Summary
Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità del ferro (Fe) rappresenta un approccio economico e versatile per valutare la biodisponibilità del Fe da alimenti, prodotti alimentari, integratori, pasti e persino regimi dietetici. Completamente validato per studi sull'uomo, rappresenta lo stato dell'arte per gli studi sulla biodisponibilità del Fe.
Abstract
La conoscenza della biodisponibilità del Fe è fondamentale per la valutazione della qualità nutrizionale della Fe negli alimenti. La misurazione in vivo della biodisponibilità del Fe è limitata dai costi, dalla produttività e dalle avvertenze inerenti all'etichettatura isotopica del Fe alimentare. Pertanto, esiste una necessità critica per un approccio che sia ad alto rendimento ed economico. Il biotest sulle cellule Caco-2 è stato sviluppato per soddisfare questa esigenza. Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità di Fe utilizza la digestione gastrica e intestinale simulata accoppiata con la coltura di una linea cellulare epiteliale intestinale umana nota come Caco-2. Nelle cellule Caco-2, l'assorbimento di Fe stimola la formazione intracellulare di ferritina, una proteina di stoccaggio del Fe facilmente misurabile mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). La ferritina si forma in proporzione all'assorbimento di Fe; quindi, misurando la produzione di ferritina cellulare Caco-2, è possibile valutare l'assorbimento intestinale di Fe da digerimenti alimentari simulati nell'enterocita.
Attraverso questo approccio, il modello replica il passaggio iniziale chiave che determina la biodisponibilità del Fe alimentare. Fin dal suo inizio nel 1998, questo approccio modello è stato rigorosamente confrontato con fattori noti per influenzare la biodisponibilità umana di Fe. Inoltre, è stato applicato in studi paralleli, con tre studi di efficacia umana che valutano le colture biofortificate Fe. In tutti i casi, il biotest ha previsto correttamente le quantità relative di biodisponibilità di Fe dai fattori, dalle colture e dalla dieta generale. Questo articolo fornisce metodi dettagliati sulla coltura cellulare di Caco-2 accoppiata con il processo di digestione in vitro e l'ELISA della ferritina cellulare necessari per condurre il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità di Fe.
Introduction
Per comprendere appieno la necessità di ricerca e il beneficio del saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità di Fe, è necessario prima comprendere gli approcci che erano in atto prima dell'avvento di questo modello. La misurazione della biodisponibilità del Fe da un alimento o pasto in vivo è un compito impegnativo, in particolare quando le combinazioni di alimenti devono essere valutate in un pasto o in una dieta. L'etichettatura isotopica è stato l'approccio più comune per la misurazione della biodisponibilità del Fe negli ultimi 50 anni1. L'etichettatura isotopica viene utilizzata per studi a pasto singolo e multipasto ed è poco pratica per studi a lungo termine. Gli isotopi stabili di Fe come 57Fe e 58Fe sono i più comunemente usati; tuttavia, sono stati condotti studi con radioisotopi come 59Fe, utilizzando il conteggio di tutto il corpo2. Per gli alimenti vegetali, l'etichettatura isotopica è stata effettuata tramite etichettatura estrinseca o intrinseca. Per l'etichettatura estrinseca, una quantità nota di isotopo viene aggiunta al cibo o al pasto. Il cibo viene quindi miscelato e un periodo di equilibrio di 15-30 minuti viene incorporato nel protocollo prima del consumo. La coltura idroponica - aggiungendo l'isotopo alla soluzione nutritiva per incorporarla nella pianta mentre cresce e si sviluppa - è necessaria per l'etichettatura intrinseca degli alimenti vegetali. I pro e i contro di ciascun approccio sono discussi di seguito.
Etichettatura isotopica estrinseca
Nella prima metà degli anni 1970, l'assorbimento umano di Fe è stato studiato mediante etichettatura estrinseca di Fe negli alimenti, in cui una quantità nota di isotopo viene aggiunta alla quantità nota di Fe nel cibo o nel pasto, miscelata ed equilibrata per 15-30 minuti prima delle misurazioni. Sono state utilizzate varie quantità di isotopi estrinseci, che vanno dall'1% al 100% del Fe intrinseco, ma più comunemente nell'intervallo 7%-30%3. L'etichettatura estrinseca si basa sul presupposto che l'isotopo Fe estrinseco sia completamente equilibrato con il Fe intrinseco del cibo o del pasto. Viene quindi misurato l'assorbimento isotopico estrinseco e ogni atomo dell'isotopo estrinseco viene calcolato per rappresentare un dato numero di atomi di Fe intrinseci. Questo calcolo si basa sulle quantità molari relative. Nel 1983, diversi studi di convalida della tecnica sono stati riassunti in un documento di revisione4. La convalida della tecnica è stata effettuata confrontando simultaneamente l'assorbimento percentuale dell'etichetta isotopica estrinseca con l'assorbimento percentuale di un'etichetta isotopica intrinseca. Pertanto, un rapporto tra l'assorbimento estrinseco e quello intrinseco vicino a 1 suggerisce che ogni pool di Fe è stato ugualmente assorbito. All'epoca, un rapporto vicino a 1 era anche considerato rappresentare l'equilibrio dell'isotopo estrinseco con il Fe intrinseco del cibo o del pasto. I rapporti tra assorbimento estrinseco e intrinseco di Fe variavano da valori medi di 0,40 a 1,62, con un rapporto medio (±SD) di 1,08 ± 0,14 in 63 confronti. È importante notare che, in tutti gli studi riassunti in questa recensione, nessuno ha testato direttamente l'equilibrio dell'etichetta estrinseca con il Fe intrinseco. In sintesi, gli autori della revisione hanno concluso quanto segue:
"La tecnica del tag estrinseco si è dimostrata valida per diversi alimenti in determinate condizioni sperimentali. Ma questo metodo non può ancora essere considerato provato per quanto riguarda tutti i tipi di alimenti. Il metodo del tag estrinseco non è appropriato per monitorare l'assorbimento del ferro da una dieta che contiene forme insolubili di ferro. La validità di questa tecnica si basa sul presupposto di base che il tag estrinseco si scambia completamente con tutto il ferro alimentare nonheme endogeno. Al momento non è noto quanto completamente le diverse forme di ferro nonheme siano etichettate da un tag estrinseco. Questo è importante alla luce di studi che hanno suggerito che gli inibitori del ferro possono influenzare il tag estrinseco in modo diverso rispetto ad alcune forme di ferro nonheme negli alimenti. La ricerca sui fattori alimentari che possono compromettere uno scambio isotopico completo è scarsa. Pertanto, l'interpretazione dei dati di biodisponibilità dalla ricerca sui tag estrinseci richiede la considerazione degli inibitori dello scambio che possono essere presenti nel cibo o nella dieta".
Dal 1983 sono stati pubblicati solo due studi che hanno valutato l'accuratezza dell'etichettatura estrinseca di Fe 3,5. In entrambi questi studi, l'equilibrio di un'etichetta isotopica estrinseca è stato direttamente confrontato con il Fe intrinseco degli alimenti, che, in questi studi, erano colture alimentari di base. Sono state testate varietà di fagioli bianchi, rossi e neri, insieme a lenticchie e mais. Utilizzando tecniche di digestione in vitro consolidate e la misurazione della solubilità e della precipitazione del Fe, entrambi gli studi hanno dimostrato che l'etichettatura isotopica estrinseca non porta costantemente a un completo equilibrio, con evidenza che, per alcune varietà di fagioli, il disequilibrio può essere molto elevato a seconda della quantità di isotopo estrinseco e del colore del rivestimento del seme3. Nonostante le conclusioni del documento di revisione del 1983, gli studi di etichettatura estrinseca dei fagioli sono continuati 6,7,8,9,10,11,12. Nessuno di questi studi includeva la verifica dell'equilibrio dell'etichetta estrinseca con il Fe intrinseco.
Etichettatura intrinseca
L'etichettatura intrinseca degli alimenti vegetali per la valutazione della biodisponibilità del Fe elimina i problemi di accuratezza dell'equilibrio nell'etichettatura estrinseca. Tuttavia, questo approccio non può produrre grandi quantità di materiale a causa della necessità di spazio in serra per la coltura idroponica. La coltura idroponica è laboriosa, richiede un'elevata quantità di isotopi stabili costosi e spesso si traduce in una crescita delle piante diversa in termini di resa e concentrazione di Fe del seme. A causa del costo, l'etichettatura intrinseca è adatta solo per studi su piccola scala volti a comprendere i meccanismi alla base dell'assorbimento di Fe o i fattori che influenzano l'assorbimento di Fe dagli alimenti. La produzione di 1-2 kg di una coltura alimentare di base costa circa $ 20.000- $ 30.000 per i soli materiali, a seconda dell'isotopo e dell'approccio idroponico13,14.
Date le sfide associate all'etichettatura isotopica, i ricercatori hanno cercato di sviluppare approcci in vitro. I primi metodi utilizzavano alimenti gastrici e intestinali simulati, accoppiati con la misurazione della solubilità di Fe o della dializzabilità di Fe come stima della biodisponibilità15. Tali studi hanno rapidamente scoperto che la dializzabilità del Fe non era una misura coerente della biodisponibilità in quanto la Fe può essere solubile, strettamente legata ai composti e, quindi, non scambiabile, portando alla sovrastima della biodisponibilità. Per affrontare questi problemi, la metodologia per utilizzare una linea cellulare intestinale umana si è evoluta, aggiungendo così un componente vivente e consentendo la misurazione dell'assorbimento di Fe16. Le cellule intestinali umane - cellule Caco-2 - hanno avuto origine da un carcinoma del colon umano e sono state ampiamente utilizzate negli studi sull'assorbimento dei nutrienti. Questa linea cellulare è utile in quanto, in coltura, le cellule si differenziano in enterociti che funzionano in modo simile alle cellule del bordo del pennello dell'intestino tenue. Gli studi hanno dimostrato che le cellule Caco-2 mostrano i trasportatori appropriati e la risposta ai fattori che influenzano l'assorbimento di Fe17,18.
Gli studi iniziali, utilizzando radioisotopi per misurare l'assorbimento di Fe nelle cellule Caco-2, sono stati perfezionati per misurare l'assorbimento di Fe sulla base della formazione di ferritina cellulare Caco-2. La misurazione della ferritina cellulare Caco-2 ha migliorato la produttività del campione e ha annullato i problemi di gestione dei radioisotopi e l'equilibrio del Fe estrinseco con Fe intrinseco19,20. La misurazione dell'assorbimento di Fe attraverso la formazione di ferritina ha permesso ai ricercatori di studiare una vasta gamma di alimenti, compresi i pasti complessi21. Pertanto, la digestione simulata (in vitro) accoppiata con l'assorbimento di Fe delle cellule Caco-2 ha fornito una migliore valutazione fisiologica dell'assorbimento di Fe dagli alimenti. È importante notare che questo modello determina principalmente differenze relative nella biodisponibilità di Fe. Come molte linee cellulari utili, anche le cellule Caco-2 hanno mostrato variabilità nella reattività, ma hanno mantenuto differenze relative consistenti nell'assorbimento di Fe tra gli alimenti. Una tecnica corretta e un'attenta attenzione ai dettagli possono migliorare la risposta coerente alla formazione di ferritina cellulare nelle cellule Caco-2.
Il modello di digestione in vitro / cellule Caco-2 è anche noto come test biologico delle cellule Caco-2. Questo test è stato accuratamente convalidato mediante confronto diretto con studi sull'uomo e sugli animali22. Oltre al confronto parallelo diretto del saggio biologico con gli studi di efficacia umana, questo modello ha dimostrato di mostrare una risposta qualitativamente simile nell'assorbimento di Fe a quella degli esseri umani18,19,23. Pertanto, come approccio in vitro, il biotest sulle cellule Caco-2 garantisce un'elevata credibilità come strumento di screening per valutare la nutrizione di Fe dagli alimenti. È stato ampiamente applicato a numerosi alimenti e prodotti alimentari 21,24,25,26,27,28.
Fin dal suo inizio nel 1998, il biotest sulle cellule Caco-2 ha fatto progredire il campo della nutrizione del Fe in quanto ha contribuito a identificare i fattori che influenzano l'assorbimento intestinale di Fe. In tal modo, questo modello ha sviluppato e perfezionato obiettivi di ricerca per studi umani più definitivi e meno costosi. Si potrebbe anche sostenere che l'uso del modello nega la necessità di alcune sperimentazioni umane.
In sintesi, la consegna relativa di Fe da un alimento o pasto può essere misurata con il biotest cellulare Caco-2. Indipendentemente dalla quantità di Fe nel pasto di prova, il biotest definisce la quantità relativa di Fe assorbita nell'enterocita, la prima fase del processo di assorbimento. Questo è il passo più importante nella definizione della biodisponibilità del Fe, poiché il più delle volte l'obiettivo è misurare con l'intento di migliorare o, per lo meno, monitorare la qualità nutrizionale del Fe in un alimento. Dato che lo stato del ferro è regolato dall'assorbimento, e quindi l'assorbimento di Fe è sovraregolato in individui carenti di Fe per soddisfare le esigenze nutrizionali, le condizioni standard del modello sono progettate in modo che l'assorbimento di Fe da parte delle cellule sia massimo. In questo modo, il saggio biologico fornisce una vera misura del potenziale del cibo per fornire Fe.
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Protocol
NOTA: Come comodo punto di riferimento per i lettori, la seguente metodologia descrive le condizioni specifiche della coltura e i materiali richiesti per la misurazione della biodisponibilità del Fe da 20 campioni sperimentali, oltre ai controlli di qualità richiesti, in una serie del saggio biologico. L'aumento del numero di campioni oltre questa capacità non è raccomandato a causa del tempo necessario per varie colture cellulari e fasi di digestione in vitro all'interno del biotest.
1. Scelta della quantità di campioni
- Per gli alimenti solidi o liquidi, determinare una quantità di alimenti che può essere considerata rappresentativa del campione da testare.
- Nel test per la biodisponibilità di Fe da una varietà di fagioli, utilizzare 100-150 g di semi di fagioli e trattare questa quantità in un campione omogeneo.
- Per campioni liquidi come succhi fortificati, prodotti lattiero-caseari e bevande sportive, assicurarsi che il cibo sia ben miscelato prima del campionamento.
NOTA: La quantità di materiale di semi di fagioli sopra menzionata è essenziale per tenere conto delle differenze intrinseche tra i semi di questa coltura di base.
2. Preparazione dei campioni
- Risciacquare via lo sporco e la polvere da qualsiasi campione di cibo con acqua distillata-deionizzata prima della lavorazione.
- Elaborare la quantità appropriata di campione secondo gli obiettivi sperimentali, ad esempio mediante metodo di cottura e macinazione.
NOTA: Per la cottura e la lavorazione, è fondamentale utilizzare pentole e attrezzature che non siano una potenziale fonte di contaminante Fe. Le attrezzature in acciaio inossidabile non contaminano; tuttavia, attrezzature come smerigliatrici per mulini a pietra, pentole in ghisa e qualsiasi attrezzatura non in acciaio inossidabile contenente Fe possono aggiungere quantità significative di Fe contaminante. Un macinino da caffè standard in acciaio inossidabile è spesso adeguato per la macinatura. - Liofilizzare e macinare in una polvere omogenea.
NOTA: Una volta omogeneizzato, la ricerca ha dimostrato che tre repliche indipendenti di analisi sono adeguate per ogni alimento misurato.- Se l'omogeneità del campione è difficile da raggiungere, rivedere la formulazione o la lavorazione del prodotto. Se ciò non è possibile, aggiungere repliche se la non omogeneità non è grave.
- Per la maggior parte degli alimenti solidi omogenei, utilizzare 0,5 g di campione liofilizzato per replica. Se necessario, utilizzare fino a 1,0 g di campione per replica, ma controllare se più di 0,5 g produce un beneficio nel grado di risposta.
NOTA: Quantità superiori a 0,5 g di alimenti solidi possono ostruire la membrana di dialisi (vedere sotto). - Utilizzare 1-2 ml di campioni liquidi.
NOTA: La liofilizzazione spesso non è necessaria per i campioni liquidi.
3. Coltura cellulare di Caco-2
- Colture di stock
- Acquistare celle Caco-2 da un fornitore certificato.
- Coltura delle cellule da flaconcini di riserva a 37 °C in un incubatore con un'atmosfera d'aria al 5% di CO 2 (umidità costante) utilizzando il Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con 25 mM HEPES (pH7,2 ), siero fetale bovino (FBS) al 10% (v/v) e soluzione antibiotico-antimicotica all'1%.
- Una volta che sono disponibili cellule sufficienti, di solito dopo 7-10 giorni di coltura, seminare le cellule in palloni non rivestiti di collagene ad una densità di 30.000 cellule / cm2.
- Scegliere la dimensione del pallone in base al numero di celle disponibili e necessarie per la semina di piastre multipozzetto.
NOTA: In generale, i palloni T225 (225 cm 2) funzionano meglio per esperimenti in cui vengono utilizzate 11 piastre multipozzetto (6 pozzetti; 9,66 cm2/pozzetto) (10 piastre per confronti di campioni, 1 piastra per controlli di qualità) per saggio biologico. - Coltivare le cellule in fiaschi per 7 giorni, cambiando il terreno a giorni alterni e utilizzare il 7° giorno per seminare le piastre multipozzetto.
NOTA: Si raccomanda di utilizzare un intervallo di passaggi non superiore a 10-15 passaggi da quando le cellule vengono avviate dalla coltura madre e successivamente utilizzate in una serie di esperimenti. I passaggi di coltura cellulare dovrebbero essere limitati in quanto un'ampia gamma di passaggi può comportare cambiamenti adattativi nella linea cellulare e, quindi, variabilità nella risposta del modello.
- Coltura cellulare su piastre multipozzetto
- Seminare le cellule Caco-2 ad una densità di 50.000 cellule / cm2 in piastre rivestite di collagene a 6 pozzetti.
NOTA: questo passaggio di solito funziona meglio se eseguito di mercoledì. I seguenti passaggi renderanno evidente perché questo giorno della settimana è ottimale. - Coltivare le cellule per 12 giorni a 37 °C in un incubatore con un'atmosfera d'aria al 5% di CO 2 (umidità costante) utilizzando DMEM integrato con 25 mM HEPES (pH7,2 ), 10% (v / v) FBS e soluzione antibiotico-antimicotica all'1%.
NOTA: La coltura dei monostrati cellulari per più di 12 giorni può causare una crescita eccessiva delle cellule. Ricerche precedenti hanno chiaramente dimostrato che, in queste condizioni, a 12 giorni dopo la semina, il monostrato cellulare è maturo, attaccato bene alla piastra e ottimale nella consistenza della risposta 29,30,31. Crescere le cellule più a lungo, ad esempio fino a 19-21 giorni, provoca una crescita eccessiva delle cellule e il mezzo si esaurisce rapidamente in sostanze nutritive, con conseguente monostrato malsano. - Durante il periodo di 12 giorni, cambiare il mezzo almeno ogni 2 giorni su un programma giornaliero coerente.
- Il 12° giorno dopo la semina, sostituire il terreno di coltura con 2 ml di Minimum Essential Medium (MEM [pH 7]) integrato con 10 mM PIPES (piperazina-N,N'-bis-[acido 2-etansolfonico]), soluzione antibiotico-antimicotica all'1%, idrocortisone (4 mg/L), insulina (5 mg/L), selenio (5 μg/L), triiodotironina (34 μg/L) e fattore di crescita epidermico (20 μg/L).
NOTA: Se la semina è iniziata di mercoledì, il 12° giorno sarebbe un lunedì. - Il giorno seguente (cioè il giorno 13), rimuovere il MEM e sostituirlo con 1 mL di MEM (pH 7).
Nota : questo passaggio si verifica di martedì. Questo è il giorno in cui inizia il saggio biologico; Pertanto, il programma di 13 giorni offre il vantaggio di un programma settimanale coerente, consentendo al test biologico di essere condotto in modo coerente nello stesso giorno della settimana.
- Seminare le cellule Caco-2 ad una densità di 50.000 cellule / cm2 in piastre rivestite di collagene a 6 pozzetti.
4. Digestione in vitro
- Preparazione degli anelli di inserimento
- Creare un anello di inserimento sterilizzato utilizzando un O-ring in silicone dotato di una membrana di dialisi lavata con acido (Figura 1A).
NOTA: Preparare gli inserti 1 giorno prima (cioè lunedì, giorno 12) del giorno del biotest e conservare in 18 MΩ acqua a 4 °C fino al momento dell'uso. - Il giorno del biotest (martedì, giorno 13), rimuovere gli inserti dal frigorifero, scolare e sostituire l'acqua con 0,5 M HCl. Lasciare a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare per almeno 1 ora prima dell'uso.
NOTA: questo passaggio deve essere eseguito prima di rimuovere il MEM dalle piastre di coltura. Il lavaggio acido della membrana serve a rimuovere possibili contaminanti di Fe e sterilizza l'anello di inserimento e la membrana. - Scolare lo 0,5 M HCl dagli inserti e risciacquare con acqua sterile da 18 MΩ. Conservare in acqua sterile da 18 MΩ a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare fino al momento dell'uso.
- Inserire un anello in ciascun pozzetto delle piastre a 6 pozzetti con celle Caco-2, creando così un sistema a due camere. Restituire le piastre con gli inserti all'incubatore.
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito subito dopo l'aggiunta di 1,0 mL di MEM a ciascun pozzetto (vedere il punto 3.2.5.).
- Creare un anello di inserimento sterilizzato utilizzando un O-ring in silicone dotato di una membrana di dialisi lavata con acido (Figura 1A).
- Preparazione della soluzione di pepsina
- Il giorno dell'esperimento, preparare la soluzione di pepsina sciogliendo 0,145 g di pepsina in 50 ml di 0,1 M HCl. Agitare delicatamente la soluzione su uno shaker a piattaforma per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Preparazione della soluzione pancreatina-bile
- Lo stesso giorno dell'esperimento, preparare 0,1 M NaHCO 3 sciogliendo 2,1 g di NaHCO3 in 250 ml di 18 MΩ di acqua.
- Mescolare 0,35 g di pancreatina e 2,1 g di estratto biliare in 175 ml di 0,1 M NaHCO3.
- Una volta solubilizzati la pancreatina e l'estratto biliare, aggiungere 87,5 g di una resina a scambio cationico debole (vedere la tabella dei materiali) e mescolare agitando per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Versare il liquame in una grande colonna e raccogliere l'eluato.
- Eluire la colonna con altri 70 ml di 0,1 M NaHCO3, raccogliendo questo volume nella soluzione biliare pancreatica.
NOTA: Lo scopo della resina è quello di rimuovere il contaminante Fe comunemente presente negli estratti pancreatina-bile.
- Avviare la digestione in vitro .
- Pesare il campione in una provetta sterile da centrifuga da 50 mL (polipropilene), seguita dall'aggiunta di 10 mL di soluzione fisiologica a pH 2, contenente 140 mM NaCl e 5 mM KCl.
- Avviare il processo di digestione gastrica aggiungendo 0,5 ml della soluzione di pepsina suina preparata al campione e incubare su uno shaker a dondolo a bassa temperatura per 1 ora a 37 °C.
- Dopo questo periodo, avviare il processo di digestione intestinale di ciascun campione regolando il pH a 5,5-6,0 con 1,0 M NaHCO3.
- Aggiungere 2,5 ml della soluzione pancreatina-bile a ciascuna provetta e regolare il pH a 6,9-7,0 con 1,0 M NaHCO3.
- Una volta regolato il pH, equalizzare il volume in ciascun tubo utilizzando una soluzione di 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6,7), misurando il peso del tubo con un valore target di 15 g.
NOTA: Per alcuni alimenti, potrebbe essere necessario portare il volume totale a 16 g o 17 g, a seconda della capacità tampone degli alimenti. - Trasferire 1,5 ml di ciascun digest intestinale nella camera superiore (cioè contenente l'anello di inserimento con la membrana di dialisi) di un pozzetto corrispondente della piastra di coltura a 6 pozzetti contenente le cellule Caco-2 (Figura 1B).
- Riposizionare il coperchio della piastra e incubare a 37 °C (5% CO 2 atmosfera d'aria) su uno shaker oscillante a 6 oscillazioni/min per2 ore.
- Rimuovere l'anello di inserimento con il digestore e aggiungere un ulteriore 1 mL di MEM (pH 7) a ciascun pozzetto.
- Riportare la piastra di coltura cellulare nell'incubatore (37 °C; 5% CO2 atmosfera d'aria) per altre 22 ore.
- Dopo 22 ore, rimuovere il terreno di coltura cellulare e aggiungere 2,0 ml di acqua 18 MΩ al monostrato cellulare.
NOTA: L'acqua lisa osmoticamente le cellule. - Raccogliere l'intero lisato cellulare in provette standard di microcentrifuga in polipropilene o simili per le successive analisi delle proteine cellulari e della ferritina cellulare.
5. Misurazione della ferritina cellulare Caco-2 e della proteina cellulare
- Utilizzare il lisato cellulare del punto 4.4.10. per la misurazione della ferritina cellulare e delle proteine.
- Per misurare il contenuto di ferritina delle cellule Caco-2, seguire le istruzioni del kit (vedere la Tabella dei materiali), ad eccezione dell'aumento del tempo di incubazione da 30 minuti a 2 ore per il coniugato topo anti-ferritina anticorpo-perossidasi di rafano (HRP).
- Per misurare le proteine cellulari, seguire le istruzioni fornite nel kit di proteine cellulari (vedere la tabella dei materiali).
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Representative Results
Identificazione e misurazione della biodisponibilità del Fe nelle colture alimentari di base
Uno dei motivi principali per lo sviluppo di questo modello è stato quello di identificare i fattori che influenzano la biodisponibilità di Fe nelle colture alimentari di base e fornire uno strumento per i selezionatori di piante che consentisse loro di identificare e sviluppare varietà con una maggiore biodisponibilità di Fe. Il fagiolo comune (Phaseolus vulgaris) è stato preso di mira a livello globale come coltura per la biofortificazione di Fe; pertanto, il modello è stato ampiamente applicato per valutare la qualità nutrizionale del Fe in una vasta gamma di classi di mercato di fagioli e programmi di selezione dei fagioli. Ad esempio, i fagioli gialli sono una classe di mercato emergente negli Stati Uniti. In regioni come l'Africa orientale, sono molto popolari e sono ampiamente noti per essere a cottura rapida e considerati da molti "facili da digerire". Recenti studi con il biotest delle cellule Caco-2 hanno dimostrato che alcune varietà di fagioli gialli possono avere un'elevata biodisponibilità di Fe rispetto ad altre classi di colore (Figura 2). In questo studio, le varietà Manteca sono state identificate come elevate nella biodisponibilità di Fe rispetto ai controlli di riferimento delle classi di colore bianco e rosso chiazzato. Inoltre, i risultati sono stati coerenti per due annate di raccolta consecutive. Tali confronti non sono semplicemente fattibili in altri modelli, in particolare nei modelli in vivo , a causa dell'alto costo e della produttività molto più bassa delle sperimentazioni su animali e umani.
Valutazione degli effetti della lavorazione degli alimenti sulla biodisponibilità del Fe
Il biotest delle cellule Caco-2 può anche essere applicato per valutare gli effetti della lavorazione degli alimenti sulla biodisponibilità del Fe. Ad esempio, i risultati nella Figura 3 provengono da un'analisi di fagioli e pasta a base di fagioli di più classi di colore. I risultati dimostrano come la lavorazione dei fagioli in una farina abbia aumentato la biodisponibilità di Fe dalle varietà di fagioli bianchi (Snowdon, Alpena e Samurai) e gialli (Canario). Per le varietà mirtillo rosso (Etna), rene rosso (Red Hawk) e nero (Zenith), la biodisponibilità di Fe è diminuita nelle preparazioni di farina di pasta. Analisi correlate hanno dimostrato che la lavorazione dei fagioli in una farina ha interrotto le pareti cellulari del cotiledone dei fagioli, rendendo così il Fe intracellulare accessibile per l'assorbimento. L'assorbimento del ferro è aumentato nella pasta di fagioli bianchi e gialli poiché i rivestimenti di semi di queste varietà non contenevano composti polifenolici che inibiscono la biodisponibilità di Fe. Al contrario, i rivestimenti di semi di mirtillo, rene rosso e fagioli neri contengono alti livelli di polifenoli inibitori, diminuendo così l'assorbimento di Fe. Questi risultati indicano chiaramente l'utilità del modello nell'esporre fattori che possono influenzare la qualità nutrizionale di Fe, che altrimenti passerebbero inosservati.
Figura 1: Inserire la configurazione dell'anello per l'assorbimento di Fe delle cellule Caco-2. (A) Immagine delle cellule Caco-2 e anello di inserimento con membrana di dialisi collegata. (B) Diagramma della procedura complessiva per la digestione in vitro accoppiata con l'assorbimento di Fe della cellula Caco-2 all'interno di un singolo pozzetto della piastra multi-pozzetto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Punteggi di biodisponibilità del ferro di genotipi di semi interi non imbevuti e cotti in un pannello diversificato di fagioli gialli. (A) Stagione 2015; (B) stagione sul campo 2016. I valori sono medie (deviazione standard) di misurazioni triplicate da due repliche di campo per genotipo (n = 6). I genotipi sono classificati sull'asse x per classe di cottura, classificati dal genotipo di cottura più veloce alla voce di cottura più lenta. *Punteggio di biodisponibilità del ferro significativamente più basso (p < 0,05) rispetto alle altre voci YBP. **Punteggi di biodisponibilità del ferro significativamente più alti (p < 0,05) rispetto agli altri genotipi YBP. Questa cifra è stata modificata da32. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Biodisponibilità del ferro espressa come formazione di ferritina cellulare Caco-2 (nanogrammo di ferritina per milligrammo di proteina cellulare) delle varietà di fagioli e dei corrispondenti spaghetti a base di fagioli. A) tre varietà di fagioli bianchi e i corrispondenti spaghetti a base di fagioli; B) quattro varietà di fagioli colorati e i corrispondenti spaghetti a base di fagioli. I valori sono la media (± deviazione standard) di sei misurazioni per varietà. La linea blu con trattino indica la biodisponibilità del ferro di una pasta di grano duro non fortificata estrusa, cotta e lavorata allo stesso modo degli spaghetti a base di fagioli. * Significativamente (p ≤ 0,05) maggiore formazione di ferritina cellulare Caco-2 rispetto ai fagioli interi dopo la cottura. **Significativamente (p ≤ 0,05) minore formazione di ferritina cellulare Caco-2 rispetto ai fagioli interi dopo la cottura. Questa cifra è stata modificata da33. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Fin dal suo inizio, sono stati pubblicati numerosi studi che descrivono questo metodo per il biotest delle cellule Caco-2. Le condizioni di base sono rimaste relativamente invariate dalla pubblicazione iniziale nel 199818. Tuttavia, negli ultimi 20 anni, numerosi dettagli tecnici sono stati perfezionati e standardizzati per produrre una coerenza senza precedenti nella risposta del saggio biologico. Un'aderenza attenta e precisa alla coltura cellulare e alle condizioni di digestione in vitro sono la chiave per la risposta coerente e sensibile del saggio biologico.
Dalla nostra esperienza nell'addestramento di numerose persone nell'uso di questo metodo, la lotta più comune è la corretta coltura delle cellule Caco-2. Una coltura coerente di monostrati sani è la chiave per monostrati di cellule Caco-2 sani e reattivi. Se i livelli di proteine cellulari non sono altamente coerenti da bene a bene e non rientrano nell'intervallo di proteine cellulari elencate nel protocollo, lo sperimentatore deve riesaminare le condizioni di coltura cellulare per deviazione dal protocollo. In alternativa, può esistere una contaminazione da microrganismi a basso livello, l'incubatore di coltura cellulare potrebbe non funzionare correttamente o il terreno di coltura cellulare potrebbe non essere formulato correttamente.
Il processo di digestione in vitro è un'altra fonte di potenziali problemi. La rimozione del contaminante Fe dagli enzimi digestivi è fondamentale. Nonostante le affermazioni del produttore, è prudente controllare periodicamente la concentrazione di Fe degli enzimi e assicurarsi che il processo di rimozione del Fe (vedi protocollo) sia efficace. Se la contaminazione da Fe è presente negli enzimi digestivi, il controllo di qualità del digesto basale produrrà valori di ferritina cellulare superiori all'intervallo raccomandato.
Un ricercatore esperto e addestrato dovrebbe essere in grado di analizzare 20 campioni sperimentali, oltre ai controlli di qualità, in una singola esecuzione del saggio biologico. Pertanto, sono necessarie circa 12 piastre a sei pozzetti per ogni esecuzione del saggio biologico. Un numero maggiore di campioni per biotest non è raccomandato in quanto i tempi per la titolazione del pH durante il processo di digestione possono essere troppo lunghi, portando a potenziali incongruenze tra i tempi di digestione del campione.
Gli svantaggi di questo modello sono relativamente pochi. Richiede ricercatori altamente qualificati nella coltura cellulare e capaci di una precisa attenzione ai dettagli e al protocollo. Lo spazio del laboratorio deve essere pulito da fonti di contaminazione da Fe e i reagenti e altri materiali devono essere regolarmente monitorati per la contaminazione da Fe. Pertanto, l'utente dovrebbe avere la capacità o l'accesso alla strumentazione per la misurazione della concentrazione di Fe. Questo modello è solo una misura relativa o semi-quantitativa. Tuttavia, con l'uso corretto dei controlli di riferimento, il modello può fornire alcune stime quantitative dell'assorbimento di Fe. In effetti, è stata generata un'equazione di conversione dei rapporti di assorbimento del controllo rispetto al materiale di prova19.
Il biotest funziona secondo il seguente principio: le cellule Caco-2 producono più proteina ferritina in risposta all'aumento delle concentrazioni cellulari di Fe. Pertanto, la biodisponibilità di Fe è proporzionale all'aumento della produzione di ferritina cellulare Caco-2. Questo aumento è espresso come rapporto tra ferritina cellulare e proteina totale delle cellule Caco-2 (nanogrammo di ferritina per milligrammo di proteina cellulare totale) dopo esposizione a un campione digerito19. Le misurazioni della ferritina vengono effettuate utilizzando un kit ELISA (vedere la tabella dei materiali) testato per la risposta in questo saggio biologico. Le concentrazioni totali di proteine cellulari sono quantificate utilizzando un kit di analisi delle proteine. Come accennato in precedenza, nelle condizioni utilizzate per questo metodo, i livelli tipici di proteine cellulari Caco-2 in una piastra a sei pozzetti variano da 2,0 mg a 2,6 mg di proteine cellulari per pozzetto. Valori al di fuori di questo intervallo indicano colture cellulari malsane, possibile crescita eccessiva di cellule o scarsa tecnica di semina cellulare. All'interno di una data esecuzione del biotest, i valori dovrebbero variare solo fino a 0,2 mg per pozzetto. Inoltre, sotto le densità di semina e le condizioni di coltura utilizzate in questa metodologia, c'è una sostanziale attività enzimatica del bordo del pennello a 13 giorni dopo la semina, indicando la maturazione della maggior parte, se non di tutto, del monostrato cellulare28,29,30. Monitorare i monostrati cellulari durante i 13 giorni precedenti l'uso per la contaminazione o lo stress, come la formazione di vacuolo o lacune nella formazione di monostrati. Se tali condizioni sono evidenti, le cellule non devono essere considerate valide per l'uso nel saggio biologico.
Per monitorare la reattività del biotest Caco-2, ogni esperimento dovrebbe essere eseguito con diversi controlli di qualità, tra cui un digest in bianco, contenente solo la soluzione salina fisiologicamente bilanciata e gli enzimi gastrointestinali. Questi controlli assicurano che non vi sia alcuna contaminazione da Fe nel biotest. I valori di ferritina delle cellule Caco-2 esposte al digest in bianco variano tipicamente da 1 ng a 6 ng di ferritina / mg di proteina cellulare. La ferritina basale in questo intervallo indica anche che le cellule sono allo stato di Fe relativamente basso e, quindi, dovrebbero mostrare la massima sensibilità al Fe disponibile.
Per i primi 15 anni di utilizzo, ulteriori controlli di qualità includevano 1) un digest in bianco con FeCl 3 (66 μM) e 2) un digest in bianco di FeCl 3 (66 μM) più l'aggiunta di1,3 mM di acido ascorbico. I valori di ferritina per il digesto FeCl 3 erano tipicamente nell'intervallo di 30-50 ng di ferritina / mg di proteina cellulare e il digesto FeCl3 con acido ascorbico era nell'intervallo di 250-400 ng di ferritina / mg di proteina cellulare. In anni più recenti, il digest in bianco rimane un controllo di qualità; tuttavia, siamo passati all'utilizzo di un campione di cibo con e senza acido ascorbico in un rapporto di 20: 1, ascorbato: Fe. Il campione alimentare utilizzato era una farina di fagioli bianchi che contiene circa 65 μg di Fe/g di campione. Questi controlli di qualità forniscono una gamma di risposta più ristretta e coerente, producendo 20-30 ng di ferritina/mg di proteine cellulari per la farina di fagioli bianchi e 70-150 ng di ferritina/mg di proteine cellulari per la farina di fagioli bianchi più ascorbato. Va notato che il nuovo intervallo di valori proviene dal kit di riferimento nella tabella dei materiali, che tende ad essere leggermente inferiore rispetto all'ormai defunto kit ELISA Ramco. Al momento della pubblicazione di questo manoscritto, solo 2-3 mesi di dati sono stati acquisiti con il kit di riferimento.
È importante riconoscere i risultati e le condizioni di coltura cellulare che indicano un'esecuzione non valida o non ottimale del biotest. In primo luogo, come affermato nei metodi, se le condizioni del digest in bianco producono concentrazioni di ferritina cellulare superiori all'intervallo suggerito, ciò potrebbe essere indicativo della contaminazione da Fe dei terreni di coltura cellulare, degli enzimi digestivi o della membrana di dialisi. Le concentrazioni accettabili di Fe per i terreni di coltura cellulare e gli enzimi digestivi sono <20 μg Fe/ml. Anche i valori al di fuori dell'intervallo per gli altri controlli di qualità, in particolare se sono bassi, indicano che la validità dei risultati è discutibile.
In sintesi, questo modello è altamente sensibile al Fe biodisponibile, poiché le condizioni di coltura cellulare sono progettate per creare cellule di basso stato Fe; pertanto, i loro meccanismi per l'assorbimento di Fe sono altamente sovraregolamentati. È un modello robusto in grado di offrire un'elevata produttività. Qualsiasi alimento o dieta che può essere somministrato agli esseri umani può essere valutato in questo modello e, pertanto, il saggio biologico ha una vasta gamma di applicazioni. I selezionatori di piante possono utilizzare questo modello per misurare la biodisponibilità di Fe negli alimenti di base, identificando tratti e regioni cromosomiche che influenzano la biodisponibilità di Fe. Gli scienziati alimentari possono applicare il modello per determinare le formulazioni ottimali e valutare gli effetti della lavorazione per garantire un'adeguata biodisponibilità di Fe. I nutrizionisti possono utilizzare il modello per valutare e monitorare la biodisponibilità dietetica di Fe da singoli alimenti, combinazioni alimentari e persino piani dietetici. È stato accuratamente convalidato per studi sull'uomo, prevedendo correttamente la direzione e l'entità degli effetti in ogni applicazione. Pertanto, combinando la digestione simulata con l'assorbimento di Fe delle cellule epiteliali intestinali, questo modello rappresenta il primo passo critico nel processo di assorbimento del Fe ed è, quindi, in grado di prevedere la consegna o la biodisponibilità di Fe dagli alimenti.
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Disclosures
L'autore non ha conflitti di interesse.
Acknowledgments
L'autore è profondamente grato per gli sforzi tecnici di Yongpei Chang e Mary Bodis. L'applicazione estremamente riuscita di questo modello nel campo della nutrizione è il risultato diretto della loro esperienza e attenzione ai dettagli. Lo sviluppo di questo modello è stato finanziato interamente dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, Servizio di ricerca agricola.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
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