Summary
이 프로토콜은 쥐 총장골 동정맥루 생성의 수술 단계를 자세히 설명합니다. 우리는 혈액 투석 접근 관련 사지 병태생리학을 연구하기 위해 이 모델을 개발했습니다.
Abstract
만성 신장 질환은 주요 공중 보건 문제이며 혈액 투석과 같은 만성 신대체 요법이 필요한 말기 신장 질환(ESRD)의 유병률이 계속 증가하고 있습니다. 자가 동정맥루(AVF) 배치는 ESRD 환자의 주요 혈관 접근 옵션으로 남아 있습니다. 안타깝게도 혈액 투석 환자의 약 절반이 미묘한 감각 이상에서 디지털 괴저에 이르기까지 투석 접근 관련 손 기능 장애(ARHD)를 경험합니다. 특히, ARHD의 원인이 되는 근본적인 생물학적 동인은 잘 이해되지 않았으며, ARHD의 예방/치료를 위한 메커니즘을 밝히거나 새로운 치료법을 개발하기 위한 적절한 동물 모델이 존재하지 않습니다. 여기에서 우리는 왼쪽 총장골동맥과 정맥 사이에 AVF가 생성되어 사지 병태생리학의 평가를 용이하게 하는 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 미세 수술에는 혈관 분리, 세로 정맥 절제술, 동정맥 문합 생성 및 정맥 재건이 포함됩니다. 가짜 수술에는 AVF 생성을 제외한 모든 중요한 단계가 포함됩니다. 장골 AVF 배치는 중추 혈역학, 말초 허혈 및 뒷다리 신경 운동 성능의 손상에서 임상적으로 관련된 변화를 초래합니다. 이 새로운 전임상 AVF 모델은 혈액 투석 환자가 보고한 일반적인 신경 운동 교란을 요약하는 유용한 플랫폼을 제공하여 연구자가 ARHD 병태생리학의 메커니즘을 조사하고 잠재적인 치료법을 테스트할 수 있도록 합니다.
Introduction
기능적 혈관 접근의 확립 및 보존은 혈액 투석을 통해 신대체 요법을 받는 말기 신장 질환(ESRD) 환자에게 중요한 주요 목표로 남아 있습니다1. 신장 기능이 부적절해지면 노폐물을 제거하고, 전해질을 정상화하고, 체액 균형을 유지하기 위해 반복적인 혈액투석 치료가 필요하므로 장기 생존에 필요하다2. 따라서 혈관 접근은 ESRD 환자의 "생명선"을 나타내며 자가 동정맥루(AVF) 배치는 이 코호트3에서 선호되는 투석 접근 옵션으로 남아 있습니다. 그러나 혈액 투석 환자의 약 30%-60%는 임상적으로 접근 관련 손 기능 장애(ARHD)로 정의되는 다양한 손 장애를 경험합니다. ARHD의 증상은 쇠약과 협응 장애에서 단일마비 및 디지털 괴저에 이르기까지 다양할 수 있으며, 이는 AVF 생성 후 초기에 발생하거나 누공 성숙과 함께 점진적으로 발생할 수 있습니다. 또한, ARDD는 ESRD 치료 일정을 복잡하게 하는데, 이는 낮은 삶의 질, 높은 심혈관 질환 위험 및 사망률 증가와 관련이 있다 2,3,4.
AVF 생성 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 후 혈역학적 변화에 의해 유도된 혈관 리모델링을 연구하기 위해 여러 동물 모델이 개발되었습니다. 장골 또는 대퇴골 AVF 16,17,18,19,20을 가진 대형 동물 모델과 경동맥-경정맥 문합 또는 신장하 대동맥-하대정맥 누공 형성을 사용하는 설치류 모델은 앞서 언급한 AVF 성숙 및 개통 측면을 조사하기 위해 잘 확립되어 있다 21 . 예를 들어, 정맥 고혈압, 더 큰 내강 직경 및 증가된 정맥 벽 두께는 성공적인 AVF 성숙의 신호인 반면, 매질의 실질적인 섬유증 및 흐름의 변화가 없는 내막 증식 또는 혈전 발달은 종종 AVF 실패를 특징으로 합니다 6,15. 그러나 대형 동물 모델은 쥐 모델의 실험적 유연성이나 형질전환 능력이 부족한 반면, 현재의 설치류 모델은 해부학적 위치 및/또는 관련 사지 병리의 부족으로 인해 ARHD 조사를 쉽게 용이하게 하지 않습니다. 실제로, 관련 임상 표현형을 요약하는 확립된 전임상 동물 모델의 부족으로 인해 증상이 있는 ARHD 환자의 수가 점진적으로 증가했음에도 불구하고 병리학적 메커니즘을 밝히고 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 연구 진행은 정체 상태를 유지하고 있습니다. 따라서 본 연구의 주요 목적은 ARHD의 독특한 마우스 모델을 도입하여 AVF 미세수술의 절차적 단계와 AVF 관련 병태생리학의 특성화를 제공하는 것입니다.
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Protocol
모든 절차는 플로리다 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)와 Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center의 승인을 받았습니다.
참고: 젊은 성인(8-10주령) 수컷 C57BL/6J 마우스를 잭슨 연구소에서 구입하여 조명(12시간 조명: 12시간 암주기 주기), 온도(22°C ± 1°C) 및 습도(50% ± 10%) 제어 동물 시설에 수용했습니다. 5마리의 생쥐가 우리당 거주할 수 있도록 허용되었으며(W:18 cm x L:29 cm x H:12.5 cm) 둥지 재료, 음식 및 물이 임의로 제공되었습니다. 표준 차우로 7일 동안 서식지에 적응한 후, 마우스를 식단 전환 단계로 7일 동안 카제인 기반 차우 식단으로 변경했습니다. 그 후, 마우스에 앞서 기술한 바와 같이 AVF 수술 전에 신장 기능 장애(CKD)를 유도하기 위해 2-3주 동안 0.2%-0.15% 아데닌 보충과 함께 카제인 기반 차우를 공급했습니다22,23,24. 대조군 마우스는 아데닌 보충 없이 카제인 기반 차우 식이를 받았습니다(대조군). 대조군 및 CKD 식단은 수술 후 회복 기간(POD) 동안 유지되었습니다.
1. 수술 전 측정
- 앞서 설명한 바와 같이 이중 초음파 영상 및 레이저 도플러를 통한 뒷다리 관류를 사용하여 기준선/수술 전 결과 측정, 대동맥 관절관 직경 및 혈역학적 흐름 매개변수를 평가합니다25.
- 앞서 설명한 대로 기준선 뒷다리 기능을 설정하기 위해 편측 뒷다리 그립 강도와 트레드밀 보행 평가를 결정합니다25,26.
- 앞서 설명한 바와 같이 FITC-이눌린 청소율 및/또는 혈청 혈액 요소 질소(BUN) 수준을 통해 사구체 여과율(GFR)을 측정하여 신장 기능을 평가합니다 22,24,27.
2. 수술 준비
- 다음 수술 도구 및 용품 준비 (재료 표) : 뜨거운 구슬 살균기, 눈 윤활제, 펜 트리머, 알코올 준비제, 클로르헥시딘 물티슈, 극세 Graefe 집게, 멸균 된 0.9 % 식염수, 29G 및 31G 바늘 주사기, 2 x 2 부직포 스폰지, 중간 단일 종단 원형 (SC-9) 및 작은 양단 단단하고 날카 롭고 뾰족한 (SC-4) 면봉, 저온 소작, 직선 Dumont 집게, 45° 각진 Dumont 집게, 직선 Vannas 스프링 가위, 곡선 Vannas 스프링 가위, 둥근 손잡이 바늘 홀더, 다양한 크기의 봉합사(4-0 실크, 5-0 PGA, 6-0 실크 및 10-0 나일론 봉합사), 헤파린, 흡수성 젤라틴 스폰지, 직선 바늘 홀더 및 부프레노르핀.
알림: 복부와 다리의 사지 고정 고무 밴드와 견인기는 수작업으로 제작되었습니다. - 수술 전 120-125°C에서 30분 동안 증기 멸균과 함께 오토클레이브를 사용하여 수술 준비를 소독한 후 30분 동안 건조시킵니다. 각 동물 수술 사이에 70% 에탄올 클렌징 후 핫 비드 멸균(240-270°C에서 3분)을 활용합니다.
- 29-31G 바늘 주사기를 사용하여 멸균된 0.9% 생리 식염수, 헤파린 처리 식염수(100IU/mL) 및 부프레노르핀(0.01mg/mL)을 준비합니다.
3. 마취 및 위치 지정
- 유도 챔버에서 마우스 마취를 시작합니다(0.8mL/분, 2.5% 이소플루란). 마우스가 적절하게 마취되면 멸균 커튼으로 덮인 수술 스테이션에서 마우스를 앙와위 자세로 놓습니다. 면도 및 위치 지정 단계에서 이소플루란 농도를 ~1.2%로 줄입니다.
- 수술 중 눈이 건조해지지 않도록 안구 윤활제를 바르십시오.
- 펜 트리머를 사용하여 수술을 위해 복모를 면도하고 수술 후 관류 측정을 위해 다리 털을 면도합니다. 수술 부위에서 머리카락을 치우십시오.
- 고무줄과 압정으로 상지와 하지를 고정하고 발가락 꼬집음 반사를 모니터링하여 마취 깊이를 확인하고 필요에 따라 마취를 적정합니다. 마취 수준을 보정하기 위해 수술 절차 전반에 걸쳐 3-5분마다 호흡 패턴 평가를 수행합니다.
4. 수술 대상 부위 탐색
- 면도한 피부 부위를 여러 번 청소하고 알코올 제제와 클로르헥시딘 물티슈를 원형 패턴으로 번갈아 가며 수술 부위를 소독합니다.
- 흉골 가장자리의 아래쪽 가장자리에서 치골 결합까지 정중선 개복술을 시행합니다. 더 넓은 수술 영역을 얻기 위해 치골 지방 패드를 해부합니다.
- celiotomy를 열어 견인기로 복막 내용물에 접근하고 중간 단일 끝 원형 면봉을 사용하여 소장과 대장을 내장을 적출합니다. 식염수에 적신 부직포 스폰지로 장을 덮으십시오.
- 후복막 맥관 구조가 적절하게 노출되면 나머지 장, 신장 및 요관을 작은 식염수에 적신 부직포 스폰지로 덮습니다. 필요에 따라 중간 크기의 단일 끝 원형 면봉으로 방광 돔을 부드럽게 짜서 팽창된 방광을 비웁니다.
- 곧은 Dumont 집게와 작고 양단이 단단하고 날카롭고 뾰족한 면봉을 사용하여 왼쪽 장골 분기점까지 확장되는 약 1cm 근위부에서 대동맥 분기점까지 약 1cm의 혈관주위 근막과 지방 조직을 조심스럽게 절개합니다.
참고: 왼쪽 장골 동맥과 정맥은 동정맥 구조를 한꺼번에 분리하면서 서로 접착된 상태로 남아 있습니다. 이 단계는 AVF 생성을 용이하게 하기에 충분한 선박 동원을 제공할 것입니다. - 왼쪽 총장골 정맥에서 시작되거나 수렴하는 작은 정맥 가지가 발견되면 필요에 따라 6-0 실크 봉합사를 사용하거나 사용하지 않고 저온 소작을 사용하여 결찰합니다.
- 각진 집게의 끝을 왼쪽 총장골 혈관 다발 아래로 통과시키고 부드럽게 여러 번 펴서 밑에 있는 후복막 근육계에서 혈관을 동원합니다(그림 1A).
5. 일반적인 장골 동정맥루 문합의 생성
- 분리된 좌측 총장골 동정맥 다발 주위에 2개의 4-0 실크 봉합사를 놓고 혈관 다발에 대한 합자(예: 교차 클램프)로 사용합니다. 각 4-0 실크 넥타이로 하나의 매듭을 만들고 근위부에서 원위부까지 순차적으로 적용하십시오.
- 실크 타이 크로스 클램프가 ~2mm의 혈관 길이를 분리할 수 있을 만큼 충분히 멀리 떨어져 있는지 확인하고 봉합사 합자를 순차적으로 적용하면 왼쪽 장골 정맥 충혈이 촉진됩니다.
- 4-0 실크 봉합사 스트링을 손잡이로 사용하여 왼쪽 장골 동정맥 다발을 시계 방향으로 돌리고 위치를 미세 조정하여 동맥 앞쪽 정맥을 일시적으로 찾습니다(그림 1B).
- 직선 Vannas 스프링 가위로 세로 정맥 절개술(~1mm)을 하고 0.9% 식염수로 정맥 내강에 남아 있는 혈액을 부드럽게 씻어냅니다(그림 1C). 고압 식염수 세척은 정맥 파열을 유발할 수 있으므로 이 단계에서 주의하십시오.
참고: 정맥 세척 후 장골 동맥에 남아 있는 붉은 색 영역은 다음 단계를 위한 시각적 창을 제공합니다. - 정맥의 후벽을 통해 10-0 나일론 봉합사를 놓습니다.
참고: 장골 정맥의 이 부분은 장골 동맥의 전벽에 즉시 위치해야 하며 벽은 자연적으로 접착됩니다. 봉합사는 양쪽 벽을 통과하고 봉합사를 단일 매듭으로 묶어야 합니다(그림 1D). 장골 동맥의 정체 된 혈액에서 비롯된 소량의 출혈은 바늘이 양쪽 벽을 통과하면 나타납니다. 이 단계에서 내강 내 출혈이 계속되면 실크 봉합사 크로스 클램프가 너무 느슨할 수 있으므로 더 조여야 합니다. - 침윤된 봉합사 끝을 잡고 장골 동맥의 후벽에서 전벽을 이동시키기 위해 부드러운 장력 하에 놓습니다. 곡선 Vannas 스프링 가위를 사용하여 ~1.0mm x 0.3mm 타원형 절개를 만들어 장골 동맥과 정맥의 접착 벽을 제거합니다.
참고: 동정맥루는 이 공통 채널이 설정되면 생성됩니다. 이 단계에서 정맥 절개술 노출을 통해 후장골정맥/전방장골동맥벽 절개를 시행하기 때문에 정맥의 외벽을 손상시킬 수 있습니다. 누공 직경을 상당히 줄이고 혈전 발생을 유발할 수 있으므로 이러한 합병증을 피하기 위해 주의를 기울여야 합니다. - 노출된 동맥 내강의 잔류 혈액을 0.9% 식염수와 헤파린 처리 식염수(100IU/mL)로 부드럽게 씻어냅니다.28 (그림 1E).
- AVF를 만든 후 중단된 방식으로 2개 또는 3개의 10-0 나일론 봉합사를 사용하여 초기 전벽 정맥 절개술을 복구합니다(그림 1F).
- 혈관 다발을 원래의 해부학적 방향으로 복원하고 지혈을 촉진하기 위해 수리된 정맥 절개술 옆에 식염수에 적신 흡수성 젤라틴 스폰지의 작은 조각을 놓습니다.
- 4-0 단일 매듭 크로스 클램프 합자를 원위에서 근위까지 순차적으로 풉니다. 각 봉합사를 풀면서 과도한 출혈이 있는지 독 절개술 부위를 면밀히 모니터링하십시오.
- 수리가 적절하게 지혈되지 않으면 크로스 클램프를 다시 적용하고 출혈 부위에 또 다른 10-0 나일론 봉합사를 놓습니다. 지혈이 확실하면 봉합사를 제거한 다음 흡수성 젤라틴 스폰지를 제거하십시오.
- 작은 양단의 단단하고 날카 롭고 뾰족한 면봉으로 혈관 다발을 부드럽게 문지르면 혈류 회복을 촉진합니다. 장골 정맥으로 들어가는 박동성의 밝은 적색 산소가 함유 된 혈액의 시각화를 사용하여 수술의 기술적 성공을 확인하고 뒷다리에서 돌아 오는 어두운 정맥혈과 혼합합니다.
- 전신 항응고를 위해 헤파린 처리 식염수(0.2 IU/g)15 를 IVC에 주입하여 AVF 개통 결과를 개선합니다.
참고: 이 단계는 혈관 재건 후에 발생하지만(혈관 교차 클램핑 전에 헤파린화가 발생하는 인간 유사체와 대조적으로) 절차의 이 단계에서 수행했을 때 수술 중 출혈의 감소 및 개선된 AVF 개통성이 관찰되었습니다. 근막 및/또는 지방으로 덮인 부위에 주사하는 것이 천자 부위의 출혈을 방지하는 것이 바람직합니다. - 헤파린 처리 식염수 주사 후 수술 부위의 지혈을 다시 검사하십시오. 출혈 우려가 없으면 정중선 근막을 봉합한 다음 흡수성 5-0 PGA 봉합사로 피부 절개를 런닝 방식으로 봉합합니다.
- 가짜 작업의 경우 AVF 형성을 제외한 절차의 모든 주요 단계를 따르십시오. 왼쪽 장골 동정맥 다발의 근위 끝에 4-0 실크 합자의 단일 매듭을 적용하고 클램프 시간을 AVF 수술에 맞춥니다(예: 미세외과 의사의 숙련도에 따라 ~20분).
6. 수술 후 관리 및 측정
- 개복술 폐쇄 후 레이저 도플러 영상을 사용하여 양측 경골근 전방 근육과 복부 발의 혈액 관류를 측정합니다.
참고: 일방적인 관류 결손은 동맥 흐름의 누공 전환("훔치기")을 확인합니다. - 0.1mg/kg 부프레노르핀을 피하 투여하고 둥지가 있는 흡수성이 높은 부드러운 침구가 있는 예열된 마우스 케이지로 마우스를 되돌립니다.
- 마취가 사라질 때까지 예열된 마우스 케이지에서 마우스가 회복되도록 허용하며, 이는 마우스가 걸을 수 있고 상호 작용할 때(~2시간) 분명합니다. 회복하는 동안 마우스가 보습되고 부드러운 식단에 쉽게 접근 할 수 있도록하십시오.
- 부프레노르핀 및/또는 피하 식염수 수분 공급을 12시간마다 최대 48시간까지 투여하고 수술 후 5일 동안 매일 모니터링을 수행합니다. 변형된 허혈 점수로 분류되는 상태가 악화되거나 과도한 조직 괴사가 있는 동물을 안락사시킵니다≥229.
- 수술 후 누공 개통을 평가하기 위해 직렬 이중 초음파 평가를 사용합니다. 누공 혈전증이 있는 마우스는 실험의 목적이 AVF 성숙 실패를 특성화하는 것이 아닌 한 후속 분석에서 제외됩니다.
- 회복 기간 동안 국소 혈역학, 악력 및 보행 성능과 같은 기타 수술 후 결과 측정을 결정합니다. 희생25,27 동안 실험이 끝날 때 조직 형태를 평가하기 위해 누공 및 근육 조직을 수집합니다.
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Representative Results
아데닌 식이에 노출된 동물은 카제인 기반 차우를 투여받은 동물에 비해 사구체 여과율이 감소하고(대조군: 441.3 ± 54.2 μL/min 대 CKD: 165.1 ± 118.3 μL/ min, p < 0.05) 혈청 요소 질소 수치가 증가하여(대조군: 20.39 ± 4.2 μL/min 대 CKD: 38.20 ± 10.65 μL/min, p < 0.05) 카제인 기반 차우를 투여받은 동물에 비해 동정맥루 수술 전에 신장 기능 부전이 있음을 확인했습니다.
AVF 개통 검증
기술적 성공에 대한 수술 중 시각적 확인은 누공 개통의 초기 식별이지만 연구 기간 동안 개통 또는 생리적 성숙을 완전히 보장하지는 않습니다. 수술 후 개통 결과(즉, 성공 또는 실패)는 이전에 입증한 바와 같이 이중 초음파 영상과 조직학적 검사를 모두 사용하여 결정되었습니다25. 도 2는 각각 동정맥루 문합의 대표적인 B 모드, 맥파 도플러 및 컬러 도 플러 초음파 영상과 형태학적 단면을 보여준다. 특허 누공은 난류 혈역학을 이용한 컬러 도플러 분석과 누공 부위의 스펙트럼 확장에서 직접 시각화됩니다. 유입 및 유출 용기의 적응형 유동 매개 변화도 AVF 개통성을 간접적으로 확인합니다. 특히, 대동맥은 최대 수축기 및 이완기 말 속도가 상승하고, IVC는 최고 속도가 높아짐에 따라 박동성이 발생하며, 대동맥과 IVC 모두에서 혈관 확장이 분명합니다(그림 2A). 대조적으로, 실패하거나 혈전이 있는 누공은 유입 또는 유출 측정에 거의 변화가 없으며 왼쪽 장골 혈관 구조 내에서 난류 또는 스펙트럼 확장이 없습니다. 일반적으로 혈전증으로 인한 누공 부전은 왼쪽 장골 동맥을 부분적으로 또는 완전히 폐색하며, 이는 맥파 도플러 분석에서 흐름이 최소화되거나 전혀 없는 것으로 시각화됩니다. 그림 2B 는 외과적 생성 2주 후 AVF의 일련의 조직학 섹션을 보여줍니다. 단면은 두께가 5μm이고 Masson의 삼색으로 염색됩니다. 동맥과 정맥의 외과적 문합이 명백하고 뚜렷한 정맥 동맥화가 존재합니다(정맥벽 비후 및 신생내막 증식을 동반한 섬유증). 수술 후 3일째에 초음파 영상을 수행하여 초기 AVF 실패가 있는 마우스를 배제한 다음 연구 기간 동안 일련의 비침습적 측정을 얻었습니다. 형태학적 평가는 희생 시 기간별 혈관 리모델링 세부 정보를 제공하고 초음파 소견을 확인하는 데 사용되었습니다. AVF 개통률은 약 50%(수술 후 사망의 20%-30%, 누공 부전의 20%-30%)25 가 초기에는 예상되지만 수술 성공률은 연습과 숙련도 증가로 크게 향상됩니다(~5%-10% 실패율).
장골 동정맥루 형성에 따른 병태생리학적 특성
혈역학적 변화: 접근 관련 사지 병태생리학을 맥락화하기 위해 AVF 혈역학 및 원위 뒷다리 관류의 특성을 정량화해야 합니다. 수술 후 B 모드 및 맥파 도플러 초음파 측정은 유입 및 유출 혈관 확장(IVC: POD3에서 1.4배, POD13에서 1.6배 및 IRA: POD3에서 1.4배, POD13에서 1.7배, p < 0.05) 및 최대 수축기 속도의 증가(IVC 최대 수축기 속도: POD3에서 5.5배, POD13 및 IRA 최대 수축기 속도에서 4.9배)의 증가를 나타냈습니다. 가짜 동물과 비교하여 POD3에서 2.8배, POD13에서 3.7배, P< 0.05). 또한, 수술 후 편측성 뒷다리 허혈이 명백하게 나타났으며, 이는 누공 원위부에서 도둑질 매개 동맥 저관류를 확인합니다. 왼쪽 발 관류 결손은 반대쪽 사지의 ~20%, 전방 경골근의 관류 결손은 ~60%로 예상됩니다. 마우스는 연구 기간 동안 이러한 결손을 부분적으로 회복했습니다(그림 3E,F).
뒷다리 기능 장애: 동측 사지 장애는 AVF 생성 후 예상되며, 이는 며칠 동안 지속될 수 있는 경증(대부분의 경우)에서 중증(소수의 경우) 다리 절뚝거림을 포함합니다. 해결되지 않은 뒷다리 마비 및/또는 발 괴사는 누공 크기가 정상 범위를 벗어난 심각한 허혈성 손상의 징후일 수 있습니다. 뒷다리 신경운동 기능은 악력 테스트와 트레드밀 보행 패턴 분석을 통해 정량화되었으며, 회복 기간 동안 순차적으로 수행되었습니다. 예상되는 편측 악력은 수술 후 4일째에 반대쪽 사지의 ~50%이며 점진적으로 회복됩니다. AVF 마우스는 또한 보행 평가(<20cm/min) 동안 감소된 트레드밀 속도가 필요합니다(그림 3G, H).
그림 1: 동정맥루 문합의 미세 수술 단계 . (A) 정중선 개복술 및 좌측 장골 동맥/정맥 격리를 포함한 수술 대상 부위의 노출. (B) 근위 및 원위 부위의 왼쪽 공통 장골 동정맥 다발에 4-0 봉합사 합자(예: 임시 혈관 클램프로 사용됨). (C) 장골 정맥의 전벽에 있는 세로 정맥 절개술. (D) 10-0 장골 정맥의 후벽과 장골 동맥의 전벽을 통한 봉합사. (E) 침윤 팽창을 통한 타원형 절개. (F) 이미지 C의 초기 세로 정맥 절개술은 중단된 10-0 봉합사를 사용하여 수리됩니다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 동정맥 누공 개통성의 검증. (A) AVF 개통성의 도플러 초음파 측정. 특허 누공의 특성에는 B 모드 영상에서 동맥 및 정맥 확장, 왼쪽 장골 혈관 구조의 컬러 도플러 분석에 대한 난류, 왼쪽 장골 혈관의 맥파 도플러 평가에 대한 박동 스펙트럼 확장, 신장하 대동맥의 최대 수축기 및 이완기 말 속도의 증가, 최대 수축기 속도의 증가에 따른 IVC 내 박동. 장골 혈관 내의 감소되거나 부재한 흐름은 AVF 실패/혈전증을 시사합니다. 이중 초음파 기술은 형태학적 및 생리학적 데이터를 모두 제공합니다. 속도 측정은 초당 밀리미터 단위입니다. (B) 누공 생성 14일 후 AVF 문합의 형태학적 평가. 이미지는 Masson의 삼색으로 염색되었습니다. 직렬 단면 현미경 검사에는 근위부(왼쪽 끝)에서 원위(오른쪽 끝) 공통 장골 동정맥 해부학으로 해부학적 변화가 있습니다. 혈전 및/또는 과도한 신생내막 증식으로 인한 맥관 구조의 폐색은 AVF 실패를 확인합니다. 이미지는 10배 배율입니다. A: 총장골동맥, V: 총장골정맥. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: AVF 형성 전후의 병태생리학적 특성. (A) 신장하 대동맥 직경, (B) 신장하 대동맥 피크 수축기 속도, (C) 하대정맥 직경 및 (D) 수술 전 및 수술 후 3일 및 13일째에 하대정맥 피크 수축기 속도에서 초음파 영상의 정량화. 수술 전 및 2주 회복 기간 동안 (E) 전경골근 및 (F) 복부 발에 대한 국소 혈액 관류(레이저 도플러) 측정. 신경 운동 기능 테스트에는 (G) 그립 강도 및 (H) 수술 전후 트레드밀 테스트가 포함되었습니다. 데이터는 양방향 ANOVA를 사용하여 분석되었으며 적절한 경우 Tukey의 사후 테스트를 수행했습니다. 값은 SD± 평균입니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 대 Control_Sham. #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001, ####p < 0.0001 대 CKD_Sham. N = 6-10/그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
AVF 생성 후 ARHD가 있는 혈액투석 환자의 유병률은30,31 지속적으로 증가했습니다. 실제로, 통증, 쇠약, 감각 이상 및/또는 운동 범위 감소와 같은 해결되지 않은 증상 합병증4,32,33은 환자의 웰빙 4,32,33,34,35,36에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 고품질의 반복적인 혈액 투석 치료를 받을 수 있는 능력을 위협할 수 있다. 지속적인 혈액 투석 접근의 달성이 ESRD 환자의 최우선 과제이지만 ARHD로 고통받는 피험자의 경우 환자 중심 결과를 개선하기 위해 이러한 잠재적으로 쇠약해지는 증상을 해결해야 합니다. 본 연구에서는 ARHD 연구 분야의 중요한 전임상 이정표로서 AVF 관련 사지 병태생리학의 검사를 용이하게 하는 장골 AVF의 마우스 모델을 생성하기 위한 상세한 수술 절차를 소개합니다. 대동맥-장골 및 IVC 혈역학의 예상되는 변화 외에도, 장골 AVF 생성은 육안적 운동 장애를 동반한 말초 조직 허혈을 포함하여 사지 기능 장애의 임상적으로 관련된 특징을 생성했습니다.
각 미세 수술 단계는 혈역학과 사지 병리 모두에 상당한 변화를 일으킬 수 있는 잠재적인 혈관 외상을 피하기 위해 세심한 주의를 기울여 수행해야 합니다. 결찰하는 동안 4-0 실크 타이 매듭은 관심 수술 부위를 통한 혈류를 방지할 수 있을 만큼만 조여야 합니다. 과도한 봉합사 합자 매듭 장력은 혈관벽을 손상시켜 바람직하지 않은 출혈을 유발할 수 있고 내막 증식에 기여하여 AVF 개통성을 감소시킬 수 있습니다. 특히, venotomy 수리는 수술 절차의 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 정맥 벽에 너무 많이 물린 경우 혈관 협착증이 발생할 수 있으며 궁극적으로 혈전증이 발생할 수 있으며 너무 얕은 수리는 출혈로 열개를 유발할 수 있습니다. 유사하게, 정맥 절개술 복구 봉합사가 너무 멀리 떨어져 있는 경우에도 출혈이 발생할 수 있습니다. 우리의 경험에 따르면 봉합사 사이의 ~0.025-0.03mm 간격은 지혈 수리를 만들기에 충분합니다.
수술 기법의 재현성 외에도 질병 또는 증상별 동물 모델을 활용하는 것은 현재 작업의 가장 중요한 기여 중 하나입니다. 본 연구에서, 동물들은 신장 기능 장애 및 ESRD 환자와 유사한 요독 환경을 확립하기 위해 AVF 수술 전후 2-3주 동안 0.2%-0.15% 아데닌 식이에 노출되었습니다. 외과적 CKD 모델(예: 5/6 신장 절제술)과 비교할 때, 아데닌 다이어트 모델은 매우 낮은 사망률과 관찰자 간 변동이 적은 등 몇 가지 장점이 있습니다27,37. 특히, 중증도 및 병태생리학적 결과는 아데닌 식이의 농도 및/또는 지속 시간에 기초하여 수정될 수 있다38,39. 식이-유도된 신병증과 함께, 본원에 기술된 현재의 동물 모델은 연구자들이 요독증이 ARHD에 영향을 미치는 병태생리학적 기전을 연구하기 위한 단계를 설정할 수 있다. 또한, 질환의 추가 동물 모델을 외과적 모델에 추가하여 당뇨병, 고혈압 또는 관상 동맥 질환과 같은 매우 널리 퍼진 동반이환 상태의 영향을 테스트할 수 있습니다.
제시된 장골 AVF 절차는 ARHD 혈액 투석 환자와 관련된 사지 병태생리학의 주요 측면을 재현 가능하게 모델링하지만 논의할 가치가 있는 몇 가지 제한 사항과 합병증이 있습니다. 첫째,이 절차를 거친 마우스는 진정한 "혈관 접근"을 갖지 못합니다. 따라서, 실험적 혈액 투석 치료와 관련된 실험은 불가능하다. 둘째, 사지 기능 장애의 중증도는 동정맥 통신의 크기에 영향을 받으므로 일관된 AVF 생성은 재현 가능한 결과에 매우 중요합니다. 예를 들어, 큰 AVF의 생성은 심각한 뒷다리 허혈을 유발할 수 있으며, 이는 사지 괴사로 절정에 달할 수 있습니다. 시술을 시작하는 새로운 미세외과 의사는 생성된 AVF의 조직학적 분석을 사용하여 일관성을 위해 크기를 분석하는 것이 좋습니다. 다른 AVF 모델을 적용받은 마우스에서, 비대 및 아마도 심부전을 포함한 심장 리모델링이 보고되었다 40,41,42. 현재 모델의 심장 변화는 엄격하게 평가되지 않았지만 가짜 동물에 비해 심장 비대를 질적으로 관찰했습니다. 또한, 쥐 심혈관계가 장골 AVF 형성 및 성숙에 어떻게 적응하는지 평가하기 위해서는 향후 장기 분석이 필요합니다. 한 가지 추가적인 우려는 더 어린 C57BL6 마우스가 허혈성 자극에 대한 동맥 형성 및 혈관 신생 반응을 생성하는 능력을 가지고 있어 이 연구에서 레이저 도플러 사지 관류의 완만한 회복으로 나타난 바와 같이 측부 혈관 형성을 유도한다는 것입니다. 따라서 마우스가 더 강력한 담보 네트워크가 형성되면 AVF 사지 병리에서 완전히 회복될 수 있습니다. 그러나 부수적 성장과 원위 맥관 구조 변화를 매핑하기 위해서는 향후 연구가 필요합니다.
현재까지 AVF 배치에 의해 손 기능이 손상 및/또는 악화되는 기본 메커니즘은 불완전하게 이해되었습니다. 마우스 게놈이 잘 특성화되어 있고 마우스의 유전자 조작을 위한 다양한 형질전환 모델에 즉시 접근할 수 있다는 점을 감안할 때 이 장골 AVF 수술 모델은 ARHD를 둘러싼 생물의학적 발견에 유용한 도구를 제공합니다. 중심 혈관 수술 (예 : 대동맥 기공 모델)을 사용하는 다른 설치류 AVF 모델 또는 대퇴골 또는 장골 AVF가있는 대형 동물 모델과 비교할 때, 아데닌 식이 유발 요독증이 있거나 없는 현재의 장골 AVF 모델은 연구자에게 혈액 투석 ARHD와 관련된 기본 생물학적 메커니즘을 조사하고 새로운 표적 치료법을 생성하는 데 사용할 수 있는 강력한 실험 플랫폼을 제공합니다. 또한, 전임상 모델은 일반적으로 약물 요법의 초기 개발 및 검증에 중요한 것으로 간주되며, 현재 ARHD를 치료/예방할 수 있는 것은 없습니다. 특히, 이 모델은 AVF의 크기와 신장 기능 장애의 중증도 모두에서 변경할 수 있으므로 조사관이 병리의 중증도를 신중하게 조절할 수 있습니다. 결론적으로, 이 독특한 전임상 마우스 AVF 모델은 AVF 배치 후 손 장애를 줄이는 것을 목표로 하는 전임상 치료 개발을 촉진하는 실용적인 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
장골 AVF 모델 개발 및 외과 교육에 대한 기술 지원을 해주신 플로리다 대학교 혈관 외과 및 혈관 내 치료 부서의 Guanyi Lu 박사와 라이브 미세 수술 이미지를 얻을 수 있도록 기술 지원을 해주신 플로리다 대학교 응용 생리학 및 운동 요법과의 Ravi Kumar에게 진심으로 감사드립니다.
이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health) 및 국립 심장, 폐 및 혈액, 연구소 번호 R01-HL148697 (STS) 및 미국 심장 협회 보조금 번호 POST903198 (KK에)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% Adenine diet | ENVIGO | TD.130899 | 20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P |
| 0.2% Adenine diet | ENVIGO | TD.130900 | 20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P |
| 10-0 Nylon suture | AD surgical | XXS-N1005T4 | |
| 29 G needle syringes | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G needle syringes | Advocate | U-100 insulin syringe | |
| 4-0 silk suture | AD surgical | S-S41813 | |
| 45-degree angled dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| 5-0 PGA suture | AD surgical | PSGU-518R13 | |
| 6-0 silk suture | AD surgical | S-S618R13 | |
| Absorbable gelatin sponge | ETHICON | 1975 | |
| Alcohol preps | Covidien | 5110-cs4000 | 70% isopropyl alcohol |
| Buprenorphine | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J mice | Jaxon Laboratory | ||
| Casein diet | ENVIGO | TD.130898 | 20% casein, 0.9% P |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-9 | Medium single-ended round cotton swab |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-4 | Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab |
| Curity non-woven sponges (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Curved Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Doppler ultrasound | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Extra fine graefe forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | 2 pairs |
| Eye lubricant | CLCMEDICA | Optixcare eye lube | |
| Heparin (5000 U/mL) | National Drug Codes List | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Low-temperature cautery | Bovie | AA04 | |
| Pen trimmer | Wahl | 5640-600 | |
| Powder-free surgical gloves | Ansell | 7824PF | |
| Round handled needle holders | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sterile towel drape | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilized 0.9% saline | National Drug Codes List | 46066-807-25 | |
| Straight dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Straight needle holder | Fine Science Tools | FST 12001-13 | |
| Straight vannas spring scissors | Fine Science Tools | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | National Drug Codes List | 17033-279-50 |
References
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