Summary
El bioensayo de células Caco-2 para la biodisponibilidad de hierro (Fe) representa un enfoque rentable y versátil para evaluar la biodisponibilidad de Fe de alimentos, productos alimenticios, suplementos, comidas e incluso regímenes dietéticos. Completamente validado para estudios en humanos, representa el estado del arte para estudios de biodisponibilidad de Fe.
Abstract
El conocimiento de la biodisponibilidad del Fe es fundamental para la evaluación de la calidad nutricional del Fe en los alimentos. La medición in vivo de la biodisponibilidad de Fe está limitada por el costo, el rendimiento y las advertencias inherentes al etiquetado isotópico del Fe alimentario. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de un enfoque que sea de alto rendimiento y rentable. El bioensayo de células Caco-2 fue desarrollado para satisfacer esta necesidad. El bioensayo de células Caco-2 para la biodisponibilidad de Fe utiliza la digestión gástrica e intestinal simulada junto con el cultivo de una línea celular epitelial intestinal humana conocida como Caco-2. En las células Caco-2, la captación de Fe estimula la formación intracelular de ferritina, una proteína de almacenamiento de Fe fácilmente medida mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La ferritina se forma en proporción a la captación de Fe; por lo tanto, al medir la producción de ferritina de células Caco-2, se puede evaluar la absorción intestinal de Fe de los alimentos simulados digeridos en el enterocito.
A través de este enfoque, el modelo replica el paso inicial clave que determina la biodisponibilidad de Fe de los alimentos. Desde su creación en 1998, este enfoque modelo se ha comparado rigurosamente con factores conocidos por influir en la biodisponibilidad humana de Fe. Además, se ha aplicado en estudios paralelos, con tres estudios de eficacia humana que evalúan cultivos biofortificados con Fe. En todos los casos, el bioensayo predijo correctamente las cantidades relativas de biodisponibilidad de Fe a partir de los factores, los cultivos y la dieta general. Este documento proporciona métodos detallados sobre el cultivo celular de Caco-2 junto con el proceso de digestión in vitro y el ELISA de ferritina celular necesarios para realizar el bioensayo de células Caco-2 para la biodisponibilidad de Fe.
Introduction
Para comprender completamente la necesidad de investigación y el beneficio del bioensayo de células Caco-2 para la biodisponibilidad de Fe, primero se deben comprender los enfoques que existían antes del advenimiento de este modelo. La medición de la biodisponibilidad de Fe de un alimento o comida in vivo es una tarea difícil, particularmente cuando las combinaciones de alimentos deben evaluarse en una comida o dieta. El etiquetado isotópico ha sido el enfoque más común para la medición de la biodisponibilidad de Fe en los últimos 50 años1. El etiquetado isotópico se utiliza para estudios de comida única y comida múltiple y no es práctico para estudios a largo plazo. Los isótopos estables de Fe como 57Fe y 58Fe son los más utilizados; sin embargo, se han realizado estudios con radioisótopos como 59Fe, utilizando el conteo de cuerpo entero2. Para los alimentos vegetales, el etiquetado isotópico se ha realizado a través del etiquetado extrínseco o intrínseco. Para el etiquetado extrínseco, se agrega una cantidad conocida de isótopo al alimento o comida. Luego se mezcla la comida y se incorpora un período de equilibrio de 15-30 minutos en el protocolo antes del consumo. El cultivo hidropónico, agregar el isótopo a la solución nutritiva para incorporarlo a la planta mientras crece y se desarrolla, es necesario para el etiquetado intrínseco de los alimentos vegetales. Los pros y los contras de cada enfoque se discuten a continuación.
Etiquetado isotópico extrínseco
A principios y mediados de la década de 1970, la absorción humana de Fe se estudió mediante el etiquetado extrínseco de Fe en los alimentos, en el que se agrega una cantidad conocida de isótopo a la cantidad conocida de Fe en el alimento o la comida, se mezcla y se equilibra durante 15-30 minutos antes de las mediciones. Se han utilizado varias cantidades de isótopos extrínsecos, que van del 1% al 100% del Fe intrínseco, pero más comúnmente en el rango de 7% -30%3. El etiquetado extrínseco se basa en la suposición de que el isótopo extrínseco de Fe se equilibra completamente con el Fe intrínseco del alimento o la comida. Luego se mide la absorción de isótopos extrínsecos, y cada átomo del isótopo extrínseco se calcula para representar un número dado de átomos de Fe intrínsecos. Este cálculo se basa en las cantidades molares relativas. En 1983, múltiples estudios de validación de la técnica fueron resumidos en un artículo de revisión4. La validación de la técnica se realizó comparando simultáneamente el porcentaje de absorción de la etiqueta isotópica extrínseca con el porcentaje de absorción de una etiqueta isotópica intrínseca. Por lo tanto, una relación de absorción extrínseca a intrínseca cercana a 1 sugiere que cada grupo de Fe fue igualmente absorbido. En ese momento, también se consideró que una relación cercana a 1 representaba el equilibrio del isótopo extrínseco con el Fe intrínseco del alimento o la comida. Las relaciones de absorción extrínseca a intrínseca de Fe variaron de valores medios de 0,40 a 1,62, con una relación media (±DE) de 1,08 ± 0,14 en 63 comparaciones. Es importante señalar que, en todos los estudios resumidos en esta revisión, ninguno probó directamente el equilibrio de la etiqueta extrínseca con la Fe intrínseca. En resumen, los autores de la revisión concluyeron lo siguiente:
"La técnica de etiqueta extrínseca ha demostrado ser válida para varios alimentos bajo ciertas condiciones experimentales. Pero, este método aún no se puede considerar probado con respecto a todos los tipos de alimentos. El método de etiqueta extrínseca no es apropiado para monitorear la absorción de hierro de una dieta que contiene formas insolubles de hierro. La validez de esta técnica se basa en la suposición básica de que la etiqueta extrínseca intercambia completamente con todo el hierro endógeno de alimentos no hemo. En la actualidad no se sabe cuán completamente las diferentes formas de hierro no hemo están etiquetadas por una etiqueta extrínseca. Esto es importante a la luz de los estudios que han sugerido que los inhibidores de hierro pueden afectar la etiqueta extrínseca de manera diferente a algunas formas de hierro no hemo en los alimentos. La investigación sobre los factores alimentarios que pueden perjudicar un intercambio isotópico completo es escasa. Por lo tanto, la interpretación de los datos de biodisponibilidad de la investigación de etiquetas extrínsecas requiere la consideración de los inhibidores del intercambio que pueden estar presentes en el alimento o la dieta".
Desde 1983, sólo se han publicado dos estudios que evaluaron la precisión del etiquetado extrínseco de Fe 3,5. En ambos estudios, el equilibrio de una etiqueta isotópica extrínseca se comparó directamente con el Fe intrínseco de los alimentos, que, en estos estudios, eran cultivos alimentarios básicos. Se probaron variedades de frijol blanco, rojo y negro, junto con lentejas y maíz. Utilizando técnicas establecidas de digestión in vitro y la medición de la solubilidad y precipitación de Fe, ambos estudios demostraron que el etiquetado isotópico extrínseco no resulta consistentemente en un equilibrio total, con evidencia de que, para algunas variedades de frijol, el desequilibrio puede ser muy alto dependiendo de la cantidad de isótopo extrínseco y el color de la cubierta de la semilla3. A pesar de las conclusiones del artículo de revisión de 1983, los estudios de etiquetado extrínseco de frijoles continuaron 6,7,8,9,10,11,12. Ninguno de estos estudios incluyó probar el equilibrio de la etiqueta extrínseca con el Fe intrínseco.
Etiquetado intrínseco
El etiquetado intrínseco de alimentos vegetales para la evaluación de la biodisponibilidad de Fe elimina los problemas de precisión del equilibrio en el etiquetado extrínseco. Sin embargo, este enfoque no puede producir grandes cantidades de material debido al requisito de espacio de invernadero para el cultivo hidropónico. El cultivo hidropónico requiere mucha mano de obra, requiere una gran cantidad de isótopos estables costosos y, a menudo, da como resultado un crecimiento de las plantas diferente en términos de rendimiento y concentración de Fe de la semilla. Debido al costo, el etiquetado intrínseco solo es adecuado para estudios a pequeña escala destinados a comprender los mecanismos subyacentes a la absorción de Fe o los factores que influyen en la absorción de Fe de los alimentos. La producción de 1-2 kg de un cultivo alimentario básico cuesta aproximadamente $ 20,000- $ 30,000 solo para materiales, dependiendo del enfoque isotópico e hidropónico13,14.
Dados los desafíos asociados con el etiquetado isotópico, los investigadores buscaron desarrollar enfoques in vitro. Los primeros métodos utilizaron alimentos gástricos e intestinales simulados, junto con la medición de la solubilidad de Fe o dializabilidad de Fe como una estimación de la biodisponibilidad15. Tales estudios encontraron rápidamente que la dializabilidad del Fe no era una medida consistente de biodisponibilidad, ya que el Fe puede ser soluble, estrechamente unido a los compuestos y, por lo tanto, no intercambiable, lo que lleva a la sobreestimación de la biodisponibilidad. Para abordar estos problemas, la metodología para utilizar una línea celular intestinal humana evolucionó, agregando así un componente vivo y permitiendo la medición de la absorción de Fe16. Las células intestinales humanas, las células Caco-2, se originaron a partir de un carcinoma de colon humano y se han utilizado ampliamente en estudios de absorción de nutrientes. Esta línea celular es útil ya que, en cultivo, las células se diferencian en enterocitos que funcionan de manera similar a las células de borde en cepillo del intestino delgado. Los estudios han demostrado que las células Caco-2 exhiben los transportadores apropiados y la respuesta a los factores que influyen en la captación de Fe17,18.
Los estudios iniciales, utilizando radioisótopos para medir la absorción de Fe en células Caco-2, se refinaron para medir la absorción de Fe basada en la formación de ferritina de células Caco-2. La medición de la ferritina de células Caco-2 mejoró el rendimiento de la muestra y anuló los problemas de manejo de radioisótopos y el equilibrio del Fe extrínseco con el Fe intrínseco19,20. La medición de la absorción de Fe a través de la formación de ferritina permitió a los investigadores estudiar una amplia gama de alimentos, incluidas las comidas complejas21. Por lo tanto, la digestión simulada (in vitro) junto con la absorción de Fe de células Caco-2 proporcionó una mejor evaluación fisiológica de la absorción de Fe de los alimentos. Es importante tener en cuenta que este modelo determina principalmente las diferencias relativas en la biodisponibilidad de Fe. Al igual que muchas líneas celulares útiles, las células Caco-2 también han mostrado variabilidad en la capacidad de respuesta, pero han mantenido diferencias relativas consistentes en la absorción de Fe entre los alimentos. La técnica adecuada y la cuidadosa atención al detalle pueden mejorar la respuesta consistente de formación de ferritina celular en las células Caco-2.
El modelo de digestión in vitro / células Caco-2 también se conoce como bioensayo de células Caco-2. Este ensayo ha sido validado exhaustivamente mediante comparación directa con estudios en humanos y animales22. Además de la comparación paralela directa del bioensayo con los ensayos de eficacia en humanos, se ha demostrado que este modelo exhibe una respuesta cualitativamente similar en la captación de Fe a la de los humanos18,19,23. Por lo tanto, como enfoque in vitro, el bioensayo de células Caco-2 garantiza una alta credibilidad como herramienta de detección para evaluar la nutrición de Fe de los alimentos. Se ha aplicado ampliamente a numerosos alimentos y productos alimenticios 21,24,25,26,27,28.
Desde su creación en 1998, el bioensayo de células Caco-2 ha avanzado en el campo de la nutrición de Fe, ya que ha ayudado a identificar los factores que influyen en la absorción intestinal de Fe. Al hacerlo, este modelo ha desarrollado y refinado objetivos de investigación para estudios humanos más definitivos y menos costosos. También se podría argumentar que el uso del modelo niega la necesidad de algunos ensayos en humanos.
En resumen, la entrega relativa de Fe de un alimento o comida se puede medir con el bioensayo de células Caco-2. Independientemente de la cantidad de Fe en la comida de prueba, el bioensayo define la cantidad relativa de Fe absorbida en el enterocito, el primer paso del proceso de absorción. Este es el paso más importante para definir la biodisponibilidad del Fe, ya que la mayoría de las veces el objetivo es medir con la intención de mejorar o, al menos, controlar la calidad nutricional del Fe en un alimento. Dado que el estado del hierro está regulado por la absorción, y por lo tanto la absorción de Fe está regulada al alza en individuos deficientes en Fe para satisfacer las necesidades nutricionales, las condiciones estándar del modelo están diseñadas para que la absorción de Fe por las células sea máxima. De esta manera, el bioensayo proporciona una verdadera medida del potencial del alimento para entregar Fe.
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Protocol
NOTA: Como punto de referencia conveniente para los lectores, la siguiente metodología describe las condiciones específicas de cultivo y los materiales requeridos para la medición de la biodisponibilidad de Fe a partir de 20 muestras experimentales, más los controles de calidad requeridos, en una ejecución del bioensayo. No se recomienda aumentar el número de muestras más allá de esta capacidad debido al tiempo requerido para varios pasos de cultivo celular y digestión in vitro dentro del bioensayo.
1. Elección de la cantidad de muestras
- Para alimentos sólidos o líquidos, determine una cantidad de alimento que pueda considerarse representativa de la muestra que se analizará.
- En las pruebas de biodisponibilidad de Fe de una variedad de frijol, use 100-150 g de semilla de frijol y procese esta cantidad a una muestra homogénea.
- Para muestras líquidas como jugos fortificados, productos lácteos y bebidas deportivas, asegúrese de que los alimentos estén bien mezclados antes de la muestra.
NOTA: La cantidad de material de semilla de frijol mencionada anteriormente es esencial para tener en cuenta las diferencias inherentes entre las semillas de este cultivo básico.
2. Preparación de las muestras
- Enjuague la tierra y el polvo de cualquier muestra de alimentos con agua destilada-desionizada antes del procesamiento.
- Procesar la cantidad adecuada de muestra según los objetivos experimentales, como el método de cocción y la molienda.
NOTA: Para cocinar y procesar, es fundamental usar utensilios de cocina y equipos que no sean una fuente potencial de contaminante Fe. El equipo de acero inoxidable no contamina; sin embargo, equipos como molinos de molinos de piedra, utensilios de cocina de hierro fundido y cualquier equipo que no contenga acero inoxidable que contenga Fe pueden agregar cantidades significativas de Fe contaminante. Un molinillo de café de acero inoxidable estándar es a menudo adecuado para moler. - Liofilizar y moler hasta obtener un polvo homogéneo.
NOTA: Una vez homogeneizado, la investigación ha demostrado que tres réplicas independientes del análisis son adecuadas para cada alimento que se está midiendo.- Si la homogeneidad de la muestra es difícil de lograr, revise la formulación o el procesamiento del producto. Si esto no es posible, agregue réplicas si la no homogeneidad no es grave.
- Para la mayoría de los alimentos sólidos homogéneos, use 0,5 g de muestra liofilizada por réplica. Si es necesario, use hasta 1.0 g de muestra por réplica, pero verifique si más de 0.5 g produce un beneficio en el grado de respuesta.
NOTA: Las cantidades superiores a 0,5 g de alimentos sólidos pueden obstruir la membrana de diálisis (ver más abajo). - Use 1-2 ml de muestras líquidas.
NOTA: La liofilización a menudo no es necesaria para muestras líquidas.
3. Cultivo celular de Caco-2
- Cultivos de stock
- Adquiera células Caco-2 de un proveedor certificado.
- Cultive las células de viales madre a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de aire deCO2 al 5% (humedad constante) utilizando el Medio de Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 25 mM HEPES (pH 7.2), 10% (v / v) de suero fetal bovino (FBS) y 1% de solución antibiótico-antimicótica.
- Una vez que haya suficientes células disponibles, generalmente después de 7-10 días de cultivo, sembrar las células en matraces no recubiertos de colágeno a una densidad de 30,000 células / cm2.
- Elija el tamaño del matraz en función del número de celdas disponibles y necesarias para sembrar placas multipocillos.
NOTA: En general, los matraces T225 (225 cm 2) funcionan mejor para experimentos en los que se utilizan 11 placas multipocillos (6 pocillos; 9,66 cm2/pocillo) (10 placas para comparaciones de muestras, 1 placa para controles de calidad) por bioensayo. - Cultivar células en frascos durante 7 días, cambiando el medio cada dos días, y usar en el7º día para sembrar las placas de pocillos.
NOTA: Se recomienda utilizar un rango de pasaje de no más de 10-15 pasajes desde que las células se inician a partir del cultivo de stock y posteriormente se utilizan en una serie de experimentos. Los pasajes de cultivo celular deben limitarse ya que una amplia gama de pasajes puede dar lugar a cambios adaptativos en la línea celular y, por lo tanto, variabilidad en la respuesta del modelo.
- Cultivo celular en placas multipocillos
- Sembrar las células Caco-2 a una densidad de 50.000 células/cm2 en placas recubiertas de colágeno de 6 pocillos.
NOTA: Este paso generalmente funciona mejor si se realiza un miércoles. Los siguientes pasos harán evidente por qué este día de la semana es óptimo. - Cultivar las células durante 12 días a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de aire deCO2 al 5% (humedad constante) utilizando DMEM suplementado con 25 mM HEPES (pH 7.2), 10% (v/v) FBS y 1% de solución antibiótico-antimicótica.
NOTA: El cultivo de las monocapas celulares durante más de 12 días puede provocar un crecimiento excesivo de la célula. Investigaciones anteriores han demostrado claramente que, en estas condiciones, a los 12 días posteriores a la siembra, la monocapa celular está madura, bien adherida a la placa y óptima en la consistencia de la respuesta 29,30,31. El crecimiento de las células por más tiempo, como hasta 19-21 días, da como resultado un crecimiento excesivo de las células, y el medio se agota rápidamente en nutrientes, lo que resulta en monocapas poco saludables. - Durante el período de 12 días, cambie el medio al menos cada 2 días en un horario diario constante.
- En el12º día posterior a la siembra, reemplace el medio de cultivo con 2 ml de Medio Esencial Mínimo (MEM [pH 7]) suplementado con TUBOS de 10 mM (piperazina-N,N'-bis-[ácido 2-etanosulfónico]), solución antibiótico-antimicótica al 1%, hidrocortisona (4 mg/L), insulina (5 mg/L), selenio (5 μg/L), triyodotironina (34 μg/L) y factor de crecimiento epidérmico (20 μg/L).
NOTA: Si la siembra se inició un miércoles, entoncesel día 12 sería un lunes. - Al día siguiente (es decir, el día 13), retire la MEM y reemplácela con 1 ml de MEM (pH 7).
NOTA: Este paso ocurriría un martes. Este es el día en que comienza el bioensayo; Por lo tanto, el programa de 13 días produce la ventaja de un programa semanal consistente, lo que permite que el bioensayo se realice de manera consistente en el mismo día de la semana.
- Sembrar las células Caco-2 a una densidad de 50.000 células/cm2 en placas recubiertas de colágeno de 6 pocillos.
4. Digestión in vitro
- Preparación de anillos de inserción
- Cree un anillo de inserción esterilizado utilizando una junta tórica de silicona equipada con una membrana de diálisis lavada con ácido (Figura 1A).
NOTA: Prepare los insertos con 1 día de antelación (es decir, lunes, día 12) del día del bioensayo y guárdelos en agua a 18 MΩ a 4 °C hasta que estén listos para usar. - El día del bioensayo (martes, día 13), retire los insertos del refrigerador, escurra y reemplace el agua con HCl 0.5 M. Déjelo a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar durante al menos 1 h antes de su uso.
NOTA: Este paso debe realizarse antes de retirar la MEM de las placas de cultivo. El lavado ácido de la membrana sirve para eliminar el Fe posible contaminante y esteriliza el anillo de inserción y la membrana. - Escurrir el HCl 0,5 M de los insertos y enjuagar con agua estéril de 18 MΩ. Almacene en agua estéril de 18 MΩ a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar hasta que esté listo para usar.
- Inserte un anillo en cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células Caco-2, creando así un sistema de dos cámaras. Devuelva las placas con los insertos a la incubadora.
NOTA: Este paso debe realizarse justo después de agregar 1.0 ml frescos de MEM a cada pocillo (consulte el Paso 3.2.5.).
- Cree un anillo de inserción esterilizado utilizando una junta tórica de silicona equipada con una membrana de diálisis lavada con ácido (Figura 1A).
- Preparación de la solución de pepsina
- El día del experimento, prepare la solución de pepsina disolviendo 0,145 g de pepsina en 50 ml de HCl 0,1 M. Agite la solución suavemente en un agitador de plataforma durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Preparación de solución pancreatina-bilis
- El mismo día del experimento, prepare 0,1 M NaHCO 3 disolviendo 2,1 g de NaHCO3 en 250 ml de agua de 18 MΩ.
- Mezclar 0,35 g de pancreatina y 2,1 g de extracto biliar en 175 mL de NaHCO3 0,1 M.
- Una vez que la pancreatina y el extracto biliar estén solubilizados, agregue 87.5 g de una resina de intercambio catiónico débil (consulte la Tabla de materiales) y mezcle agitando durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Vierta la suspensión en una columna grande y recoja el eluido.
- Eluya la columna con 70 ml adicionales de NaHCO3 0,1 M, recogiendo este volumen en la solución biliar de pancreatina.
NOTA: El propósito de la resina es eliminar el contaminante Fe comúnmente encontrado en los extractos de bilis de pancreatina.
- Iniciar la digestión in vitro .
- Pesar la muestra en un tubo centrífugo estéril de 50 ml (polipropileno), seguido de la adición de 10 ml de solución salina fisiológica a pH 2, que contiene 140 mM de NaCl y 5 mM de KCl.
- Iniciar el proceso de digestión gástrica añadiendo 0,5 ml de la solución de pepsina porcina preparada a la muestra e incubar en una coctelera a un ajuste bajo y suave durante 1 h a 37 °C.
- Después de este período, iniciar el proceso de digestión intestinal de cada muestra ajustando el pH a 5.5-6.0 con 1.0 M NaHCO3.
- Agregue 2.5 ml de la solución de pancreatina-bilis a cada tubo de muestra y ajuste el pH a 6.9-7.0 con NaHCO3 de 1.0 M.
- Una vez ajustado el pH, igualar el volumen en cada tubo utilizando una solución de 140 mM de NaCl, 5 mM KCl (pH 6,7), midiendo el peso del tubo con un valor objetivo de 15 g.
NOTA: Para algunos alimentos, es posible que sea necesario llevar el volumen total a 16 g o 17 g, dependiendo de la capacidad de amortiguación de los alimentos. - Transfiera 1,5 ml de cada digestión intestinal a la cámara superior (es decir, que contenga el anillo de inserción con la membrana de diálisis) de un pocillo correspondiente de la placa de cultivo de 6 pocillos que contiene las células Caco-2 (Figura 1B).
- Sustituir la tapa de la placa e incubar a 37 °C (5%CO2 atmósfera de aire) en una coctelera oscilante a 6 oscilaciones/min durante 2 h.
- Retire el anillo de inserción con el digest y agregue 1 ml adicional de MEM (pH 7) a cada pocillo.
- Devolver la placa de cultivo celular a la incubadora (37 °C; 5% CO2 atmósfera de aire) durante22 h adicionales.
- Después de 22 h, retire el medio de cultivo celular y agregue 2.0 ml de agua de 18 MΩ a la monocapa celular.
NOTA: El agua lisará osmóticamente las células. - Recolectar todo el lisado celular en tubos de microcentrífuga de polipropileno estándar o similares para análisis posteriores de proteínas celulares y ferritina celular.
5. Medición de ferritina celular Caco-2 y proteína celular
- Utilice el lisado celular del paso 4.4.10. para la medición de ferritina celular y proteína.
- Para medir el contenido de ferritina de las células Caco-2, siga las instrucciones del kit (consulte la Tabla de materiales), con la excepción de aumentar el tiempo de incubación de 30 min a 2 h para el conjugado de ratón anticuerpo antiferritina-peroxidasa de rábano picante (HRP).
- Para medir la proteína celular, siga las instrucciones proporcionadas en el kit de proteínas celulares (consulte la Tabla de materiales).
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Representative Results
Identificación y medición de la biodisponibilidad de Fe en cultivos alimentarios básicos
Una de las razones principales para desarrollar este modelo fue identificar los factores que influyen en la biodisponibilidad de Fe en cultivos alimentarios básicos y proporcionar una herramienta para los fitomejoradores que les permita identificar y desarrollar variedades con mayor biodisponibilidad de Fe. El frijol común (Phaseolus vulgaris) ha sido seleccionado a nivel mundial como cultivo para la biofortificación de Fe; por lo tanto, el modelo se ha aplicado ampliamente para evaluar la calidad nutricional del Fe en una amplia gama de clases de mercado de frijol y programas de mejoramiento de frijol. Por ejemplo, los frijoles amarillos son una clase de mercado emergente en los Estados Unidos. En regiones como África oriental, son muy populares y son ampliamente conocidos por ser de cocina rápida y considerados por muchos como "fáciles de digerir". Estudios recientes con el bioensayo de células Caco-2 han demostrado que ciertas variedades de frijoles amarillos pueden tener una alta biodisponibilidad de Fe en relación con otras clases de color (Figura 2). En este estudio, las variedades Manteca fueron identificadas como altas en biodisponibilidad de Fe en relación con los controles de referencia de las clases de color blanco y moteado rojo. Además, los resultados fueron consistentes a lo largo de dos años de cosecha consecutivos. Tales comparaciones simplemente no son factibles en otros modelos, particularmente en modelos in vivo , debido al alto costo y al rendimiento mucho menor de los ensayos en animales y humanos.
Evaluación de los efectos del procesamiento de alimentos sobre la biodisponibilidad del Fe
El bioensayo de células Caco-2 también se puede aplicar para evaluar los efectos del procesamiento de alimentos sobre la biodisponibilidad de Fe. Por ejemplo, los resultados de la Figura 3 provienen de un análisis de frijoles y pasta a base de frijoles de múltiples clases de color. Los resultados demuestran cómo el procesamiento de los granos en una harina aumentó la biodisponibilidad de Fe de las variedades de frijol blanco (Snowdon, Alpena y Samurai) y amarillo (Canario). Para las variedades de arándano (Etna), riñón rojo (Red Hawk) y negro (Zenith), la biodisponibilidad de Fe disminuyó en las preparaciones de harina de pasta. Los análisis relacionados demostraron que el procesamiento de los frijoles en una harina interrumpió las paredes celulares de cotiledón de los frijoles, lo que hizo que el Fe intracelular fuera accesible para la absorción. La absorción de hierro aumentó en la pasta de frijoles blancos y amarillos, ya que las capas de semillas de estas variedades no contenían compuestos polifenólicos que inhiben la biodisponibilidad del Fe. En contraste, las capas de semillas de arándano, riñón rojo y frijoles negros contienen altos niveles de polifenoles inhibitorios, disminuyendo así la absorción de Fe. Estos resultados indican claramente la utilidad del modelo para exponer factores que pueden influir en la calidad nutricional de Fe, que de otro modo pasarían desapercibidos.
Figura 1: Configuración del anillo de inserción para la absorción de Fe de células Caco-2. (A) Imagen de células Caco-2 e inserte anillo con membrana de diálisis adjunta. (B) Diagrama del procedimiento general para la digestión in vitro acoplada con la captación de Fe de células Caco-2 dentro de un solo pocillo de la placa de pocillos múltiples. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Puntuaciones de biodisponibilidad de hierro de genotipos de semillas enteras no empapadas y cocidas en un panel diverso de frijoles amarillos. A) Temporada de campo 2015; (B) temporada de campo 2016. Los valores son medias (desviación estándar) de mediciones triplicadas de dos réplicas de campo por genotipo (n = 6). Los genotipos se clasifican en el eje x por clase de cocción, clasificados desde el genotipo de cocción más rápida hasta la entrada de cocción más lenta. *Puntuación de biodisponibilidad de hierro significativamente menor (p < 0,05) que las otras entradas de YBP. **Puntuaciones de biodisponibilidad de hierro significativamente más altas (p < 0,05) que los otros genotipos de YBP. Esta cifra se modificó de32. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Biodisponibilidad de hierro expresada como formación de ferritina de células Caco-2 (nanogramos de ferritina por miligramo de proteína celular ) de variedades de frijol y sus correspondientes espaguetis a base de frijol. A) Tres variedades de frijol blanco y sus correspondientes espaguetis a base de frijol; (B) cuatro variedades de frijol de color y sus correspondientes espaguetis a base de frijol. Los valores son las medias (± desviación estándar) de seis mediciones de cada variedad. La línea azul con guiones indica la biodisponibilidad de hierro de un control de pasta de trigo duro no fortificado extruido, cocido y procesado de la misma manera que los espaguetis a base de frijoles. *Significativamente (p ≤ 0.05) mayor formación de ferritina de células Caco-2 que los frijoles enteros después de la cocción. **Significativamente (p ≤ 0.05) menor formación de ferritina de células Caco-2 que los frijoles enteros después de la cocción. Esta cifra se modificó de33. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Desde sus inicios, se han publicado numerosos estudios que describen este método para el bioensayo de células Caco-2. Las condiciones básicas se han mantenido relativamente sin cambios desde la publicación inicial en 199818. Sin embargo, en los últimos 20 años, numerosos detalles técnicos se han refinado y estandarizado para producir una consistencia sin precedentes en la respuesta del bioensayo. La adherencia cuidadosa y precisa al cultivo celular y las condiciones de digestión in vitro son la clave para la respuesta consistente y sensible del bioensayo.
A partir de nuestra experiencia en la capacitación de numerosas personas en el uso de este método, la lucha más común es el cultivo adecuado de las células Caco-2. El cultivo consistente de monocapas sanas es clave para las monocapas de células Caco-2 sanas y sensibles. Si los niveles de proteína celular no son altamente consistentes de pozo a pozo y no están dentro del rango de proteína celular enumerada en el protocolo, el investigador debe reexaminar las condiciones de cultivo celular para detectar desviaciones del protocolo. Alternativamente, puede existir contaminación de microorganismos de bajo nivel, la incubadora de cultivo celular puede no estar funcionando correctamente o el medio de cultivo celular puede no estar formulado correctamente.
El proceso de digestión in vitro es otra fuente de problemas potenciales. La eliminación del contaminante Fe de las enzimas digestivas es crítica. A pesar de las afirmaciones del fabricante, es prudente verificar periódicamente la concentración de Fe de las enzimas y asegurarse de que el proceso de eliminación de Fe (ver protocolo) sea efectivo. Si la contaminación por Fe está presente en las enzimas digestivas, entonces el control de calidad de la digestión basal producirá valores de ferritina celular superiores al rango recomendado.
Un investigador experimentado y capacitado debe ser capaz de analizar 20 muestras experimentales, más los controles de calidad, en una sola ejecución del bioensayo. Por lo tanto, se necesitan aproximadamente 12 placas de seis pocillos para cada ejecución del bioensayo. No se recomienda un mayor número de muestras por bioensayo, ya que el tiempo para la titulación del pH durante el proceso de digestión puede ser demasiado largo, lo que lleva a una posible inconsistencia entre los tiempos de digestión de la muestra.
Las desventajas de este modelo son relativamente pocas. Requiere investigadores que estén altamente capacitados en cultivo celular y sean capaces de prestar atención precisa a los detalles y al protocolo. El espacio del laboratorio debe estar limpio de fuentes de contaminación por Fe, y los reactivos y otros materiales deben ser monitoreados rutinariamente para detectar contaminación por Fe. Por lo tanto, el usuario debe tener la capacidad o el acceso a la instrumentación para la medición de la concentración de Fe. Este modelo es sólo una medida relativa o semicuantitativa. Sin embargo, con el uso adecuado de controles de referencia, el modelo puede proporcionar algunas estimaciones cuantitativas de la absorción de Fe. De hecho, se ha generado una ecuación de conversión de las relaciones de absorción del control frente al material de ensayo19.
El bioensayo funciona de acuerdo con el siguiente principio: las células Caco-2 producen más proteína ferritina en respuesta a los aumentos en las concentraciones celulares de Fe. Por lo tanto, la biodisponibilidad de Fe es proporcional al aumento en la producción de ferritina de células Caco-2. Este aumento se expresa como una relación entre la ferritina celular y la proteína celular Caco-2 total (nanogramos de ferritina por miligramo de proteína celular total) después de la exposición a una muestra digerida19. Las mediciones de ferritina se realizan utilizando un kit ELISA (consulte la Tabla de materiales) probado para determinar su respuesta en este bioensayo. Las concentraciones totales de proteína celular se cuantifican utilizando un kit de ensayo de proteínas. Como se mencionó anteriormente, bajo las condiciones utilizadas para este método, los niveles típicos de proteína celular Caco-2 en una placa de seis pocillos varían de 2.0 mg a 2.6 mg de proteína celular por pocillo. Los valores fuera de este rango indican cultivos celulares no saludables, posible crecimiento excesivo de células o una técnica de siembra celular deficiente. Dentro de una serie dada del bioensayo, los valores solo deben variar hasta 0,2 mg por pocillo. Además, bajo las densidades de siembra y las condiciones de cultivo utilizadas en esta metodología, existe una actividad enzimática de borde en cepillo sustancial a los 13 días posteriores a la siembra, lo que indica la maduración de la mayoría, si no toda, de la monocapa celular28,29,30. Controle las monocapas celulares durante los 13 días anteriores al uso para detectar contaminación o estrés, como la formación de vacuolas o brechas en la formación de monocapas. Si tales condiciones son evidentes, las células no deben considerarse válidas para su uso en el bioensayo.
Para monitorear la capacidad de respuesta del bioensayo Caco-2, cada experimento debe ejecutarse con varios controles de calidad, incluido un resumen en blanco, que contenga solo la solución salina fisiológicamente equilibrada y las enzimas gastrointestinales. Estos controles aseguran que no haya contaminación por Fe en el bioensayo. Los valores de ferritina de las células Caco-2 expuestas al digesto en blanco varían típicamente de 1 ng a 6 ng de ferritina/mg de proteína celular. La ferritina basal en este rango también indica que las células están en un estado de Fe relativamente bajo y, por lo tanto, deben exhibir una sensibilidad máxima al Fe disponible.
Durante los primeros 15 años de uso, los controles de calidad adicionales incluyeron 1) un resumen en blanco con FeCl 3 (66 μM) y 2) un resumen en blanco de FeCl 3 (66 μM) más la adición de ácido ascórbico1,3 mM. Los valores de ferritina para el digesto de FeCl 3 estuvieron típicamente en el rango de 30-50 ng de ferritina/mg de proteína celular, y el digesto de FeCl3 con ácido ascórbico estuvo en el rango de 250-400 ng de ferritina/mg de proteína celular. En años más recientes, el resumen en blanco sigue siendo un control de calidad; sin embargo, hemos cambiado a usar una muestra de alimento con y sin ácido ascórbico en una proporción de 20: 1, ascorbato: Fe. La muestra de alimento utilizada fue una harina de frijol blanco que contiene aproximadamente 65 μg Fe/g de muestra. Estos controles de calidad dan un rango de respuesta más estrecho y consistente, produciendo 20-30 ng de ferritina/mg de proteína celular para la harina de frijol blanco y 70-150 ng de ferritina/mg de proteína celular para la harina de frijol blanco más ascorbato. Cabe señalar que el nuevo rango de valores es del kit al que se hace referencia en la Tabla de materiales, que tiende a ser ligeramente inferior al ahora desaparecido kit ELISA de Ramco. A partir de la publicación de este manuscrito, solo se han adquirido 2-3 meses de datos con el kit referenciado.
Es importante reconocer los resultados y las condiciones de cultivo celular que indican una ejecución no válida o subóptima del bioensayo. Primero, como se indica en los métodos, si las condiciones de digestión en blanco producen concentraciones de ferritina celular más altas que el rango sugerido, esto podría ser indicativo de contaminación por Fe de los medios de cultivo celular, las enzimas digestivas o la membrana de diálisis. Las concentraciones aceptables de Fe para los medios de cultivo celular y las enzimas digestivas son <20 μg Fe/ml. Los valores fuera del rango para los otros controles de calidad, particularmente si están en el lado bajo, también indican que la validez de los resultados es cuestionable.
En resumen, este modelo es altamente sensible al Fe biodisponible, ya que las condiciones de cultivo celular están diseñadas para crear células de bajo estado de Fe; por lo tanto, sus mecanismos para la adopción de Fe están altamente regulados. Es un modelo robusto capaz de un alto rendimiento. Cualquier alimento o dieta que pueda ser alimentado a los humanos puede ser evaluado en este modelo y, por lo tanto, el bioensayo tiene una amplia gama de aplicaciones. Los fitomejoradores pueden usar este modelo para medir la biodisponibilidad de Fe en alimentos básicos, identificando rasgos y regiones cromosómicas que afectan la biodisponibilidad de Fe. Los científicos de alimentos pueden aplicar el modelo para determinar formulaciones óptimas y evaluar los efectos del procesamiento para garantizar una biodisponibilidad adecuada de Fe. Los nutricionistas pueden usar el modelo para evaluar y monitorear la biodisponibilidad dietética de Fe a partir de alimentos individuales, combinaciones de alimentos e incluso planes de dieta. Ha sido validado a fondo para ensayos en humanos, prediciendo correctamente la dirección y magnitud de los efectos en cada aplicación. Por lo tanto, al combinar la digestión simulada con la absorción de Fe de las células epiteliales intestinales, este modelo representa el primer paso crítico en el proceso de absorción de Fe y, por lo tanto, es capaz de predecir la entrega o biodisponibilidad de Fe de los alimentos.
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Disclosures
El autor no tiene conflictos de intereses.
Acknowledgments
El autor está profundamente agradecido por los esfuerzos técnicos de Yongpei Chang y Mary Bodis. La aplicación extremadamente exitosa de este modelo en el campo de la nutrición es un resultado directo de su experiencia y atención al detalle. El desarrollo de este modelo fue financiado en su totalidad por el Servicio de Investigación Agrícola del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
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