Summary
De Caco-2 cel bioassay voor ijzer (Fe) biologische beschikbaarheid vertegenwoordigt een kosteneffectieve en veelzijdige aanpak om fe biologische beschikbaarheid te beoordelen van voedingsmiddelen, voedingsproducten, supplementen, maaltijden en zelfs dieetregimes. Grondig gevalideerd voor menselijke studies, vertegenwoordigt het de state-of-the-art voor studies van fe biologische beschikbaarheid.
Abstract
Kennis van de biologische beschikbaarheid van Fe is van cruciaal belang voor de beoordeling van de voedingskwaliteit van Fe in voedingsmiddelen. In vivo meting van de biologische beschikbaarheid van Fe wordt beperkt door de kosten, doorvoer en de kanttekeningen die inherent zijn aan isotopische etikettering van het voedsel Fe. Er bestaat dus een kritieke behoefte aan een aanpak met een hoge doorvoer en kosteneffectief. De Caco-2 cel bioassay is ontwikkeld om aan deze behoefte te voldoen. De Caco-2 celbioassay voor fe biobeschikbaarheid maakt gebruik van gesimuleerde maag- en darmvertering in combinatie met cultuur van een menselijke intestinale epitheelcellijn die bekend staat als Caco-2. In Caco-2-cellen stimuleert Fe-opname de intracellulaire vorming van ferritine, een Fe-opslageiwit dat gemakkelijk kan worden gemeten door enzymgebonden immunosorbent assay (ELISA). Ferritine vormt in verhouding tot fe opname; dus, door de productie van Caco-2-celferritine te meten, kan men de intestinale Fe-opname van gesimuleerde voedselvertelling in de enterocyt beoordelen.
Via deze aanpak repliceert het model de belangrijkste eerste stap die de biologische beschikbaarheid van voedsel bepaalt. Sinds de oprichting in 1998 is deze modelbenadering rigoureus vergeleken met factoren waarvan bekend is dat ze de biologische beschikbaarheid van menselijke fe beïnvloeden. Bovendien is het toegepast in parallelle studies, met drie menselijke werkzaamheidsstudies die fe biofortified gewassen evalueren. In alle gevallen voorspelde de bioassay correct de relatieve hoeveelheden fe biologische beschikbaarheid van de factoren, gewassen en het algehele dieet. Dit artikel biedt gedetailleerde methoden over Caco-2 celcultuur in combinatie met het in vitro verteringsproces en cel ferritine ELISA die nodig is om de Caco-2 cel bioassay voor Fe biologische beschikbaarheid uit te voeren.
Introduction
Om de onderzoeksbehoefte en het voordeel van de Caco-2 celbioassay voor fe biologische beschikbaarheid volledig te begrijpen, moet men eerst de benaderingen begrijpen die vóór de komst van dit model van kracht waren. Het meten van de biologische beschikbaarheid van fe fe uit een levensmiddel of maaltijd in vivo is een uitdagende taak, vooral wanneer combinaties van voedsel moeten worden beoordeeld in een maaltijd of dieet. Isotopische etikettering is de afgelopen 50 jaar de meest gebruikelijke benadering geweest voor het meten van de biologische beschikbaarheid van fe1. Isotopische etikettering wordt gebruikt voor studies met één maaltijd en meerdere maaltijden en is onpraktisch voor langetermijnstudies. Stabiele isotopen van Fe zoals 57Fe en 58Fe worden het meest gebruikt; er zijn echter studies uitgevoerd met radio-isotopen zoals 59Fe, waarbij gebruik wordt gemaakt van het tellen van het hele lichaam2. Voor plantaardig voedsel is isotopische etikettering gedaan via extrinsieke of intrinsieke etikettering. Voor extrinsieke etikettering wordt een bekende hoeveelheid isotoop aan het voedsel of de maaltijd toegevoegd. Het voedsel wordt vervolgens gemengd en een evenwichtsperiode van 15-30 minuten wordt opgenomen in het protocol voorafgaand aan de consumptie. Hydroponische cultuur - het toevoegen van de isotoop aan de voedingsoplossing om het in de plant op te nemen terwijl het groeit en zich ontwikkelt - is vereist voor de intrinsieke etikettering van plantaardig voedsel. De voor- en nadelen van elke aanpak worden hieronder besproken.
Extrinsieke isotopische etikettering
In het begin tot het midden van de jaren 1970 werd de menselijke Fe-absorptie bestudeerd door extrinsieke etikettering van Fe in voedingsmiddelen, waarbij een bekende hoeveelheid isotoop wordt toegevoegd aan de bekende hoeveelheid Fe in het voedsel of de maaltijd, gemengd en in evenwicht gebracht gedurende 15-30 minuten vóór de metingen. Er zijn verschillende hoeveelheden extrinsieke isotopen gebruikt, variërend van 1% tot 100% van de intrinsieke Fe, maar meestal in het bereik van 7% -30% 3. Extrinsieke etikettering is gebaseerd op de veronderstelling dat de extrinsieke Fe-isotoop volledig in evenwicht wordt gebracht met de intrinsieke Fe van het voedsel of de maaltijd. Extrinsieke isotoopabsorptie wordt vervolgens gemeten en elk atoom van de extrinsieke isotoop wordt berekend om een bepaald aantal intrinsieke Fe-atomen te vertegenwoordigen. Deze berekening is gebaseerd op de relatieve molaire bedragen. In 1983 werden meerdere validatiestudies van de techniek samengevat in een overzichtsartikel4. Validatie van de techniek werd gedaan door tegelijkertijd de procentuele absorptie van het extrinsieke isotopische label te vergelijken met de procentuele absorptie van een intrinsiek isotopisch label. Een verhouding van de extrinsieke tot intrinsieke absorptie dicht bij 1 suggereert dus dat elke pool van Fe gelijkelijk werd geabsorbeerd. In die tijd werd een verhouding dicht bij 1 ook beschouwd als een evenwicht tussen de extrinsieke isotoop en de intrinsieke Fe van het voedsel of de maaltijd. Verhoudingen van extrinsieke tot intrinsieke Fe-absorptie varieerden van gemiddelde waarden van 0,40 tot 1,62, met een gemiddelde (±SD) ratio van 1,08 ± 0,14 in 63 vergelijkingen. Het is belangrijk op te merken dat in alle studies die in deze review worden samengevat, geen enkele direct de equilibratie van het extrinsieke label met de intrinsieke Fe heeft getest. Samenvattend concludeerden de auteurs van de review het volgende:
"De extrinsieke tagtechniek is geldig gebleken voor verschillende voedingsmiddelen onder bepaalde experimentele omstandigheden. Maar deze methode kan nog niet als bewezen worden beschouwd met betrekking tot alle soorten voedsel. De extrinsieke tagmethode is niet geschikt voor het controleren van de ijzerabsorptie van een dieet dat onoplosbare vormen van ijzer bevat. De validiteit van deze techniek is gebaseerd op de basisaanname dat de extrinsieke tag volledig wordt uitgewisseld met alle endogene nonheme voedselijzers. Op dit moment is niet bekend hoe volledig de verschillende vormen van nonheme ijzer worden gelabeld door een extrinsieke tag. Dit is belangrijk in het licht van studies die hebben gesuggereerd dat ijzerremmers de extrinsieke tag anders kunnen beïnvloeden dan sommige vormen van nonheme ijzer in voedingsmiddelen. Onderzoek naar voedselfactoren die een volledige isotopische uitwisseling kunnen belemmeren, is schaars. De interpretatie van gegevens over de biologische beschikbaarheid van extrinsieke tag-onderzoek vereist dus dat rekening wordt gehouden met remmers van uitwisseling die aanwezig kunnen zijn in het voedsel of dieet. "
Sinds 1983 zijn er slechts twee studies gepubliceerd die de nauwkeurigheid van extrinsieke etikettering van Fe 3,5 evalueerden. In beide studies werd de equilibratie van een extrinsiek isotopisch etiket direct vergeleken met de intrinsieke Fe van de voedingsmiddelen, die in deze studies basisvoedselgewassen waren. Witte, rode en zwarte bonenvariëteiten werden getest, samen met linzen en maïs. Met behulp van gevestigde in vitro verteringstechnieken en de meting van fe-oplosbaarheid en neerslag, toonden beide studies aan dat extrinsieke isotopische etikettering niet consequent resulteert in volledige evenwicht, met bewijs dat voor sommige bonenvariëteiten de misequilibratie zeer hoog kan zijn, afhankelijk van de hoeveelheid extrinsieke isotoop en zaadlaagkleur3. Ondanks de conclusies van het overzichtsartikel van 1983, gingen extrinsieke etiketteringsstudies van bonen doormet 6,7,8,9,10,11,12. Geen van deze studies omvatte het testen van de equilibratie van het extrinsieke label met de intrinsieke Fe.
Intrinsieke etikettering
Intrinsieke etikettering van plantaardig voedsel voor de beoordeling van de biologische beschikbaarheid van fe elimineert de nauwkeurigheidsproblemen van equilibratie bij extrinsieke etikettering. Deze aanpak kan echter geen grote hoeveelheden materiaal opleveren vanwege de behoefte aan kasruimte voor hydrocultuur. Hydrocultuur is arbeidsintensief, vereist een grote hoeveelheid dure stabiele isotoop en resulteert vaak in plantengroei die verschilt in termen van opbrengst en zaad Fe-concentratie. Vanwege de kosten is intrinsieke etikettering alleen geschikt voor kleinschalige studies gericht op het begrijpen van mechanismen die ten grondslag liggen aan Fe-opname of factoren die de opname van Fe uit voedingsmiddelen beïnvloeden. De productie van 1-2 kg van een basisvoedselgewas kost ongeveer $ 20.000 - $ 30.000 voor materialen alleen, afhankelijk van de isotoop- en hydrocultuurbenadering13,14.
Gezien de uitdagingen die gepaard gaan met isotopische etikettering, probeerden onderzoekers in vitro benaderingen te ontwikkelen. Vroege methoden gebruikten gesimuleerd maag- en darmvoedsel, gekoppeld aan de meting van fe-oplosbaarheid of fe-dialyseerbaarheid als een schatting van de biologische beschikbaarheid15. Dergelijke studies toonden al snel aan dat fe-dialyseerbaarheid geen consistente maat was voor de biologische beschikbaarheid, omdat Fe oplosbaar kan zijn, nauw gebonden aan verbindingen en daarom niet uitwisselbaar, wat leidt tot de overschatting van de biologische beschikbaarheid. Om deze problemen aan te pakken, evolueerde de methodologie om een menselijke darmcellijn te gebruiken, waardoor een levende component werd toegevoegd en de meting van Fe-opnamemogelijk werd gemaakt 16. De menselijke darmcellen - Caco-2-cellen - zijn afkomstig van een humaan darmcarcinoom en zijn op grote schaal gebruikt in voedingsopnamestudies. Deze cellijn is nuttig omdat de cellen in cultuur differentiëren tot enterocyten die op dezelfde manier functioneren als de borstelrandcellen van de dunne darm. Studies hebben aangetoond dat Caco-2-cellen de juiste transporters en respons op factoren vertonen die fe-opnamebeïnvloeden 17,18.
De eerste studies, waarbij radio-isotopen werden gebruikt om fe-opname in Caco-2-cellen te meten, werden verfijnd om fe-opname te meten op basis van caco-2-celferritinevorming. Caco-2-celferritinemeting verbeterde de monsterdoorvoer en elimineerde problemen met de behandeling van radio-isotopen en de equilibratie van extrinsieke Fe met intrinsieke Fe19,20. Meting van fe-opname via ferritinevorming stelde onderzoekers in staat om een breed scala aan voedingsmiddelen te bestuderen, waaronder complexe maaltijden21. Gesimuleerde (in vitro) spijsvertering in combinatie met Caco-2 cel Fe opname zorgde dus voor een betere fysiologische beoordeling van Fe opname uit voedingsmiddelen. Het is belangrijk op te merken dat dit model voornamelijk relatieve verschillen in fe biologische beschikbaarheid bepaalt. Zoals veel nuttige cellijnen, hebben Caco-2-cellen ook variabiliteit in responsiviteit aangetoond, maar hebben ze consistente relatieve verschillen in Fe-opname tussen voedingsmiddelen behouden. Een goede techniek en zorgvuldige aandacht voor detail kunnen de consistente reactie op celferritinevorming in Caco-2-cellen verbeteren.
Het in vitro digestie/Caco-2 celmodel staat ook bekend als Caco-2 cel bioassay. Deze test is grondig gevalideerd via directe vergelijking met studies bij mens en dier22. Naast de directe parallelle vergelijking van de bioassay met menselijke werkzaamheidsproeven, is aangetoond dat dit model een kwalitatief vergelijkbare respons vertoont in Fe-opname als die van mensen 18,19,23. Daarom, als een in vitro benadering, rechtvaardigt de Caco-2 cel bioassay een hoge geloofwaardigheid als een screeningsinstrument voor het evalueren van Fe-voeding uit voedingsmiddelen. Het is op grote schaal toegepast op tal van voedingsmiddelen en voedingsmiddelen 21,24,25,26,27,28.
Sinds de oprichting in 1998 heeft de Caco-2-celbioassay het gebied van Fe-voeding vooruitgeholpen, omdat het heeft geholpen bij het identificeren van factoren die de intestinale Fe-opname beïnvloeden. Daarbij heeft dit model onderzoeksdoelstellingen ontwikkeld en verfijnd voor meer definitieve en minder kostbare menselijke studies. Men zou ook kunnen stellen dat het gebruik van het model de noodzaak van sommige menselijke proeven tenietdoet.
Samenvattend kan de relatieve levering van Fe uit een voedingsmiddel of maaltijd worden gemeten met de Caco-2 celbioassay. Ongeacht de hoeveelheid Fe in de testmaaltijd, definieert de bioassay de relatieve hoeveelheid Fe die in de enterocyt wordt opgenomen - de eerste stap van het absorptieproces. Dit is de belangrijkste stap in het definiëren van de biologische beschikbaarheid van Fe, omdat het meestal het doel is om te meten met de bedoeling om de voedingskwaliteit van Fe in een voedingsmiddel te verbeteren of op zijn minst te bewaken. Aangezien de ijzerstatus wordt gereguleerd door absorptie, en dus fe-opname wordt gereguleerd bij fe-deficiënte individuen om aan de voedingsbehoeften te voldoen, zijn de standaardvoorwaarden van het model zo ontworpen dat fe-opname door de cellen maximaal is. Op deze manier biedt de bioassay een echte maat voor het potentieel van het voedsel om Fe te leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Als een handig referentiepunt voor lezers, beschrijft de volgende methodologie de specifieke kweekomstandigheden en materialen die nodig zijn voor het meten van de biologische beschikbaarheid van Fe uit 20 experimentele monsters, plus de vereiste kwaliteitscontroles, in een run van de bioassay. Het verhogen van het aantal monsters boven deze capaciteit wordt niet aanbevolen vanwege de tijd die nodig is voor verschillende celkweek- en in vitro verteringsstappen binnen de bioassay.
1. Het aantal monsters kiezen
- Bepaal voor vaste of vloeibare levensmiddelen een hoeveelheid levensmiddelen die als representatief voor het te testen monster kan worden beschouwd.
- Gebruik bij het testen op fe biologische beschikbaarheid van een bonenras 100-150 g bonenzaad en verwerk deze hoeveelheid tot een homogeen monster.
- Voor vloeibare monsters zoals verrijkte sappen, melkproducten en sportdranken, moet u ervoor zorgen dat het voedsel goed is gemengd voordat u het bemonstert.
OPMERKING: De hierboven genoemde hoeveelheid bonenzaadmateriaal is essentieel om rekening te houden met de inherente verschillen tussen zaden van dit basisgewas.
2. Bereiding van monsters
- Spoel de grond en het stof van een voedselmonster af met gedestilleerd gedeïoniseerd water voordat u het verwerkt.
- Verwerk de juiste hoeveelheid monster volgens de experimentele doelstellingen, zoals door kookmethode en frezen.
OPMERKING: Voor het koken en verwerken is het van cruciaal belang om kookgerei en apparatuur te gebruiken die geen potentiële bron van verontreiniging Fe is. Roestvrijstalen apparatuur verontreinigt niet; apparatuur zoals steenmolenmolens, gietijzeren kookgerei en niet-roestvrijstalen apparatuur die Fe bevat, kan echter aanzienlijke hoeveelheden verontreiniging Fe toevoegen. Een standaard roestvrijstalen koffiemolen is vaak voldoende om te malen. - Lyofiliseer en maal tot een homogeen poeder.
OPMERKING: Eenmaal gehomogeniseerd, heeft onderzoek aangetoond dat drie onafhankelijke replicaties van analyse voldoende zijn voor elk voedsel dat wordt gemeten.- Als de homogeniteit van het monster moeilijk te bereiken is, herzie dan de formulering of verwerking van het product. Als dit niet mogelijk is, voegt u replicaties toe als de niet-homogeniteit niet ernstig is.
- Gebruik voor de meeste homogene vaste voedingsmiddelen 0,5 g gelyofiliseerd monster per replicaat. Gebruik indien nodig maximaal 1,0 g monster per replicatie, maar controleer of meer dan 0,5 g een voordeel oplevert in de mate van respons.
OPMERKING: Hoeveelheden hoger dan 0,5 g vast voedsel kunnen het dialysemembraan verstoppen (zie hieronder). - Gebruik 1-2 ml vloeistofmonsters.
OPMERKING: Lyofilisatie is vaak niet nodig voor vloeibare monsters.
3. Caco-2 celcultuur
- Stamculturen
- Koop Caco-2 cellen van een gecertificeerde leverancier.
- Kweek de cellen uit voorraadflacons bij 37 °C in een incubator met een 5% CO 2-luchtatmosfeer (constante vochtigheid) met behulp van Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 25 mM HEPES (pH 7,2), 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum-antimycotische oplossing.
- Zodra voldoende cellen beschikbaar zijn, meestal na 7-10 dagen cultuur, zaaien de cellen in niet-collageen-gecoate kolven met een dichtheid van 30.000 cellen / cm2.
- Kies de flesgrootte afhankelijk van het aantal beschikbare cellen dat nodig is voor het zaaien van multiwellplaten.
OPMERKING: Over het algemeen werken de T225 (225 cm2) kolven het beste voor experimenten waarbij 11 multiwell (6-well; 9,66 cm2/well) platen worden gebruikt (10 platen voor monstervergelijkingen, 1 plaat voor kwaliteitscontroles) per bioassay. - Kweek cellen in kolven gedurende 7 dagen, verander het medium om de andere dag en gebruik op de7e dag voor het zaaien van de multiwell-platen.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een passagebereik van niet meer dan 10-15 passages te gebruiken vanaf het moment dat de cellen worden gestart vanuit de stamcultuur en vervolgens worden gebruikt in een reeks experimenten. Celkweekpassages moeten worden beperkt, omdat een breed scala aan passages kan leiden tot adaptieve veranderingen in de cellijn en dus variabiliteit in de respons van het model.
- Celkweek op multiwell platen
- Zaai de Caco-2 cellen met een dichtheid van 50.000 cellen/cm2 in 6-well collageen-gecoate platen.
OPMERKING: Deze stap werkt meestal het beste als deze op een woensdag wordt uitgevoerd. De volgende stappen zullen duidelijk maken waarom deze dag van de week optimaal is. - Laat de cellen gedurende 12 dagen groeien bij 37 °C in een incubator met een 5% CO 2-luchtatmosfeer (constante vochtigheid) met DMEM aangevuld met 25 mM HEPES (pH 7,2), 10% (v/v) FBS en 1% antibioticum-antimycotische oplossing.
OPMERKING: Het kweken van de celmonolagen langer dan 12 dagen kan leiden tot celovergroei. Eerder onderzoek heeft duidelijk aangetoond dat, onder deze omstandigheden, 12 dagen na het zaaien, de celmonolaag volwassen is, goed aan de plaat is bevestigd en optimaal is in de consistentie van respons 29,30,31. Het langer laten groeien van de cellen, zoals tot 19-21 dagen, resulteert in celovergroei en de media putten snel voedingsstoffen uit, wat resulteert in ongezonde monolagen. - Verander tijdens de periode van 12 dagen het medium ten minste om de 2 dagen volgens een consistent dagelijks schema.
- Vervang op de12e dag na het zaaien het kweekmedium door 2 ml Minimum Essential Medium (MEM [pH 7]) aangevuld met 10 mM PIPES (piperazine-N,N'-bis-[2-ethaansulfonzuur]), 1% antibioticum-antimycotische oplossing, hydrocortison (4 mg/l), insuline (5 mg/l), selenium (5 μg/l), triiodothyronine (34 μg/l) en epidermale groeifactor (20 μg/l).
OPMERKING: Als het zaaien op een woensdag werd gestart, zou de12e dag een maandag zijn. - Verwijder de volgende dag (d.w.z. dag 13) de MEM en vervang deze door 1 ml MEM (pH 7).
OPMERKING: Deze stap zou op een dinsdag plaatsvinden. Dit is de dag waarop de bioassay begint; het 13-daagse schema levert dus het voordeel op van een consistent weekschema, waardoor de bioassay consistent op dezelfde weekdag kan worden uitgevoerd.
- Zaai de Caco-2 cellen met een dichtheid van 50.000 cellen/cm2 in 6-well collageen-gecoate platen.
4. In vitro vertering
- Voorbereiding van wisselplaatringen
- Maak een gesteriliseerde inzetring met behulp van een siliconen O-ring uitgerust met een zuurgewassen dialysemembraan (figuur 1A).
OPMERKING: Bereid inserts 1 dag van tevoren (d.w.z. maandag, dag 12) van de dag van de bioassay en bewaar ze in 18 MΩ water bij 4 °C totdat ze klaar zijn voor gebruik. - Verwijder op de dag van de bioassay (dinsdag, dag 13) de inzetstukken uit de koelkast, giet af en vervang het water door 0,5 M HCl. Laat het op kamertemperatuur in een laminaire stromingskap gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd voordat de MEM uit de kweekplaten wordt verwijderd. Zure spoeling van het membraan dient om mogelijke besmetting Fe te verwijderen en steriliseert de insteekring en het membraan. - Giet de 0,5 M HCl af van de inzetstukken en spoel af met steriel water van 18 MΩ. Bewaren in steriel water van 18 MΩ bij kamertemperatuur in een laminaire stromingskap totdat het klaar is voor gebruik.
- Plaats een ring in elke put van de 6-well platen met Caco-2 cellen, waardoor een tweekamersysteem ontstaat. Breng de platen met de inzetstukken terug naar de couveuse.
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd net nadat vers 1,0 ml MEM aan elke put is toegevoegd (zie stap 3.2.5.).
- Maak een gesteriliseerde inzetring met behulp van een siliconen O-ring uitgerust met een zuurgewassen dialysemembraan (figuur 1A).
- Bereiding van pepsine-oplossing
- Bereid op de dag van het experiment de pepsine-oplossing door 0,145 g pepsine op te lossen in 50 ml 0,1 M HCl. Schud de oplossing voorzichtig op een platformschudder gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereiding van pancreatine-galoplossing
- Bereid op dezelfde dag als het experiment 0,1 M NaHCO3 door 2,1 g NaHCO3 op te lossen in 250 ml water van 18 MΩ.
- Meng 0,35 g pancreatine en 2,1 g galextract in 175 ml 0,1 M NaHCO3.
- Zodra de pancreatine en het galextract zijn opgelost, voegt u 87,5 g van een zwakke kationenuitwisselingshars toe (zie de tabel met materialen) en mengt u door gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te schudden.
- Giet de drijfmest in een grote kolom en verzamel het eluaat.
- Eluteer de kolom met een extra 70 ml van 0,1 M NaHCO3 en verzamel dit volume in de galoplossing van de pancreas.
OPMERKING: Het doel van de hars is om verontreiniging Fe te verwijderen die vaak wordt aangetroffen in de pancreas-galextracten.
- In vitro vertering initiëren.
- Weeg het monster af in een steriele centrifugebuis van 50 ml (polypropyleen), gevolgd door de toevoeging van 10 ml fysiologische zoutoplossing bij pH 2, met 140 mM NaCl en 5 mM KCl.
- Start het maagvergistingsproces door 0,5 ml van de bereide pepsine-oplossing van het varkens aan het monster toe te voegen en gedurende 1 uur bij 37 °C op een schommelschudder op een lage, zachte stand te incuberen.
- Start na deze periode het intestinale verteringsproces van elk monster door de pH aan te passen aan 5,5-6,0 met 1,0 M NaHCO3.
- Voeg 2,5 ml van de pancreatine-galoplossing toe aan elke monsterbuis en pas de pH aan op 6,9-7,0 met 1,0 M NaHCO3.
- Zodra de pH is aangepast, egaliseert u het volume in elke buis met behulp van 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6,7) oplossing, waarbij het gewicht van de buis wordt gemeten met een streefwaarde van 15 g.
OPMERKING: Voor sommige voedingsmiddelen kan het nodig zijn om het totale volume op 16 g of 17 g te brengen, afhankelijk van de buffercapaciteit van de voedingsmiddelen. - Breng 1,5 ml van elke darmvertering over in de bovenste kamer (d.w.z. met de inbrengring met het dialysemembraan) van een overeenkomstige put van de 6-well kweekplaat met de Caco-2-cellen (figuur 1B).
- Vervang het plaatdeksel en incubeer bij 37 °C (5% CO2 luchtatmosfeer) op een schommelende schudder met 6 oscillaties/min gedurende 2 uur.
- Verwijder de insteekring met de digest en voeg een extra 1 ml MEM (pH 7) toe aan elk putje.
- Breng de celkweekplaat terug naar de incubator (37 °C; 5% CO2 luchtatmosfeer) gedurende nog eens 22 uur.
- Verwijder na 22 uur het celkweekmedium en voeg 2,0 ml 18 MΩ water toe aan de celmonolaag.
OPMERKING: Het water zal osmotisch de cellen lyseren. - Oogst het volledige cellysaat in standaard polypropyleen microcentrifugebuizen of vergelijkbaar voor daaropvolgende celeiwit- en celferritineanalyses.
5. Meting van Caco-2 cel ferritine en celeiwit
- Gebruik het celllysaat uit stap 4.4.10. voor de meting van celferritine en eiwit.
- Om het ferritinegehalte van de Caco-2-cellen te meten, volgt u de instructies van de kit (zie de tabel met materialen), met uitzondering van het verhogen van de incubatietijd van 30 minuten tot 2 uur voor het muisanti-ferritine antilichaam-mierikswortelperoxidase (HRP) conjugaat.
- Om celeiwit te meten, volgt u de instructies in de celeiwitkit (zie de tabel met materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identificatie en meting van de biologische beschikbaarheid van fe in basisvoedselgewassen
Een van de belangrijkste redenen voor het ontwikkelen van dit model was om factoren te identificeren die van invloed zijn op de biologische beschikbaarheid van fe in basisvoedselgewassen en een hulpmiddel te bieden voor plantenveredelaars waarmee ze rassen met verbeterde fe-biologische beschikbaarheid kunnen identificeren en ontwikkelen. De gewone boon (Phaseolus vulgaris) is wereldwijd doelwit geweest als gewas voor Fe-biofortificatie; daarom is het model uitgebreid toegepast om de voedingskwaliteit van Fe te evalueren in een breed scala aan bonenmarktklassen en bonenveredelingsprogramma's. Gele bonen zijn bijvoorbeeld een opkomende marktklasse in de Verenigde Staten. In regio's zoals Oost-Afrika zijn ze zeer populair en staan ze algemeen bekend als snel kokend en door velen beschouwd als 'gemakkelijk te verteren'. Recente studies met de Caco-2 celbioassay hebben aangetoond dat bepaalde variëteiten van gele bonen een hoge fe biologische beschikbaarheid kunnen hebben in vergelijking met andere kleurklassen (figuur 2). In deze studie werden de Manteca-variëteiten geïdentificeerd als hoog in fe biologische beschikbaarheid ten opzichte van referentiecontroles van de witte en roodgevlekte kleurklassen. Bovendien waren de resultaten consistent over twee opeenvolgende oogstjaren. Dergelijke vergelijkingen zijn eenvoudigweg niet haalbaar in andere modellen, met name in vivo modellen, vanwege de hoge kosten en de veel lagere doorvoer van dier- en menselijke proeven.
Evaluatie van voedselverwerkende effecten op de biologische beschikbaarheid van fe
De Caco-2 cel bioassay kan ook worden toegepast om voedselverwerkingseffecten op fe biologische beschikbaarheid te evalueren. De resultaten in figuur 3 zijn bijvoorbeeld afkomstig van een analyse van bonen en pasta op basis van bonen van meerdere kleurklassen. De resultaten tonen aan hoe het verwerken van de bonen tot een meel de biologische beschikbaarheid van fe verhoogde van witte (Snowdon, Alpena en Samurai) en gele (Canario) bonenvariëteiten. Voor de cranberry (Etna), rode nier (Red Hawk) en zwarte (Zenith) variëteiten, fe biologische beschikbaarheid verminderd in de pastameelbereidingen. Gerelateerde analyses toonden aan dat het verwerken van de bonen tot een meel de zaadlobbencelwanden van de bonen verstoorde, waardoor de intracellulaire Fe toegankelijk werd voor opname. De ijzeropname nam toe in de witte en gele bonenpasta omdat de zaadlagen van deze variëteiten geen polyfenolische verbindingen bevatten die de biologische beschikbaarheid van fe remmen. Daarentegen bevatten de zaadlagen van cranberry, rode nieren en zwarte bonen hoge niveaus van remmende polyfenolen, waardoor de fe-opname afneemt. Deze resultaten geven duidelijk het nut van het model aan bij het blootleggen van factoren die de voedingskwaliteit van Fe kunnen beïnvloeden, die anders onopgemerkt zouden blijven.
Figuur 1: Ringopstelling voor Caco-2-cel Fe-opname invoegen. (A) Afbeelding van Caco-2-cellen en ring met bevestigd dialysemembraan. (B) Schema van de algemene procedure voor in vitro vertering in combinatie met Caco-2 cel Fe opname binnen een enkele put van de multi-well plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: IJzerbiobeschikbaarheidsscores van ongesopende en gekookte genotypen van hele zaden in een divers panel van gele bonen. (A) Veldseizoen 2015; (B) veldseizoen 2016. Waarden zijn gemiddelden (standaarddeviatie) van drievoudige metingen van twee veldreplicaties per genotype (n = 6). Genotypen worden gecategoriseerd op de x-as per kookles, gerangschikt van het snelst kokende genotype tot de langzaamste kookingang. *Aanzienlijk lagere (p < 0,05) ijzerbiobeschikbaarheidsscore dan de andere YBP-vermeldingen. **Significant hogere (p < 0,05) ijzerbiobeschikbaarheidsscores dan de andere YBP-genotypen. Dit cijfer is gewijzigd van32. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Biologische beschikbaarheid van ijzer, uitgedrukt als Caco-2-celferritinevorming (nanogram ferritine per milligram celeiwit) van bonenvariëteiten en hun overeenkomstige spaghetti's op basis van bonen. (A) Drie witte bonenvariëteiten en hun overeenkomstige spaghetti's op basis van bonen; B) vier gekleurde bonenvariëteiten en de bijbehorende spaghetti's op basis van bonen. Waarden zijn het gemiddelde (± standaarddeviatie) van zes metingen van elke variëteit. De blauwe afgebroken lijn geeft de biologische beschikbaarheid van ijzer aan van een niet-verrijkte durumtarwe pastacontrole geëxtrudeerd, gekookt en verwerkt op dezelfde manier als de spaghettis op basis van bonen. * Significant (p ≤ 0,05) hogere Caco-2 cel ferritine vorming dan hele bonen na het koken. **Significant (p ≤ 0,05) lagere Caco-2 cel ferritine vorming dan hele bonen na het koken. Dit cijfer is gewijzigd van33. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinds de oprichting zijn er talloze studies gepubliceerd die deze methode beschrijven voor de Caco-2 celbioassay. De basisvoorwaarden zijn sinds de eerste publicatie in 1998 relatief ongewijzigd gebleven18. In de afgelopen 20 jaar zijn echter tal van technische details verfijnd en gestandaardiseerd om een ongekende consistentie in de reactie van de bioassay te verkrijgen. Zorgvuldige en nauwkeurige naleving van de celkweek en in vitro verteringsvoorwaarden zijn de sleutel tot de consistente en gevoelige respons van de bioassay.
Uit onze ervaring met het trainen van talloze individuen in het gebruik van deze methode, is de meest voorkomende strijd de juiste cultuur van de Caco-2-cellen. Consistente kweek van gezonde monolagen is de sleutel tot gezonde en responsieve Caco-2 cel monolagen. Als de celeiwitniveaus niet zeer consistent zijn van goed tot goed en niet binnen het bereik van celeiwit dat in het protocol wordt vermeld, moet de onderzoeker de celkweekomstandigheden opnieuw onderzoeken op afwijking van het protocol. Als alternatief kan er sprake zijn van micro-organismen op laag niveau, kan het zijn dat de celkweekincubator niet goed werkt of dat het celkweekmedium mogelijk niet goed is geformuleerd.
Het in vitro verteringsproces is een andere bron van potentiële problemen. Verwijdering van verontreiniging Fe uit de spijsverteringsenzymen is van cruciaal belang. Ondanks claims van de fabrikant, is het verstandig om periodiek de Fe-concentratie van de enzymen te controleren en ervoor te zorgen dat het Fe-verwijderingsproces (zie protocol) effectief is. Als Fe-besmetting aanwezig is in de spijsverteringsenzymen, zal de kwaliteitscontrole van de basislijn digest celferritine opleveren die hoger is dan het aanbevolen bereik.
Een ervaren en getrainde onderzoeker moet in staat zijn om 20 experimentele monsters, plus de kwaliteitscontroles, in één run van de bioassay te analyseren. Er zijn dus ongeveer 12 zesputtenplaten nodig voor elke run van de bioassay. Hogere aantallen monsters per bioassay worden niet aanbevolen omdat de timing voor pH-titratie tijdens het verteringsproces te lang kan zijn, wat leidt tot mogelijke inconsistentie tussen de verteringstijden van monsters.
De nadelen van dit model zijn relatief klein. Het vereist onderzoekers die zeer bekwaam zijn in celkweek en in staat zijn tot nauwkeurige aandacht voor detail en protocol. De laboratoriumruimte moet schoon zijn van bronnen van Fe-verontreiniging en reagentia en andere materialen moeten routinematig op Fe-verontreiniging worden gecontroleerd. De gebruiker moet dus de mogelijkheid of toegang hebben tot instrumenten voor het meten van de Fe-concentratie. Dit model is slechts een relatieve of semi-kwantitatieve maat. Met het juiste gebruik van referentiecontroles kan het model echter enkele kwantitatieve schattingen van fe-absorptie opleveren. Er is inderdaad een conversievergelijking van absorptieverhoudingen van controle versus testmateriaal gegenereerd19.
De bioassay werkt volgens het volgende principe: Caco-2 cellen produceren meer ferritine-eiwit als reactie op verhogingen van cellulaire Fe-concentraties. Daarom is de biologische beschikbaarheid van fe evenredig met de toename van de productie van Caco-2-celferritine. Deze toename wordt uitgedrukt als een verhouding van celferritine tot totaal Caco-2-celeiwit (nanogram ferritine per milligram totaal celeiwit) na blootstelling aan een verteerd monster19. Ferritinemetingen worden uitgevoerd met behulp van een ELISA-kit (zie de tabel met materialen) getest op respons in deze bioassay. De totale celeiwitconcentraties worden gekwantificeerd met behulp van een eiwittestkit. Zoals eerder vermeld, variëren onder de omstandigheden die voor deze methode worden gebruikt, typische Caco-2-celeiwitniveaus in een zesputtenplaat van 2,0 mg tot 2,6 mg celeiwit per put. Waarden buiten dit bereik duiden op ongezonde celculturen, mogelijke overgroei van cellen of slechte celzaaitechniek. Binnen een bepaalde run van de bioassay mogen de waarden slechts variëren tot 0,2 mg per put. Bovendien is er onder de zaaidichtheden en kweekomstandigheden die in deze methodologie worden gebruikt, een aanzienlijke borstelrandenzymactiviteit op 13 dagen na het zaaien, wat wijst op rijping van de meeste, zo niet alle, van de celmonolaag 28,29,30. Controleer celmonolagen gedurende de 13 dagen voorafgaand aan gebruik op verontreiniging of stress, zoals vacuolevorming of hiaten in de vorming van monolagen. Als dergelijke omstandigheden duidelijk zijn, mogen de cellen niet als geldig worden beschouwd voor gebruik in de bioassay.
Om de responsiviteit van de Caco-2 bioassay te controleren, moet elk experiment worden uitgevoerd met verschillende kwaliteitscontroles, waaronder een blanco digest, die alleen de fysiologisch uitgebalanceerde zoutoplossing en de gastro-intestinale enzymen bevat. Deze controles zorgen ervoor dat er geen Fe-besmetting in de bioassay is. Ferritinewaarden van Caco-2-cellen die worden blootgesteld aan de blanco digest variëren meestal van 1 ng tot 6 ng ferritine / mg celeiwit. Baseline ferritine in dit bereik geeft ook aan dat de cellen een relatief lage Fe-status hebben en dus maximale gevoeligheid voor beschikbare Fe moeten vertonen.
Voor de eerste 15 jaar gebruik omvatten aanvullende kwaliteitscontroles 1) een blanco digest met FeCl3 (66 μM) en 2) een blanco digest van FeCl3 (66 μM) plus de toevoeging van 1,3 mM ascorbinezuur. Ferritinewaarden voor de FeCl3 digest lagen meestal in het bereik van 30-50 ng ferritine / mg celeiwit, en de FeCl3-digest met ascorbinezuur lag in het bereik van 250-400 ng ferritine / mg celeiwit. In recentere jaren blijft de blanco digest een kwaliteitscontrole; we zijn echter overgestapt op het gebruik van een voedselmonster met en zonder ascorbinezuur in een verhouding van 20:1, ascorbaat:Fe. Het gebruikte voedselmonster was een wit bonenmeel dat ongeveer 65 μg Fe / g monster bevat. Deze kwaliteitscontroles geven een smaller en consistenter responsbereik, wat 20-30 ng ferritine / mg celeiwit voor het witte bonenmeel en 70-150 ng ferritine / mg celeiwit oplevert voor het witte bonenmeel plus ascorbaat. Opgemerkt moet worden dat het nieuwe bereik van waarden afkomstig is van de referentiekit in de tabel met materialen, die meestal iets lager is dan de nu ter ziele gegane Ramco ELISA-kit. Vanaf de publicatie van dit manuscript zijn slechts 2-3 maanden aan gegevens verkregen met de gerefereerde kit.
Het is belangrijk om de resultaten en celkweekcondities te herkennen die wijzen op een ongeldige of suboptimale run van de bioassay. Ten eerste, zoals vermeld in de methoden, als de blanco digest-omstandigheden celferritineconcentraties opleveren die hoger zijn dan het voorgestelde bereik, kan dit wijzen op Fe-besmetting van de celkweekmedia, de spijsverteringsenzymen of het dialysemembraan. Aanvaardbare Fe-concentraties voor de celkweekmedia en de spijsverteringsenzymen zijn < 20 μg Fe/ml. Waarden buiten het bereik voor de andere kwaliteitscontroles, vooral als ze aan de lage kant zijn, geven ook aan dat de validiteit van de resultaten twijfelachtig is.
Samenvattend is dit model zeer gevoelig voor biologisch beschikbare Fe, omdat de celkweekomstandigheden zijn ontworpen om cellen met een lage Fe-status te creëren; hun mechanismen voor fe-opname zijn dus sterk gereguleerd. Het is een robuust model dat in staat is tot een hoge doorvoer. Elk voedsel of dieet dat aan mensen kan worden gevoerd, kan in dit model worden beoordeeld en daarom heeft de bioassay een breed scala aan toepassingen. Plantenveredelaars kunnen dit model gebruiken om de biologische beschikbaarheid van Fe in basisvoedingsmiddelen te meten, waarbij eigenschappen en chromosomale regio's worden geïdentificeerd die de biologische beschikbaarheid van fe beïnvloeden. Voedingswetenschappers kunnen het model toepassen om optimale formuleringen te bepalen en de effecten van verwerking te evalueren om een adequate biologische beschikbaarheid van fe te garanderen. Voedingsdeskundigen kunnen het model gebruiken om de biologische beschikbaarheid van fe fe te evalueren en te controleren van individuele voedingsmiddelen, voedselcombinaties en zelfs dieetplannen. Het is grondig gevalideerd voor menselijke proeven en voorspelt correct de richting en omvang van de effecten in elke toepassing. Door gesimuleerde spijsvertering te combineren met intestinale epitheelcel Fe-opname, vertegenwoordigt dit model dus de kritieke eerste stap in het Fe-absorptieproces en is het daarom in staat om de levering of biologische beschikbaarheid van Fe uit voedingsmiddelen te voorspellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteur is zeer dankbaar voor de technische inspanningen van Yongpei Chang en Mary Bodis. De uiterst succesvolle toepassing van dit model op het gebied van voeding is een direct gevolg van hun expertise en aandacht voor detail. De ontwikkeling van dit model werd volledig gefinancierd door het Amerikaanse ministerie van Landbouw, Agricultural Research Service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
References
- Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
- Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
- Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
- Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
- Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
- Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
- Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
- Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
- Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
- Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
- Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
- Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
- Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
- Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O'Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
- Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
- Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
- Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
- Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
- Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
- Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
- Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
- Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
- Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
- Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
- Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
- Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
- Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
- Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
- Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).
