Summary
يصف هذا البروتوكول فحصا مقارنا ، باستخدام أنشطة الميتوكوندريا المعقدة CI + CIII و CII + CIII في وجود أو عدم وجود Na + ، لدراسة وجود تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا.
Abstract
يتم تقسيم تجمعات Ubiquinone (CoQ) في غشاء الميتوكوندريا الداخلي (IMM) جزئيا إلى إنزيمات معقدة I أو تعتمد على FAD. ويمكن تقييم هذا التقسيم الفرعي بسهولة عن طريق مقايسة مقارنة باستخدام NADH أو السكسينات كمتبرعين بالإلكترونات في الميتوكوندريا المذابة المجمدة، حيث يقاس انخفاض السيتوكروم ج (cyt c). يعتمد الفحص على تأثير Na+ على IMM ، مما يقلل من سيولته. هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس نشاط NADH-cyt c oxidoreductase وأنشطة أوكسيدوريدوكتاز خلية سكسينات c في وجود كلوريد الصوديوم أو KCl. يتم قياس التفاعلات ، التي تعتمد على خليط الكواشف في كوفيت بطريقة تدريجية ، الطيف الضوئي خلال 4 دقائق في وجود Na + أو K +. يتم تنفيذ نفس الخليط بالتوازي في وجود مثبطات الإنزيم المحددة من أجل طرح التغيير غير المحدد في الامتصاص. لا ينخفض نشاط NADH-cyt c oxidoreductase في وجود أي من هذه الكاتيونات. ومع ذلك ، ينخفض نشاط أوكسيدوريدوكتاز السكسينات - cyt c في وجود كلوريد الصوديوم. تسلط هذه التجربة البسيطة الضوء على: 1) تأثير Na+ في تقليل سيولة IMM ونقل CoQ ؛ 2) أن المركبين الفائقين I+III2 يحمي نقل يوبيكينون (CoQ) من التأثر بخفض سيولة IMM؛ 3) أن نقل CoQ بين CI و CIII يختلف وظيفيا عن نقل CoQ بين CII و CIII. تدعم هذه الحقائق وجود برك CoQ متباينة وظيفيا في IMM وتظهر أنه يمكن تنظيمها بواسطة بيئة Na+ المتغيرة للميتوكوندريا.
Introduction
نظام الفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا (OXPHOS) هو المسار الرئيسي الذي يقود تخليق الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، واستهلاك المكافئات المختزلة ، مثل نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) أو السكسينات ، بواسطة الميتوكوندريا. يتكون نظام OXPHOS من خمسة مجمعات بروتينية: المركب I (CI) يؤكسد NADH ويقلل من CoQ إلى يوبيكوينول (CoQH2). المركب الثاني (CII) يؤكسد السكسينات إلى فومارات ويقلل من CoQ إلى CoQH2. المركب الثالث (CIII) يؤكسد CoQH2 مرة أخرى إلى CoQ ، مما يقلل من السيتوكروم c (cyt c). أخيرا ، يؤكسد المركب IV (CIV) cyt c ويقلل من الأكسجين إلى الماء. تقترن سلسلة اختزال الأكسدة هذه ، ما يسمى بسلسلة نقل الإلكترون (mETC) ، بضخ H + عبر IMM ، مما يخلق تدرجا كهروكيميائيا يستخدمه المركب V (CV) إلى فوسفوريلات الأدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) في ATP.
يمكن أن تكون مجمعات mETC إما بمفردها في IMM أو تتجمع في هياكل رباعية تسمى المجمعات الفائقة. يمكن أن تتجمع CIV مع CIII ، وتشكل III 2 + IV أو Q-respirasome (لأنها قادرة على التنفس في وجود CoQH 2) 1،2،3 أو تشكيل homodimers أو homooligomers4. يمكن أن يتفاعل CIII مع CI ، ويشكل التعقيد الفائق I + III25. أخيرا ، CI قادر أيضا على التفاعل مع Q-respirasome ، وبناء I + III2 + IV أو N-respirasome (حيث يمكنه التنفس استهلاك NADH) 1،6،7،8،9،10.
CoQ و cyt c هما حاملان إلكترونات متنقلان مسؤولان عن نقل الإلكترونات من CI / CII إلى CIII ، ومن CIII إلى CIV ، على التوالي. ما إذا كانت المجمعات العملاقة تفرض قيودا محلية وظيفية على هذه الناقلات أم لا كانت مسألة نقاش مكثف خلال العقدين الماضيين 2,7,11,12,13,14,15,16,17. ومع ذلك ، فقد أثبتت العديد من المجموعات المستقلة أنه يمكن تقسيم CoQ و cyt c وظيفيا إلى تجمعات في IMM. فيما يتعلق ب CoQ ، يمكن تقسيمه وظيفيا إلى تجمع CoQ محدد ل CI (CoQNAD) وتجمع آخر مخصص للإنزيمات المعتمدة على FAD (CoQFAD) 1،7،12،18،19. ومع ذلك ، من أجل التمييز بين وجود تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا ، كان التعبير المفرط عن أوكسيديز البديل (AOX) وتوليد طفرات mtDNA محددة ، والتي يمكنها تجميع CI في غياب CIII ، مطلوبة1،19،20.
كانت آلية إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أثناء نقص الأكسجة غير معروفة حتى وقت قريب. عند نقص الأكسجة الحاد ، يخضع CI للانتقال النشط / النشط (A / D) ، والذي ينطوي على انخفاض في نشاط أوكسيدوريدوكتاز NADH-CoQ الذي يضخ H +. مثل هذا الانخفاض في ضخ H + يحمض مصفوفة الميتوكوندريا ويذيب جزئيا ترسب الكالسيوم والفوسفات في مصفوفة الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى إطلاق Ca2 + القابل للذوبان. هذه الزيادة في Ca 2+ القابلة للذوبان تنشط مبادل Na + / Ca2+ (NCLX) ، الذي يقذف Ca 2 + مقابل Na +. تتفاعل زيادة الميتوكوندريا Na+ مع الدهون الفوسفاتية في الجانب الداخلي من IMM ، مما يقلل من سيولتها ونقل CoQ بين CII و CIII ، وأخيرا ينتج أنيون فائق الأكسيد ، إشارة أكسدة وأكسدة21. ومن المثير للاهتمام أن نقل CoQ قد تضاءل فقط بين CII و CIII ، ولكن ليس بين CI و CIII ، مما يسلط الضوء على أن 1) Na+ كان قادرا على تعديل واحد فقط من تجمعات CoQ الموجودة في الميتوكوندريا. 2) توجد تجمعات CoQ متباينة وظيفيا في IMM. وبالتالي ، يمكن استخدام بروتوكول يستخدم على نطاق واسع لدراسة أنشطة إنزيم الميتوكوندريا لتقييم وجود تجمعات CoQ المذكورة.
يعتمد البروتوكول الحالي على قياس الحد من cyt c المؤكسدة ، ركيزة CIII ، عن طريق الامتصاص في وجود السكسينات (أي ركيزة CII) أو NADH (أي ركيزة CI). تنقسم نفس العينة إلى عينتين ، سيتم التعامل مع أحدهما باستخدام KCl ، والآخر بنفس تركيز كلوريد الصوديوم. وبهذه الطريقة ، بالنظر إلى أن Na + يقلل من سيولة IMM ، إذا كان CoQ موجودا في تجمع فريد في IMM ، فإن كل من CI + CIII و CII + CIII سينخفضان في وجود Na +. ومع ذلك ، إذا كان CoQ موجودا في تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا ، فإن تأثير Na + سيكون واضحا في الغالب (أو فقط) على نشاط CII + CIII ، ولكن ليس على CI + CIII. كما نشر مؤخرا21 ، يؤثر Na + فقط على نقل CoQ بين CII و CIII (الشكل 1C ، D) ، ولكن ليس بين CI و CIII (الشكل 1A ، B).
وقد استخدم هذا البروتوكول، إلى جانب مجموعة من التقنيات، لتأكيد وجود تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا في IMM، واحدة مخصصة ل CI (أي CoQNAD)، وأخرى مخصصة للإنزيمات المرتبطة ب FAD (أي CoQFAD)1،3،7؛ ملاحظة أنه على الرغم من استمرار مناقشتها22 ، فقد تم تأكيدها بشكل مستقل من قبل العديد من المجموعات 7,19. وبالتالي ، فإن التجميع الفائق ل CI في مجمعات فائقة يؤثر على التنقل المحلي ل CoQ ، مما يسهل استخدامه من قبل CIII داخل المجمع الفائق1،7،13،14،23،24،25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية التابعة للمركز الوطني للبحوث القلبية الوعائية كارلوس الثالث (CNIC) ، إسبانيا ، وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي المؤرخ 22 سبتمبر 2010 (2010/63/UE) والمرسوم الملكي الإسباني المؤرخ 1 فبراير 2013 (53/2013). وبذلت جميع الجهود لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة ومعاناتها.
ملاحظة: يتم وصف هذا الفحص المقارن لدراسة تجزئة برك CoQ الميتوكوندريا على النحو التالي:
1. تحديد كمية البروتين
- قم بتجميد وإذابة الميتوكوندريا المعزولة26 من كبد فأر من النوع البري ثلاث مرات (أي أغشية الميتوكوندريا) قبل التجريب لجعل العضيات قابلة للنفاذ إلى ركائز التفاعل.
- حدد كمية البروتين في عينة الميتوكوندريا المعزولة بطرق برادفورد أو حمض البيسينكونينيك (BCA). في حالة برادفورد ، أضف 2 ميكرولتر من العينة إلى 1 مل من كاشف برادفورد 1x.
- قسم العينة إلى أربع عينات فرعية سعة كل منها 20 ميكروغرام (وهي: A, B, C, D; الشكل 2 ألف).
2. قياس نشاط CI + CIII
ملاحظة: يستخدم هذا الجزء من البروتوكول العينتين A وB لقياس نشاط CI+CIII (الشكل 2B).
- قسم العينتين A و B إلى عينتين فرعيتين سعة كل منهما 10 ميكروغرام (وهما A1 و A2 و B1 و B2). امزج كل عينة من العينات الفرعية في كوفيت 1 مل مع 30 ميكرولتر من cyt c (10 mg / mL) ، و 10 μL من 100 mM malonate ، وأضف المخزن المؤقت C1 / C2 المسخن مسبقا (الجدول 1) عند 37 درجة مئوية حتى 980 ميكرولتر (979 ميكرولتر للكوفيت A2 و B2).
تحذير: تتضمن هذه الخطوة استخدام الكواشف السامة مالونات وسيانيد البوتاسيوم.
ملاحظة: يجب تحضير cyt c (10 mg / mL) طازجا عن طريق خلط 10 mg من cyt c في 1 مل من محلول 10 mM K 2 HPO4 ، وضبط درجة الحموضة إلى7.2، ويجب الحفاظ عليها في الجليد طوال التجربة. - أضف 10 ميكرولتر من 1 M KCl في الكوفيت A1 و A2 ، وأضف 10 ميكرولتر من 1 M NaCl في cuvettes B1 و B2.
- أضف 1 ميكرولتر من 1 mM rotenone إلى الكوفيت الذي يحتوي على عينات فرعية A2 و B2.
تنبيه: تتضمن هذه الخطوة استخدام الكاشف السام الروتينون. - قبل القياس مباشرة ، أضف 10 ميكرولتر من NADH (10 mM) في جميع الكفيتات.
ملاحظة: يفضل إضافة 10 ميكرولتر على خطوة الكوفيت ، لذلك يبدأ التفاعل عند الخلط. - اخلطي الكوفيت عن طريق قلبه بعناية ثلاث مرات. ضعه في قارئ كوفيت الامتصاص (مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية / VISJASCO).
- انقر فوق قياس معلمات > > عام واضبط معلمات القياس على الطول الموجي: 550 نانومتر ، والوقت: 4 دقائق من القراءة ؛ اضغط على الزرين قبول وابدأ لبدء التجربة.
- في نهاية القياس، احفظ المنحدر الذي يضم الزيادة الخطية في الامتصاص بالنقر فوق ملف وحفظ باسم. يمكن أيضا جمع المنحدر يدويا.
3. قياس نشاط CII + CIII
ملاحظة: يستخدم هذا الجزء من البروتوكول العينتين C وD لقياس نشاط CII+CIII (الشكل 2C).
- قسم العينتين C و D إلى عينتين فرعيتين سعة كل منهما 10 ميكروغرام (وهما C1 و C2 و D1 و D2). امزج كل عينة من العينات الفرعية في كوفيت 1 مل مع 30 ميكرولتر من cyt c (10 mg / mL) ، 1 μL من 1 mM rotenone ، وأضف المخزن المؤقت C1 / C2 المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية حتى 980 ميكرولتر (970 ميكرولتر للكوفيت C2 و D2).
تحذير: تتضمن هذه الخطوة استخدام الكواشف السامة سيانيد البوتاسيوم والروتينون.
ملاحظة: يجب تحضير cyt c (10 mg / mL) طازجا عن طريق خلط 10 mg من cyt c في 1 مل من محلول 10 mM K 2 HPO4 ، وضبط درجة الحموضة إلى7.2، ويجب الحفاظ عليها في الجليد طوال التجربة. - أضف 10 ميكرولتر من 1 M KCl في الكوفيت C1 و C2 ، وأضف 10 ميكرولتر من 1 M NaCl في cuvettes D1 و D2.
- أضف 1 ميكرولتر من 1 mM antimycin A إلى الكوفيت الذي يحتوي على عينات فرعية C2 و D2.
تنبيه: تتضمن هذه الخطوة استخدام الكاشف السام antimycin A. - قبل القياس مباشرة ، أضف 10 ميكرولتر من السكسينات (1 م) إلى جميع الكفيتات.
ملاحظة: يفضل إضافة 10 ميكرولتر على خطوة الكوفيت ، لذلك يبدأ التفاعل عند الخلط. - اخلطي الكوفيت بعناية ، وقلبيه ثلاث مرات. ضعه في قارئ كوفيت الامتصاص (مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية/VIS).
- انقر فوق قياس معلمات > > عام واضبط معلمات القياس على الطول الموجي: 550 نانومتر ، والوقت: 4 دقائق من القراءة ؛ اضغط على الزرين قبول وابدأ لبدء التجربة.
- في نهاية القياس، احفظ المنحدر الذي يضم الزيادة الخطية في الامتصاص بالنقر فوق ملف وحفظ باسم. يمكن أيضا جمع المنحدر يدويا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد أدناه النتائج النموذجية لهذا البروتوكول (الشكل 3). نظرا لأن الامتصاص المنخفض للخلية c يقع عند 550 نانومتر ، يجب أن تظهر جميع العينات الفرعية غير المثبطة زيادة في الامتصاص عند 550 نانومتر. تظهر العينات الفرعية المثبطة بشكل مثالي منحدرا مسطحا أو متزايدا قليلا (الشكل 3). يجب طرح المنحدرات من العينات الفرعية المثبطة من العينات الفرعية غير المثبطة.
وللعينتين ألف وباء، اللتان تم تصحيحهما بواسطة تثبيط مراسلهما واللتين تمثلان نشاط أكسيدوريدوكتاز NADH:cyt c oxidoreductase، منحدر مماثل (الشكل 3A). ومع ذلك، فإن العينتين الفرعيتين C وD، اللتين تم تصحيحهما بواسطة تثبيط مراسلهما والتي تمثل نشاط السكسينات:cyt c oxidoreductase، مختلفتان، من حيث أن نشاط العينة الفرعية C أعلى من نشاط العينة الفرعية D (الشكل 3B). لاحظ أن الامتصاص القاعدي يمكن أن يكون مختلفا قليلا بين العينات (الشكل 3A).
هذه النتائج (أي المنحدرات التي تم تصحيحها بالفعل بواسطة مثبطها. الجدول 2) يمكن تمثيلها بقسمة كمية البروتين المستخدمة (0.01 ملغ) على أنها بروتين a.u./min/mg. من هذه القيمة ، يمكن حساب معدل انخفاض cyt c باستخدام قانون Lamber-Beer21.
الأهم من ذلك ، قد تختلف هذه النتائج وفقا لعدة عوامل: (i) أصل العينات. بالنظر إلى أن الأنسجة وأنواع الخلايا المختلفة لها تركيبة متغيرة من مجمعات OXPHOS والمجمعات الفائقة ، فقد تختلف القيم المطلقة والتغيرات النسبية عبر العينات. (ii) بالنظر إلى أن الأنسجة المختلفة قد يكون لها تركيبة متغيرة من مجمعات OXPHOS والمجمعات الفائقة ، فإن إضافة المزيد من الميتوكوندريا المذابة المجمدة (لتعويض القيم المطلقة المنخفضة لنسيج معين) إلى خليط التفاعل قد يكون له تأثير ثانوي ، وهو أن نسبة Na + أو K + لكل ملغ من البروتين / الدهون الفوسفاتية في العينة تنخفض. وبالتالي ، يجب توخي الحذر عند تغيير كمية الميتوكوندريا أو تركيز Na + / K + المضاف إلى العينة. '3' قد ينشأ التباين بين التجارب من مدة ودرجة حرارة دورات التجميد والذوبان أو الدفعة التجارية للكواشف أو التخزين العازل المتغير للميتوكوندريا المعزولة.
الشكل 1: Na+ يقلل على وجه التحديد من نقل الإلكترون بين CII و CIII ، ولكن ليس بين CI و CIII . (A) التمثيل التخطيطي لنقل الإلكترون بين NADH و cyt c ، الذي يحدث من خلال CoQNAD في التعقيد الفائق I + III2. (ب) لا يتأثر انتقال الإلكترون بين NADH و cyt c ، الذي يحدث من خلال CoQNAD في المجمع الفائق I + III2 ، ب Na + داخل الميتوكوندريا. (ج) التمثيل التخطيطي لنقل الإلكترون بين السكسينات و cyt c ، الذي يحدث من خلال CoQFAD في CII. (د) ينخفض انتقال الإلكترون بين NADH و cyt c ، الذي يحدث من خلال CoQFAD في المركب الفائق I + III2 ، بواسطة Na + داخل الميتوكوندريا العالية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التمثيل التخطيطي للبروتوكول من التقسيم الفرعي للعينة الأصلية إلى القياس الحركي. (أ) التمثيل التخطيطي لتقسيم العينة الفرعية ، مع تسليط الضوء على نفس الأصل لجميع العينات الفرعية. (ب) مخطط الخطوات المتعاقبة لإضافات الكاشف لنشاط CI+CIII في العينتين الفرعيتين A1 وB1. تمثل الدائرة الحمراء الموقع الذي يجب إضافة NADH إليه بشكل مثالي. لاحظ أن الفرق الوحيد مع العينات الفرعية A2 و B2 هو الإضافة الإضافية للروتينون في الأخير. (ج) مخطط الخطوات المتعاقبة لإضافات الكاشف لنشاط CII + CIII في العينتين الفرعيتين C1 و D1. تمثل الدائرة الحمراء الموقع الذي يجب إضافة السكسينات إليه بشكل مثالي. لاحظ أن الفرق الوحيد مع العينات الفرعية C2 و D2 هو الإضافة الإضافية ل antimycin A في الأخير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تأثير Na+ على تقليل cyt c بواسطة أغشية الميتوكوندريا كبد الفأر على NADH أو إضافة السكسينات. (أ) آثار تمثيلية تبين تأثير Na+ على الحد من الخلايا C بواسطة أغشية الميتوكوندريا كبد الفأر المؤكسدة NADH. (ب) آثار تمثيلية تبين تأثير Na+ على الحد من cyt c بواسطة أغشية الميتوكوندريا المؤكسدة لكبد الفأر السكسينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مركب | تركيز |
| K2HPO4 | 25 مللي متر |
| مج كل2 | 5 مللي متر |
| كيه سي إن | 3 مللي متر |
| ألبومين مصل البقر (BSA) | 2.5 ملغم/مل |
الجدول 1: تكوين المخزن المؤقت C1/C2. يتم تقديم تكوين المخزن المؤقت بتركيزات مولية.
| المعدلات المتوقعة | +KCl (متوسط) | +KCl (SD) | +كلوريد الصوديوم (متوسط) | +كلوريد الصوديوم (SD) | قيمة مان-ويتني P |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| القيم الفردية | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| القيم الفردية | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
الجدول 2: نطاقات المعدلات المتوقعة. يتم عرض القيم المتوقعة لكل نشاط في وحدات تعسفية. كما يتم تقديم الاختبار الإحصائي المقابل بين +KCl و +NaCl. يمثل "n" عدد النسخ المتماثلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن هذا البروتوكول يمثل إجراء مباشرا للغاية لتحديد وجود تجمعات CoQ المجزأة جزئيا ، إلا أن هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب مراعاتها. يفضل إضافة الركائز (أي NADH أو السكسينات) أخيرا نظرا لاحتمال حدوث الأكسدة الذاتية لهذه المركبات. يجب أن يكون تقليب كوفيت حذرا لتجنب تكوين فقاعات قد تتداخل مع القراءة.
بالإضافة إلى ذلك ، تقدم التقنية الحالية بعض القيود التي تستحق الذكر. لا يتم إجراء القياسات في الميتوكوندريا السليمة. وبالتالي ، قد يؤدي المحتوى الاصطناعي ونسبة المخزن المؤقت إلى اختلافات مع البيئة الأصلية للميتوكوندريا.
تضاف الكواشف بشكل زائد ، وقد لا تمثل التوافر الحقيقي للركائز في الأنسجة السليمة.
وتنطوي الأساليب الحالية على توليد واستخدام نماذج ومعدات جينية محددة للغاية لا تتوفر بسهولة في العديد من المختبرات1. يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة وسهلة التنفيذ لقياس وجود تجمعات CoQ المتباينة جزئيا باستخدام الكواشف والأدوات المتاحة على نطاق واسع. وبالتالي ، من الممكن تطبيقه في الدراسات المستقبلية التي تقارن النماذج الجينية لمرض الميتوكوندريا.
لا يزال تنقل حاملات الإلكترونات المتنقلة في mETC موضوعا مثيرا للجدل25,27 ، على الرغم من أن وجود مجمعات متباينة جزئيا أصبح مقبولا7,12,18,28,29. في الآونة الأخيرة ، جلب قياس التنفس عالي الدقة والتوصيف الكيميائي الحيوي المفصل للعديد من طفرات OXPHOS التي تعبر عن AOX1 ، إلى جانب دراسات المجهر الإلكتروني المبرد المكرر التي تحافظ على بيئة الدهون الطبيعية7 ، الضوء على المناقشة. هذا يطرح حججا ثقيلة لصالح وجود تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا.
بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن المحفزات الفسيولوجية يتم تنظيمها بواسطة برك CoQ المختلفة. على وجه الخصوص ، استجابة نقص الأكسجة الحادة التي يقودها Na + داخل الميتوكوندريا. مستويات Na+ الأعلى في الميتوكوندريا أثناء نقص الأكسجة تقلل من نقل الإلكترون بين CII و CIII ، مما يؤدي إلى فصل دورة Q على مستوى CIII وإنتاج أنيون فائق الأكسيد. في المقابل ، لم ينخفض نقل الإلكترون بين CI و CIII21. ويشرح البروتوكول الحالي على نطاق واسع الإجراء الذي تم من خلاله الحصول على هذه النتائج.
يمكن تطبيق المزيد من الضوابط على البروتوكول الحالي إذا تم إجراء العلاج قيد الدراسة في الخلية أو في الجسم الحي ، وهي الأنشطة المعقدة المعزولة ل CI و CII و CIII ، حيث قد تختلف كمياتها الفردية أو أنشطتها الفردية مع العلاج. وباتباع إجراء مشابه جدا كما هو موضح أعلاه، لم تلاحظ اختلافات في أي من هذه الأنشطة المعزولة21 في وجود أو عدم وجود Na+. للملاحظة ، تم وصف أن Na + يمكن أن يزيد من انتقال D / A30. ومع ذلك ، فإن البروتوكول المستخدم في هذه الملاحظة ينطوي على استخدام الجسيمات الخالدة الغضروفية (SMPs) ، في حين يستخدم بروتوكولنا أغشية الميتوكوندريا ، مما يسلط الضوء على ضرورة إمكانات الغشاء عبر IMM للتأثير المحسوب30.
تجدر الإشارة إلى أن دورات التجميد والذوبان لا تذوب الأغشية كما تفعل المنظفات ، وبالتالي لا تزال المجمعات الفردية والمجمعات الفائقة مرتبطة بالطبقات الثنائية الفوسفاتية. ويتضح ذلك من حقيقة أن استهلاك أكسجين الميتوكوندريا المذاب المجمد من خلال CI أو CII يمكن قياسه في وجود السيتوكروم c31. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان هناك تأثير لدورات التجميد والذوبان على نشاط CII+CIII، فلن يظهر ذلك فقط في عينات "كلوريد الصوديوم 10 مللي متر"، ولكن أيضا في عينات "KCl 10 mM". هذا من شأنه أن يجعل القياس مستحيلا (حيث سيتم فصل CII عن CIII من خلال تحلل الغشاء) أو أقل إلى نقطة لا يمكن فيها رؤية الاختلافات بين K + و Na +. ومع ذلك ، كما هو موضح في الشكل 2 ب ، فإن هذا ليس هو الحال. تم تصميم إضافة KCl في البروتوكول لتجاهل الآثار المحتملة إما للتناضح أو القوة الأيونية على الأنشطة المقاسة. الأسمولية النهائية في كلتا الحالتين ، عينة "10 mM KCl" وعينة "10 mM NaCl" ، متساوية (116 mEq / L) والفرق الوحيد بين العينات هو وجود 10 mM K + أو 10 mM Na +. ومع ذلك ، إذا كان للكاتيونات K + من المخزن المؤقت تأثير ، فسيظهر ذلك في كل من عينات "KCl 10 mM" و "NaCl 10 mM" ، مما يجعل مثل هذا التأثير غير ملحوظ في أي من العينتين.
في قدرة الكاتيونات المختلفة على ربط الدهون الفوسفاتية ، فإن ما هو حاسم بالفعل هو كيمياء التنسيق ونصف القطر الأيوني لكل كاتيون (كما هو موضح تجريبيا في ورقتنا الأصلية21 ، ونظريا في Böckmann et al.32). في حين أن K+ يعرض متوسط عدد التنسيق من ستة ، فإن متوسط عدد التنسيق Na + هو خمسة ، مما يؤدي إلى هندسة معقدة تنسيق مختلفة ، والتي تترجم إلى تأثيرات مختلفة جدا ل K + و Na + على طبقة ثنائية الفوسفوليبيد33.
وتجدر الإشارة أيضا إلى أن نصف القطر الأيوني ل K + و Na + مختلفان. في حين أن K+ له نصف قطر أيوني يبلغ 280 مساء ، فإن Na+ له نصف قطر أيوني يبلغ 227 مساء. يؤثر هذا الاختلاف بشكل مباشر على تفاعلها مع الأنيونات (أو zwitterions) ، لأن نصف القطر الأيوني المنخفض (أي أغلفة إلكترونية أقل) يؤدي إلى تفاعل أقوى مع جزيء سالب الشحنة حيث تكون النواة الأيونية الموجبة أكثر تعرضا كما لو كانت تحتوي على أغلفة إلكترونية إضافية (أي نصف قطر أيوني أعلى). في الواقع ، ربما تكون جميع الكاتيونات قادرة على التفاعل مع الدهون الفوسفاتية. ومع ذلك ، فقط أولئك الذين لديهم خصائص كيميائية فيزيائية محددة قادرون على أن يكون لهم تأثيرات محددة على طبقة ثنائية الدهون الفوسفاتية ، مثل Na +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
مارتينيز - دي - مينا، و م. م. مونيوز - هيرنانديز، أ.، والدكتور س. خيمينيز و إ. ر. مارتينيز - خيمينيز على المساعدة التقنية. تم دعم هذه الدراسة من قبل MICIN: RTI2018-099357-B-I00 و HFSP (RGP0016/2018). يتم دعم CNIC من قبل معهد Salud Carlos III (ISCIII) ، ووزارة العلوم ، و Innovación y Universidades (MCNU) ومؤسسة Pro CNIC وهو مركز Severo Ochoa للتميز (SEV-2015-0505). الشكل 2 تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A.
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al.
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A.
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A.
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J.
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T.
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
