.
Reaktifler fazla miktarda eklenir ve sağlam dokulardaki substratların gerçek mevcudiyetini temsil etmeyebilirler.
Mevcut yöntemler, birçok laboratuvarda kolayca bulunamayan çok özel genetik modellerin ve ekipmanların üretilmesini ve kullanılmasını ima etmektedir1. Bu protokol, geniş çapta kullanılabilen reaktifler ve araçlar kullanarak kısmen farklılaştırılmış CoQ havuzlarının varlığını ölçmek için güvenilir ve yapılması kolay bir yöntem sağlar. Bu nedenle, mitokondriyal hastalığın genetik modellerini karşılaştıran gelecekteki çalışmalarda uygulanması mümkündür.
Mobil elektron taşıyıcılarının mETC'deki hareketliliği hala çok tartışılan bir konudur 25,27, ancak kısmen farklılaşmış havuzların varlığı kabul edilmektedir 7,12,18,28,29. Son zamanlarda, AOX1'i eksprese eden birkaç OXPHOS mutantının yüksek çözünürlüklü respirometrisi ve ayrıntılı biyokimyasal karakterizasyonu, doğal lipid ortamı7'yi koruyan rafine kriyoelektron mikroskopi çalışmaları ile birlikte tartışmaya ışık tutmuştur. Bu, kısmen parçalanmış fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığı lehine ağır argümanlar ortaya koymaktadır.
Ek olarak, fizyolojik uyaranların farklı CoQ havuzları tarafından düzenlendiği gösterilmiştir; özellikle, intramitokondriyal Na + tarafından yönlendirilen akut hipoksik yanıt. Hipoksi sırasında mitokondrideki daha yüksek Na + seviyeleri, CII ve CIII arasındaki elektron transferini azaltır, Q döngüsünü CIII seviyesinde ayırır ve bir süperoksit anyonu üretir. Buna karşılık, CI ve CIII arasındaki elektron transferi21'i azaltmadı. Mevcut protokol, bu sonuçların elde edildiği prosedürü kapsamlı bir şekilde açıklamaktadır.
İncelenen tedavi, CI, CII ve CIII'nin izole kompleks aktiviteleri olan selül veya in vivo olarak gerçekleştirilirse, bireysel miktarları veya tek aktiviteleri tedavi ile birlikte değişebileceğinden, mevcut protokole daha fazla kontrol uygulanabilir. Yukarıda tarif edildiği gibi çok benzer bir prosedürü takiben, bu izole aktivitelerin hiçbirinde farklılıklar görülmemiştir21 Na+'nın varlığında veya yokluğunda. Not etmek gerekirse, Na + 'nın D / A geçişini30 artırabileceği açıklanmıştır. Bununla birlikte, bu gözlemde kullanılan protokol, submitodondrial parçacıkların (SMP'ler) kullanımını içerirken, protokolümüz mitokondriyal membranları kullanır ve hesaplanan etki30 için İBB genelinde membran potansiyelinin gerekliliğini vurgulamaktadır.
Donma-çözülme döngülerinin membranları deterjanlar gibi çözmediği, dolayısıyla tek komplekslerin ve süper komplekslerin hala fosfolipid çift katmanlarına bağlı olduğu belirtilmelidir. Bu, CI veya CII yoluyla dondurulmuş çözülmüş mitokondri oksijen tüketiminin sitokrom c31 varlığında ölçülebildiği gerçeğiyle kanıtlanmaktadır. Ek olarak, donma-çözülme döngülerinin CII + CIII aktivitesi üzerinde bir etkisi olsaydı, sadece "NaCl 10 mM" numunelerinde değil, aynı zamanda "KCl 10 mM" numunelerinde de görülürdü. Bu, ölçümü ya imkansız hale getirecektir (CII, membran ayrışması yoluyla CIII'den ayrılacağı için) ya da K + ve Na + arasındaki farkların görülmeyeceği bir noktaya düşecektir. Ancak, Şekil 2B'de görüldüğü gibi, durum böyle değildir. Protokole KCl ilavesi, ozmolaritenin veya iyonik mukavemetin ölçülen aktiviteler üzerindeki olası etkilerini atmak için tasarlanmıştır. Her iki durumda da nihai ozmolarite, "10 mM KCl" numunesi ve "10 mM NaCl" numunesi, eşittir (116 mEq / L) ve numuneler arasındaki tek fark, 10 mM K + veya 10 mM Na + 'nın varlığıdır. Bununla birlikte, tampondan gelen K + katyonlarının bir etkisi olsaydı, hem "KCl 10 mM" hem de "NaCl 10 mM" numunelerinde ortaya çıkar ve bu da böyle bir etkiyi her iki numunede de fark edilemez hale getirir.
Farklı katyonların fosfolipitleri bağlama yeteneğinde, gerçekten önemli olan koordinasyon kimyası ve her katyonun iyonik yarıçapıdır (orijinal makalemiz21'de deneysel olarak vurgulandığı gibi ve teorik olarak Böckmann ve ark.32). K + ortalama koordinasyon sayısı altı gösterirken, Na + ortalama koordinasyon sayısı beştir, bu da K + ve Na + 'nın fosfolipit çift katmanlı33 üzerinde çok farklı etkilerine dönüşen farklı bir koordinasyon kompleksi geometrisi ile sonuçlanır.
K + ve Na + 'nın iyonik yarıçapının farklı olduğu da belirtilmelidir. K + 280 pm iyonik yarıçapa sahipken, Na + 227 pm iyonik yarıçapa sahiptir. Bu fark, anyonlarla (veya zwitterionlarla) etkileşimlerini doğrudan etkiler, çünkü daha düşük bir iyonik yarıçap (yani daha az elektron kabuğu), pozitif iyonik çekirdek, ekstra elektron kabuklarına (yani daha yüksek iyonik yarıçapa) sahipmiş gibi daha fazla maruz kaldığından, negatif yüklü bir molekülle daha güçlü bir etkileşime neden olur. Gerçekten de, tüm katyonlar muhtemelen fosfolipitlerle etkileşime girebilir; Bununla birlikte, yalnızca belirli kimyasal-fiziksel özelliklere sahip olanlar, Na + gibi bir fosfolipid çift katmanı üzerinde spesifik etkilere sahip olabilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Teknik yardım için Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez ve E. R. Martínez-Jimenez'e teşekkür ederiz. Bu çalışma MICIN: RTI2018-099357-B-I00 ve HFSP (RGP0016/2018) tarafından desteklenmiştir. CNIC, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) ve Pro CNIC Vakfı tarafından desteklenmektedir ve bir Severo Ochoa Mükemmeliyet Merkezidir (SEV-2015-0505). Şekil 2, BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A.
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al.
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A.
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A.
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J.
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T.
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
