Summary
该协议描述了一种比较测定，在存在或不存在Na +的情况下使用线粒体复合物活性CI + CIII和CII + CIII，以研究部分分段功能CoQ池的存在。
Abstract
线粒体内膜（IMM）中的泛醌（CoQ）池部分分割为复合I或FAD依赖性酶。这种细分可以很容易地通过使用NADH或琥珀酸盐作为冷冻解冻线粒体中的电子供体的比较测定来评估，其中测量细胞色素c（cyt c）减少。该测定依赖于Na + 对IMM的影响，从而降低其流动性。在这里，我们提出了一种方案，用于在NaCl或KCl存在下测量NADH-cyt c氧化还原酶活性和琥珀酸-细胞c氧化还原酶活性。反应依赖于比色皿中试剂的混合物，在Na + 或K +存在下在4分钟内进行分光光度法测量。在特定酶抑制剂存在下平行进行相同的混合物，以减去吸光度的非特异性变化。NADH-cyt c氧化还原酶活性在任何这些阳离子的存在下都不会降低。然而，琥珀酸细胞c氧化还原酶活性在NaCl存在下降低。这个简单的实验突出了：1）Na + 在降低IMM流动性和CoQ转移方面的作用;2）超复合物I + III2 保护泛醌（CoQ）转移免受降低IMM流动性的影响;3）CI和CIII之间的CoQ转移在功能上不同于CII和CIII之间的CoQ转移。这些事实支持了IMM中存在功能分化的辅酶Q池，并表明它们可以受到线粒体不断变化的Na + 环境的调节。
Introduction
线粒体氧化磷酸化系统（OXPHOS）是线粒体驱动三磷酸腺苷（ATP）合成，活性氧（ROS）产生和消耗还原当量（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或琥珀酸盐）的主要途径。OXPHOS系统由五种蛋白质复合物组成：复合物I（CI）氧化NADH并将CoQ还原成泛醇（CoQH2）。复合物II（CII）将琥珀酸盐氧化成富马酸盐，并将辅酶Q还原成CoQH2。复合物III（CIII）将CoQH2 氧化回CoQ，减少细胞色素c（cyt c）。最后，复合物IV（CIV）氧化cyt c并将氧气还原为水。这种氧化还原链，即所谓的电子传递链（mETC），耦合到H + 泵浦过IMM，从而产生复合物V（CV）使用的电化学梯度，将磷酸腺苷二磷酸（ADP）转化为ATP。
mETC配合物可以在IMM中单独存在，也可以组装成称为超复合物的四元结构。CIV可以与CIII组装，形成III2 + IV或Q-呼吸体（因为它能够在CoQH2存在下呼吸）1，2，3 或形成同源二聚体或同源物4。CIII可以与CI相互作用，形成超复杂I + III25。最后，CI还能够与Q-呼吸体相互作用，建立I + III2 + IV或N-呼吸体（因为它可以呼吸消耗NADH）1，6，7，8，9，10。
CoQ和cyt c是移动电子载体，分别负责将电子从CI / CII转移到CIII，以及从CIII转移到CIV。超复合物是否对这些载体施加功能局部限制在过去二十年中一直是一个激烈争论的问题2，7，11，12，13，14，15，16，17。然而，几个独立的小组已经证明，CoQ和cyt c可以在功能上分割成IMM中的池。在辅酶Q方面，它可以在功能上细分为CI的特定辅酶Q池（CoQNAD）和另一个专用于FAD依赖性酶（CoQFAD）的池1，7，12，18，19。然而，为了区分部分分割的功能性CoQ池的存在，需要替代氧化酶（AOX）的过表达和在没有CIII的情况下可以组装CI的特定mtDNA突变体的产生1，19，20。
缺氧期间活性氧（ROS）产生的机制直到最近才为人所知。在急性缺氧时，CI经历活性/去活性（A / D）转变，这涉及其H + 泵送NADH-CoQ氧化还原酶活性的降低。H+ 泵送的这种减少使线粒体基质酸化，并部分溶解线粒体基质中的磷酸钙沉淀物，释放可溶性Ca2 +。可溶性Ca2 + 的这种增加激活Na + / Ca2 + 交换器（NCLX），其挤出Ca2 + 以换取Na +。线粒体Na+ 增加与IMM内侧的磷脂相互作用，降低其流动性和CII和CIII之间的CoQ转移，最终产生超氧阴离子，氧化还原信号21。有趣的是，CoQ转移仅在CII和CIII之间减少，但在CI和CIII之间没有减少，这突出表明1）Na + 只能调节线粒体中现有的一个CoQ池;2）IMM中存在功能差异化的辅酶Q池。因此，用于研究线粒体酶活性的广泛使用的方案可用于评估所提到的CoQ池的存在。
目前的方案是基于通过琥珀酸盐（即CII底物）或NADH（即CI底物）存在下的吸光度来测量氧化cyt c（CIII的底物）的还原。将相同的样品分为两个，其中一个用KCl处理，另一个用相同浓度的NaCl处理。这样，鉴于Na + 降低了IMM的流动性，如果CoQ存在于IMM中的独特池中，则在Na +存在的情况下，CI + CIII和CII + CIII都将降低。然而，如果CoQ存在于部分分段的功能CoQ池中，Na + 对CII + CIII活性的影响将大部分（或仅）明显，但对CI + CIII的影响则不明显。正如最近发表的21，Na + 仅影响CII和CIII之间的CoQ转移（图1C，D），但不影响CI和CIII之间的CoQ转移（图1A，B）。
该协议与一系列技术一起，已被用于确认IMM中存在部分分段的功能性CoQ池，一个专用于CI（即CoQNAD），另一个专用于FAD连接的酶（即CoQFAD）1，3，7;一个观察结果，虽然它继续争论22，但已被几个团体独立证实7，19。因此，CI的超复合体分解会影响CoQ的局部移动性，促进CIII在超复合物1，7，13，14，23，24，25中的使用。
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Protocol
所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行，并得到西班牙卡洛斯三世心血管研究中心（CNIC）机构伦理委员会的批准，符合2010年9月22日的欧盟指令（2010/63/UE）和2013年2月1日的西班牙皇家法令（53/2013）。我们尽一切努力尽量减少使用的动物数量及其痛苦。
注意：该研究线粒体CoQ池分割的比较测定描述如下：
1. 蛋白质定量
- 在实验前将分离的线粒体26 从野生型小鼠肝脏（即线粒体膜）中冷冻和解冻三次，以使细胞器可渗透到反应底物上。
- 通过布拉德福德或比辛可宁酸（BCA）方法定量分离的线粒体样品的蛋白质量。在布拉德福德的情况下，将2μL样品加入1mL的1x布拉德福德试剂中。
- 将样品分成四个子样品，每个子样品20μg（即：A，B，C，D; 图 2A）。
2. 测量CI+CIII活性
注意：实验方案的这一部分使用样品A和B来测量CI + CIII活性（图2B）。
- 将样品A和B分成两个子样品，每个子样品10μg（即A1，A2，B1和B2）。将1 mL比色皿中的每个子样品与30μLcyt c（10mg / mL），10μL 100mM丙二酸盐混合，并在37°C下加入预热的C1 / C2缓冲液（表1），最高可达980μL（比色皿A2和B2为979μL）。
注意：此步骤涉及使用有毒试剂丙二酸盐和氰化钾。
注意：cyt c（10 mg / mL）必须通过将10 mg cyt c与1 mL的10 mM K2HPO4 溶液混合来新鲜制备，pH调节至7.2，并且在整个实验过程中必须保持在冰中。 - 在比色皿A1和A2中加入10μL的1M KCl，并在比色皿B1和B2中加入10μL的1M NaCl。
- 将1μL1mM鱼藤酮加入含有子样品A2和B2的比色皿中。
注意：此步骤涉及使用有毒试剂鱼藤酮。 - 在测量之前，向所有比色皿中加入10μL NADH（10mM）。
注意：优选在比色皿的步骤上加入10μL，因此反应在混合时开始。 - 将比色皿小心地翻转三次混合。将其放入吸光度比色皿读数器（UV/VISJASCO分光光度计）中。
- 单击 “测量>参数”>“常规 ”，并将测量参数设置为波长：550 nm和时间：读数4分钟;按 “接受 ”和“ 开始 ”按钮开始实验。
- 在测量结束时，通过单击“ 文件 ”和“另存为”来保存包含吸光度线性增加 的斜率。坡度也可以手动收集。
3. 测量CII+CIII活性
注意：实验方案的这一部分使用样品C和D来测量CII + CIII活性（图2C）。
- 将样品C和D分成两个子样品，每个子样品10μg（即C1，C2，D1和D2）。将1 mL比色皿中的每个子样品与30μLcyt c（10mg / mL），1μL 1mM鱼藤酮混合，并在37°C下加入预热的C1 / C2缓冲液至980μL（比色皿C2和D2为970μL）。
注意：此步骤涉及使用有毒试剂氰化钾和鱼藤酮。
注意：cyt c（10 mg / mL）必须通过将10 mg cyt c与1 mL的10 mM K2HPO4 溶液混合来新鲜制备，pH调节至7.2，并且在整个实验过程中必须保持在冰中。 - 在比色皿C1和C2中加入10μL的1M KCl，并在比色皿D1和D2中加入10μL的1M NaCl。
- 将1μL的1mM抗霉素A加入含有子样品C2和D2的比色皿中。
注意：此步骤涉及使用有毒试剂抗霉素A。 - 在测量之前，向所有比色皿中加入10μL琥珀酸盐（1M）。
注意：优选在比色皿的步骤上加入10μL，因此反应在混合时开始。 - 仔细混合比色皿，翻转三次。将其放入吸光度比色皿读数器（紫外可见分光光度计）。
- 单击 “测量>参数”>“常规 ”，并将测量参数设置为波长：550 nm和时间：读数4分钟;按 “接受 ”和“ 开始 ”按钮开始实验。
- 在测量结束时，通过单击“ 文件 ”和“另存为”来保存包含吸光度线性增加 的斜率。坡度也可以手动收集。
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Representative Results
该协议的典型结果如下所示（图3）。由于降低的cyt c吸光度位于550nm处，因此所有未抑制的子样品必须在550nm处显示吸光度增加。理想情况下，抑制的子样本显示平坦或略微增加的斜率（图3）。从不受抑制的子样本中减去来自抑制子样本的斜率。
样品A和B都通过其对应抑制物校正并且代表NADH：cyt c氧化还原酶活性，具有相似的斜率（图3A）。然而，子样品C和D，两者都通过其对应抑制校正并且代表琥珀酸盐：cyt c氧化还原酶活性，是不同的，因为子样品C的活性高于子样品D的活性（图3B）。请注意，样品之间的基础吸光度可能略有不同（图3A）。
这些结果（即，已经由其抑制剂校正的斜率; 表 2）可以通过将使用的蛋白质量（0.01mg）除以a.u./min/mg蛋白质来表示。从这个值，可以使用兰伯-比尔定律21进一步计算cyt c减少率。
重要的是，这些结果可能因几个因素而异：（i）样品的来源。鉴于不同的组织和细胞类型具有可变的OXPHOS复合物和超复合物组成，绝对值和相对变化可能因样品而异。（ii）鉴于不同的组织可能具有可变的OXPHOS复合物和超复合物组成，在反应混合物中加入更多冷冻解冻的线粒体（以补偿特定组织的较低绝对值）可能具有次要效应，即样品中每毫克蛋白质/磷脂的Na + 或K + 的比例降低。因此，当改变线粒体的量或添加到样品中的Na + / K + 浓度时应谨慎。（iii）隔膜变异可能由冻融循环的持续时间和温度、试剂商业批次或分离线粒体的不同储存缓冲液引起。
图1：Na +特异性地减少了CII和CIII之间的电子转移，但不是CI和CIII之间的电子转移。（A）NADH和cyt c之间电子转移的示意图，通过超复杂I + III2中的CoQNAD发生。（B）NADH和cyt c之间的电子转移，通过超复合物I + III2中的CoQNAD发生，不受线粒体内Na +的影响。（C）琥珀酸盐和cyt c之间电子转移的示意图，通过CII中的CoQFAD发生。（D）NADH和cyt c之间的电子转移，通过超复合物I + III2中的CoQFAD发生，通过高线粒体内Na +降低。请点击此处查看此图的大图。
图 2：从原始样本的细分到动力学测量的协议 示意图。（A） 子样本划分的示意图，突出显示了所有子样本的相同原点。（B）试剂添加CI+CIII活性在子样品A1和B1中的连续步骤的示意图。红色圆圈表示理想情况下应添加 NADH 的位置。请注意，与子样本A2和B2的唯一区别是在后者中额外添加了鱼藤酮。（C）试剂添加CII+CIII活性在子样品C1和D1中的连续步骤的示意图。红色圆圈表示理想情况下应添加琥珀酸盐的位置。请注意，与子样本C2和D2的唯一区别是在后者中额外添加抗霉素A。 请点击此处查看此图的大图。
图3：Na + 对小鼠肝脏线粒体膜对NADH或琥珀酸盐添加的cyt c还原的影响。（A）具有代表性的示踪剂显示Na+ 通过小鼠肝脏线粒体膜氧化NADH对cyt c还原的影响。（B）具有代表性的痕迹，显示Na + 通过小鼠肝脏线粒体膜氧化琥珀酸盐对cyt c还原的影响。 请点击此处查看此图的大图。
| 复合 | 浓度 |
| K2HPO4 | 25 毫米 |
| 氯化镁2 | 5 毫米 |
| 断续器 | 3 毫米 |
| 牛血清白蛋白 | 2.5毫克/毫升 |
表 1：C1/C2 缓冲液的组成。 缓冲液组合物以摩尔浓度表示。
| 预期费率 | +氯化钾（平均值） | +氯化钾 （标清） | +氯化钠（平均值） | +氯化钠 （标清） | 曼-惠特尼 P 值 |
| CII + CIII （n = 4） | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| 个人价值观 | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII （n = 4） | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| 个人价值观 | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
表2：预期费率范围。 每个活动的预期值以任意单位表示。还给出了+KCl和+NaCl之间的相应统计检验。“n”表示重复次数。
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Discussion
虽然该协议代表了识别部分分段的CoQ池存在的非常简单的过程，但有几个关键步骤需要考虑。底物（即NADH或琥珀酸盐）优选最后加入，因为这些化合物可能发生自氧化。比色皿的翻转必须小心，以避免形成可能干扰读数的气泡。
此外，本技术还存在一些值得一提的局限性。测量不是在完整的线粒体中进行的。因此，人工缓冲液的含量和比例可能导致与线粒体的天然环境的差异。
试剂过量添加，它们可能不代表完整组织中底物的真实可用性。
目前的方法意味着生成和使用许多实验室不易获得的非常具体的遗传模型和设备1.该协议提供了一种可靠且易于操作的方法，可以使用广泛使用的试剂和工具测量部分分化的辅酶Q池的存在。因此，有可能将其应用于未来比较线粒体疾病遗传模型的研究中。
mETC中移动电子载流子的迁移率仍然是一个备受争议的话题25，27，尽管部分分化池的存在正在被接受为7，12，18，28，29。最近，高分辨率呼吸测定法和几种表达AOX1的OXPHOS突变体的详细生化表征，以及保存天然脂质环境7的精细冷冻电子显微镜研究，为讨论带来了光明。这为部分分段功能辅酶Q池的存在提出了强有力的论据。
此外，生理刺激已被证明受到不同辅酶Q池的调节;特别是，由线粒体内Na +驱动的急性缺氧反应。缺氧期间线粒体中较高的Na + 水平会降低CII和CIII之间的电子转移，在CIII水平上解耦Q循环并产生超氧阴离子。相比之下，CI和CIII之间的电子转移没有减少21。目前的协议广泛解释了获得这些结果的过程。
如果所研究的治疗是在纤维素或体内进行的，则可以将进一步的控制应用于当前的方案，这是CI，CII和CIII的分离复杂活性，因为它们的个体量或单个活性可能随治疗而变化。按照如上所述的非常相似的程序，在Na+的存在与否的情况下，这些孤立的活性21中的任何一个都没有看到差异。需要注意的是，已经描述了Na+可以增加D/A转换30。然而，用于该观察的方案涉及使用提交粒体颗粒（SMP），而我们的方案使用线粒体膜，突出了跨IMM的膜电位对于核算效应的必要性30。
应该注意的是，冻融循环不会像洗涤剂那样溶解膜，因此单个复合物和超复合物仍然附着在磷脂双分子层上。这可以通过以下事实来证明：在存在细胞色素c31的情况下，可以通过CI或CII测量冷冻解冻的线粒体耗氧量。此外，如果冻融循环对CII+CIII活性有影响，则不仅在“NaCl 10 mM”样品中可见，而且在“KCl 10 mM”样品中也可见。这将使测量变得不可能（因为CII将通过膜分解与CIII分离），或者降低到看不到K+ 和Na+ 之间差异的点。但是，如图 2B 所示，情况并非如此。在方案中添加KCl旨在消除渗透压或离子强度对所测活动的潜在影响。两种情况下的最终渗透压，“10 mM KCl”样本和“10 mM NaCl”样本，相等（116 mEq / L），样本之间的唯一区别是存在10 mM K + 或10 mM Na +。尽管如此，如果来自缓冲液的K + 阳离子具有作用，它将在“KCl 10 mM”和“NaCl 10 mM”样品中表现出来，使得这种效应在任一样品中都无法辨别。
在不同阳离子结合磷脂的能力中，真正关键的是每种阳离子的配位化学和离子半径（正如我们的原始论文21中实验所强调的那样，以及Böckmann等人的理论32）。虽然K+ 显示的平均配位数为6，但Na+ 的平均配位数为5，导致不同的配位复几何，这转化为K+ 和Na+ 对磷脂双层33的非常不同的影响。
还应该注意的是，K+和Na+的离子半径是不同的。虽然K+的离子半径为280 pm，但Na+的离子半径为227 pm。这种差异直接影响它们与阴离子（或两性离子）的相互作用，因为较低的离子半径（即较少的电子壳）导致与带负电荷的分子的更强的相互作用，因为正离子原子核暴露得更多，就好像它具有额外的电子壳层（即较高的离子半径） 一样。事实上，所有的阳离子都可能与磷脂相互作用;然而，只有那些具有特定化学物理性质的人才能够对磷脂双分子层产生特定影响，例如Na +。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢马丁内斯·德梅纳博士、穆尼奥斯-埃尔南德斯博士、希门尼斯博士和马丁内斯-希门尼斯博士提供的技术援助。这项研究得到了MICIN的支持：RTI2018-099357-B-I00和HFSP（RGP0016/2018）。CNIC得到了Salud Carlos III研究所（ISCIII），科学部长，创新与大学（MCNU）和Pro CNIC基金会的支持，是Severo Ochoa卓越中心（SEV-2015-0505）。使用 BioRender.com 创建的图 2。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
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