Summary
В этом протоколе подробно описаны хирургические этапы создания общей подвздошной артериовенозной фистулы у мышей. Мы разработали эту модель для изучения патофизиологии конечностей, связанной с доступом к гемодиализу.
Abstract
Хроническая болезнь почек является серьезной проблемой общественного здравоохранения, и распространенность терминальной стадии почечной недостаточности (ТПН), требующей хронической заместительной почечной терапии, такой как гемодиализ, продолжает расти. Установка аутогенного артериовенозного свища (АВФ) остается основным вариантом сосудистого доступа для пациентов с ТПН. К сожалению, примерно половина пациентов, находящихся на гемодиализе, испытывают дисфункцию рук, связанную с диализным доступом (ARHD), начиная от тонкой парестезии и заканчивая цифровой гангреной. Примечательно, что основные биологические факторы, ответственные за АРГД, плохо изучены, и не существует адекватной модели на животных для выяснения механизмов и / или разработки новых терапевтических средств для профилактики / лечения АРГД. Здесь мы описываем новую мышиную модель, в которой AVF создается между левой общей подвздошной артерией и веной, тем самым облегчая оценку патофизиологии конечностей. Микрохирургия включает в себя изоляцию сосудов, продольную венотомию, создание артериовенозного анастомоза и венозную реконструкцию. Фиктивные операции включают в себя все критические этапы, кроме создания AVF. Размещение АВФ подвздошной кости приводит к клинически значимым изменениям центральной гемодинамики, периферической ишемии и нарушениям нейромоторных характеристик задних конечностей. Эта новая доклиническая модель AVF обеспечивает полезную платформу, которая повторяет распространенные нейромоторные возмущения, о которых сообщают пациенты, находящиеся на гемодиализе, позволяя исследователям исследовать механизмы патофизиологии АРГД и тестировать потенциальные терапевтические средства.
Introduction
Установление и сохранение функционального сосудистого доступа остается важной основной целью для пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности (ТПН), получающих заместительную почечную терапию посредством гемодиализа1. Повторные процедуры гемодиализа необходимы для удаления продуктов жизнедеятельности, нормализации электролитов и поддержания баланса жидкости после того, как функция почек становится неадекватной, и, таким образом, необходимы для долгосрочной выживаемости2. Таким образом, сосудистый доступ представляет собой «спасательный круг» для пациентов с ТПН, и размещение аутогенного артериовенозного свища (АВФ) остается предпочтительным вариантом доступа к диализу среди этой когорты3. Тем не менее, примерно 30-60% пациентов, находящихся на гемодиализе, испытывают целый спектр нарушений кисти, клинически определяемых как дисфункция рук, связанная с доступом (ARHD). Симптомы АРГД могут варьироваться от слабости и дискоординации до моноплегии и пальцевой гангрены, которые могут возникать рано после создания АВФ или развиваться постепенно с созреванием свища. Кроме того, ARHD усложняет схему лечения ТПН, что связано с низким качеством жизни, высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний и повышенной смертностью 2,3,4.
Было разработано несколько моделей на животных для изучения сосудистого ремоделирования, вызванного гемодинамическими изменениями после создания AVF 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Модели крупных животных с АВФ подвздошной или бедренной кости 16,17,18,19,20 и модели грызунов с использованием анастомоза сонной артерии-яремной вены или формирования свища нижней полой вены инфраренальной аорты хорошо известны для изучения вышеупомянутых аспектов созревания и проходимости АВФ 21 . Например, венозная гипертензия, больший диаметр просвета и увеличение толщины стенки вены являются признаками успешного созревания АВФ, тогда как значительный фиброз среды и гиперплазия интимы или развитие тромба без изменений потока часто характеризуют неудачи АВФ 6,15. Тем не менее, модели крупных животных не обладают экспериментальной гибкостью или трансгенными возможностями мышиных моделей, в то время как современные модели грызунов не облегчают исследование АРГД из-за анатомического расположения и/или отсутствия сопутствующей патологии конечностей. Действительно, из-за отсутствия установленной доклинической модели животных, которая повторяет соответствующий клинический фенотип, прогресс исследований по выяснению патобиологических механизмов и разработке новых терапевтических стратегий оставался в застое, несмотря на прогрессирующее увеличение числа симптоматических пациентов с ДРГД. Таким образом, основная цель этого исследования состоит в том, чтобы представить уникальную мышиную модель АРГД, обеспечивающую процедурные этапы микрохирургии АВФ и характеристику патофизиологии, связанной с АВФ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Флориды и Медицинским центром по делам ветеранов Малкольма Рэндалла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Молодые взрослые (8-10 недель) самцы мышей C57BL / 6J были приобретены в лаборатории Джексона и размещены в помещении для контролируемых животных с легким (12-часовой свет: 12-часовой темный цикл), температурой (22 °C ± 1 °C) и влажностью (50% ± 10%). Пяти мышам было разрешено жить в клетке (Ш: 18 см x Д: 29 см x В: 12,5 см) с материалами для гнездования, пищей и водой, которые были доступны вволю. После 7 дней акклиматизации среды обитания со стандартным кормом мыши были переведены на рацион на основе казеина в течение 7 дней в качестве переходной фазы диеты. После этого мышей кормили чау-чау на основе казеина добавкой аденина 0,2%-0,15% в течение 2-3 недель, чтобы вызвать почечную дисфункцию (ХБП) до операции AVF, как описано ранее22,23,24. Контрольные мыши получали пищу на основе казеина без добавок аденина (контроль). Контрольная диета и диета при ХБП сохранялись в течение всего послеоперационного восстановительного периода (POD).
1. Предоперационные измерения
- Оцените исходные/предоперационные исходы, диаметры аорто-подвздошных сосудов и параметры гемодинамического потока с помощью дуплексной ультразвуковой визуализации и перфузии задних конечностей с помощью лазерной допплерографии, как описано ранее25.
- Определите одностороннюю силу захвата задних конечностей и оценку походки на беговой дорожке, чтобы установить исходную функцию задних конечностей, как описано ранее25,26.
- Оцените функцию почек путем измерения скорости клубочковой фильтрации (СКФ) с помощью клиренса FITC-инулина и/или уровня азота мочевины мочевины (АМК) сыворотки крови, как описано ранее22,24,27.
2. Хирургическая подготовка
- Подготовьте следующие хирургические инструменты и расходные материалы (Таблица материалов): стерилизатор горячих шариков, смазка для глаз, триммер для ручек, спиртовые препараты, салфетки с хлоргексидином, сверхтонкие щипцы Graefe, стерилизованные 0,9% физиологический раствор, игольчатые шприцы 29 г и 31 г, нетканые губки 2 х 2, средние односторонние круглые (SC-9) и маленькие двусторонние твердые, острые, заостренные (SC-4) ватные палочки, низкотемпературное прижигание, прямые щипцы Dumont, щипцы Dumont под углом 45°, прямые пружинные ножницы Vannas, изогнутые пружинные ножницы Vannas, иглодержатели с круглой ручкой, швы нескольких размеров (шелк 4-0, PGA, шелк 6-0 и нейлоновые швы 10-0), гепарин, рассасывающаяся желатиновая губка, держатель прямой иглы и бупренорфин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Резинки для фиксации конечностей и ретракторы для живота и ног были изготовлены вручную. - Стерилизуют хирургические препараты в автоклаве с паровой стерилизацией при 120-125 °C в течение 30 минут с последующей сушкой в течение 30 минут перед операцией. Используйте 70% очистку этанолом с последующей стерилизацией горячих гранул (240-270 ° C в течение 3 минут) между каждой операцией на животных.
- Приготовьте стерилизованный 0,9% физиологический раствор, гепаринизированный физиологический раствор (100 МЕ / мл) и бупренорфин (0,01 мг / мл) с помощью игольчатых шприцев по 29-31 г.
3. Анестезия и позиционирование
- Инициируйте анестезию мыши в индукционной камере (0,8 мл / мин, 2,5% изофлурана). После того, как мышь будет адекватно анестезирована, поместите мышь в положение лежа на спине на хирургической станции, накрытой стерильной простыней. Уменьшите концентрацию изофлурана до ~ 1,2% на этапах бритья и позиционирования.
- Нанесите смазку для глаз, чтобы защитить глаза от высыхания во время операции.
- Используя триммер для ручки, сбрейте волосы на животе перед операцией и волосы на ногах для послеоперационных измерений перфузии. Очистите волосы от операционного поля.
- Зафиксируйте верхние и нижние конечности резинками и зажимами, проверьте глубину анестезии, контролируя рефлекс защемления пальцев ног, и при необходимости титруйте анестезию. Выполняйте оценку характера дыхания каждые 3-5 минут на протяжении всей хирургической процедуры, чтобы откалибровать уровень анестезии.
4. Исследование хирургической целевой области
- Очистите выбритый участок кожи несколько раз, чередуя спиртовые салфетки и салфетки с хлоргексидином по кругу, чтобы продезинфицировать операционное поле.
- Делают срединную лапаротомию от нижнего края грудины до лобкового симфиза. Рассеките лобковую жировую подушку, чтобы получить более широкое операционное поле.
- Откройте целиотомию, чтобы получить доступ к перитонеальному содержимому с помощью ретракторов, и выпотрошите тонкую и толстую кишку с помощью средних односторонних круглых ватных тампонов. Накройте кишечник пропитанной солевым раствором нетканой губкой.
- После получения адекватного воздействия на забрюшинную сосудистую сеть покройте оставшийся кишечник, почки и мочеточники небольшими неткаными губками, пропитанными физиологическим раствором. Эвакуируйте растянутый мочевой пузырь, осторожно сжимая купол мочевого пузыря средними односторонними круглыми ватными тампонами по мере необходимости.
- Тщательно рассекают периваскулярную фасцию и жировую ткань примерно на 1 см проксимально до бифуркации аорты, доходящей до уровня левой бифуркации подвздошной кости, используя прямые щипцы Дюмона и небольшие двусторонние твердые, острые, заостренные ватные тампоны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Левая подвздошная артерия и вена остаются прилипшими друг к другу, изолируя артериовенозные структуры в массовом порядке. Этот шаг обеспечит достаточную мобилизацию судов для облегчения создания AVF. - Если обнаружены какие-либо небольшие венозные ветви, происходящие из левой общей подвздошной вены или сходящиеся с ней, перевязывайте их с помощью низкотемпературного прижигания с шелковым швом 6-0 или без него по мере необходимости.
- Проведите кончиком угловых щипцов под левым общим пучком подвздошных сосудов и аккуратно распределите несколько раз, чтобы мобилизовать сосуды из нижележащей забрюшинной мускулатуры (рис. 1А).
5. Создание общего анастомоза подвздошной артериовенозной фистулы
- Наложите два шелковых шва 4-0 вокруг изолированного левого общего подвздошного артериовенозного пучка и используйте их в качестве лигатур (например, перекрестных зажимов) к сосудистому пучку. Создайте один узел с каждым шелковым галстуком 4-0 и наложите их последовательно от проксимального к дистальному.
- Убедитесь, что поперечные зажимы с шелковыми галстуками расположены достаточно далеко друг от друга, чтобы изолировать ~ 2 мм длины сосуда, а последовательное наложение шовных лигатур ускорит нагрубание левой подвздошной вены.
- Используя шелковые шовные нити 4-0 в качестве ручек, поверните левый подвздошный артериовенозный сосудистый пучок по часовой стрелке и точно отрегулируйте положение, чтобы временно расположить вену спереди от артерии (рис. 1B).
- Сделайте продольную венотомию (~1 мм) прямыми пружинными ножницами Vannas и аккуратно смойте остатки крови из венозного просвета 0,9% физиологическим раствором (рис. 1В). Будьте осторожны на этом этапе, так как промывка физиологическим раствором под высоким давлением может вызвать венозное нарушение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Область красного цвета, которая остается в подвздошной артерии после венозной промывки, обеспечивает визуальное окно для следующего шага. - Наложите имбрикационный нейлоновый шов 10-0 через заднюю стенку вены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть подвздошной вены должна находиться непосредственно к передней стенке подвздошной артерии, и стенки естественно прилипают. Шов должен проходить через обе стенки и завязывать шов одним узлом (рис. 1D). Обратите внимание, что небольшое количество кровотечения, которое происходит из застоявшейся крови в подвздошной артерии, появится, как только игла пройдет через обе стенки. Если внутрипросветное кровотечение продолжается на этом этапе, поперечные зажимы шелкового шва могут быть слишком ослаблены и нуждаются в дальнейшем затягивании. - Возьмитесь за отрубленные концы швов и поместите их под легкое натяжение, чтобы сместить переднюю стенку от задней стенки подвздошной артерии. Сделайте эллиптический разрез ~ 1,0 мм x 0,3 мм с помощью изогнутых пружинных ножниц Vannas, удалив прилипшие стенки как подвздошной артерии, так и вены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, артериовенозная фистула создается после того, как этот общий канал установлен. На этом этапе можно повредить боковые стенки вены, так как разрез задней подвздошной вены / передней подвздошной артерии выполняется через венотомию. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать этого осложнения, так как это может значительно уменьшить диаметр свища и привести к развитию тромба. - Осторожно промойте остаточную кровь из открытого просвета артерии 0,9% физиологическим раствором и гепаринизированным физиологическим раствором (100 МЕ / мл)28 (рис. 1E).
- После создания AVF восстановите первоначальную венотомию передней стенки с помощью двух или трех нейлоновых швов 10-0 в прерывистом режиме (рис. 1F).
- Восстановите сосудистый пучок в его первоначальной анатомической ориентации и поместите небольшой кусочек пропитанной физиологическим раствором желатиновой губки рядом с восстановленной венотомией, чтобы облегчить гемостаз.
- Ослабьте лигатуры с перекрестным зажимом 4-0 с одним узлом последовательно от дистального к проксимальному. Внимательно следите за местом венотомии на предмет чрезмерного кровотечения, ослабляя каждый шов.
- Если восстановление не является адекватно кровоостанавливающим, повторно наложите крестовые зажимы и наложите еще один нейлоновый шов 10-0 на место кровотечения. Если гемостаз обеспечен, снимите швы, а затем рассасывающуюся желатиновую губку.
- Аккуратно потрите сосудистый пучок небольшими двусторонними твердыми, острыми, заостренными ватными палочками, которые еще больше облегчают восстановление кровотока. Подтвердите технический успех операции с помощью визуализации пульсирующей, ярко-красной насыщенной кислородом крови, поступающей в подвздошную вену и смешивающейся с темной венозной кровью, возвращающейся из задней конечности.
- Ввести гепаринизированный физиологический раствор (0,2 МЕ / г)15 в НПВ для системной антикоагуляции для улучшения результатов проходимости АВФ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что этот этап происходит после сосудистой реконструкции (в отличие от человеческого аналога, где гепаринизация происходит до перекрестного пережатия сосудов), при выполнении на этом этапе процедуры наблюдалось снижение интраоперационного кровотечения и улучшение проходимости АВФ. Инъекция в участок, покрытый фасцией и/или жиром, предпочтительна для предотвращения кровотечения из места прокола. - Повторно осмотрите место операции на предмет гемостаза после инъекции гепаринизированного физиологического раствора. Если нет проблем с кровотечением, закройте срединную фасцию, а затем разрез кожи рассасывающимися швами 5-0 PGA в беговой манере.
- Для фиктивных операций выполните все ключевые этапы процедуры, кроме формирования AVF. Наложите один узел шелковой лигатуры 4-0 на проксимальный конец левого подвздошного артериовенозного пучка и сопоставьте время зажима с операциями AVF (например, ~ 20 минут, в зависимости от квалификации микрохирурга).
6. Послеоперационный уход и измерение
- После закрытия лапаротомии измерьте перфузию крови двусторонних передних мышц большеберцовой кости и вентральных лап с помощью лазерной допплерографии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Односторонний дефицит перфузии подтвердит отклонение артериального кровотока фистулой («кража»). - Введите 0,1 мг / кг бупренорфина подкожно и верните мышь в предварительно разогретую клетку для мыши с хорошо впитываемой мягкой подстилкой с гнездом.
- Дайте мыши восстановиться в предварительно разогретой клетке для мыши до тех пор, пока анестезия не пройдет, что будет очевидно, когда мышь будет амбулаторной и интерактивной (~ 2 часа). Во время выздоровления обеспечьте мышке легкий доступ к увлажненной, мягкой диете.
- Вводите бупренорфин и/или подкожную гидратацию физиологическим раствором каждые 12–48 ч и проводите ежедневный мониторинг в течение 5 дней после операции. Усыплять животных с ухудшающимся состоянием или чрезмерным некрозом тканей, классифицированным как модифицированная оценка ишемии ≥229.
- Используйте серийные дуплексные ультразвуковые исследования для оценки проходимости свища после операции; мыши с тромбозом свищей исключаются из последующих анализов, если целью экспериментов не является характеристика недостаточности созревания AVF.
- Определите другие показатели послеоперационных результатов, такие как локальная гемодинамика, сила захвата и эффективность походки в период восстановления. Собирают свищ и мышечную ткань для оценки гистоморфологии в конце эксперимента во время жертвоприношения25,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Животные, подвергшиеся воздействию адениновой диеты, имеют сниженную скорость клубочковой фильтрации (контроль: 441,3 ± 54,2 мкл / мин против ХБП: 165,1 ± 118,3 мкл / мин, p < 0,05) и повышенный уровень азота мочевины в сыворотке крови (контроль: 20,39 ± 4,2 мкл / мин против ХБП: 38,20 ± 10,65 мкл / мин, p < 0,05) по сравнению с животными, получавшими чау на основе казеина, что подтверждает наличие почечной недостаточности до операции по удалению артериовенозной фистулы.
Валидация проходимости АВФ
Хотя интраоперационным визуальным подтверждением технического успеха является первичное выявление проходимости свища, оно не гарантирует в полной мере проходимость или физиологическое созревание на протяжении всего периода исследования. Исходы послеоперационной проходимости (т.е. успех или неудача) определяли как с помощью дуплексной ультразвуковой визуализации, так и с помощью гистологического исследования, как мы ранее продемонстрировали25. На рисунке 2 показаны репрезентативные изображения режима B, допплерографии пульсовой волны и цветного допплеровского ультразвука и морфологические срезы анастомоза артериовенозной фистулы соответственно. Патентованный свищ непосредственно визуализируется при цветном допплеровском анализе с турбулентной гемодинамикой, а также спектральным расширением в месте свища. Адаптивные проточно-опосредованные изменения сосудов притока и оттока также косвенно подтверждают проходимость АВФ. В частности, аорта имеет повышенную пиковую систолическую и конечную диастолическую скорость, НПВ развивает пульсацию с повышенной пиковой скоростью, а расширение сосудов как в аорте, так и в НПВ очевидно (рис. 2А). Напротив, неудачный или тромбированный свищ почти не имеет изменений в измерениях притока или оттока, а также не имеет турбулентности или спектрального расширения в левой подвздошной сосудистой сети. Обычно фистула из-за тромбоза частично или полностью окклюзирует левую подвздошную артерию, что визуализируется как минимальный поток или его отсутствие при пульс-волновом допплеровском анализе. На рисунке 2B показаны серийные гистологические срезы АВФ через 2 недели после хирургического создания. Срезы имеют толщину 5 мкм и окрашены трихромом Массона. Хирургический анастомоз артерии и вены очевиден, и присутствует отчетливая венозная артериализация (утолщение венозной стенки и фиброз с неоинтимальной гиперплазией). Ультразвуковая визуализация проводилась на 3-й день после операции, чтобы исключить мышей с ранней недостаточностью AVF, а затем в течение всего периода исследования были получены серийные неинвазивные измерения. Морфологическая оценка предоставляет детали ремоделирования сосудов для конкретного периода во время жертвоприношения и использовалась для подтверждения результатов ультразвукового исследования. Первоначально следует ожидать проходимости AVF примерно 50% (20-30% послеоперационной смерти и 20-30% недостаточности свища)25 , но частота успеха хирургического вмешательства значительно улучшается (~ 5-10% отказов) с практикой и повышением мастерства.
Патофизиологические особенности формирования подвздошной артериовенозной фистулы
Гемодинамические изменения: Характеристики гемодинамики AVF и дистальной перфузии задних конечностей должны быть количественно определены, чтобы контекстуализировать патофизиологию конечностей, связанную с доступом. Ультразвуковые измерения В-моды и импульсно-волновой допплерографии после операции выявили расширение сосудов притока и оттока (IVC: в 1,4 раза при POD3 и в 1,6 раза при POD13 и IRA: в 1,4 раза при POD3 и в 1,7 раза при POD13, p < 0,05) и увеличение пиковой систолической скорости (пиковая систолическая скорость IVC: в 5,5 раза при POD3 и в 4,9 раза при POD13 и пиковая систолическая скорость IRA: в 2,8 раза при POD3 и в 3,7 раза при POD13, P < 0,05) по сравнению с фиктивными животными (рис. 3A-D). Кроме того, односторонняя ишемия задних конечностей была очевидна после операции, что подтверждает опосредованную кражу артериальной гипоперфузии дистальнее свища. Ожидается, что дефицит перфузии левой лапы составит ~ 20% от контралатеральной конечности, а дефицит перфузии передней большеберцовой мышцы составляет ~ 60%. Мыши частично восстановили этот дефицит в течение всего периода исследования (рис. 3E, F).
Дисфункция задних конечностей: После создания АВФ ожидается инвалидность ипсилатеральных конечностей, которая включает в себя легкую (в большинстве случаев) или тяжелую (в редких случаях) хромоту ног, которая может длиться несколько дней. Неразрешенный паралич задних конечностей и/или некроз лап могут свидетельствовать о тяжелом ишемическом инсульте, вызванном размером свища, выходящим за пределы нормы. Нейромоторная функция задних конечностей была количественно определена с помощью тестирования силы захвата и анализа паттерна походки на беговой дорожке, которые выполнялись последовательно в течение всего периода восстановления. Ожидаемая односторонняя сила захвата составляет ~ 50% от контралатеральной конечности на 4-й день после операции с постепенным восстановлением. Мышам AVF также требуется снижение скорости беговой дорожки во время оценки походки (<20 см / мин) (рис. 3G, H).
Рисунок 1: Микрохирургические этапы анастомоза артериовенозной фистулы . (A) Воздействие на хирургическую целевую область, включая срединную лапаротомию и изоляцию левой подвздошной артерии/вены. (B) Шовные лигатуры 4-0 (например, используемые в качестве временных зажимов для сосудов) на левом общем подвздошном артериовенозном пучке в проксимальном и дистальном участках. (C) Продольная венотомия на передней стенке подвздошной вены. (D) 10-0 имбрикационный шов через заднюю стенку подвздошной вены и переднюю стенку подвздошной артерии. (E) Эллиптический разрез с имбрикационным растяжением. (F) Первоначальная продольная венотомия на снимке C восстанавливается с помощью прерывистого шва 10-0. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Валидация проходимости артериовенозной фистулы . (А) Ультразвуковая допплерография для определения проходимости АВФ. Характеристики патентованной фистулы включают артериальную и венозную дилатацию при визуализации в режиме В, турбулентный поток при цветном допплеровском анализе сосудистой сети левой подвздошной кости, пульсирующее спектральное расширение при пульс-волновой допплеровской оценке левых подвздошных сосудов, увеличение пиковой систолической и конечной диастолической скорости инфраренальной аорты и пульсации в НПВ с увеличением пиковой систолической скорости. Уменьшение или отсутствие кровотока в подвздошных сосудах указывает на недостаточность / тромбоз AVF. Метод дуплексного ультразвука предоставляет как морфологические, так и физиологические данные. Измерения скорости измеряются в миллиметрах в секунду. (B) Морфологическая оценка анастомоза AVF через 14 дней после образования свища. Изображения были испачканы трихромом Массона. Наблюдаются анатомические изменения в микроскопии серийных срезов от проксимальной (левый конец) до дистальной (правый конец) общей подвздошной артериовенозной анатомии. Окклюзия сосудистой сети из-за сгустка и/или чрезмерной неоинтимальной гиперплазии подтверждает недостаточность АВФ. Изображения имеют 10-кратное увеличение. A: Общая подвздошная артерия, V: Общая подвздошная вена. Масштабная линейка = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Патофизиологические характеристики до и после образования АВФ. Количественная оценка ультразвуковой визуализации при (A) диаметре инфраренальной аорты, (B) систолической скорости пика инфраренальной аорты, (C) диаметре нижней полой вены и (D) пиковой систолической скорости нижней полой вены до операции и на 3-й и 13-й дни после операции. Локальное измерение перфузии крови (лазерная допплерография) на (E) передней большеберцовой кости и (F) вентральной лапе перед операцией и в течение 2-недельного периода восстановления. Нейромоторное функциональное тестирование включало (G) силу хвата и (H) тест на беговой дорожке до и после операции. Данные были проанализированы с использованием двусторонней ANOVA, и при необходимости был проведен пост-фактум тест Тьюки. Значения являются средними ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 против Control_Sham. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, ####p < 0,0001 против CKD_Sham. N = 6-10/группа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Распространенность пациентов с АРГД, находящихся на гемодиализе после создания АВФ, продолжала увеличиваться30,31. Действительно, неразрешенные симптоматические осложнения 4,32,33, такие как боль, слабость, парестезии и/или снижение диапазона движений, могут негативно повлиять на самочувствие пациента 4,32,33,34,35,36 и угрожать его способности получать высококачественное повторяющееся лечение гемодиализом. Хотя достижение длительного доступа к гемодиализу является главным приоритетом для пациентов с ТПН, для субъектов, страдающих ДРГ, эти потенциально изнурительные симптомы должны быть устранены для улучшения результатов, ориентированных на пациента. В настоящем исследовании, в качестве важной доклинической вехи в области исследований АРГД, мы представляем подробную хирургическую процедуру для создания мышиной модели подвздошной АВФ, которая облегчает изучение патофизиологии конечностей, связанной с АВФ. В дополнение к ожидаемым изменениям в гемодинамике аорто-подвздошной кости и НПВ, создание АВФ подвздошной кости вызывало клинически значимые признаки дисфункции конечностей, включая ишемию периферических тканей с грубыми двигательными нарушениями.
Каждый этап микрохирургии должен выполняться с особой осторожностью, чтобы избежать потенциальной травмы сосудов, которая может вызвать существенные изменения как в гемодинамике, так и в патологии конечностей. Во время перевязки шелковый узел галстука 4-0 должен быть затянут только настолько, чтобы предотвратить кровоток через интересующий хирургический участок. Чрезмерное натяжение узла вязи шва может повредить стенку сосуда, что может вызвать нежелательное кровотечение и может способствовать гиперплазии интимы, что приведет к снижению проходимости АВФ. В частности, восстановление венотомии является одним из наиболее важных этапов хирургического вмешательства. Слишком большой укус в стенке вены может привести к стенозу сосуда и, в конечном итоге, к тромбозу, в то время как слишком неглубокое восстановление может вызвать расхождение с кровоизлиянием. Точно так же кровотечение также может возникнуть, если швы для восстановления венотомии расположены слишком далеко друг от друга. По нашему опыту, интервала между швами ~0,025-0,03 мм достаточно для создания гемостатического восстановления.
В дополнение к воспроизводимости хирургической техники, использование модели животных, специфичной для заболевания или симптома, является одним из наиболее важных вкладов в текущую работу. В настоящем исследовании животные подвергались воздействию 0,2-0,15% адениновой диеты в течение 2-3 недель до и после операции AVF для установления почечной дисфункции и уремической среды, аналогичной пациентам с ТПН. По сравнению с хирургическими моделями ХБП (например, нефрэктомия 5/6) модель адениновой диеты имеет ряд преимуществ, включая очень низкие показатели смертности и меньшую вариабельность между наблюдателями27,37. Примечательно, что тяжесть и патофизиологические последствия могут быть изменены в зависимости от концентрации и/или продолжительности адениновой диеты38,39. В сочетании с нефропатией, вызванной диетой, текущая животная модель, описанная здесь, может подготовить почву для изучения исследователями патофизиологических механизмов, с помощью которых уремия влияет на АРГД. Кроме того, к хирургической модели могут быть добавлены дополнительные животные модели заболевания, чтобы проверить влияние широко распространенных сопутствующих заболеваний, таких как диабет, гипертония или ишемическая болезнь сердца.
Несмотря на то, что представленная процедура АВФ подвздошной кости воспроизводимо моделирует ключевые аспекты патофизиологии конечностей, имеющие отношение к пациентам с АРГД, находящимся на гемодиализе, существуют некоторые ограничения и осложнения, заслуживающие обсуждения. Во-первых, мыши, подвергшиеся этой процедуре, не имеют истинного «сосудистого доступа»; Таким образом, эксперименты, связанные с экспериментальным лечением гемодиализом, невозможны. Во-вторых, на тяжесть дисфункции конечностей влияет размер артериовенозной коммуникации, поэтому последовательное создание AVF имеет решающее значение для воспроизводимых результатов. Например, создание большого AVF может привести к тяжелой ишемии задних конечностей, которая может привести к некрозу конечностей. Новым микрохирургам, начинающим процедуру, рекомендуется использовать гистологический анализ созданных AVF для анализа размера на предмет согласованности. У мышей, подвергшихся воздействию других моделей AVF, сообщалось о ремоделировании сердца, включая гипертрофию и, возможно, сердечную недостаточность 40,41,42. Сердечные изменения в текущей модели не были строго оценены, хотя мы качественно наблюдали гипертрофию сердца по сравнению с фиктивными животными. Кроме того, необходимы будущие долгосрочные анализы, чтобы оценить, как сердечно-сосудистая система мышей адаптируется к формированию и созреванию подвздошной АВФ. Еще одна проблема заключается в том, что более молодые мыши C57BL6 обладают способностью генерировать ответы артериогенеза и ангиогенеза на ишемические стимулы, что приводит к образованию коллатеральных сосудов, о чем свидетельствует умеренное восстановление лазерной допплеровской перфузии конечностей в этом исследовании. Таким образом, вполне возможно, что мыши полностью оправятся от патологии конечностей AVF, как только сформируются более надежные коллатеральные сети; Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования для картирования коллатерального роста и изменений дистальных сосудов.
На сегодняшний день основные механизмы, с помощью которых функция руки нарушается и/или усугубляется размещением АВФ, до конца не изучены. Учитывая, что геном мыши хорошо охарактеризован и существует свободный доступ к широкому спектру трансгенных моделей для манипуляций с генами у мышей, эта хирургическая модель подвздошной АВФ представляет собой полезный инструмент для биомедицинских открытий, связанных с АРГД. По сравнению с другими моделями АВФ грызунов, в которых используется хирургия центральной сосудистой сети (например, модель аорто-кавальной фистулы), или моделями крупных животных с бедренной или подвздошной АВФ, настоящая модель АВФ подвздошной кости с уремией, вызванной аденином, или без нее, предоставляет исследователям надежную экспериментальную платформу, которая может быть использована для изучения основных биологических механизмов, связанных с гемодиализом ВСРД, и создания новых таргетных методов лечения. Кроме того, доклинические модели, как правило, считаются решающими для ранней разработки и валидации фармацевтических методов лечения, из которых в настоящее время нет доступных для лечения / профилактики АРГД. Примечательно, что эта модель также поддается изменениям как в размере АВФ, так и в тяжести почечной дисфункции, что позволяет исследователям тщательно модулировать тяжесть патологии. В заключение, эта уникальная доклиническая модель AVF мыши может служить практической платформой для облегчения доклинических терапевтических разработок, направленных на снижение инвалидности рук после установки AVF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Мы искренне благодарим доктора Гуаньи Лу из отделения сосудистой хирургии и эндоваскулярной терапии Университета Флориды за техническую поддержку в разработке модели подвздошной АВФ, а также хирургическую подготовку, а также Рави Кумара из кафедры прикладной физиологии и кинезиологии Университета Флориды за техническую поддержку в получении живых микрохирургических изображений.
Эта работа была поддержана грантами Национального института здоровья и Национального института сердца, легких и крови, номера Института R01-HL148697 (для S.T.S.), а также грант Американской кардиологической ассоциации No POST903198 (для K.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% Adenine diet | ENVIGO | TD.130899 | 20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P |
| 0.2% Adenine diet | ENVIGO | TD.130900 | 20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P |
| 10-0 Nylon suture | AD surgical | XXS-N1005T4 | |
| 29 G needle syringes | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G needle syringes | Advocate | U-100 insulin syringe | |
| 4-0 silk suture | AD surgical | S-S41813 | |
| 45-degree angled dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| 5-0 PGA suture | AD surgical | PSGU-518R13 | |
| 6-0 silk suture | AD surgical | S-S618R13 | |
| Absorbable gelatin sponge | ETHICON | 1975 | |
| Alcohol preps | Covidien | 5110-cs4000 | 70% isopropyl alcohol |
| Buprenorphine | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J mice | Jaxon Laboratory | ||
| Casein diet | ENVIGO | TD.130898 | 20% casein, 0.9% P |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-9 | Medium single-ended round cotton swab |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-4 | Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab |
| Curity non-woven sponges (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Curved Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Doppler ultrasound | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Extra fine graefe forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | 2 pairs |
| Eye lubricant | CLCMEDICA | Optixcare eye lube | |
| Heparin (5000 U/mL) | National Drug Codes List | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Low-temperature cautery | Bovie | AA04 | |
| Pen trimmer | Wahl | 5640-600 | |
| Powder-free surgical gloves | Ansell | 7824PF | |
| Round handled needle holders | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sterile towel drape | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilized 0.9% saline | National Drug Codes List | 46066-807-25 | |
| Straight dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Straight needle holder | Fine Science Tools | FST 12001-13 | |
| Straight vannas spring scissors | Fine Science Tools | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | National Drug Codes List | 17033-279-50 |
References
- Gameiro, J., Ibeas, J. Factors affecting arteriovenous fistula dysfunction: a narrative review. The Journal of Vascular Access. 21 (2), 134-147 (2020).
- Culleton, B. F., Asola, M. R. The impact of short daily and nocturnal hemodialysis on quality of life, cardiovascular risk and survival. Journal of Nephrology. 24 (4), 405 (2011).
- Huber, T. S., et al. Access-related hand ischemia and the hemodialysis fistula maturation study. Journal of Vascular Surgery. 64 (4), 1050-1058 (2016).
- Rehfuss, J. P., et al. The spectrum of hand dysfunction after hemodialysis fistula placement. Kidney International Reports. 2 (3), 332-341 (2017).
- Caplice, N. M., et al. Neoangiogenesis and the presence of progenitor cells in the venous limb of an arteriovenous fistula in the rat. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), 470-475 (2007).
- Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney International. 70 (2), 315-320 (2006).
- Croatt, A. J., et al. Characterization of a model of an arteriovenous fistula in the rat: the effect of L-NAME. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2530-2541 (2010).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. Journal of Surgical Research. 108 (1), 112-121 (2002).
- Kojima, T., et al. The relationship between venous hypertension and expression of vascular endothelial growth factor: hemodynamic and immunohistochemical examinations in a rat venous hypertension model. Surgical Neurology. 68 (3), 277-284 (2007).
- Misra, S., et al. The rat femoral arteriovenous fistula model: increased expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 at the venous stenosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 19 (4), 587-594 (2008).
- Nath, K. A., Kanakiriya, S. K., Grande, J. P., Croatt, A. J., Katusic, Z. S. Increased venous proinflammatory gene expression and intimal hyperplasia in an aorto-caval fistula model in the rat. The American Journal of Pathology. 162 (6), 2079-2090 (2003).
- Nath, K. A., et al. The murine dialysis fistula model exhibits a senescence phenotype: pathobiological mechanisms and therapeutic potential. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (5), 1493-1499 (2018).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), 1718-1725 (2013).
- Yang, S. T., et al. Adult mouse venous hypertension model: common carotid artery to external jugular vein anastomosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e50472 (2015).
- Wong, C. Y., et al. A novel murine model of arteriovenous fistula failure: the surgical procedure in detail. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53294 (2016).
- Krishnamoorthy, M. K., et al. Anatomic configuration affects the flow rate and diameter of porcine arteriovenous fistulae. Kidney International. 81 (8), 745-750 (2012).
- Wang, Y., et al. Venous stenosis in a pig arteriovenous fistula model-anatomy, mechanisms and cellular phenotypes. Nephrology Dialysis Transplantation. 23 (2), 525-533 (2008).
- Loveland-Jones, C. E., et al. A new model of arteriovenous fistula to study hemodialysis access complications. The Journal of Vascular Access. 15 (5), 351-357 (2014).
- Nugent, H. M., et al. Perivascular endothelial implants inhibit intimal hyperplasia in a model of arteriovenous fistulae: a safety and efficacy study in the pig. Journal of Vascular Research. 39 (6), 524-533 (2002).
- Butterfield, A. B., et al. Inverse effect of chronically elevated blood flow on atherogenesis in miniature swine. Atherosclerosis. 26 (2), 215-224 (1977).
- Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. The American Journal of Pathology. 164 (1), 81-89 (2004).
- Berru, F. N., et al. Chronic kidney disease exacerbates ischemic limb myopathy in mice via altered mitochondrial energetics. Scientific Reports. 9 (1), 15547 (2019).
- Khattri, R. B., Thome, T., Ryan, T. E. Tissue-specific 1H-NMR metabolomic profiling in mice with adenine-induced chronic kidney disease. Metabolites. 11 (1), 45 (2021).
- Thome, T., et al. Impaired muscle mitochondrial energetics is associated with uremic metabolite accumulation in chronic kidney disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (1), 139826 (2021).
- Kim, K., et al. Development of a murine iliac arteriovenous fistula model for examination of hemodialysis access-related limb pathophysiology. Journal of Vascular Surgery-Vascular Science. 2, 247-259 (2021).
- Castro, B., Kuang, S. Evaluation of muscle performance in mice by treadmill exhaustion test and whole-limb grip strength assay. Bio-protocol. 7 (8), 2237 (2017).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: a comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 321 (1), 106-119 (2021).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 20 (7), 946-950 (2009).
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Bello, A. K., et al. Assessment of global kidney health care status. Journal of the American Medical Association. 317 (18), 1864-1881 (2017).
- Levin, A., et al. Global kidney health 2017 and beyond: a roadmap for closing gaps in care, research, and policy. The Lancet. 390 (10105), 1888-1917 (2017).
- Hassabi, M., et al. Comparing strength and range of motion of the upper limb with AV fistula access with the contralateral upper limb among patients treated with hemodialysis. Researcher Bulletin of Medical Sciences. 22 (1), 1 (2017).
- Capitanini, A., Galligani, C., Lange, S., Cupisti, A. Upper limb disability in hemodialysis patients: evaluation of contributing factors aside from amyloidosis. Therapeutic Apheresis and Dialysis. 16 (3), 242-247 (2012).
- Altintepe, L., et al. Physical disability, psychological status, and health-related quality of life in older hemodialysis patients and age-matched controls. Hemodialysis International. 10 (3), 260-266 (2006).
- Castaneda, C., et al. Resistance training to reduce the malnutrition-inflammation complex syndrome of chronic kidney disease. American Journal of Kidney Diseases. 43 (4), 607-616 (2004).
- Hurton, S., et al. Upper extremity complications in patients with chronic renal failure receiving haemodialysis. Journal of Renal Care. 36 (4), 203-211 (2010).
- Mazumder, M. K., Giri, A., Kumar, S., Borah, A. A highly reproducible mice model of chronic kidney disease: Evidences of behavioural abnormalities and blood-brain barrier disruption. Life Sciences. 161, 27-36 (2016).
- Jia, T., et al. A novel model of adenine-induced tubulointerstitial nephropathy in mice. BioMed Central Nephrology. 14, 116 (2013).
- Kieswich, J. E., et al. A novel model of reno-cardiac syndrome in the C57BL/ 6 mouse strain. BioMed Central Nephrology. 19 (1), 346 (2018).
- Abassi, Z., Goltsman, I., Karram, T., Winaver, J., Hoffman, A. Aortocaval fistula in rat: a unique model of volume-overload congestive heart failure and cardiac hypertrophy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 729497 (2011).
- Brower, G. L., Levick, S. P., Janicki, J. S. Inhibition of matrix metalloproteinase activity by ACE inhibitors prevents left ventricular remodeling in a rat model of heart failure. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (6), 3057-3064 (2007).
- Francis, B. N., Abassi, Z., Heyman, S., Winaver, J., Hoffman, A. Differential regulation of ET (A) and ET (B) in the renal tissue of rats with compensated and decompensated heart failure. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 44, 362-365 (2004).
