Summary
Caco-2-cellebioanalysen for jern (Fe) biotilgængelighed repræsenterer en omkostningseffektiv og alsidig tilgang til vurdering af Fe-biotilgængelighed fra fødevarer, fødevarer, kosttilskud, måltider og endda diætregimer. Grundigt valideret til humane studier repræsenterer det det nyeste for studier af Fe biotilgængelighed.
Abstract
Kendskab til Fe biotilgængelighed er afgørende for vurderingen af den ernæringsmæssige kvalitet af Fe i fødevarer. In vivo-måling af Fe-biotilgængelighed er begrænset af omkostninger, gennemstrømning og de forbehold, der er forbundet med isotopmærkning af fødevaren Fe. Der er således et kritisk behov for en tilgang, der er høj kapacitet og omkostningseffektiv. Caco-2-cellebioanalysen blev udviklet for at tilfredsstille dette behov. Caco-2-cellebioassay for Fe-biotilgængelighed anvender simuleret mave- og tarmfordøjelse kombineret med kultur af en human tarmepitelcellelinje kendt som Caco-2. I Caco-2-celler stimulerer Fe-optagelse den intracellulære dannelse af ferritin, et Fe-opbevaringsprotein, der let måles ved enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). Ferritin former i forhold til Fe optagelse; ved at måle Caco-2-celleferritinproduktion kan man således vurdere tarm-Fe-optagelse fra simulerede madfordøjelser til enterocyten.
Via denne tilgang replikerer modellen det vigtigste indledende trin, der bestemmer fødevarens biotilgængelighed. Siden starten i 1998 er denne modelmetode blevet nøje sammenlignet med faktorer, der vides at påvirke menneskers Fe-biotilgængelighed. Desuden er det blevet anvendt i parallelle undersøgelser med tre humane effektivitetsundersøgelser, der evaluerer Fe bioberigede afgrøder. I alle tilfælde forudsagde bioanalysen korrekt de relative mængder Fe-biotilgængelighed ud fra faktorerne, afgrøderne og den samlede kost. Dette papir giver detaljerede metoder til Caco-2-cellekultur kombineret med in vitro-fordøjelsesprocessen og celleferritin ELISA, der er nødvendig for at udføre Caco-2-cellebioassay for Fe-biotilgængelighed.
Introduction
For fuldt ud at forstå forskningsbehovet og fordelene ved Caco-2-cellebioanalysen for Fe-biotilgængelighed skal man først forstå de tilgange, der var på plads før fremkomsten af denne model. Måling af Fe biotilgængelighed fra en fødevare eller et måltid in vivo er en udfordrende opgave, især når kombinationer af fødevarer skal vurderes i et måltid eller en diæt. Isotopmærkning har været den mest almindelige tilgang til måling af Fe biotilgængelighed i løbet af de sidste 50 år1. Isotopmærkning bruges til enkeltmåltider og undersøgelser med flere måltider og er upraktisk til langtidsundersøgelser. Stabile isotoper af Fe som 57Fe og 58Fe er de mest almindeligt anvendte; undersøgelser er imidlertid blevet udført med radioisotoper såsom 59Fe, ved hjælp af helkropstælling2. For vegetabilske fødevarer er isotopmærkning sket via ydre eller iboende mærkning. Til ydre mærkning tilsættes en kendt mængde isotop til maden eller måltidet. Maden blandes derefter, og en 15-30 minutters ligevægtsperiode indarbejdes i protokollen inden forbruget. Hydroponisk kultur - tilsætning af isotopen til næringsopløsningen for at inkorporere den i planten, mens den vokser og udvikler sig - er nødvendig for den iboende mærkning af plantefødevarer. Fordele og ulemper ved hver tilgang diskuteres nedenfor.
Ydre isotopmærkning
I begyndelsen til midten af 1970'erne blev human Fe-absorption undersøgt ved ekstrinsisk mærkning af Fe i fødevarer, hvor en kendt mængde isotop tilsættes til den kendte mængde Fe i fødevaren eller måltidet, blandes og ligevægtes i 15-30 minutter før målinger. Der er anvendt forskellige mængder ekstrinsiske isotoper, der spænder fra 1% til 100% af den iboende Fe, men oftest i området 7%-30%3. Ydre mærkning er baseret på antagelsen om, at den ydre Fe-isotop bliver fuldt ud afbalanceret med madens eller måltidets iboende Fe. Ekstrinsisk isotopabsorption måles derefter, og hvert atom i den ydre isotop beregnes til at repræsentere et givet antal iboende Fe-atomer. Denne beregning er baseret på de relative molære mængder. I 1983 blev flere valideringsundersøgelser af teknikken opsummeret i et gennemgangspapir4. Validering af teknikken blev udført ved samtidig at sammenligne den procentvise absorption af den ydre isotopiske etiket med den procentvise absorption af en iboende isotopetiket. Således antyder et forhold mellem den ydre og iboende absorption tæt på 1, at hver pulje af Fe blev absorberet ligeligt. På det tidspunkt blev et forhold tæt på 1 også anset for at repræsentere ligevægt mellem den ydre isotop og madens eller måltidets iboende Fe. Forholdet mellem ekstrinsisk og iboende Fe-absorption varierede fra middelværdier på 0,40 til 1,62 med et gennemsnitligt (±SD) forhold på 1,08 ± 0,14 i 63 sammenligninger. Det er vigtigt at bemærke, at i alle de undersøgelser, der er opsummeret i denne gennemgang, testede ingen direkte ækvilibreringen af den ydre etiket med den iboende Fe. Sammenfattende konkluderede forfatterne af anmeldelsen følgende:
"Den ydre tagteknik har vist sig gyldig for flere fødevarer under visse eksperimentelle forhold. Men denne metode kan endnu ikke betragtes som bevist med hensyn til alle typer fødevarer. Den ydre mærkemetode er ikke egnet til overvågning af jernabsorption fra en diæt, der indeholder uopløselige former for jern. Gyldigheden af denne teknik er afhængig af den grundlæggende antagelse, at det ydre mærke udveksles fuldstændigt med alt endogent nonheme madjern. På nuværende tidspunkt vides det ikke, hvor fuldstændigt de forskellige former for nonheme jern er mærket med et ydre mærke. Dette er vigtigt i lyset af undersøgelser, der har antydet, at jernhæmmere kan påvirke det ydre mærke anderledes end nogle former for nonheme jern i fødevarer. Forskning i fødevarefaktorer, der kan forringe en fuldstændig isotopudveksling, er ringe. Fortolkning af biotilgængelighedsdata fra forskning i ydre mærker kræver således overvejelse af udvekslingshæmmere, som kan være til stede i fødevaren eller kosten.
Siden 1983 er der kun offentliggjort to undersøgelser, der evaluerede nøjagtigheden af ydre mærkning af Fe 3,5. I begge disse undersøgelser blev ligevægten af en ydre isotopetiket direkte sammenlignet med den iboende Fe af fødevarerne, som i disse undersøgelser var basisfødevareafgrøder. Hvide, røde og sorte bønnesorter blev testet sammen med linser og majs. Ved hjælp af etablerede in vitro-fordøjelsesteknikker og måling af Fe-opløselighed og nedbør viste begge undersøgelser, at ydre isotopmærkning ikke konsekvent resulterer i fuld ligevægt, med bevis for, at for nogle bønnesorter kan misligevægten være meget høj afhængigt af mængden af ekstrinsisk isotop og frøbelægningsfarve3. På trods af konklusionerne i 1983-gennemgangspapiret fortsatte ekstrinsiske mærkningsundersøgelser af bønner 6,7,8,9,10,11,12. Ingen af disse undersøgelser omfattede test af ækvilibreringen af den ydre etiket med den iboende Fe.
Iboende mærkning
Iboende mærkning af planteføde til vurdering af Fe-biotilgængelighed eliminerer nøjagtighedsproblemerne med ækvilibrering i ydre mærkning. Denne tilgang kan imidlertid ikke give store mængder materiale på grund af kravet om drivhusplads til hydroponisk kultur. Hydroponisk kultur er arbejdskrævende, kræver en stor mængde dyr stabil isotop og resulterer ofte i plantevækst forskellig med hensyn til udbytte og frø Fe-koncentration. På grund af omkostningerne er iboende mærkning kun egnet til mindre undersøgelser, der sigter mod at forstå mekanismer, der ligger til grund for Fe-optagelse eller faktorer, der påvirker Fe-optagelse fra fødevarer. Produktion af 1-2 kg af en basisfødevareafgrøde koster ca. $ 20.000 - $ 30.000 for materialer alene, afhængigt af isotopen og hydroponisk tilgang13,14.
I betragtning af de udfordringer, der er forbundet med isotopmærkning, forsøgte efterforskere at udvikle in vitro-tilgange. Tidlige metoder anvendte simuleret gastrisk og tarmføde kombineret med måling af Fe-opløselighed eller Fe dialyzabilitet som et skøn over biotilgængelighed15. Sådanne undersøgelser viste hurtigt, at Fe dialyserbarhed ikke var et konsekvent mål for biotilgængelighed, da Fe kan være opløselig, tæt bundet til forbindelser og derfor ikke udskiftelig, hvilket fører til overvurdering af biotilgængelighed. For at løse disse problemer udviklede metoden til at udnytte en human tarmcellelinje og derved tilføje en levende komponent og muliggøre måling af Fe-optagelse16. De humane tarmceller - Caco-2-celler - stammer fra et humant tyktarmskarcinom og har været meget udbredt i næringsstofoptagelsesundersøgelser. Denne cellelinje er nyttig, da cellerne i kultur differentierer sig til enterocytter, der fungerer på samme måde som tyndtarmens børstekantceller. Undersøgelser har vist, at Caco-2-celler udviser de passende transportører og respons på faktorer, der påvirker Fe-optagelse17,18.
De indledende undersøgelser, der anvendte radioisotoper til at måle Fe-optagelse i Caco-2-celler, blev raffineret til at måle Fe-optagelse baseret på Caco-2-celleferritindannelse. Caco-2-celleferritinmåling forbedrede prøvegennemstrømningen og negerede problemer med radioisotophåndtering og ligevægten af ekstrinsisk Fe med iboende Fe19,20. Måling af Fe-optagelse via ferritindannelse gjorde det muligt for forskere at studere en bred vifte af fødevarer, herunder komplekse måltider21. Således gav simuleret (in vitro) fordøjelse kombineret med Caco-2-celle Fe-optagelse en bedre fysiologisk vurdering af Fe-optagelse fra fødevarer. Det er vigtigt at bemærke, at denne model primært bestemmer relative forskelle i Fe biotilgængelighed. Som mange nyttige cellelinjer har Caco-2-celler også vist variabilitet i lydhørhed, men har opretholdt konsekvente relative forskelle i Fe-optagelse mellem fødevarer. Korrekt teknik og omhyggelig opmærksomhed på detaljer kan forbedre konsistent celleferritindannelsesrespons i Caco-2-celler.
In vitro-fordøjelses-/Caco-2-cellemodellen er også kendt som Caco-2-cellebioassay. Dette assay er blevet grundigt valideret via direkte sammenligning med human- og dyreforsøg22. Ud over den direkte parallelle sammenligning af bioassay med humane effektivitetsforsøg har denne model vist sig at udvise et kvalitativt lignende respons i Fe-optagelse som for mennesker18,19,23. Derfor garanterer Caco-2-cellebioanalysen som en in vitro-tilgang høj troværdighed som et screeningsværktøj til evaluering af Fe-ernæring fra fødevarer. Det har været bredt anvendt på mange fødevarer og fødevarer 21,24,25,26,27,28.
Siden starten i 1998 har Caco-2-cellebioanalysen avanceret Fe-ernæringsområdet, da det har hjulpet med at identificere faktorer, der påvirker tarmens Fe-optagelse. Dermed har denne model udviklet og forfinet forskningsmål for mere definitive og billigere menneskelige undersøgelser. Man kan også argumentere for, at brugen af modellen negerer behovet for nogle menneskelige forsøg.
Sammenfattende kan den relative levering af Fe fra en mad eller et måltid måles med Caco-2-cellebioassayet. Uanset mængden af Fe i testmåltidet definerer bioanalysen den relative mængde Fe, der optages i enterocyten - det første trin i absorptionsprocessen. Dette er det vigtigste skridt i definitionen af Fe biotilgængelighed, da målet oftest er at måle med det formål at forbedre eller i det mindste overvåge den ernæringsmæssige kvalitet af Fe i en fødevare. I betragtning af at jernstatus reguleres af absorption, og Fe-optagelsen derfor opreguleres hos personer med Fe-mangel for at imødekomme ernæringsmæssige behov, er standardbetingelserne i modellen designet således, at Fe-optagelsen af cellerne er maksimal. På denne måde giver bioassayet et sandt mål for fødevarens potentiale til at levere Fe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Som et praktisk referencepunkt for læserne beskriver følgende metode de specifikke dyrkningsbetingelser og materialer, der kræves til måling af Fe-biotilgængelighed fra 20 eksperimentelle prøver plus de krævede kvalitetskontroller i en kørsel af bioassayet. Det anbefales ikke at øge antallet af prøver ud over denne kapacitet på grund af den tid, der kræves til forskellige cellekultur- og in vitro-fordøjelsestrin inden for bioassayet.
1. Valg af mængde prøver
- For faste eller flydende fødevarer bestemmes en mængde fødevarer, der kan betragtes som repræsentative for den prøve, der skal testes.
- Ved test for Fe biotilgængelighed fra en bønnesort skal du bruge 100-150 g bønnefrø og behandle dette beløb til en homogen prøve.
- For flydende prøver såsom beriget juice, mejeriprodukter og sportsdrikke skal du sikre dig, at maden er godt blandet inden prøveudtagning.
BEMÆRK: Mængden af bønnefrømateriale nævnt ovenfor er afgørende for at tage højde for de iboende forskelle mellem frø af denne basisafgrøde.
2. Forberedelse af prøver
- Skyl jord og støv af enhver fødevareprøve med destilleret deioniseret vand inden forarbejdning.
- Behandl den passende mængde prøve i henhold til de eksperimentelle mål, såsom ved tilberedningsmetode og fræsning.
BEMÆRK: Til madlavning og forarbejdning er det vigtigt at bruge køkkengrej og udstyr, der ikke er en potentiel kilde til forurenende Fe. Rustfrit ståludstyr forurener ikke; udstyr såsom stenmøllekværne, støbejerns køkkengrej og alt udstyr i ikke-rustfrit stål, der indeholder Fe, kan dog tilføje betydelige mængder forurenende Fe. En standard kaffekværn i rustfrit stål er ofte tilstrækkelig til slibning. - Lyofiliser og slib til et homogent pulver.
BEMÆRK: Når den er homogeniseret, har forskning vist, at tre uafhængige replikationer af analyse er tilstrækkelige for hver fødevare, der måles.- Hvis prøvehomogenitet er vanskelig at opnå, skal formuleringen eller forarbejdningen af produktet revideres. Hvis dette ikke er muligt, skal du tilføje replikationer, hvis ikke-homogeniteten ikke er alvorlig.
- For de fleste homogene faste fødevarer skal du bruge 0,5 g frysetørret prøve pr. Replikat. Brug om nødvendigt op til 1,0 g prøve pr. replikat, men kontroller, om mere end 0,5 g giver en fordel i responsgraden.
BEMÆRK: Mængder højere end 0,5 g faste fødevarer kan tilstoppe dialysemembranen (se nedenfor). - Brug 1-2 ml flydende prøver.
BEMÆRK: Frysetørring er ofte ikke nødvendig for flydende prøver.
3. Caco-2 cellekultur
- Stamkulturer
- Anskaf Caco-2-celler fra en certificeret leverandør.
- Kultur cellerne fra lagerhætteglas ved 37 ° C i en inkubator med en 5% CO 2 luftatmosfære (konstant fugtighed) ved hjælp af Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) suppleret med 25 mM HEPES (pH7,2 ), 10% (v / v) føtal bovin serum (FBS) og 1% antibiotisk-antimykotisk opløsning.
- Når tilstrækkelige celler er tilgængelige, normalt efter 7-10 dages dyrkning, frø cellerne i ikke-kollagenbelagte kolber med en tæthed på 30.000 celler / cm2.
- Vælg kolbestørrelsen afhængigt af antallet af celler, der er tilgængelige og nødvendige til såning af multiwell-plader.
BEMÆRK: Generelt fungerer T225 (225 cm 2) kolber bedst til forsøg, hvor der anvendes 11 multiwell (6-brønd; 9,66 cm2 / brønd) plader (10 plader til prøvesammenligninger, 1 plade til kvalitetskontrol) pr. Bioassay. - Dyrk celler i kolber i 7 dage, skift mediet hver anden dag, og brug på den 7. dag til såning af multiwellpladerne.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge et passageområde på højst 10-15 passager fra, når cellerne startes fra stamkultur og efterfølgende anvendes i en række eksperimenter. Cellekulturpassager bør begrænses, da en bred vifte af passager kan resultere i adaptive ændringer i cellelinjen og dermed variation i modellens respons.
- Cellekultur på multiwell plader
- Frø Caco-2-cellerne med en tæthed på 50.000 celler / cm2 i 6-brønds kollagenbelagte plader.
BEMÆRK: Dette trin fungerer normalt bedst, hvis det gøres på en onsdag. Følgende trin vil gøre det tydeligt, hvorfor denne ugedag er optimal. - Cellerne dyrkes i 12 dage ved 37 °C i en inkubator med en 5% CO 2 luftatmosfære (konstant fugtighed) ved hjælp af DMEM suppleret med 25 mM HEPES (pH7,2 ), 10% (v / v) FBS og 1% antibiotisk-antimykotisk opløsning.
BEMÆRK: Dyrkning af cellemonolagene længere end 12 dage kan resultere i cellevækst. Tidligere forskning har tydeligt vist, at cellemonolaget under disse forhold, 12 dage efter såning, er modent, fastgjort godt til pladen og optimalt i konsistensen af respons 29,30,31. Voksende cellerne længere, såsom op til 19-21 dage, resulterer i celle overvækst, og medierne nedbrydes hurtigt i næringsstoffer, hvilket resulterer i usunde monolag. - I løbet af 12-dages perioden skal du skifte mediet mindst hver 2. dag på en konsekvent daglig tidsplan.
- På den 12. dag efter såning udskiftes dyrkningsmediet med 2 ml minimum essentielt medium (MEM [pH 7]) suppleret med 10 mM RØR (piperazin-N, N'-bis-[2-ethanesulfonsyre]), 1% antibiotika-antimykotisk opløsning, hydrocortison (4 mg / L), insulin (5 mg / L), selen (5 μg / L), triiodothyronin (34 μg / L) og epidermal vækstfaktor (20 μg / L).
BEMÆRK: Hvis seedning blev startet på en onsdag, ville den 12. dag være en mandag. - Den følgende dag (dvs. dag 13) fjernes MEM'en, og den erstattes med 1 ml MEM (pH 7).
BEMÆRK: Dette trin ville forekomme på en tirsdag. Dette er dagen, hvor bioanalysen begynder; Således giver 13-dages tidsplanen fordelen ved en konsekvent ugentlig tidsplan, hvilket gør det muligt at udføre bioanalysen konsekvent på samme hverdag.
- Frø Caco-2-cellerne med en tæthed på 50.000 celler / cm2 i 6-brønds kollagenbelagte plader.
4. In vitro fordøjelse
- Klargøring af indsatsringe
- Opret en steriliseret skærring ved hjælp af en silikone O-ring udstyret med en syrevasket dialysemembran (figur 1A).
BEMÆRK: Forbered indsatser 1 dag i forvejen (dvs. mandag, dag 12) på dagen for bioanalysen og opbevar i 18 MΩ vand ved 4 ° C, indtil de er klar til brug. - På dagen for bioanalysen (tirsdag, dag 13) skal du fjerne indsatserne fra køleskabet, afløbet og udskifte vandet med 0,5 M HCI. Lad det stå ved stuetemperatur i en laminær strømningshætte i mindst 1 time før brug.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres, inden MEM fjernes fra kulturpladerne. Syrevask af membranen tjener til at fjerne mulig forurenende Fe og steriliserer indsatsringen og membranen. - Tøm 0,5 M HCl fra indsatserne og skyl med sterilt 18 MΩ vand. Opbevares i sterilt 18 MΩ vand ved stuetemperatur i en laminær strømningshætte, indtil den er klar til brug.
- Indsæt en ring i hver brønd i 6-brøndspladerne med Caco-2-celler, hvorved der skabes et tokammersystem. Returner pladerne med indsatserne til inkubatoren.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres lige efter, at der er tilføjet friske 1,0 ml MEM til hver brønd (se trin 3.2.5.).
- Opret en steriliseret skærring ved hjælp af en silikone O-ring udstyret med en syrevasket dialysemembran (figur 1A).
- Fremstilling af pepsinopløsning
- På forsøgsdagen fremstilles pepsinopløsningen ved at opløse 0,145 g pepsin i 50 ml 0,1 M HCI. Ryst opløsningen forsigtigt på en platformryster i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Fremstilling af pancreatin-galdeopløsning
- Samme dag som eksperimentet tilberedes 0,1 M NaHCO 3 ved at opløse 2,1 g NaHCO3 i 250 ml 18 MΩ vand.
- Bland 0,35 g pancreatin og 2,1 g galdeekstrakt i 175 ml 0,1 M NaHCO3.
- Når pancreatin og galdeekstrakt er opløseligt, tilsættes 87,5 g af en svag kationbytterharpiks (se materialetabellen) og blandes ved at ryste i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Hæld gyllen i en stor søjle og saml eluatet.
- Elute søjlen med yderligere 70 ml 0,1 M NaHCO3, og opsamling dette volumen i pancreatin galdeopløsningen.
BEMÆRK: Formålet med harpiksen er at fjerne forurenende Fe, der almindeligvis findes i pancreatin-galdeekstrakterne.
- Initier in vitro fordøjelse.
- Prøven afvejes i et sterilt 50 ml centrifugerør (polypropylen) efterfulgt af tilsætning af 10 ml fysiologisk saltvand ved pH 2, indeholdende 140 mM NaCl og 5 mM KCl.
- Gastrisk fordøjelsesproces initieres ved at tilsætte 0,5 ml af den tilberedte porcine pepsinopløsning til prøven og inkuberes på en rokkeryster ved en lav, skånsom indstilling i 1 time ved 37 °C.
- Efter denne periode initieres tarmfordøjelsesprocessen for hver prøve ved at justere pH til 5,5-6,0 med 1,0 M NaHCO3.
- Der tilsættes 2,5 ml pancreatin-galdeopløsning til hvert prøverør, og pH-værdien justeres til 6,9-7,0 med 1,0 M NaHCO3.
- Når pH-værdien er justeret, udlignes volumenet i hvert rør ved hjælp af 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6,7) opløsning, idet rørets vægt måles med en målværdi på 15 g.
BEMÆRK: For nogle fødevarer kan det være nødvendigt at bringe det samlede volumen til 16 g eller 17 g afhængigt af fødevarens bufferkapacitet. - Overfør 1,5 ml af hver tarmfordøjelse til det øverste kammer (dvs. indeholdende indsatsringen med dialysemembranen) af en tilsvarende brønd i 6-brønds kulturpladen indeholdende Caco-2-cellerne (figur 1B).
- Pladedækslet udskiftes, og der inkuberes ved 37 °C (5 % CO 2 luftatmosfære) på en rokkeryster ved 6 svingninger/min i2 timer.
- Fjern indsatsringen med fordøjelsen, og tilsæt yderligere 1 ml MEM (pH 7) til hver brønd.
- Cellekulturpladen returneres til inkubatoren (37 °C; 5% CO2 luftatmosfære) i yderligere 22 timer.
- Efter 22 timer fjernes cellekulturmediet, og der tilsættes 2,0 ml 18 MΩ vand til cellemonolaget.
BEMÆRK: Vandet vil osmotisk lyse cellerne. - Høst hele cellelysatet i standard polypropylenmikrocentrifugerør eller lignende til efterfølgende celleprotein- og celleferritinanalyser.
5. Måling af Caco-2 celleferritin og celleprotein
- Brug cellelysatet fra trin 4.4.10. til måling af celleferritin og protein.
- For at måle ferritinindholdet i Caco-2-cellerne skal du følge sættets instruktioner (se materialetabellen) med undtagelse af at øge inkubationstiden fra 30 minutter til 2 timer for musens anti-ferritin-antistof-peberrodsperoxidase (HRP) konjugat.
- For at måle celleprotein skal du følge instruktionerne i celleproteinsættet (se materialetabellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifikation og måling af Fe-biotilgængelighed i basisfødevareafgrøder
En af de primære grunde til at udvikle denne model var at identificere faktorer, der påvirker Fe-biotilgængeligheden i basisfødevareafgrøder og give et værktøj til planteforædlere, der ville sætte dem i stand til at identificere og udvikle sorter med forbedret Fe-biotilgængelighed. Den almindelige bønne (Phaseolus vulgaris) er blevet målrettet globalt som en afgrøde til Fe biofortification; Modellen er således blevet anvendt i vid udstrækning til at evaluere Fe's ernæringsmæssige kvalitet i en bred vifte af bønnemarkedsklasser og bønneavlsprogrammer. For eksempel er gule bønner en ny markedsklasse i USA. I regioner som Østafrika er de meget populære og er almindeligt kendt for at være hurtigkogende og anses af mange for at være "lette at fordøje." Nylige undersøgelser med Caco-2-cellebioanalysen har vist, at visse sorter af gule bønner kan have høj Fe-biotilgængelighed i forhold til andre farveklasser (figur 2). I denne undersøgelse blev Manteca-sorterne identificeret som værende høje i Fe-biotilgængelighed i forhold til referencekontroller af de hvide og rødbrogede farveklasser. Desuden var resultaterne konsistente over to på hinanden følgende høstår. Sådanne sammenligninger er simpelthen ikke mulige i andre modeller, især in vivo-modeller , på grund af de høje omkostninger og meget lavere gennemstrømning af dyreforsøg og menneskelige forsøg.
Evaluering af fødevareforarbejdningseffekter på Fe-biotilgængeligheden
Caco-2-cellebioanalysen kan også anvendes til at evaluere fødevareforarbejdningseffekter på Fe-biotilgængelighed. For eksempel er resultaterne i figur 3 fra en analyse af bønner og bønnebaseret pasta med flere farveklasser. Resultaterne viser, hvordan forarbejdning af bønnerne til et mel øgede Fe-biotilgængeligheden fra hvide (Snowdon, Alpena og Samurai) og gule (Canario) bønnesorter. For tranebær (Etna), rød nyre (Red Hawk) og sort (Zenith) sorter faldt Fe biotilgængeligheden i pastamelpræparaterne. Relaterede analyser viste, at forarbejdning af bønnerne til et mel forstyrrede bønnernes cotyledoncellevægge, hvilket gjorde den intracellulære Fe tilgængelig for optagelse. Jernoptagelsen steg i den hvide og gule bønnepasta, da frøbeklædningerne af disse sorter ikke indeholdt polyfenoliske forbindelser, der hæmmer Fe-biotilgængeligheden. I modsætning hertil indeholder frøbeklædningerne af tranebær, rød nyre og sorte bønner høje niveauer af hæmmende polyfenoler, hvilket reducerer Fe-optagelsen. Disse resultater viser tydeligt modellens anvendelighed til at udsætte faktorer, der kan påvirke Fe's ernæringsmæssige kvalitet, som ellers ikke ville blive opdaget.
Figur 1: Indsæt ringopsætning for Caco-2-celle Fe-optagelse. (A) Billede af Caco-2-celler og indsæt ring med vedhæftet dialysemembran. (B) Diagram over den samlede procedure for in vitro-fordøjelse kombineret med Caco-2-celle Fe-optagelse i en enkelt brønd af multibrøndpladen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Jernbiotilgængelighedsscorer af uhæmmede og kogte helfrøgenotyper i et varieret panel af gule bønner. (A) Field sæson 2015; (B) felt sæson 2016. Værdier er midler (standardafvigelse) af tredobbelte målinger fra to feltreplikater pr. genotype (n = 6). Genotyper er kategoriseret på x-aksen efter madlavningskursus, rangeret fra den hurtigste madlavningsgenotype til den langsomste madlavningspost. *Signifikant lavere (p < 0,05) jernbiotilgængelighedsscore end de andre YBP-poster. **Signifikant højere (p < 0,05) jernbiotilgængelighedsscorer end de andre YBP-genotyper. Dette tal blev ændret fra32. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Jernbiotilgængelighed udtrykt som dannelse af Caco-2-celleferritin (nanogram ferritin pr. milligram celleprotein) af bønnesorter og deres tilsvarende bønnebaserede spaghettis. A) tre hvidbønnesorter og deres tilsvarende bønnebaserede spaghettis B) fire farvede bønnesorter og deres tilsvarende bønnebaserede spaghettis. Værdier er middelværdien (± standardafvigelse) af seks målinger fra hver sort. Den blå bindestreg angiver jernbiotilgængeligheden af en ikke-beriget hård hvedepastakontrol ekstruderet, kogt og forarbejdet på samme måde som den bønnebaserede spaghettis. *Signifikant (p ≤ 0,05) højere dannelse af Caco-2-celleferritin end hele bønner efter tilberedning. **Signifikant (p ≤ 0,05) lavere dannelse af Caco-2-celleferritin end hele bønner efter tilberedning. Dette tal blev ændret fra33. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siden starten er der offentliggjort adskillige undersøgelser, der beskriver denne metode til Caco-2-cellebioassayet. De grundlæggende betingelser har været forholdsvis uændrede siden den første offentliggørelse i 199818. I løbet af de sidste 20 år er adskillige tekniske detaljer imidlertid blevet raffineret og standardiseret for at give hidtil uset konsistens i bioassayets respons. Omhyggelig og præcis overholdelse af cellekulturen og in vitro-fordøjelsesbetingelser er nøglen til bioassayets konsekvente og følsomme respons.
Fra vores erfaring med at træne mange individer i brugen af denne metode er den mest almindelige kamp den korrekte kultur af Caco-2-cellerne. Konsekvent kultur af sunde monolag er nøglen til sunde og lydhøre Caco-2-cellemonolag. Hvis celleproteinniveauerne ikke er meget konsistente fra brønd til brønd og ikke inden for det område af celleprotein, der er anført i protokollen, bør investigator undersøge cellekulturbetingelserne for afvigelse fra protokollen. Alternativt kan der eksistere lavniveaumikroorganismeforurening, cellekulturinkubatoren fungerer muligvis ikke korrekt, eller cellekulturmediet er muligvis ikke korrekt formuleret.
In vitro-fordøjelsesprocessen er en anden kilde til potentielle problemer. Fjernelse af forurenende Fe fra fordøjelsesenzymerne er kritisk. På trods af producentens påstande er det klogt med jævne mellemrum at kontrollere Fe-koncentrationen af enzymerne og sørge for, at Fe-fjernelsesprocessen (se protokollen) er effektiv. Hvis Fe-forurening er til stede i fordøjelsesenzymerne, vil baseline digest kvalitetskontrol give celleferritinværdier ud over det anbefalede interval.
En erfaren og uddannet efterforsker skal være i stand til at analysere 20 eksperimentelle prøver plus kvalitetskontrollen i en enkelt kørsel af bioassayet. Således er der brug for ca. 12 seks-brøndsplader til hver kørsel af bioassayet. Et højere antal prøver pr. bioassay anbefales ikke, da tidspunktet for pH-titrering under fordøjelsesprocessen kan være for langt, hvilket fører til potentiel inkonsekvens mellem prøvefordøjelsestiderne.
Ulemperne ved denne model er relativt få. Det kræver efterforskere, der er højt kvalificerede inden for cellekultur og i stand til præcis opmærksomhed på detaljer og protokol. Laboratorierummet skal være rent for kilder til Fe-forurening, og reagenser og andre materialer skal rutinemæssigt overvåges for Fe-forurening. Brugeren skal således have mulighed for eller adgang til instrumentering til måling af Fe-koncentration. Denne model er kun et relativt eller semikvantitativt mål. Ved korrekt brug af referencekontroller kan modellen imidlertid give nogle kvantitative skøn over Fe-absorptionen. Faktisk er der genereret en konverteringsligning af absorptionsforhold mellem kontrol og testmateriale19.
Bioassay fungerer efter følgende princip: Caco-2-celler producerer mere ferritinprotein som reaktion på stigninger i cellulære Fe-koncentrationer. Derfor er Fe biotilgængelighed proportional med stigningen i Caco-2 celleferritinproduktion. Denne stigning udtrykkes som et forhold mellem celleferritin og det samlede Caco-2-celleprotein (nanogram ferritin pr. milligram totalt celleprotein) efter eksponering for en fordøjet prøve19. Ferritinmålinger foretages ved hjælp af et ELISA-sæt (se materialetabellen), der er testet for respons i dette bioassay. De samlede celleproteinkoncentrationer kvantificeres ved hjælp af et proteinanalysesæt. Som tidligere nævnt varierer typiske Caco-2-celleproteinniveauer i en seks-brøndplade under de betingelser, der anvendes til denne metode, fra 2,0 mg til 2,6 mg celleprotein pr. Brønd. Værdier uden for dette interval indikerer usunde cellekulturer, mulig tilgroning af celler eller dårlig cellesåningsteknik. Inden for en given kørsel af bioassayet bør værdierne kun variere op til 0,2 mg pr. Brønd. Under såtæthederne og dyrkningsbetingelserne, der anvendes i denne metode, er der desuden betydelig børstegrænseenzymaktivitet 13 dage efter såning, hvilket indikerer modning af de fleste, hvis ikke alle, cellemonolaget28,29,30. Overvåg cellemonolag i løbet af de 13 dage før brug for forurening eller stress, såsom vakuoldannelse eller huller i monolagsdannelse. Hvis sådanne forhold er tydelige, bør cellerne ikke betragtes som gyldige til brug i bioassayet.
For at overvåge Caco-2-bioassayets lydhørhed skal hvert eksperiment køres med flere kvalitetskontroller, herunder en blank fordøjelse, der kun indeholder den fysiologisk afbalancerede saltvand og de gastrointestinale enzymer. Disse kontroller sikrer, at der ikke er nogen Fe-forurening i bioassayet. Ferritinværdier af Caco-2-celler udsat for den tomme fordøjelse varierer typisk fra 1 ng til 6 ng ferritin / mg celleprotein. Baseline ferritin i dette interval indikerer også, at cellerne har relativt lav Fe-status og derfor bør udvise maksimal følsomhed over for tilgængelig Fe.
I de første 15 års brug omfattede yderligere kvalitetskontrol 1) en blindfordøjelse med FeCl 3 (66 μM) og 2) en blank fordøjelse af FeCl 3 (66 μM) plus tilsætning af1,3 mM ascorbinsyre. Ferritinværdier for FeCl 3-fordøjelsen lå typisk i området 30-50 ng ferritin/mg-celleprotein, og FeCl3-fordøjelsen med ascorbinsyre lå i området 250-400 ng ferritin/mg-celleprotein. I de senere år forbliver den tomme fordøjelse en kvalitetskontrol; Vi er dog gået over til at bruge en fødevareprøve med og uden ascorbinsyre i et forhold på 20:1, ascorbat:Fe. Den anvendte fødevareprøve var et hvidt bønnemel, der indeholder ca. 65 μg Fe / g prøve. Disse kvalitetskontroller giver et snævrere og mere ensartet responsområde, hvilket giver 20-30 ng ferritin/mg celleprotein til det hvide bønnemel og 70-150 ng ferritin/mg celleprotein til det hvide bønnemel plus ascorbat. Det skal bemærkes, at den nye række værdier er fra det refererede sæt i materialetabellen, som har tendens til at være lidt lavere end det nu hedengangne Ramco ELISA-sæt. Fra offentliggørelsen af dette manuskript er der kun erhvervet 2-3 måneders data med det refererede sæt.
Det er vigtigt at genkende resultaterne og cellekulturbetingelserne, der indikerer en ugyldig eller suboptimal kørsel af bioassayet. For det første, som anført i metoderne, hvis de tomme fordøjelsesbetingelser giver celleferritinkoncentrationer højere end det foreslåede interval, kan dette være tegn på Fe-forurening af cellekulturmediet, fordøjelsesenzymerne eller dialysemembranen. Acceptable Fe-koncentrationer for cellekulturmedierne og fordøjelsesenzymerne er <20 μg Fe/ml. Værdier uden for intervallet for de andre kvalitetskontroller, især hvis de er på den lave side, indikerer også, at resultaternes gyldighed er tvivlsom.
Sammenfattende er denne model meget følsom over for biotilgængelig Fe, da cellekulturbetingelserne er designet til at skabe celler med lav Fe-status; således er deres mekanismer for Fe-optagelse stærkt opreguleret. Det er en robust model, der er i stand til høj gennemstrømning. Enhver mad eller diæt, der kan fodres til mennesker, kan vurderes i denne model, og derfor har bioanalysen en bred vifte af anvendelser. Planteforædlere kan bruge denne model til at måle Fe-biotilgængelighed i basisfødevarer og identificere træk og kromosomale regioner, der påvirker Fe-biotilgængeligheden. Fødevareforskere kan anvende modellen til at bestemme optimale formuleringer og evaluere virkningerne af forarbejdning for at sikre tilstrækkelig Fe-biotilgængelighed. Ernæringseksperter kan bruge modellen til at evaluere og overvåge kostens Fe-biotilgængelighed fra individuelle fødevarer, madkombinationer og endda kostplaner. Det er blevet grundigt valideret til menneskelige forsøg, der korrekt forudsiger retningen og størrelsen af effekter i hver applikation. Ved at kombinere simuleret fordøjelse med tarmepitelcelle Fe-optagelse repræsenterer denne model således det kritiske første trin i Fe-absorptionsprocessen og er derfor i stand til at forudsige levering eller biotilgængelighed af Fe fra fødevarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatteren er dybt taknemmelig for den tekniske indsats fra Yongpei Chang og Mary Bodis. Den ekstremt vellykkede anvendelse af denne model inden for ernæring er et direkte resultat af deres ekspertise og opmærksomhed på detaljer. Udviklingen af denne model blev finansieret udelukkende af det amerikanske landbrugsministerium, Agricultural Research Service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
References
- Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
- Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
- Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
- Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
- Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
- Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
- Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
- Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
- Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
- Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
- Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
- Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
- Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
- Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O'Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
- Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
- Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
- Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
- Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
- Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
- Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
- Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
- Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
- Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
- Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
- Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
- Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
- Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
- Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
- Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).
