Summary
Ce protocole décrit un test comparatif, utilisant des activités complexes mitochondriales CI+CIII et CII+CIII en présence ou en l’absence de Na+, pour étudier l’existence de pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés.
Abstract
Les pools d’ubiquinone (CoQ) dans la membrane mitochondriale interne (IMM) sont partiellement segmentés en enzymes complexes I ou dépendantes de la FAD. Une telle subdivision peut être facilement évaluée par un essai comparatif utilisant le NADH ou le succinate comme donneurs d’électrons dans les mitochondries congelées-décongelées, dans lequel la réduction du cytochrome c (cyt c) est mesurée. Le test repose sur l’effet de Na+ sur l’IMM, diminuant sa fluidité. Nous présentons ici un protocole pour mesurer l’activité de la NADH-cyt c oxydoréductase et les activités de la succinate-cyt c oxydoréductase en présence de NaCl ou de KCl. Les réactions, qui reposent sur le mélange de réactifs dans une cuvette de manière progressive, sont mesurées spectrophotométriquement pendant 4 min en présence de Na+ ou K+. Le même mélange est réalisé en parallèle en présence des inhibiteurs enzymatiques spécifiques afin de soustraire le changement non spécifique d’absorbance. L’activité de la NADH-cyt c oxydoréductase ne diminue en présence d’aucun de ces cations. Cependant, l’activité de la succinate-cyt c oxydoréductase diminue en présence de NaCl. Cette expérience simple met en évidence : 1) l’effet de Na+ sur la diminution de la fluidité de l’IMM et du transfert de CoQ ; 2) que le supercomplexe I+III2 protège le transfert d’ubiquinone (CoQ) d’être affecté par l’abaissement de la fluidité de l’IMM; 3) que le transfert de CoQ entre CI et CIII est fonctionnellement différent du transfert de CoQ entre CII et CIII. Ces faits soutiennent l’existence de pools de CoQ fonctionnellement différenciés dans l’IMM et montrent qu’ils peuvent être régulés par l’environnement Na+ changeant des mitochondries.
Introduction
Le système de phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS) est la principale voie conduisant à la synthèse de l’adénosine triphosphate (ATP), à la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et à la consommation d’équivalents réducteurs, tels que le nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) ou le succinate, par les mitochondries. Le système OXPHOS est composé de cinq complexes protéiques : le complexe I (IC) oxyde le NADH et réduit la CoQ en ubiquinol (CoQH2). Le complexe II (CII) oxyde le succinate en fumarate et réduit la CoQ enCoQH2. Le complexe III (CIII) oxyde la CoQH2 en CoQ, réduisant ainsi le cytochrome c (cyt c). Enfin, le complexe IV (CIV) oxyde le cyt c et réduit l’oxygène en eau. Cette chaîne d’oxydoréduction, appelée chaîne de transport d’électrons (mETC), est couplée au pompage de H+ à travers l’IMM, ce qui crée un gradient électrochimique utilisé par le complexe V (CV) pour phosphoryler l’adénosine diphosphate (ADP) en ATP.
Les complexes mETC peuvent être seuls dans l’IMM ou s’assembler en structures quaternaires appelées supercomplexes. Le CIV peut s’assembler avec le CIII, formant le III2+IV ou le Q-respirasome (car il est capable de respirer en présence de CoQH2)1,2,3 ou formant des homodimères ou des homooligomères4. CIII peut interagir avec CI, formant le supercomplexe I +III25. Enfin, l’IC est également capable d’interagir avec le Q-respirasome, en construisant le I + III2 + IV ou le N-respirasome (car il peut respirer en consommant du NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ et cyt c sont des transporteurs d’électrons mobiles chargés de transférer des électrons de CI/CII à CIII, et de CIII à CIV, respectivement. La question de savoir si les supercomplexes imposent ou non une restriction locale fonctionnelle à ces transporteurs a fait l’objet d’un débat intense au cours des deux dernières décennies 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Cependant, plusieurs groupes indépendants ont démontré que coq et cyt c peuvent être segmentés fonctionnellement en pools dans l’IMM. En ce qui concerne la CoQ, elle peut être segmentée fonctionnellement en un pool de CoQ spécifique pour l’IC (CoQNAD) et un autre pool dédié aux enzymes dépendantes de la DCP (CoQFAD)1,7,12,18,19. Cependant, afin de différencier l’existence de pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés, la surexpression de l’oxydase alternative (AOX) et la génération de mutants spécifiques de l’ADNmt, qui peuvent assembler l’IC en l’absence de CIII, ont été nécessaires 1,19,20.
Le mécanisme de production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) pendant l’hypoxie était inconnu jusqu’à récemment. En cas d’hypoxie aiguë, l’IC subit la transition active/décactive (A/D), qui implique la diminution de son activité oxydoréductase de pompage H+ NADH-CoQ. Une telle diminution du pompage H+ acidifie la matrice mitochondriale et dissout partiellement les précipités de calcium-phosphate dans la matrice mitochondriale, libérantdu Ca 2+ soluble. Cette augmentation du Ca2+ soluble active l’échangeur Na+/Ca2+ (NCLX), qui extrude le Ca2+ en échange de Na+. L’augmentation mitochondriale de Na+ interagit avec les phospholipides de la face interne de l’IMM, diminuant sa fluidité et son transfert de CoQ entre CII et CIII, produisant finalement un anion superoxyde, un signal redox21. Fait intéressant, le transfert de CoQ n’a diminué qu’entre CII et CIII, mais pas entre CI et CIII, soulignant que 1) Na+ n’était capable de moduler qu’un seul des pools de CoQ existants dans les mitochondries; 2) il existe des pools de CoQ fonctionnellement différenciés dans l’IMM. Ainsi, un protocole largement utilisé pour l’étude des activités enzymatiques mitochondriales peut être utilisé pour évaluer l’existence des pools de CoQ mentionnés.
Le protocole actuel est basé sur la mesure de la réduction du cyt c oxydé, le substrat de CIII, par absorbance en présence de succinate (c.-à-d. substrat CII) ou de NADH (c.-à-d. substrat CI). Le même échantillon est divisé en deux, dont l’un sera traité avec du KCl et l’autre avec la même concentration de NaCl. De cette façon, étant donné que Na+ diminue la fluidité de l’IMM, si la CoQ existait dans un pool unique dans l’IMM, CI+CIII et CII+CIII diminueraient en présence de Na+. Cependant, si la CoQ existait dans des pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés, l’effet de Na+ serait principalement (ou seulement) évident sur l’activité CII+CIII, mais pas sur l’IC+CIII. Comme récemment publié21, Na+ n’affecte que le transfert de CoQ entre CII et CIII (Figure 1C,D), mais pas entre CI et CIII (Figure 1A,B).
Ce protocole, ainsi qu’une panoplie de techniques, a été utilisé pour confirmer l’existence de pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés dans l’IMM, l’un dédié à l’IC (c.-à-d.le NAD de CoQ) et l’autre aux enzymes liées à la DCP (c.-à-d. laDCP de CoQ)1,3,7; une observation qui, bien qu’elle continue d’être débattue22, a été corroborée indépendamment par plusieurs groupes 7,19. Ainsi, le superassemblage de CI en supercomplexes a un impact sur la mobilité locale de la CoQ, facilitant son utilisation par le CIII au sein du supercomplexe 1,7,13,14,23,24,25.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le comité d’éthique institutionnel du Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Espagne, conformément à la directive de l’Union européenne du 22 septembre 2010 (2010/63/UE) et au décret royal espagnol du 1er février 2013 (53/2013). Tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre d’animaux utilisés et leurs souffrances.
REMARQUE: Ce test comparatif pour étudier la segmentation des pools de CoQ mitochondriaux est décrit comme suit:
1. Quantification des protéines
- Congeler et décongeler les mitochondriesisolées 26 d’un foie de souris de type sauvage trois fois (c.-à-d. membranes mitochondriales) avant l’expérimentation pour rendre les organites perméables aux substrats de réaction.
- Quantifier la quantité de protéines de l’échantillon de mitochondries isolées par les méthodes de Bradford ou d’acide bicinchoninique (BCA). Dans le cas de Bradford, ajouter 2 μL d’échantillon dans 1 mL de réactif 1x Bradford.
- Diviser l’échantillon en quatre sous-échantillons de 20 μg chacun (à savoir: A, B, C, D; Figure 2A).
2. Mesure de l’activité CI+CIII
REMARQUE : Cette partie du protocole utilise les échantillons A et B pour mesurer l’activité CI+CIII (Figure 2B).
- Divisez les échantillons A et B en deux sous-échantillons de 10 μg chacun (à savoir A1, A2, B1 et B2). Mélanger chacun des sous-échantillons dans une cuvette de 1 mL avec 30 μL de cyt c (10 mg/mL), 10 μL de malonate de 100 mM et ajouter un tampon C1/C2 préchauffé (tableau 1) à 37 °C jusqu’à 980 μL (979 μL pour les cuvettes A2 et B2).
ATTENTION : Cette étape implique l’utilisation des réactifs toxiques malonate et cyanure de potassium.
REMARQUE : Le cyt c (10 mg/mL) doit être préparé frais en mélangeant 10 mg de cyt c dans 1 mL de solution de 10 mM K2HPO4 , pH ajusté à 7,2, et il doit être maintenu dans la glace tout au long de l’expérience. - Ajouter 10 μL de 1 M KCl dans les cuvettes A1 et A2, et ajouter 10 μL de 1 M NaCl dans les cuvettes B1 et B2.
- Ajouter 1 μL de roténone de 1 mM dans la cuvette contenant les sous-échantillons A2 et B2.
ATTENTION : Cette étape implique l’utilisation du réactif toxique roténone. - Juste avant la mesure, ajoutez 10 μL de NADH (10 mM) dans toutes les cuvettes.
NOTE: Les 10 μL sont de préférence ajoutés sur l’étape de la cuvette, de sorte que la réaction commence au mélange. - Mélangez la cuvette en la retournant soigneusement trois fois. Placez-le dans le lecteur de cuvette d’absorbance (spectrophotomètre UV/VISJASCO).
- Cliquez sur Mesurer > Paramètres > Général et réglez les paramètres de mesure sur Longueur d’onde: 550 nm et Temps: 4 min de lecture; appuyez sur les boutons Accepter et Démarrer pour commencer l’expérience.
- À la fin de la mesure, enregistrez la pente comprenant l’augmentation linéaire de l’absorbance en cliquant sur Fichier et Enregistrer sous. La pente peut également être collectée manuellement.
3. Mesure de l’activité CII+CIII
REMARQUE : Cette partie du protocole utilise les échantillons C et D pour mesurer l’activité CII+CIII (Figure 2C).
- Divisez les échantillons C et D en deux sous-échantillons de 10 μg chacun (à savoir C1, C2, D1 et D2). Mélanger chacun des sous-échantillons dans une cuvette de 1 mL avec 30 μL de cyt c (10 mg/mL), 1 μL de roténone de 1 mM et ajouter un tampon C1/C2 préchauffé à 37 °C jusqu’à 980 μL (970 μL pour les cuvettes C2 et D2).
ATTENTION : Cette étape implique l’utilisation des réactifs toxiques cyanure de potassium et roténone.
REMARQUE : Le cyt c (10 mg/mL) doit être préparé frais en mélangeant 10 mg de cyt c dans 1 mL de solution de 10 mM K2HPO4 , pH ajusté à 7,2, et il doit être maintenu dans la glace tout au long de l’expérience. - Ajouter 10 μL de 1 M KCl dans les cuvettes C1 et C2, et ajouter 10 μL de 1 M NaCl dans les cuvettes D1 et D2.
- Ajouter 1 μL de 1 mM d’antimycine A dans la cuvette contenant les sous-échantillons C2 et D2.
ATTENTION : Cette étape implique l’utilisation du réactif toxique antimycine A. - Juste avant la mesure, ajouter 10 μL de succinate (1 M) dans toutes les cuvettes.
NOTE: Les 10 μL sont de préférence ajoutés sur l’étape de la cuvette, de sorte que la réaction commence au mélange. - Mélangez soigneusement la cuvette en la retournant trois fois. Placez-le dans le lecteur de cuvette d’absorbance (spectrophotomètre UV/VIS).
- Cliquez sur Mesurer > Paramètres > Général et réglez les paramètres de mesure à Longueur d’onde: 550 nm et Temps: 4 min de lecture; appuyez sur les boutons Accepter et Démarrer pour commencer l’expérience.
- À la fin de la mesure, enregistrez la pente comprenant l’augmentation linéaire de l’absorbance en cliquant sur Fichier et Enregistrer sous. La pente peut également être collectée manuellement.
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Representative Results
Les résultats typiques de ce protocole sont représentés ci-dessous (Figure 3). Comme l’absorbance cyt c réduite se situe à 550 nm, tous les sous-échantillons non inhibés doivent montrer une augmentation de l’absorbance à 550 nm. Les sous-échantillons inhibés montrent idéalement une ligne plate ou une pente légèrement croissante (Figure 3). Les pentes des sous-échantillons inhibés doivent être soustraites des sous-échantillons non inhibés.
Les échantillons A et B, tous deux corrigés par leur inhibition correspondante et qui représentent l’activité de la NADH:cyt c oxydoréductase, ont une pente similaire (figure 3A). Cependant, les sous-échantillons C et D, tous deux corrigés par leur inhibition correspondante et qui représentent l’activité succinate:cyt c oxydoréductase, sont différents, en ce sens que l’activité du sous-échantillon C est supérieure à l’activité du sous-échantillon D (figure 3B). Notez que l’absorbance basale peut être légèrement différente d’un échantillon à l’autre (figure 3A).
Ces résultats (c.-à-d. pentes déjà corrigées par leur inhibiteur; Tableau 2) peut être représenté en divisant la quantité de protéines utilisées (0,01 mg) en a.u./min/mg de protéines. À partir de cette valeur, le taux de réduction de la cyt c peut être calculé en utilisant la loi Lamber-Beer21.
Il est important de noter que ces résultats peuvent varier en fonction de plusieurs facteurs: (i) Origine des échantillons. Étant donné que différents tissus et types de cellules ont une composition variable de complexes OXPHOS et de supercomplexes, les valeurs absolues et les changements relatifs peuvent varier d’un échantillon à l’autre. (ii) Étant donné que différents tissus peuvent avoir une composition variable de complexes OXPHOS et de supercomplexes, l’ajout de plus de mitochondries congelées-décongelées (pour compenser les valeurs absolues inférieures d’un certain tissu) au mélange réactionnel peut avoir un effet secondaire, à savoir que le rapport Na+ ou K+ par mg de protéine/phospholipide dans l’échantillon diminue. Par conséquent, il faut faire preuve de prudence lorsque l’on fait varier la quantité de mitochondries ou la concentration de Na+/K+ ajoutée à l’échantillon. (iii) La variation interexpérimentaire peut résulter de la durée et de la température des cycles de congélation-décongélation, du lot commercial de réactifs ou de la variation du tampon de stockage des mitochondries isolées.
Figure 1 : Na+ diminue spécifiquement le transfert d’électrons entre CII et CIII, mais pas entre CI et CIII. (A) Représentation schématique du transfert d’électrons entre NADH et cyt c, se produisant à travers le CoQNAD dans le supercomplexe I+III2. (B) Le transfert d’électrons entre le NADH et le cyt cyt, qui se produit à travers le CoQNAD dans le supercomplexe I+III2, n’est pas affecté par le Na+ intramitochondrial. (C) Représentation schématique du transfert d’électrons entre le succinate et le cyt c, se produisant à travers leDCP CoQ dans CII. (D) Le transfert d’électrons entre le NADH et le cyt cyt, se produisant à travers leDCP CoQ dans le supercomplexe I+ III2, est diminué par un Na+ intramitochondrial élevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Représentation schématique du protocole depuis la subdivision de l’échantillon d’origine jusqu’à la mesure cinétique. (A) Représentation schématique de la division du sous-échantillon, mettant en évidence la même origine de tous les sous-échantillons. (B) Schéma des étapes successives des additions de réactifs pour l’activité CI+CIII dans les sous-échantillons A1 et B1. Le cercle rouge représente l’endroit où le NADH devrait idéalement être ajouté. Notez que la seule différence avec les sous-échantillons A2 et B2 est l’ajout supplémentaire de roténone dans ce dernier. (C) Schéma des étapes successives des additions de réactifs pour l’activité CII+CIII dans les sous-échantillons C1 et D1. Le cercle rouge représente l’endroit où le succinate devrait idéalement être ajouté. Notez que la seule différence avec les sous-échantillons C2 et D2 est l’ajout supplémentaire d’antimycine A dans ce dernier. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Effet du Na+ sur la réduction du cyt c par les membranes mitochondriales du foie de souris lors de l’ajout de NADH ou de succinate. (A) Traces représentatives montrant l’effet du Na+ sur la réduction du cyt c par les membranes mitochondriales du foie de souris oxydant le NADH. (B) Traces représentatives montrant l’effet du Na+ sur la réduction du cyt cyt par les membranes mitochondriales du foie de souris oxydant le succinate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composé | Concentration |
| K2HPO4 | 25 mM |
| MgCl2 | 5 mM |
| KCN | 3 mM |
| Albumine sérique bovine (BSA) | 2,5 mg/mL |
Tableau 1 : Composition du tampon C1/C2. La composition tampon est présentée en concentrations molaires.
| Taux prévus | +KCl (Moyenne) | +KCl (SD) | +NaCl (moyenne) | +NaCl (SD) | Valeur de Mann-Whitney P |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| Valeurs individuelles | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| IC + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| Valeurs individuelles | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
Tableau 2 : Fourchettes de taux attendues. Les valeurs attendues pour chaque activité sont présentées en unités arbitraires. Le test statistique correspondant entre +KCl et +NaCl est également présenté. « n » représente le nombre de réplications.
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Discussion
Bien que ce protocole représente une procédure très simple pour identifier l’existence des pools de CoQ partiellement segmentés, il y a quelques étapes critiques à prendre en compte. Les substrats (c.-à-d. le NADH ou le succinate) sont de préférence ajoutés en dernier puisque l’autooxydation de ces composés peut se produire. Le retournement de la cuvette doit être prudent afin d’éviter la formation de bulles qui peuvent interférer avec la lecture.
En outre, la technique actuelle présente quelques limites qui méritent d’être mentionnées. Les mesures ne sont pas effectuées dans les mitochondries intactes. Ainsi, le contenu artificiel et la proportion du tampon peuvent entraîner des différences avec l’environnement natif des mitochondries.
Les réactifs sont ajoutés en excès et ils peuvent ne pas représenter la véritable disponibilité des substrats dans les tissus intacts.
Les méthodes actuelles impliquent la génération et l’utilisation de modèles génétiques et d’équipements très spécifiques qui ne sont pas facilement disponibles dans de nombreux laboratoires1. Ce protocole fournit une méthode fiable et facile à faire pour mesurer l’existence des pools de CoQ partiellement différenciés à l’aide de réactifs et d’outils largement disponibles. Ainsi, il est possible qu’il puisse être appliqué dans de futures études comparant des modèles génétiques de maladie mitochondriale.
La mobilité des porteurs d’électrons mobiles dans le mETC est toujours un sujet très débattu25,27, bien que l’existence de pools partiellement différenciés soit de plus en plus acceptée 7,12,18,28,29. Récemment, la respirométrie à haute résolution et la caractérisation biochimique détaillée de plusieurs mutants OXPHOS exprimant AOX1, ainsi que des études raffinées de microscopie cryoélectronique préservant le milieu lipidique naturel7, ont apporté de la lumière dans la discussion. Cela pose de lourds arguments en faveur de l’existence de pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés.
De plus, il a été démontré que les stimuli physiologiques sont régulés par les différents pools de CoQ; en particulier, la réponse hypoxique aiguë entraînée par na+ intramitochondrial. Des niveaux plus élevés de Na+ dans les mitochondries pendant l’hypoxie diminuent le transfert d’électrons entre CII et CIII, découplant le cycle Q au niveau de CIII et produisant un anion superoxyde. En revanche, le transfert d’électrons entre CI et CIII n’a pas diminué21. Le protocole actuel explique en détail la procédure par laquelle ces résultats ont été obtenus.
D’autres contrôles peuvent être appliqués au protocole actuel si le traitement à l’étude est effectué en cellule ou in vivo, qui sont les activités complexes isolées de l’IC, de l’IC et de la CIII, car leurs quantités individuelles ou leurs activités individuelles peuvent varier en même temps que le traitement. À la suite d’une procédure très similaire à celle décrite ci-dessus, aucune différence n’a été observée dans aucune de ces activités isolées21 en présence ou en l’absence de Na+. A noter, il a été décrit que Na+ peut augmenter la transition D/A30. Cependant, le protocole utilisé sur cette observation impliquait l’utilisation de particules de submitochondrial (SMP), tandis que notre protocole utilise des membranes mitochondriales, soulignant la nécessité d’un potentiel membranaire à travers l’IMM pour l’effet comptabilisé30.
Il convient de noter que les cycles de gel-dégel ne dissolvent pas les membranes comme le font les détergents, de sorte que des complexes uniques et des supercomplexes sont toujours attachés à des bicouches de phospholipides. Ceci est mis en évidence par le fait que la consommation d’oxygène des mitochondries congelées-décongelées par IC ou CII peut être mesurée en présence de cytochrome c31. De plus, s’il y avait un effet des cycles de gel-dégel sur l’activité CII+CIII, il serait observé non seulement dans les échantillons « NaCl 10 mM », mais aussi dans les échantillons « KCl 10 mM ». Cela rendrait la mesure impossible (car l’ICI serait séparée de CIII par décomposition membranaire) ou plus bas à un point où les différences entre K+ et Na+ ne seraient pas observées. Cependant, comme le montre la figure 2B, ce n’est pas le cas. L’ajout de KCl dans le protocole est conçu pour éliminer les effets possibles de l’osmolarité ou de la force ionique sur les activités mesurées. L’osmolarité finale dans les deux cas, échantillon « 10 mM KCl » et échantillon « 10 mM NaCl », est égale (116 mEq/L) et la seule différence entre les échantillons est la présence de 10 mM K+ ou 10 mM Na+. Néanmoins, si les cations K+ du tampon avaient un effet, il se manifesterait à la fois dans les échantillons « KCl 10 mM » et « NaCl 10 mM », rendant un tel effet indiscernable dans l’un ou l’autre échantillon.
Dans la capacité des différents cations à lier les phospholipides, ce qui est en effet crucial est la chimie de coordination et le rayon ionique de chaque cation (comme souligné expérimentalement dans notre article original21, et théoriquement dans Böckmann et al.32). Alors que K+ affiche un nombre de coordination moyen de six, le nombre de coordination moyen Na+ est de cinq, ce qui donne une géométrie complexe de coordination différente, ce qui se traduit par des effets très différents de K+ et Na+ sur une bicouche de phospholipides33.
Il convient également de noter que le rayon ionique de K+ et Na+ est différent. Alors que K+ a un rayon ionique de 280 pm, Na+ a un rayon ionique de 227 pm. Cette différence a un impact direct sur leur interaction avec les anions (ou zwitterions), car un rayon ionique plus faible (c’est-à-dire moins de couches d’électrons) entraîne une interaction plus forte avec une molécule chargée négativement car le noyau ionique positif est plus exposé comme s’il avait des couches d’électrons supplémentaires (c’est-à-dire un rayon ionique plus élevé). En effet, tous les cations sont éventuellement capables d’interagir avec les phospholipides ; cependant, seuls ceux qui ont des propriétés physico-chimiques spécifiques sont capables d’avoir des effets spécifiques sur une bicouche de phospholipides, comme Na+.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions M. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr C. Jimenez et E. R. Martínez-Jimenez pour leur assistance technique. Cette étude a été soutenue par MICIN: RTI2018-099357-B-I00 et HFSP (RGP0016/2018). Le CNIC est soutenu par l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), le Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) et la Fondation Pro CNIC et est un centre d’excellence Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Figure 2 créée avec BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
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