Summary
Ce protocole détaille les étapes chirurgicales de la création de fistules artérioveineuses iliaques communes murines. Nous avons développé ce modèle pour étudier la physiopathologie des membres liée à l’accès à l’hémodialyse.
Abstract
L’insuffisance rénale chronique est un problème majeur de santé publique, et la prévalence de l’insuffisance rénale terminale (IRT) nécessitant des traitements de remplacement rénal chronique tels que l’hémodialyse continue d’augmenter. La mise en place de la fistule artérioveineuse autogène (FAV) reste une option d’accès vasculaire primaire pour les patients atteints d’IRT. Malheureusement, environ la moitié des patients hémodialysés souffrent d’un dysfonctionnement de la main lié à l’accès à la dialyse (ARHD), allant de la paresthésie subtile à la gangrène digitale. Notamment, les facteurs biologiques sous-jacents responsables de la MRSA sont mal compris, et il n’existe aucun modèle animal adéquat pour élucider les mécanismes et/ou développer de nouveaux traitements pour la prévention et le traitement de l’ARHD. Ici, nous décrivons un nouveau modèle murin dans lequel un AVF est créé entre l’artère iliaque commune gauche et la veine, facilitant ainsi l’évaluation de la physiopathologie des membres. La microchirurgie comprend l’isolement des vaisseaux, la veinotomie longitudinale, la création d’une anastomose artérioveineuse et la reconstruction veineuse. Les chirurgies fictives comprennent toutes les étapes critiques, à l’exception de la création d’AVF. La mise en place d’une FVA iliaque entraîne des altérations cliniquement pertinentes de l’hémodynamique centrale, de l’ischémie périphérique et des déficiences de la performance neuromotrice des membres postérieurs. Ce nouveau modèle préclinique AVF fournit une plate-forme utile qui récapitule les perturbations neuromotrices courantes signalées par les patients hémodialysés, permettant aux chercheurs d’étudier les mécanismes de la physiopathologie ARHD et de tester des thérapies potentielles.
Introduction
L’établissement et la préservation de l’accès vasculaire fonctionnel restent un objectif principal important pour les patients atteints d’insuffisance rénale terminale (IRT) recevant un traitement de remplacement rénal par hémodialyse1. Des traitements d’hémodialyse répétés sont nécessaires pour éliminer les déchets, normaliser les électrolytes et maintenir l’équilibre hydrique une fois que la fonction rénale devient inadéquate, et sont donc nécessaires à la survie à long terme2. Par conséquent, l’accès vasculaire représente une « bouée de sauvetage » pour les patients atteints d’IRT, et le placement de la fistule artérioveineuse autogène (FAV) reste une option d’accès privilégiée à la dialyse parmi cette cohorte3. Cependant, environ 30% à 60% des patients hémodialysés présentent un spectre de handicaps de la main, cliniquement définis comme un dysfonctionnement de la main lié à l’accès (ARHD). Les symptômes de l’ARHD peuvent aller de la faiblesse et de la discoordination à la monoplégie et à la gangrène digitale, qui peuvent survenir tôt après la création de l’AVF ou se développer progressivement avec la maturation de la fistule. De plus, la MRA complique le calendrier de traitement de l’IRT, qui est associé à une mauvaise qualité de vie, à un risque élevé de maladie cardiovasculaire et à une mortalité accrue 2,3,4.
Plusieurs modèles animaux ont été développés pour étudier le remodelage vasculaire induit par des altérations hémodynamiques suite à la création de FVA 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Les grands modèles animaux avec AVFiliaque ou fémorale 16,17,18,19,20 et les modèles de rongeurs utilisant soit l’anastomose de la veine carotide-jugulaire ou la formation de fistule de veine cave inférieure de l’aorte infrarénale sont bien établis pour examiner les aspects susmentionnés de la maturation et de la perméabilité de la FVA 21 . Par exemple, l’hypertension veineuse, un diamètre luminal plus important et une épaisseur accrue de la paroi veineuse sont des signes d’une maturation réussie de l’AVF, tandis qu’une fibrose importante du milieu et une hyperplasie intimale ou un développement de thrombus sans modification du débit caractérisent souvent les défaillances de la FVA 6,15. Cependant, les modèles de grands animaux n’ont pas la flexibilité expérimentale ou les capacités transgéniques des modèles murins, tandis que les modèles actuels de rongeurs ne facilitent pas facilement l’étude de la MRA en raison de l’emplacement anatomique et / ou de l’absence de pathologie associée aux membres. En effet, en raison de l’absence d’un modèle animal préclinique établi qui récapitule le phénotype clinique pertinent, les progrès de la recherche pour élucider les mécanismes pathobiologiques et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques sont restés stagnants, malgré une augmentation progressive du nombre de patients symptomatiques atteints de MRA. Par conséquent, l’objectif principal de cette étude est d’introduire un modèle murin unique d’ARHD, fournissant les étapes procédurales de la microchirurgie AVF et la caractérisation de la physiopathologie liée à l’AVF.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Floride et le Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center.
REMARQUE : Les jeunes souris adultes (8 à 10 semaines) mâles C57BL/6J ont été achetées auprès du Jackson Laboratory et logées dans une installation contrôlée pour animaux contrôlée par la lumière (lumière de 12 h : 12 h par cycle d’obscurité), la température (22 °C ± 1 °C) et l’humidité (50 % ± 10 %). Cinq souris ont été autorisées à habiter par cage (L: 18 cm x L: 29 cm x H: 12,5 cm) avec des matériaux de nidification, de la nourriture et de l’eau mis à disposition ad libitum. Après 7 jours d’acclimatation de l’habitat avec le chow standard, les souris ont été changées pour un régime à base de caséine pendant 7 jours comme phase de transition alimentaire. Par la suite, des souris ont été nourries avec une supplémentation en adénine de 0,2% à 0,15% pendant 2 à 3 semaines pour induire un dysfonctionnement rénal (IRC) avant la chirurgie AVF comme décrit précédemment22,23,24. Les souris témoins ont reçu un régime alimentaire à base de caséine sans supplémentation en adénine (témoin). Les régimes de contrôle et de MRC ont été maintenus tout au long de la période de récupération postopératoire (POD).
1. Mesures préopératoires
- Évaluer les mesures des résultats de base/préopératoires, les diamètres des vaisseaux aortoilés et les paramètres d’écoulement hémodynamique à l’aide de l’imagerie échographique duplex et de la perfusion des membres postérieurs par Doppler laser, comme décrit précédemment25.
- Déterminer la force de préhension unilatérale des membres postérieurs et l’évaluation de la marche sur tapis roulant pour établir la fonction de base des membres postérieurs comme décrit précédemment25,26.
- Évaluer la fonction rénale en mesurant le débit de filtration glomérulaire (DFG) via la clairance de l’inuline FITC et/ou le taux sérique d’azote uréique (BUN) dans le sang, comme décrit précédemment22,24,27.
2. Préparation chirurgicale
- Préparez les outils et fournitures chirurgicaux suivants (tableau des matériaux) : stérilisateur de billes chaudes, lubrifiant pour les yeux, coupe-bordure, préparations à base d’alcool, lingettes à la chlorhexidine, pinces Graefe extra-fines, solution saline stérilisée à 0,9 %, seringues à aiguille de 29 G et 31 G, 2 x 2 éponges non tissées, moyennes rondes à une extrémité (SC-9) et petites tiges de coton dures, tranchantes et pointues (SC-4) à double extrémité, cautérisation à basse température, pinces Dumont droites, pinces Dumont inclinées à 45°, ciseaux à ressort Vannas droits, ciseaux à ressort Vannas incurvés, porte-aiguilles à manche rond, sutures de plusieurs tailles de sutures (soie 4-0, 5-0 PGA, soie 6-0 et sutures en nylon 10-0), héparine, éponge à gélatine résorbable, porte-aiguille droit et buprénorphine.
REMARQUE: Les élastiques de fixation des extrémités et les rétracteurs pour l’abdomen et les jambes ont été fabriqués à la main. - Stériliser les préparations chirurgicales à l’aide d’un autoclave avec stérilisation à la vapeur à 120-125 °C pendant 30 minutes, suivie d’un séchage pendant 30 minutes avant la chirurgie. Utilisez un nettoyage à l’éthanol à 70% suivi d’une stérilisation des billes chaudes (240-270 °C pendant 3 min) entre chaque chirurgie animale.
- Préparer une solution saline normale stérilisée à 0,9 %, une solution saline héparinée (100 UI/mL) et de la buprénorphine (0,01 mg/mL) à l’aide de seringues à aiguille de 29 à 31 G.
3. Anesthésie et positionnement
- Initier l’anesthésie de la souris dans la chambre d’induction (0,8 mL/min, 2,5 % d’isoflurane). Une fois que la souris est correctement anesthésiée, placez-la en décubitus dorsal sur la station chirurgicale recouverte d’un champ stérile. Réduire la concentration d’isoflurane à ~1,2% pendant les étapes de rasage et de positionnement.
- Appliquez le lubrifiant oculaire pour protéger les yeux du dessèchement pendant la chirurgie.
- À l’aide d’un coupe-bordures, rasez les poils abdominaux pour l’opération et les poils des jambes pour les mesures de perfusion postopératoires. Dégagez les cheveux du champ chirurgical.
- Fixez les membres supérieurs et inférieurs avec des élastiques et des pinces, vérifiez la profondeur de l’anesthésie en surveillant le réflexe de pincement des orteils et titrez l’anesthésie au besoin. Effectuez l’évaluation du schéma respiratoire toutes les 3-5 minutes tout au long de l’intervention chirurgicale pour calibrer le niveau d’anesthésie.
4. Exploration de la zone cible chirurgicale
- Nettoyez la zone de peau rasée plusieurs fois, en alternant entre la préparation à l’alcool et les lingettes à la chlorhexidine selon un schéma circulaire pour désinfecter le champ chirurgical.
- Faites une laparotomie médiane du bord inférieur de la marge sternale à la symphyse pubienne. Disséquez le coussinet adipeux du pubis pour obtenir un champ opératoire plus large.
- Ouvrez la céliotomie pour accéder au contenu péritonéal avec des écarteurs et éviscérez l’intestin grêle et le gros intestin à l’aide de cotons-tiges ronds moyens et unilatéraux. Couvrir les intestins avec une éponge non tissée imbibée de solution saline.
- Une fois que l’exposition adéquate du système vasculaire rétropéritonéal est obtenue, couvrir l’intestin, les reins et les uretères restants avec de petites éponges non tissées imbibées de solution saline. Évacuez une vessie distendue en pressant doucement le dôme de la vessie avec des cotons-tiges ronds moyens et unilatéraux au besoin.
- Disséquer soigneusement le fascia périvasculaire et le tissu adipeux d’environ 1 cm proximal à la bifurcation aortique s’étendant jusqu’au niveau de la bifurcation iliaque gauche à l’aide de pinces Dumont droites et de petits cotons-tiges durs, pointus et pointus à double extrémité.
REMARQUE: L’artère iliaque gauche et la veine restent adhérentes l’une à l’autre tout en isolant les structures artérioveineuses en masse. Cette étape fournira une mobilisation suffisante des navires pour faciliter la création de l’AVF. - Si de petites branches veineuses proviennent de la veine iliaque commune gauche ou convergent avec elle, ligaturez-les en utilisant une cautérisation à basse température avec ou sans suture de soie 6-0 au besoin.
- Passez l’extrémité de la pince inclinée sous le faisceau vasculaire iliaque commun gauche et écartez-la doucement plusieurs fois pour mobiliser les vaisseaux de la musculature rétropéritonéale sous-jacente (Figure 1A).
5. Création d’une anastomose de fistule artérioveineuse iliaque commune
- Placez deux sutures de soie 4-0 autour du faisceau artérioveineux iliaque commun gauche isolé et utilisez-les comme ligatures (p. ex. pinces croisées) du faisceau vasculaire. Créez un seul nœud avec chaque cravate en soie 4-0 et appliquez-les séquentiellement de proximal à distale.
- Assurez-vous que les pinces croisées en soie sont placées suffisamment loin l’une de l’autre pour isoler ~2 mm de longueur de vaisseau, et l’application séquentielle des ligatures de suture précipitera l’engorgement de la veine iliaque gauche.
- En utilisant les cordes de suture en soie 4-0 comme poignées, faites pivoter le faisceau vasculaire artérioveineux iliaque gauche dans le sens des aiguilles d’une montre et affinez la position pour localiser temporairement la veine antérieure à l’artère (Figure 1B).
- Faites une veinotomie longitudinale (~1 mm) avec des ciseaux à ressort Vannas droits et rincez doucement le sang résiduel de la lumière veineuse avec une solution saline à 0,9 % (figure 1C). Soyez prudent pendant cette étape, car un rinçage de solution saline à haute pression peut provoquer une perturbation veineuse.
REMARQUE: La région de couleur rouge qui reste dans l’artère iliaque après le rinçage veineux fournit une fenêtre visuelle pour l’étape suivante. - Placez une suture imbriquante en nylon 10-0 à travers la paroi postérieure de la veine.
REMARQUE: Cette partie de la veine iliaque doit être en apposition immédiate à la paroi antérieure de l’artère iliaque, et les parois sont naturellement adhérentes. La suture doit traverser les deux parois et attacher la suture avec un seul nœud (Figure 1D). Notez qu’une petite quantité de saignement, qui provient du sang stagnant dans l’artère iliaque, apparaîtra une fois que l’aiguille passera à travers les deux parois. Si le saignement intra-luminal se poursuit au cours de cette étape, les pinces croisées de suture en soie peuvent être trop lâches et doivent être resserrées. - Saisissez les extrémités de suture imbriquées et placez-les sous une légère tension pour déplacer la paroi antérieure de la paroi postérieure de l’artère iliaque. Faites une incision elliptique de ~1,0 mm x 0,3 mm à l’aide de ciseaux à ressort Vannas incurvés, en enlevant les parois adhérentes de l’artère iliaque et de la veine.
REMARQUE: La fistule artérioveineuse est ainsi créée une fois ce canal commun établi. Il est possible de blesser les parois latérales de la veine au cours de cette étape car l’incision de la veine iliaque postérieure / paroi de l’artère iliaque antérieure est réalisée par exposition à la veinotomie. Des précautions doivent être prises pour éviter cette complication car cela peut réduire considérablement le diamètre de la fistule et conduire au développement de thrombus. - Rincer doucement le sang résiduel de la lumière artérielle exposée avec une solution saline à 0,9 % et une solution saline héparinée (100 UI/mL)28 (figure 1E).
- Après la création de l’AVF, réparer la veinotomie initiale de la paroi antérieure à l’aide de deux ou trois sutures en nylon 10-0 de façon interrompue (figure 1F).
- Restaurez le faisceau vasculaire à son orientation anatomique d’origine et placez un petit morceau d’éponge de gélatine absorbable imbibée de solution saline à côté de la veinotomie réparée pour faciliter l’hémostase.
- Desserrez les ligatures de pince croisée à un nœud 4-0 séquentiellement de distale à proximale. Surveillez de près le site de veinotomie pour détecter tout saignement excessif tout en desserrant chaque suture.
- Si la réparation n’est pas suffisamment hémostatique, réappliquez les pinces croisées et placez une autre suture en nylon 10-0 sur le site du saignement. Si l’hémostase est assurée, retirez les sutures puis l’éponge de gélatine résorbable.
- Frottez doucement le faisceau vasculaire avec de petits cotons-tiges durs, pointus et à double extrémité, ce qui facilite davantage le rétablissement du flux sanguin. Confirmer le succès technique de l’opération en visualisant le sang oxygéné rouge vif pulsatile entrant dans la veine iliaque et se mélangeant au sang veineux foncé revenant du membre postérieur.
- Injecter une solution saline héparinée (0,2 UI/g)15 dans l’IVC pour l’anticoagulation systémique afin d’améliorer les résultats de perméabilité AVF.
REMARQUE: Bien que cette étape se produise après la reconstruction vasculaire (par opposition à l’analogue humain où l’héparinisation se produit avant le serrage croisé des vaisseaux), une réduction des saignements peropératoires et une amélioration de la perméabilité AVF ont été observées lorsqu’elles sont effectuées à ce stade de la procédure. L’injection dans un site recouvert de fascia et/ou de graisse est préférable pour prévenir les saignements du site de ponction. - Réinspecter le site chirurgical pour l’hémostase après l’injection de solution saline héparinisée. S’il n’y a pas de problèmes de saignement, fermez le fascia médian, puis l’incision cutanée avec des sutures résorbables 5-0 PGA en courant.
- Pour les opérations fictives, suivez toutes les étapes clés de la procédure, à l’exception de la formation AVF. Appliquez un seul nœud de la ligature de soie 4-0 à l’extrémité proximale du faisceau artérioveineux iliaque gauche et faites correspondre les temps de serrage aux chirurgies AVF (par exemple, ~ 20 min, selon les compétences du microchirurgien).
6. Soins postopératoires et mesure
- Après la fermeture de la laparotomie, mesurer la perfusion sanguine des muscles antérieurs bilatéraux du tibial et des pattes ventrales à l’aide de l’imagerie Doppler laser.
NOTE: Les déficits de perfusion unilatéraux confirmeront le détournement du flux artériel de la fistule (« voler »). - Administrer 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée et remettre la souris dans une cage à souris préchauffée avec une litière molle hautement absorbable avec nid.
- Laissez la souris récupérer dans la cage de souris préchauffée jusqu’à ce que l’anesthésie se dissipe, ce qui sera évident lorsque la souris est ambulatoire et interactive (~2 h). Pendant la récupération, donnez à la souris un accès facile à une alimentation hydratée et douce.
- Administrer de la buprénorphine et/ou une solution saline sous-cutanée toutes les 12 h jusqu’à 48 h et effectuer une surveillance quotidienne pendant 5 jours après l’opération. Euthanasier les animaux dont l’état se détériore ou dont la nécrose tissulaire est excessive, classés comme un score d’ischémie modifié ≥229.
- Utiliser des échographies duplex en série pour évaluer la perméabilité de la fistule après l’opération; les souris atteintes de thrombose de la fistule sont exclues des analyses ultérieures, sauf si le but des expériences est de caractériser l’échec de la maturation AVF.
- Déterminer d’autres mesures de résultats postopératoires telles que l’hémodynamique locale, la force de préhension et la performance de la marche pendant la période de récupération. Recueillir des fistules et des tissus musculaires pour évaluer l’histomorphologie à la fin de l’expérience pendant le sacrifice25,27.
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Representative Results
Les animaux exposés à un régime adénine ont des taux de filtration glomérulaire réduits (contrôle : 441,3 ± 54,2 μL/min vs IRC : 165,1 ± 118,3 μL/min, p < 0,05) et une augmentation des taux sériques d’azote uréique dans le sang (témoin : 20,39 ± 4,2 μL/min vs IRC : 38,20 ± 10,65 μL/min, p < 0,05) par rapport aux animaux ayant reçu du chow à base de caséine, confirmant la présence d’une insuffisance rénale avant la chirurgie de la fistule artérioveineuse.
Validation de la perméabilité AVF
Bien que la confirmation visuelle peropératoire du succès technique soit l’identification initiale de la perméabilité de la fistule, elle ne garantit pas pleinement la perméabilité ou la maturation physiologique tout au long de la période d’étude. Les résultats de perméabilité postopératoire (c.-à-d. succès ou échec) ont été déterminés à l’aide de l’imagerie échographique duplex et de l’examen histologique, comme nous l’avons déjà démontré25. La figure 2 montre respectivement les images d’échographie représentatives du mode B, du Doppler à onde de pouls et du Doppler couleur et les coupes morphologiques d’une anastomose de fistule artérioveineuse. Une fistule patente est directement visualisée sur l’analyse Doppler couleur avec hémodynamique turbulente, ainsi que l’élargissement spectral au site de la fistule. Les changements adaptatifs médiés par le débit des vaisseaux d’entrée et de sortie confirment également indirectement la perméabilité de l’AVF. Plus précisément, l’aorte a une vitesse systolique et diastolique maximales élevée, l’IVC développe une pulsatilité avec une vitesse maximale élevée et une dilatation des vaisseaux dans l’aorte et l’IVC est apparente (Figure 2A). En revanche, une fistule défaillante ou thrombosée n’a presque aucun changement dans les mesures d’entrée ou de sortie et aucune turbulence ou élargissement spectral dans le système vasculaire iliaque gauche. Habituellement, l’échec de la fistule due à la thrombose obstrue partiellement ou totalement l’artère iliaque gauche, ce qui est visualisé comme un débit minimal ou nul sur l’analyse Doppler à ondes de pouls. La figure 2B montre les coupes histologiques en série d’une FVA 2 semaines après la création chirurgicale. Les sections ont une épaisseur de 5 μm et sont teintées au trichrome de Masson. L’anastomose chirurgicale de l’artère et de la veine est évidente et une artérialisation veineuse distincte est présente (épaississement de la paroi veineuse et fibrose avec hyperplasie néo-intimale). L’imagerie échographique a été réalisée le jour 3 postopératoire pour exclure les souris présentant un échec précoce de l’AVF, puis des mesures en série non invasives ont été obtenues tout au long de la période d’étude. L’évaluation morphologique fournit des détails de remodelage vasculaire spécifiques à la période au moment du sacrifice et a été utilisée pour confirmer les résultats de l’échographie. Un taux de perméabilité AVF d’environ 50 % (20 % à 30 % des décès postopératoires et 20 % à 30 % des cas d’insuffisance de fistule)25 est à prévoir initialement, mais le taux de réussite chirurgicale s’améliore considérablement (~5 % à 10 % de taux d’échec) avec la pratique et une compétence accrue.
Caractéristiques physiopathologiques après formation de fistule artérioveineuse iliaque
Altération hémodynamique : Les caractéristiques de l’hémodynamique AVF et de la perfusion distale des membres postérieurs doivent être quantifiées pour contextualiser la physiopathologie des membres liée à l’accès. Les mesures échographiques Doppler en mode B et à onde de pouls après la chirurgie ont révélé une dilatation des vaisseaux entrants et sortants (IVC: 1,4 fois à POD3 et 1,6 fois à POD13 et IRA: 1,4 fois à POD3 et 1,7 fois à POD13, p < 0,05) et une augmentation de la vitesse systolique maximale (vitesse systolique maximale IVC: 5,5 fois à POD3 et 4,9 fois à POD13 et vitesse systolique maximale IRA: 2,8 fois à POD3 et 3,7 fois à POD13, P < 0,05) par rapport aux animaux fictifs (Figure 3A-D). De plus, une ischémie unilatérale des membres postérieurs était apparente après l’opération, ce qui confirme une hypoperfusion artérielle distale à médiation volée à la fistule. Les déficits de perfusion de la patte gauche devraient être ~20% du membre controlatéral, et le déficit de perfusion du muscle antérieur du tibial est de ~60%. Les souris ont partiellement récupéré ces déficits tout au long de la période d’étude (figure 3E,F).
Dysfonctionnement des membres postérieurs : une incapacité des membres ipsilatéraux est attendue après la création d’AVF, ce qui implique une boiterie légère (la plupart des cas) à sévère (quelques cas) des jambes qui peut durer plusieurs jours. Une paralysie des membres postérieurs non résolue et/ou une nécrose des pattes peuvent indiquer une agression ischémique grave causée par une taille de fistule hors de la plage normale. La fonction neuromotrice des membres postérieurs a été quantifiée par des tests de force de préhension et une analyse du modèle de marche sur tapis roulant, qui ont été effectués séquentiellement tout au long de la période de récupération. La force de préhension unilatérale attendue est de ~50% du membre controlatéral au jour 4 postopératoire, avec une récupération progressive. Les souris AVF ont également besoin d’une vitesse réduite sur tapis roulant lors de l’évaluation de la marche (<20 cm/min) (figure 3G,H).
Figure 1 : Étapes microchirurgicales de l’anastomose de la fistule artérioveineuse. (A) Exposition de la zone cible chirurgicale, y compris la laparotomie médiane et l’isolement de l’artère/veine iliaque gauche. (B) ligatures de suture 4-0 (p. ex. utilisées comme colliers de serrage vasculaires temporaires) sur le faisceau artérioveineux iliaque commun gauche aux sites proximaux et distaux. (C) Une veinotomie longitudinale sur la paroi antérieure de la veine iliaque. (D) suture imbriquante 10-0 via la paroi postérieure de la veine iliaque et la paroi antérieure de l’artère iliaque. (E) Incision elliptique avec distension imbriquante. (F) La veinotomie longitudinale initiale de l’image C est réparée à l’aide d’une suture interrompue de 10-0. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Validation de la perméabilité de la fistule artérioveineuse. (A) Détermination par échographie Doppler de la perméabilité AVF. Les caractéristiques d’une fistule patente comprennent la dilatation artérielle et veineuse sur l’imagerie en mode B, l’analyse Doppler couleur du flux turbulent du système vasculaire iliaque gauche, l’élargissement spectral pulsatile sur l’évaluation Doppler par ondes de pouls des vaisseaux iliaques gauches, l’augmentation de la vitesse systolique maximale et diastolique terminale de l’aorte infrarénale et la pulsatilité dans l’IVC avec augmentation de la vitesse systolique maximale. Une diminution ou une absence d’écoulement dans les vaisseaux iliaques suggère une défaillance ou une thrombose de la FVA. La technique de l’échographie duplex fournit des données à la fois morphologiques et physiologiques. Les mesures de vitesse sont en millimètres par seconde. (B) Évaluation morphologique de l’anastomose AVF 14 jours après la création de la fistule. Les images étaient tachées du trichrome de Masson. Il y a des changements anatomiques dans la microscopie de section sérielle de l’anatomie artérioveineuse iliaque commune proximale (extrémité gauche) à distale (extrémité droite). L’occlusion du système vasculaire due à un caillot et/ou à une hyperplasie néo-intimale excessive confirme l’échec de la FAV. Les images sont grossies 10x. A : Artère iliaque commune, V : Veine iliaque commune. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Caractéristiques physiopathologiques avant et après la formation de la FVA. Quantification de l’imagerie échographique dans (A) le diamètre aortique infrarénal, (B) la vitesse systolique maximale de l’aorte infrarénale, (C) le diamètre inférieur de la veine cave et (D) la vitesse systolique maximale inférieure de la veine cave avant l’opération et aux jours 3 et 13 postopératoires. Mesure locale de la perfusion sanguine (Laser Doppler) sur (E) tibial antérieur et (F) patte ventrale avant la chirurgie et tout au long de la période de récupération de 2 semaines. Les tests fonctionnels neuromoteurs comprenaient (G) la force de préhension et (H) le test sur tapis roulant avant et après l’opération. Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA bidirectionnelle, et le test post-hoc de Tukey a été effectué lorsque cela était approprié. Les valeurs sont des moyennes ± écart-type. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 par rapport à Control_Sham. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, ####p < 0,0001 contre CKD_Sham. N = 6-10/groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La prévalence des patients hémodialysés atteints de MRA après la création de la FVA a continué d’augmenterde 30,31. En effet, les complications symptomatiques non résolues 4,32,33 telles que la douleur, la faiblesse, la paresthésie et/ou la réduction de l’amplitude des mouvements peuvent avoir un impact négatif sur le bien-être du patient 4,32,33,34,35,36 et menacer sa capacité à recevoir un traitement d’hémodialyse répétitive de haute qualité. Bien que la réalisation d’un accès durable à l’hémodialyse soit une priorité absolue pour les patients atteints d’IRT, pour les sujets atteints de MRA, ces symptômes potentiellement débilitants doivent être traités pour améliorer les résultats centrés sur le patient. Dans la présente étude, en tant qu’étape préclinique importante dans le domaine de la recherche sur la MRA, nous introduisons une procédure chirurgicale détaillée pour générer un modèle murin de FVA iliaque, ce qui facilite l’examen de la physiopathologie des membres associée à la FVA. En plus des altérations attendues de l’hémodynamique aorto-iliaque et IVC, la création de FVA iliaque a produit des caractéristiques cliniquement pertinentes de dysfonctionnement des membres, y compris une ischémie tissulaire périphérique avec déficience motrice globale.
Chaque étape de microchirurgie doit être effectuée avec un soin exquis pour éviter un traumatisme vasculaire potentiel, qui peut entraîner des changements substantiels dans l’hémodynamique et la pathologie des membres. Pendant la ligature, le nœud de cravate en soie 4-0 ne doit être resserré que suffisamment pour empêcher le flux sanguin à travers le site chirurgical d’intérêt. Une tension excessive du nœud de ligature de suture peut blesser la paroi du vaisseau, ce qui peut provoquer des saignements indésirables et contribuer à une hyperplasie intimale, entraînant une diminution de la perméabilité AVF. En particulier, la réparation de la veinotomie est l’une des étapes les plus importantes de l’intervention chirurgicale. Une morsure trop importante dans la paroi veineuse peut entraîner une sténose des vaisseaux et, finalement, une thrombose, tandis qu’une réparation trop superficielle peut provoquer une déhiscence avec hémorragie. De même, des saignements peuvent également survenir si les sutures de réparation de veinotomie sont trop espacées. D’après notre expérience, un intervalle de ~0,025-0,03 mm entre les sutures est suffisant pour créer une réparation hémostatique.
Outre la reproductibilité de la technique chirurgicale, l’utilisation d’un modèle animal spécifique à une maladie ou à un symptôme est l’une des contributions les plus importantes des travaux actuels. Dans la présente étude, les animaux ont été exposés à un régime adénine de 0,2% à 0,15% pendant 2 à 3 semaines avant et après la chirurgie AVF pour établir un dysfonctionnement rénal et un milieu urémique analogue aux patients atteints d’IRT. Comparativement aux modèles chirurgicaux de MRC (p. ex. néphrectomie 5/6), un modèle de régime adénine présente plusieurs avantages, notamment de très faibles taux de mortalité et moins de variationinter-observateurs27,37. Notamment, la gravité et les conséquences physiopathologiques peuvent être modifiées en fonction de la concentration et/ou de la durée du régime adénine38,39. Couplé à la néphropathie induite par l’alimentation, le modèle animal actuel décrit ici peut ouvrir la voie aux chercheurs pour étudier les mécanismes physiopathologiques par lesquels l’urémie affecte la MRA. De plus, d’autres modèles animaux de la maladie peuvent être ajoutés au modèle chirurgical pour tester l’influence de comorbidités très répandues, telles que le diabète, l’hypertension ou les maladies coronariennes.
Bien que la procédure de FVA iliaque présentée modélise de manière reproductible les aspects clés de la physiopathologie des membres pertinents pour les patients hémodialysés atteints de MRA, certaines limites et complications méritent d’être discutées. Premièrement, les souris soumises à cette procédure n’ont pas de véritable « accès vasculaire » ; Ainsi, les expériences impliquant des traitements expérimentaux d’hémodialyse ne sont pas possibles. Deuxièmement, la gravité du dysfonctionnement des membres est affectée par la taille de la communication artérioveineuse, de sorte que la création constante d’AVF est essentielle pour des résultats reproductibles. Par exemple, la création d’un AVF important peut produire une ischémie sévère des membres postérieurs, qui peut aboutir à une nécrose des membres. Les nouveaux microchirurgiens qui commencent la procédure sont encouragés à utiliser des analyses histologiques des AVF créés pour analyser la taille pour la cohérence. Chez les souris soumises à d’autres modèles AVF, un remodelage cardiaque, y compris une hypertrophie et éventuellement une insuffisance cardiaque, a été rapporté 40,41,42. Les altérations cardiaques dans le modèle actuel n’ont pas été rigoureusement évaluées, bien que nous ayons qualitativement observé une hypertrophie cardiaque par rapport aux animaux fictifs. En outre, de futures analyses à long terme sont nécessaires pour évaluer comment le système cardiovasculaire murin s’adapte à la formation et à la maturation iliaques de l’AVF. Une préoccupation supplémentaire est que les souris C57BL6 plus jeunes ont la capacité de générer des réponses d’artériogenèse et d’angiogenèse aux stimuli ischémiques, conduisant à la formation de vaisseaux collatéraux, comme le montre la récupération modeste de la perfusion laser Doppler des membres dans cette étude. Ainsi, il est possible que les souris se rétablissent complètement de la pathologie des membres AVF une fois que des réseaux collatéraux plus robustes se sont formés; Cependant, des études futures sont nécessaires pour cartographier la croissance collatérale et les changements vasculaires distaux.
À ce jour, les mécanismes sous-jacents par lesquels la fonction de la main est altérée et/ou exacerbée par la mise en place de l’AVF sont incomplètement compris. Étant donné que le génome de la souris est bien caractérisé et qu’il existe un accès facile à un large éventail de modèles transgéniques pour la manipulation génétique chez la souris, ce modèle chirurgical iliaque AVF fournit un outil utile pour la découverte biomédicale autour de l’ARHD. Comparé à d’autres modèles de FVA chez les rongeurs, qui utilisent la chirurgie vasculaire centrale (par exemple, le modèle de fistule aorto-caviale) ou les modèles de grands animaux avec AVF fémorale ou iliaque, le modèle actuel de FVA iliaque avec ou sans urémie induite par le régime adéniné fournit aux chercheurs une plate-forme expérimentale robuste qui peut être utilisée pour interroger les mécanismes biologiques sous-jacents associés à l’hémodialyse ARHD et générer de nouvelles thérapies ciblées. En outre, les modèles précliniques sont généralement considérés comme cruciaux pour le développement précoce et la validation de thérapies pharmaceutiques, dont aucun n’est actuellement disponible pour traiter / prévenir la MRCA. Notamment, ce modèle se prête également à des modifications de la taille de l’AVF et de la gravité du dysfonctionnement rénal, ce qui permet aux chercheurs de moduler soigneusement la gravité de la pathologie. En conclusion, ce modèle unique de FVA préclinique chez la souris peut servir de plate-forme pratique pour faciliter le développement thérapeutique préclinique visant à réduire l’invalidité de la main après le placement de la FVA.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions sincèrement le Dr Guanyi Lu de la Division de chirurgie vasculaire et de thérapie endovasculaire de l’Université de Floride pour le soutien technique sur le développement du modèle iliaque AVF, ainsi que la formation chirurgicale, et Ravi Kumar du Département de physiologie appliquée et de kinésiologie de l’Université de Floride pour le soutien technique pour obtenir les images microchirurgicales en direct.
Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et du National Heart, Lung, and Blood, numéros d’institut R01-HL148697 (à S.T.S.), ainsi que par le numéro de subvention POST903198 de l’American Heart Association (à K.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% Adenine diet | ENVIGO | TD.130899 | 20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P |
| 0.2% Adenine diet | ENVIGO | TD.130900 | 20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P |
| 10-0 Nylon suture | AD surgical | XXS-N1005T4 | |
| 29 G needle syringes | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G needle syringes | Advocate | U-100 insulin syringe | |
| 4-0 silk suture | AD surgical | S-S41813 | |
| 45-degree angled dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| 5-0 PGA suture | AD surgical | PSGU-518R13 | |
| 6-0 silk suture | AD surgical | S-S618R13 | |
| Absorbable gelatin sponge | ETHICON | 1975 | |
| Alcohol preps | Covidien | 5110-cs4000 | 70% isopropyl alcohol |
| Buprenorphine | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J mice | Jaxon Laboratory | ||
| Casein diet | ENVIGO | TD.130898 | 20% casein, 0.9% P |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-9 | Medium single-ended round cotton swab |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-4 | Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab |
| Curity non-woven sponges (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Curved Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Doppler ultrasound | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Extra fine graefe forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | 2 pairs |
| Eye lubricant | CLCMEDICA | Optixcare eye lube | |
| Heparin (5000 U/mL) | National Drug Codes List | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Low-temperature cautery | Bovie | AA04 | |
| Pen trimmer | Wahl | 5640-600 | |
| Powder-free surgical gloves | Ansell | 7824PF | |
| Round handled needle holders | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sterile towel drape | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilized 0.9% saline | National Drug Codes List | 46066-807-25 | |
| Straight dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Straight needle holder | Fine Science Tools | FST 12001-13 | |
| Straight vannas spring scissors | Fine Science Tools | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | National Drug Codes List | 17033-279-50 |
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