Summary
O bioensaponenciamento celular Caco-2 para biodisponibilidade de ferro (Fe) representa uma abordagem econômica e versátil para avaliar a biodisponibilidade da Fe a partir de alimentos, produtos alimentícios, suplementos, refeições e até regimes dietéticos. Validada minuciosamente aos estudos humanos, representa o estado da arte para estudos de biodisponibilidade fe.
Abstract
O conhecimento da biodisponibilidade fe é fundamental para a avaliação da qualidade nutricional da Fe nos alimentos. A medição in vivo da biodisponibilidade fe é limitada pelo custo, throughput e as ressalvas inerentes à rotulagem isotópica do alimento Fe. Assim, existe uma necessidade crítica de uma abordagem de alto rendimento e custo-benefício. O bioensaio celular Caco-2 foi desenvolvido para satisfazer essa necessidade. O bioensaio celular Caco-2 para biodisponibilidade fe utiliza digestão gástrica e intestinal simulada juntamente com a cultura de uma linha celular epitelial intestinal humana conhecida como Caco-2. Nas células de Caco-2, a absorção de Fe estimula a formação intracelular de ferritina, uma proteína de armazenamento Fe facilmente medida por ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA). Forma-se de ferritina proporcional à absorção de Fe; assim, medindo a produção de ferritina celular Caco-2, pode-se avaliar a absorção intestinal de Fe a partir de digestões simuladas de alimentos para o enterócito.
Através dessa abordagem, o modelo replica o passo inicial chave que determina a biodisponibilidade de Alimentos Fe. Desde sua criação, em 1998, essa abordagem modelo tem sido rigorosamente comparada a fatores conhecidos por influenciar a biodisponibilidade humana fe. Além disso, tem sido aplicado em estudos paralelos, com três estudos de eficácia humana avaliando culturas bioesforificadas da Fe. Em todos os casos, o bioensaio previu corretamente as quantidades relativas da biodisponibilidade fe dos fatores, culturas e dieta geral. Este artigo fornece métodos detalhados sobre a cultura celular Caco-2, juntamente com o processo de digestão in vitro e ferritina celular ELISA necessário para conduzir o bioensa de célula Caco-2 para biodisponibilidade fe.
Introduction
Para entender completamente a necessidade e o benefício da pesquisa da biodisponibilidade celular Caco-2 para a biodisponibilidade da Fe, é preciso primeiro entender as abordagens que estavam em vigor antes do advento desse modelo. A medição da biodisponibilidade fe a partir de um alimento ou refeição in vivo é uma tarefa desafiadora, particularmente quando combinações de alimentos precisam ser avaliadas em uma refeição ou dieta. A rotulagem isotópica tem sido a abordagem mais comum para a medição da biodisponibilidade fe nos últimos 50 anos1. A rotulagem isotópica é usada para estudos de refeição única e múltiplas refeições e é impraticável para estudos de longo prazo. Isótopos estáveis de Fe como 57Fe e 58Fe são os mais utilizados; no entanto, estudos têm sido realizados com radioisótopos como 59Fe, utilizando a contagem de corpo inteiro2. Para alimentos vegetais, a rotulagem isotópica tem sido feita através de rotulagem extrínseca ou intrínseca. Para rotulagem extrínseca, uma quantidade conhecida de isótopo é adicionada à comida ou refeição. O alimento é então misturado, e um período de equilíbrio de 15-30 min é incorporado ao protocolo antes do consumo. A cultura hidropônica que adiciona o isótopo à solução de nutrientes para incorporá-lo na planta enquanto ela cresce e se desenvolve - é necessária para a rotulagem intrínseca de alimentos vegetais. Os prós e contras de cada abordagem são discutidos abaixo.
Rotulagem isotópica extrínseca
No início da década de 1970, a absorção de Fe humano foi estudada pela rotulagem extrínseca de Fe em alimentos, onde uma quantidade conhecida de isótopo é adicionada à quantidade conhecida de Fe na comida ou refeição, misturada e equilibrada por 15-30 minutos antes das medições. Várias quantidades de isótopos extrínsecos têm sido utilizadas, variando de 1% a 100% do Fe intrínseco, mas mais comumente na faixa de 7%-30%3. A rotulagem extrínseca baseia-se no pressuposto de que o isótopo fe extrínseco fica totalmente equilibrado com o Fe intrínseco da comida ou refeição. A absorção de isótopos extrínsecos é então medida, e cada átomo do isótopo extrínseco é calculado para representar um determinado número de átomos fe intrínsecos. Este cálculo é baseado nas quantidades relativas molares. Em 1983, múltiplos estudos de validação da técnica foram resumidos em artigode revisão 4. A validação da técnica foi feita comparando simultaneamente a absorção percentual do rótulo isotópico extrínseco à absorção percentual de um rótulo isotópico intrínseco. Assim, uma razão da absorção extrínseca para intrínseca próxima a 1 sugere que cada piscina de Fe foi igualmente absorvida. Na época, também foi considerada uma relação próxima a 1, representando o equilíbrio do isótopo extrínseco com o Fe intrínseco da comida ou refeição. As razões de absorção fe extrínseca à intrínseca variaram de valores médios de 0,40 a 1,62, com razão média (±SD) de 1,08 ± 0,14 em 63 comparações. É importante notar que, em todos os estudos resumidos nesta revisão, nenhum testou diretamente o equilíbrio do rótulo extrínseco com o Fe intrínseco. Em resumo, os autores da revisão concluíram o seguinte:
"A técnica de etiqueta extrínseca tem se mostrado válida para vários alimentos em determinadas condições experimentais. Mas, esse método ainda não pode ser considerado comprovado em relação a todos os tipos de alimentos. O método de etiqueta extrínseca não é apropriado para monitorar a absorção de ferro a partir de uma dieta que contém formas insolúveis de ferro. A validade desta técnica baseia-se no pressuposto básico de que a tag extrínseca troca completamente com todo ferro alimentar não-hemo endógeno. No momento, não se sabe como completamente as diferentes formas de ferro não-heme são rotuladas por uma tag extrínseca. Isso é importante à luz de estudos que sugerem que os inibidores de ferro podem afetar a etiqueta extrínseca de forma diferente de algumas formas de ferro não-heme nos alimentos. Pesquisas sobre fatores alimentares que podem prejudicar uma troca isotópica completa são escassas. Assim, a interpretação dos dados de biodisponibilidade da pesquisa de etiquetas extrínsecas requer a consideração de inibidores de troca que possam estar presentes na alimentação ou na dieta."
Desde 1983, foram publicados apenas dois estudos que avaliaram a exatidão da rotulagem extrínseca de Fe 3,5. Em ambos os estudos, o equilíbrio de um rótulo isotópico extrínseco foi diretamente comparado com o Fe intrínseco dos alimentos, que, nesses estudos, eram culturas alimentares básicas. Foram testadas variedades de feijão branco, vermelho e preto, juntamente com lentilhas e milho. Utilizando técnicas de digestão in vitro estabelecidas e a medição da solubilidade e precipitação de Fe, ambos os estudos demonstraram que a rotulagem isotópica extrínseca não resulta consistentemente em equilíbrio total, com evidências de que, para algumas variedades de feijão, a misequilibração pode ser muito alta dependendo da quantidade de isótopo extrínseco e da cordo casaco de sementes 3. Apesar das conclusões do artigo de revisão de 1983, os estudos de rotulagem extrínseca de feijão continuaramem 6,7,8,9,10,11,12. Nenhum desses estudos incluiu testar o equilíbrio do rótulo extrínseco com o Fe intrínseco.
Rotulagem intrínseca
A rotulagem intrínseca de alimentos vegetais para a avaliação da biodisponibilidade fe elimina as questões de precisão do equilíbrio na rotulagem extrínseca. No entanto, essa abordagem não pode produzir grandes quantidades de material devido à exigência de espaço de estufa para a cultura hidropônica. A cultura hidropônica é intensiva em mão-de-obra, requer uma alta quantidade de isótopo estável caro, e muitas vezes resulta em crescimento vegetal diferente em termos de produção e concentração de sementes Fe. Devido ao custo, a rotulagem intrínseca só é adequada para estudos de pequena escala que visam compreender mecanismos subjacentes à absorção de Fe ou fatores que influenciam a absorção de Fe dos alimentos. A produção de 1-2 kg de uma cultura de alimentos básicos custa aproximadamente US $ 20.000-US $ 30.000 apenas para materiais, dependendo do isótopo e abordagem hidropônica13,14.
Dado os desafios associados à rotulagem isotópica, os investigadores procuraram desenvolver abordagens in vitro. Os métodos iniciais utilizaram alimentos gástricos e intestinais simulados, juntamente com a medição da solubilidade fe ou dialyzabilidade fe como estimativa de biodisponibilidade15. Tais estudos rapidamente descobriram que a dialise fe não era uma medida consistente de biodisponibilidade, pois Fe pode ser solúvel, firmemente ligado a compostos e, portanto, não trocável, levando à superestimação da biodisponibilidade. Para lidar com essas questões, evoluiu a metodologia de utilização de uma linha celular intestinal humana, adicionando assim um componente vivo e permitindo a medição da captação de Fe16. As células intestinais humanas-Caco-2 foram originadas de um carcinoma de cólon humano e têm sido amplamente utilizadas em estudos de absorção de nutrientes. Esta linha celular é útil, pois, na cultura, as células se diferenciam em enterócitos que funcionam de forma semelhante às células fronteiriças do intestino delgado. Estudos mostram que as células Caco-2 apresentam os transportadores apropriados e resposta a fatores que influenciam a absorçãode Fe 17,18.
Os estudos iniciais, utilizando radioisótopos para medir a absorção de Fe em células Caco-2, foram refinados para medir a absorção de Fe com base na formação de ferritina celular Caco-2. A medição da ferritina celular Caco-2 aumentou o rendimento da amostra e negou questões de manuseio de radioisótopos e o equilíbrio da Fe extrínseca com fe intrínseco19,20. A medição da absorção de Fe através da formação de ferritina permitiu aos pesquisadores estudar uma ampla gama de alimentos, incluindo refeições complexas21. Assim, a digestão simulada (in vitro) juntamente com a absorção fe celular Caco-2 proporcionou uma melhor avaliação fisiológica da absorção fe dos alimentos. É importante notar que este modelo determina principalmente diferenças relativas na biodisponibilidade fe. Como muitas linhas celulares úteis, as células Caco-2 também mostraram variabilidade na responsividade, mas mantiveram diferenças relativas consistentes na absorção de Fe entre os alimentos. A técnica adequada e a atenção cuidadosa aos detalhes podem melhorar a resposta consistente da formação de ferritina celular nas células Caco-2.
O modelo de célula in vitro/Caco-2 também é conhecido como bioensaio celular Caco-2. Este ensaio foi minuciosamente validado por meio de comparação direta com estudos humanos e animais22. Além da comparação paralela direta do bioensativo aos ensaios de eficácia humana, este modelo tem mostrado uma resposta qualitativamente semelhante na absorção de Fe à de humanos 18,19,23. Portanto, como abordagem in vitro, o bioensa de células Caco-2 garante alta credibilidade como ferramenta de triagem para avaliação da nutrição fe a partir de alimentos. Tem sido amplamente aplicado a inúmeros alimentos e produtos alimentícios 21,24,25,26,27,28.
Desde sua criação, em 1998, o bioensaio celular Caco-2 avançou no campo da nutrição fe, pois ajudou a identificar fatores que influenciam a absorção intestinal do Fe. Ao fazê-lo, esse modelo desenvolveu e refinou os objetivos de pesquisa para estudos humanos mais definitivos e menos dispendiosos. Pode-se também argumentar que o uso do modelo nega a necessidade de alguns testes em humanos.
Em resumo, a entrega relativa de Fe de um alimento ou refeição pode ser medida com o bioensaio celular Caco-2. Independentemente da quantidade de Fe na refeição de teste, o bioensaio define a quantidade relativa de Fe levada para o enterócito - a primeira etapa do processo de absorção. Este é o passo mais importante na definição da biodisponibilidade fe, pois na maioria das vezes o objetivo é medir com a intenção de melhorar ou, no mínimo, monitorar a qualidade nutricional de Fe em um alimento. Dado que o estado do ferro é regulado pela absorção e, portanto, a absorção de Fe é regulada em indivíduos deficientes fe para atender às necessidades nutricionais, as condições padrão do modelo são projetadas para que a absorção fe pelas células seja máxima. Dessa forma, o bioensaio fornece uma verdadeira medida do potencial do alimento para entregar Fe.
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Protocol
NOTA: Como ponto de referência conveniente para os leitores, a seguinte metodologia descreve as condições de cultura específicas e materiais necessários para a medição da biodisponibilidade fe a partir de 20 amostras experimentais, além dos controles de qualidade necessários, em uma execução do bioensaio. O aumento do número de amostras além dessa capacidade não é recomendado devido ao tempo necessário para várias culturas celulares e etapas de digestão in vitro dentro do bioensaio.
1. Escolher a quantidade de amostras
- Para alimentos sólidos ou líquidos, determine uma quantidade de alimentos que podem ser considerados representativos da amostra a ser testada.
- Em testes para biodisponibilidade fe de uma variedade de feijão, use 100-150 g de semente de feijão e processe essa quantidade para uma amostra homogênea.
- Para amostras líquidas, como sucos fortificados, produtos lácteos e bebidas esportivas, certifique-se de que os alimentos estão bem misturados antes da amostragem.
NOTA: A quantidade de material de semente de feijão mencionado acima é essencial para explicar as diferenças inerentes entre as sementes desta cultura de grampo.
2. Preparação de amostras
- Enxágüe o solo e a poeira de qualquer amostra de alimentos com água destilada desionizada antes do processamento.
- Processe a quantidade adequada de amostra conforme os objetivos experimentais, como pelo método de cozimento e fresagem.
NOTA: Para cozinhar e processar, é fundamental usar panelas e equipamentos que não são uma fonte potencial de contaminante Fe. Equipamento de aço inoxidável não contamina; no entanto, equipamentos como moedores de moinho de pedra, panelas de ferro fundido e qualquer equipamento de aço não inoxidável contendo Fe pode adicionar quantidades significativas de Fe contaminante. Um moedor de café de aço inoxidável padrão é muitas vezes adequado para moagem. - Lyophilize e triture em pó homogêneo.
NOTA: Uma vez homogeneizadas, pesquisas mostraram que três replicações independentes de análise são adequadas para cada alimento que está sendo medido.- Se a homogeneidade da amostra for difícil de alcançar, revise a formulação ou processamento do produto. Se isso não for possível, adicione replicações se a não homogeneidade não for grave.
- Para a maioria dos alimentos sólidos homogêneos, utilize 0,5 g de amostra liofilizada por réplica. Se necessário, use até 1,0 g de amostra por réplica, mas verifique se mais de 0,5 g produz um benefício no grau de resposta.
NOTA: Quantidades superiores a 0,5 g de alimentos sólidos podem entupir a membrana de diálise (veja abaixo). - Use 1-2 mL de amostras líquidas.
NOTA: A lyofilização muitas vezes não é necessária para amostras líquidas.
3. Cultura celular caco-2
- Culturas de ações
- Adquira células Caco-2 de um fornecedor certificado.
- Cultura as células a partir de frascos de estoque a 37 °C em uma incubadora com atmosfera de ar de 5% CO2 (umidade constante) usando o Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco complementado com 25 mM HEPES (pH 7.2), 10% (v/v) soro bovino fetal (FBS) e 1% solução antimíctica antibiótico-antimíctica.
- Uma vez que células suficientes estão disponíveis, geralmente após 7-10 dias de cultura, semearam as células em frascos não revestidos de colágeno a uma densidade de 30.000 células/cm2.
- Escolha o tamanho do frasco dependendo do número de células disponíveis e necessárias para semeadura de placas multiwell.
NOTA: Em geral, os frascos T225 (225 cm2) funcionam melhor para experimentos onde são utilizadas 11 placas multiwell (6-well; 9,66 cm2/well) (10 placas para comparações de amostras, 1 placa para controles de qualidade) por bioensaio. - Cultivar células em frascos por 7 dias, mudando o meio a cada dois dias, e usar no7º dia para semear as placas multiwell.
NOTA: Recomenda-se usar uma faixa de passagem de no máximo 10-15 passagens de quando as células são iniciadas a partir da cultura do estoque e posteriormente usadas em uma série de experimentos. As passagens de cultura celular devem ser limitadas, pois uma ampla gama de passagens pode resultar em mudanças adaptativas na linha celular e, assim, variabilidade na resposta do modelo.
- Cultura celular em placas multiwell
- Semente as células Caco-2 a uma densidade de 50.000 células/cm2 em placas revestidas de colágeno de 6 poços.
NOTA: Esta etapa geralmente funciona melhor se feita em uma quarta-feira. Os seguintes passos tornarão evidente por que este dia da semana é ótimo. - Cresça as células por 12 dias a 37 °C em uma incubadora com atmosfera de ar de 5% de CO2 (umidade constante) utilizando DMEM complementado com HEPES de 25 mM (pH 7.2), 10% (v/v) FBS e 1% solução antimicomolética antibiótico.
NOTA: A colheita das monocamadas celulares por mais de 12 dias pode resultar em crescimento excessivo celular. Pesquisas anteriores mostraram claramente que, nessas condições, aos 12 dias após a semeadura, a monocamada celular é madura, bem presa à placa, e ótima na consistência da resposta 29,30,31. O crescimento das células por mais tempo, como até 19-21 dias, resulta em crescimento excessivo celular, e a mídia rapidamente se esgota em nutrientes, resultando em monocamadas não saudáveis. - Durante o período de 12 dias, troque o meio pelo menos a cada 2 dias em um horário diário consistente.
- No pós-semeadura de12 dias , substitua o meio de cultura por 2 mL de Meio Essencial Mínimo (MEM [pH 7]) complementado com PIPES de 10 mM (piperazine-N,N'-bis-[2-ácido estanolfônico]), solução antibiótico-antimicomolética de 1%, hidrocortisona (4 mg/L), insulina (5 mg/L), selênio (5 μg/L), triiodotironina (34 μg/L) e fator de crescimento epidérmico (20 μg/L).
NOTA: Se a semeadura fosse iniciada em uma quarta-feira, então o12º dia seria uma segunda-feira. - No dia seguinte (ou seja, dia 13), retire o MEM e substitua-o por 1 mL de MEM (pH 7).
NOTA: Esta etapa ocorreria em uma terça-feira. Este é o dia em que o bioensaio começa; assim, o cronograma de 13 dias rende a vantagem de um cronograma semanal consistente, permitindo que o bioensaio seja realizado de forma consistente no mesmo dia da semana.
- Semente as células Caco-2 a uma densidade de 50.000 células/cm2 em placas revestidas de colágeno de 6 poços.
4. Digestão in vitro
- Preparação de anéis de inserção
- Crie um anel de inserção esterilizado usando um anel O de silicone equipado com uma membrana de diálise lavada com ácido (Figura 1A).
NOTA: Prepare as pastilhas com 1 dia de antecedência (ou seja, segunda-feira, dia 12) do dia do bioensaio e armazene em 18 MΩ água a 4°C até estar pronto para uso. - No dia do bioensaio (terça-feira, dia 13), retire as pastilhas da geladeira, escorra e substitua a água por 0,5 M HCl. Deixe-a em temperatura ambiente em uma capa de fluxo laminar por pelo menos 1h antes de ser usada.
NOTA: Esta etapa deve ser feita antes de remover o MEM das placas de cultura. A lavagem ácida da membrana serve para remover a possível contaminação do Fe e esteriliza o anel e a membrana da inserção. - Escorra os 0,5 M HCl das pastilhas e enxágue com água estéril de 18 MΩ. Guarde em água estéril de 18 MΩ à temperatura ambiente em uma capa de fluxo laminar até estar pronta para uso.
- Insira um anel em cada poço das placas de 6 poços com células Caco-2, criando assim um sistema de duas câmaras. Devolva as placas com as pastilhas para a incubadora.
NOTA: Esta etapa deve ser feita logo após a adição de 1,0 mL de MEM a cada poço (ver Passo 3.2.5.).
- Crie um anel de inserção esterilizado usando um anel O de silicone equipado com uma membrana de diálise lavada com ácido (Figura 1A).
- Preparação da solução pepsina
- No dia do experimento, prepare a solução pepsina dissolvendo 0,145 g de pepsina em 50 mL de 0,1 M HCl. Agite a solução suavemente em um agitador de plataforma por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Preparação da solução pancreatina-bile
- No mesmo dia do experimento, prepare 0,1 M NaHCO3 dissolvendo 2,1 g de NaHCO3 em 250 mL de 18 MΩ de água.
- Misture 0,35 g de pancreatina e 2,1 g de extrato de bile em 175 mL de 0,1 M NaHCO3.
- Uma vez que o extrato de pancreatina e biliar seja solubilizado, adicione 87,5 g de uma fraca resina de troca de cáção (ver a Tabela de Materiais) e misture tremendo por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Despeje o chorume em uma coluna grande e colete o elunato.
- Elute a coluna com um adicional de 70 mL de 0,1 M NaHCO3, coletando este volume na solução bile pancreatina.
NOTA: O objetivo da resina é remover o contaminante Fe comumente encontrado nos extratos de pâncreas-bile.
- Iniciar digestão in vitro .
- Pesar a amostra em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL (polipropileno), seguido pela adição de 10 mL de soro fisiológico no pH 2, contendo 140 mM NaCl e 5 mM KCl.
- Inicie o processo de digestão gástrica adicionando 0,5 mL da solução de pepsina suína preparada à amostra e incubar em um agitador de balanço em um ajuste baixo e suave por 1h a 37 °C.
- Após esse período, inicie o processo de digestão intestinal de cada amostra ajustando o pH para 5,5-6,0 com 1,0 M NaHCO3.
- Adicione 2,5 mL da solução pancreatina-bile a cada tubo de amostra e ajuste o pH para 6,9-7,0 com 1,0 M NaHCO3.
- Uma vez ajustado o pH, equalize o volume em cada tubo usando a solução de 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6.7), medindo o peso do tubo com um valor-alvo de 15 g.
NOTA: Para alguns alimentos, pode-se precisar levar o volume total para 16 g ou 17 g, dependendo da capacidade de tampão dos alimentos. - Transfira 1,5 mL de cada digestão intestinal para a câmara superior (ou seja, contendo o anel de inserção com a membrana de diálise) de um poço correspondente da placa de cultura de 6 poços contendo as células Caco-2 (Figura 1B).
- Substitua a tampa da placa e incubar a 37 °C (atmosfera de ar de 5% CO2 ) em um agitador de balanço a 6 oscilações/min por 2h.
- Remova o anel de inserção com o digestor e adicione mais 1 mL de MEM (pH 7) a cada poço.
- Retorne a placa de cultura celular à incubadora (37 °C; 5% de atmosfera de ar CO2 ) por mais 22 h.
- Após 22 h, remova o meio de cultura celular e adicione 2,0 mL de água de 18 MΩ à monocamada celular.
NOTA: A água vai liseticamente as células. - Colher toda a célula lysate em tubos padrão de microcentrífugo de polipropileno ou semelhante para análises subsequentes de proteína celular e ferritina celular.
5. Medição da ferritina celular Caco-2 e proteína celular
- Use o lisecelular do passo 4.4.10. para a medição da ferritina celular e proteína.
- Para medir o teor de ferritina das células Caco-2, siga as instruções do kit (veja a Tabela de Materiais), com exceção do aumento do tempo de incubação de 30 min para 2 h para o conjugado de anticorpo anti-ferritina do rato (HRP).
- Para medir a proteína celular, siga as instruções fornecidas no kit de proteína celular (veja a Tabela de Materiais).
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Representative Results
Identificação e medição da biodisponibilidade de Fe em culturas de alimentos básicos
Uma das principais razões para o desenvolvimento desse modelo foi identificar fatores que influenciam a biodisponibilidade da Fe nas culturas alimentares básicas e fornecer uma ferramenta para os criadores de plantas que lhes permitiriam identificar e desenvolver variedades com biodisponibilidade fe aprimorada. O feijão comum (Phaseolus vulgaris) tem sido alvo globalmente como uma cultura para a biofortificação fe; assim, o modelo tem sido aplicado extensivamente para avaliar a qualidade nutricional da Fe em uma ampla gama de classes de mercado de feijão e programas de melhoramento de feijão. Por exemplo, os feijões amarelos são uma classe de mercado emergente nos Estados Unidos. Em regiões como a África Oriental, eles são altamente populares e são amplamente conhecidos por serem de cozimento rápido e considerados por muitos como "fáceis de digerir". Estudos recentes com o bioensa de células Caco-2 demonstraram que certas variedades de feijões amarelos podem ter alta biodisponibilidade fe em relação a outras classes de cor (Figura 2). Neste estudo, as variedades Manteca foram identificadas como elevadas em biodisponibilidade fe em relação aos controles de referência das classes de cores brancas e vermelhas. Além disso, os resultados foram consistentes ao longo de dois anos consecutivos de colheita. Tais comparações simplesmente não são viáveis em outros modelos, particularmente modelos in vivo , devido ao alto custo e rendimento muito menor de testes em animais e humanos.
Avaliação dos efeitos do processamento de alimentos na biodisponibilidade da Fe
O bioensaio celular Caco-2 também pode ser aplicado para avaliar os efeitos de processamento de alimentos na biodisponibilidade fe. Por exemplo, os resultados na Figura 3 são de uma análise de grãos e massas à base de feijão de múltiplas classes de cores. Os resultados demonstram como o processamento dos grãos em uma farinha aumentou a biodisponibilidade fe das variedades de feijão branco (Snowdon, Alpena e Samurai) e amarelo (Canario). Para as variedades cranberry (Etna), rim vermelho (Falcão Vermelho) e preto (Zenith), a biodisponibilidade fe diminuiu nas preparações de farinha de massa. Análises relacionadas demonstraram que o processamento do feijão em uma farinha interrompeu as paredes celulares cotyledon dos grãos, tornando o Fe intracelular acessível para absorção. A captação de ferro aumentou na massa de feijão branco e amarelo, pois as camadas de sementes dessas variedades não continham compostos polifenólicos que inibem a biodisponibilidade fe. Em contraste, as camadas de sementes de cranberry, rim vermelho e feijão preto contêm altos níveis de polifenóis inibitórios, diminuindo assim a absorção de Fe. Esses resultados indicam claramente a utilidade do modelo em expor fatores que podem influenciar a qualidade nutricional de Fe, que de outra forma passaria despercebida.
Figura 1: Insira a configuração do anel para captação fe de células Caco-2. (A) Imagem de células Caco-2 e insira anel com membrana de diálise anexada. (B) Diagrama do procedimento global para digestão in vitro juntamente com a absorção fe da célula Caco-2 dentro de um único poço da placa multi-poço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Pontuações de biodisponibilidade de ferro de genótipos inteiros não cozidos e cozidos em um painel diversificado de feijões amarelos. (A) Temporada de campo 2015; (B) temporada de campo 2016. Os valores são meios (desvio padrão) de medidas triplicadas a partir de duas réplicas de campo por genótipo (n = 6). Os genótipos são categorizados no eixo x pela classe de cozimento, classificados do genótipo de cozimento mais rápido para a entrada de cozimento mais lento. *Pontuação significativamente menor (p < 0,05) de biodisponibilidade de ferro do que as outras entradas YBP. **Significativamente maior (p < 0,05) escores de biodisponibilidade de ferro do que os outros genótipos YBP. Este número foi modificado de32. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Biodisponibilidade de ferro expressa como formação de ferritina celular Caco-2 (nanograma de ferritin por miligrama de proteína celular) de variedades de feijão e seus espaguetes correspondentes à base de feijão. (A) Três variedades de feijão branco e seus espaguetes correspondentes à base de feijão; (B) quatro variedades de feijão colorido e seus espaguetes correspondentes à base de feijão. Os valores são os meios (± desvio padrão) de seis medidas de cada variedade. A linha hifenizada azul indica a biodisponibilidade de ferro de um controle de massa de trigo durum não fortificado extrudado, cozido e processado da mesma forma que os espaguetes à base de feijão. *Significativamente (p ≤ 0,05) maior formação de ferritina celular Caco-2 do que feijão inteiro após o cozimento. **Significativamente (p ≤ 0,05) formação de ferritina celular Caco-2 inferior ao feijão inteiro após o cozimento. Este número foi modificado de33. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Desde sua criação, inúmeros estudos foram publicados que descrevem este método para o bioensaio celular Caco-2. As condições básicas permaneceram relativamente inalteradas desde a publicação inicial em 199818. No entanto, nos últimos 20 anos, inúmeros detalhes técnicos foram refinados e padronizados para produzir consistência sem precedentes na resposta ao bioensaio. A adesão cuidadosa e precisa à cultura celular e às condições de digestão in vitro são a chave para a resposta consistente e sensível do bioensato.
Pela nossa experiência em formar inúmeros indivíduos no uso desse método, a luta mais comum é a cultura adequada das células Caco-2. A cultura consistente de monocamadas saudáveis é a chave para monocamadas de células Caco-2 saudáveis e responsivas. Se os níveis de proteína celular não forem altamente consistentes de poço para poço e não dentro da gama de proteínas celulares listadas no protocolo, o pesquisador deve reexaminar as condições de cultura celular para desvio do protocolo. Alternativamente, a contaminação por microrganismos de baixo nível pode existir, a incubadora de cultura celular pode não estar operando corretamente, ou o meio de cultura celular pode não ser devidamente formulado.
O processo de digestão in vitro é outra fonte de problemas potenciais. A remoção do contaminante Fe das enzimas digestivas é fundamental. Apesar das alegações do fabricante, é prudente verificar periodicamente a concentração fe das enzimas e certificar-se de que o processo de remoção fe (ver protocolo) é eficaz. Se a contaminação fe estiver presente nas enzimas digestivas, então o controle de qualidade do digestão de base produzirá valores de ferritina celular superior à faixa recomendada.
Um pesquisador experiente e treinado deve ser capaz de analisar 20 amostras experimentais, além dos controles de qualidade, em uma única execução do bioensaio. Assim, são necessárias aproximadamente 12 placas de seis poços para cada execução do bioensaio. Um número maior de amostras por bioensaio não é recomendado, pois o tempo para titulação de pH durante o processo de digestão pode ser muito longo, levando a uma potencial inconsistência entre os tempos de digestão da amostra.
As desvantagens deste modelo são relativamente poucas. Requer investigadores altamente qualificados em cultura celular e capazes de atenção precisa aos detalhes e protocolos. O espaço laboratorial deve ser limpo de fontes de contaminação fe, e reagentes e outros materiais devem ser monitorados rotineiramente para contaminação fe. Assim, o usuário deve ter a capacidade ou acesso à instrumentação para a medição da concentração fe. Este modelo é apenas uma medida relativa ou semi-quantitativa. No entanto, com o uso adequado de controles de referência, o modelo pode fornecer algumas estimativas quantitativas de absorção fe. De fato, uma equação de conversão das razões de absorção de controle versus material de teste foi gerada19.
O bioensaio funciona de acordo com o seguinte princípio: as células caco-2 produzem mais proteína de ferritina em resposta ao aumento das concentrações de Fe celulares. Portanto, a biodisponibilidade fe é proporcional ao aumento da produção de ferritina celular Caco-2. Este aumento é expresso como uma razão de ferritina celular para proteína celular total Caco-2 (nanograma de ferritin por miligrama de proteína celular total) após a exposição a uma amostra digerida19. As medidas de ferritina são feitas utilizando-se um kit ELISA (ver a Tabela de Materiais) testado para resposta neste bioensaio. Concentrações totais de proteína celular são quantificadas usando um kit de ensaio de proteínas. Como mencionado anteriormente, sob as condições utilizadas para este método, os níveis típicos de proteína celular Caco-2 em uma placa de seis poços variam de 2,0 mg a 2,6 mg de proteína celular por poço. Valores fora dessa faixa indicam culturas celulares insalubres, possível crescimento excessivo de células ou má técnica de semeadura celular. Dentro de uma determinada execução do bioensaio, os valores devem variar apenas até 0,2 mg por poço. Além disso, sob as densidades de semeadura e condições culturais utilizadas nesta metodologia, há atividade substancial de enzimas de borda de pincel aos 13 dias após a semeadura, indicando a maturação da maioria, se não todas, da monocamadacelular 28,29,30. Monitore as monocamadas celulares durante os 13 dias anteriores ao uso para contaminação ou estresse, como formação de vacuole ou lacunas na formação de monocamadas. Se tais condições forem evidentes, as células não devem ser consideradas válidas para uso no bioensaio.
Para monitorar a capacidade de resposta do bioensaio Caco-2, cada experimento deve ser executado com vários controles de qualidade, incluindo um digestor em branco, contendo apenas o soro fisiologicamente equilibrado e as enzimas gastrointestinais. Esses controles garantem que não haja contaminação fe no bioensaio. Os valores de ferritina das células Caco-2 expostas ao digestor em branco tipicamente variam de 1 ng a 6 ng de proteína celular ferritina/mg. A ferritina de base nesta faixa também indica que as células estão em status fe relativamente baixo e, portanto, devem apresentar sensibilidade máxima à Fe disponível.
Para os 15 anos iniciais de uso, os controles adicionais de qualidade incluíram 1) um digestor em branco com FeCl3 (66 μM) e 2) um digestor em branco de FeCl3 (66 μM) mais a adição de ácido ascórbico de 1,3 mM. Os valores de ferritina para o digestor FeCl3 estavam tipicamente na faixa de 30-50 ng de proteína celular ferritina/mg, e o digestor FeCl3 com ácido ascórbico estava na faixa de 250-400 ng de proteína celular de ferritina/mg. Nos anos mais recentes, o digestão em branco continua sendo um controle de qualidade; no entanto, passamos a usar uma amostra de alimentos com e sem ácido ascórbico a uma proporção de 20:1, ascorbate:Fe. A amostra de alimento utilizada foi uma farinha de feijão branco que contém aproximadamente 65 μg Fe/g de amostra. Estes controles de qualidade dão uma gama de resposta mais estreita e consistente, produzindo 20-30 ng de ferritina/mg de proteína celular para a farinha de feijão branco e 70-150 ng de ferritina/mg de proteína celular para a farinha de feijão branco mais ascorbate. Deve-se notar que a nova gama de valores é do kit referenciado na Tabela de Materiais, que tende a ser ligeiramente menor do que o extinto kit Ramco ELISA. A partir da publicação deste manuscrito, apenas 2-3 meses de dados foram adquiridos com o kit referenciado.
É importante reconhecer os resultados e as condições de cultura celular que indicam uma execução inválida ou subótima do bioensaio. Primeiro, como dito nos métodos, se as condições de digestão em branco produzirem concentrações de ferritina celular superior à faixa sugerida, isso poderia ser indicativo da contaminação fe da mídia de cultura celular, das enzimas digestivas ou da membrana de diálise. As concentrações de Fe aceitáveis para a mídia da cultura celular e as enzimas digestivas são <20 μg Fe/mL. Valores fora do intervalo para os outros controles de qualidade, particularmente se estiverem no lado baixo, também indicam que a validade dos resultados é questionável.
Em resumo, este modelo é altamente sensível à Fe biodisponi disponível, pois as condições de cultura celular são projetadas para criar células de baixo status fe; assim, seus mecanismos de absorção de Fe são altamente regulamentados. É um modelo robusto capaz de alta produtividade. Qualquer alimento ou dieta que possa ser alimentada com humanos pode ser avaliada neste modelo e, portanto, o bioensaio tem uma ampla gama de aplicações. Os criadores de plantas podem usar esse modelo para medir a biodisponibilidade de Fe em alimentos básicos, identificando traços e regiões cromossômicas que afetam a biodisponibilidade fe. Os cientistas de alimentos podem aplicar o modelo para determinar formulações ideais e avaliar os efeitos do processamento para garantir a biodisponibilidade adequada de Fe. Nutricionistas podem usar o modelo para avaliar e monitorar a biodisponibilidade dietética fe de alimentos individuais, combinações alimentares e até planos de dieta. Foi completamente validado para testes em humanos, prevendo corretamente a direção e magnitude dos efeitos em cada aplicação. Assim, ao combinar digestão simulada com a absorção fe da célula epitelial intestinal, este modelo representa o primeiro passo crítico no processo de absorção de Fe e é, portanto, capaz de prever a entrega ou biodisponibilidade de Fe a partir de alimentos.
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Disclosures
O autor não tem conflitos de interesse.
Acknowledgments
O autor é profundamente grato pelos esforços técnicos de Yongpei Chang e Mary Bodis. A aplicação extremamente bem sucedida desse modelo no campo da nutrição é resultado direto de sua expertise e atenção aos detalhes. O desenvolvimento desse modelo foi financiado inteiramente pelo Departamento de Agricultura, Serviço de Pesquisa Agrícola dos Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
References
- Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
- Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
- Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
- Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
- Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
- Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
- Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
- Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
- Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
- Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
- Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
- Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
- Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
- Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O'Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
- Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
- Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
- Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
- Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
- Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
- Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
- Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
- Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
- Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
- Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
- Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
- Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
- Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
- Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
- Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).
