Summary
Este protocolo detalla los pasos quirúrgicos de la creación de fístula arteriovenosa ilíaca común murina. Desarrollamos este modelo para estudiar la fisiopatología de las extremidades relacionada con el acceso a la hemodiálisis.
Abstract
La enfermedad renal crónica es un importante problema de salud pública, y la prevalencia de la enfermedad renal terminal (ESRD) que requiere terapias de reemplazo renal crónicas como la hemodiálisis continúa aumentando. La colocación de fístula arteriovenosa autógena (FAV) sigue siendo una opción de acceso vascular primario para los pacientes con ESRD. Desafortunadamente, aproximadamente la mitad de los pacientes de hemodiálisis experimentan disfunción de la mano relacionada con el acceso a diálisis (ARHD), que va desde parestesia sutil hasta gangrena digital. En particular, los impulsores biológicos subyacentes responsables de la ARHD son poco conocidos, y no existe un modelo animal adecuado para dilucidar los mecanismos y / o desarrollar nuevas terapias para la prevención / tratamiento de ARHD. Aquí, describimos un nuevo modelo de ratón en el que se crea una FAV entre la arteria ilíaca común izquierda y la vena, facilitando así la evaluación de la fisiopatología de las extremidades. La microcirugía incluye aislamiento de vasos, venotomía longitudinal, creación de anastomosis arteriovenosa y reconstrucción venosa. Las cirugías simuladas incluyen todos los pasos críticos, excepto la creación de FAV. La colocación de FAV ilíaca da lugar a alteraciones clínicamente relevantes en la hemodinámica central, isquemia periférica y deficiencias en el rendimiento neuromotor de las extremidades posteriores. Este nuevo modelo preclínico de FAV proporciona una plataforma útil que recapitula las perturbaciones neuromotoras comunes informadas por los pacientes en hemodiálisis, lo que permite a los investigadores investigar los mecanismos de la fisiopatología de ARHD y probar posibles terapias.
Introduction
El establecimiento y la preservación del acceso vascular funcional siguen siendo un objetivo primario importante para los pacientes con enfermedad renal terminal (ERT) que reciben terapia de reemplazo renal por hemodiálisis1. Los tratamientos repetidos de hemodiálisis son necesarios para eliminar los productos de desecho, normalizar los electrolitos y mantener el equilibrio de líquidos una vez que la función renal se vuelve inadecuada y, por lo tanto, son necesarios para la supervivencia a largo plazo2. Por lo tanto, el acceso vascular representa un "salvavidas" para los pacientes con ERT, y la colocación de fístula arteriovenosa autógena (FAV) sigue siendo una opción preferida de acceso a diálisis entre estacohorte 3. Sin embargo, aproximadamente el 30% -60% de los pacientes en hemodiálisis experimentan un espectro de discapacidades de la mano, clínicamente definidas como disfunción de la mano relacionada con el acceso (ARHD). Los síntomas de ARHD pueden variar desde debilidad y descoordinación hasta monoplejia y gangrena digital, que pueden ocurrir temprano después de la creación de AVF o desarrollarse gradualmente con la maduración de la fístula. Además, la ARHD complica el esquema de tratamiento de la ERT, que se asocia con mala calidad de vida, alto riesgo de enfermedad cardiovascular y aumento de la mortalidad 2,3,4.
Se han desarrollado varios modelos animales para estudiar la remodelación vascular inducida por alteraciones hemodinámicas tras la creación de FAV 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Los modelos animales grandes con FAV ilíaca o femoral 16,17,18,19,20 y los modelos de roedores que utilizan anastomosis de la vena yugular de la arteria carótida o la formación de fístula infrarrenal de la vena cava inferior de la aorta están bien establecidos para examinar los aspectos antes mencionados de la maduración y permeabilidad de la FAV 21 . Por ejemplo, la hipertensión venosa, el mayor diámetro luminal y el aumento del grosor de la pared venosa son signos de maduración exitosa de la FAV, mientras que la fibrosis sustancial de los medios y la hiperplasia de la íntima o el desarrollo de trombos sin cambios en el flujo a menudo caracterizan las fallas de la FAV 6,15. Sin embargo, los modelos animales grandes carecen de la flexibilidad experimental o las capacidades transgénicas de los modelos murinos, mientras que los modelos actuales de roedores no facilitan fácilmente la investigación de ARHD debido a la ubicación anatómica y / o la falta de patología asociada de las extremidades. De hecho, debido a la falta de un modelo animal preclínico establecido que recapitule el fenotipo clínico relevante, el progreso de la investigación para dilucidar los mecanismos patobiológicos y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas se ha mantenido estancado, a pesar de un aumento progresivo en el número de pacientes sintomáticos con ARHD. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio es introducir un modelo único de ratón de ARHD, proporcionando pasos de procedimiento de microcirugía AVF y caracterización de la fisiopatología relacionada con AVF.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Florida y el Centro Médico de Asuntos de Veteranos Malcom Randall.
NOTA: Los ratones machos C57BL / 6J adultos jóvenes (8-10 semanas de edad) se compraron en el Laboratorio Jackson y se alojaron en una instalación de animales controlada por luz (12 h luz: 12 h ciclo oscuro), temperatura (22 ° C ± 1 ° C) y humedad (50% ± 10%). Se permitió que cinco ratones habitaran por jaula (W: 18 cm x L: 29 cm x H: 12.5 cm) con materiales de anidación, alimentos y agua disponibles ad libitum. Después de 7 días de aclimatación al hábitat con comida estándar, los ratones fueron cambiados a una dieta de comida a base de caseína durante 7 días como una fase de transición de la dieta. Posteriormente, los ratones fueron alimentados con la comida a base de caseína con suplementación con 0,2%-0,15% de adenina durante 2-3 semanas para inducir disfunción renal (ERC) antes de la cirugía de FAV como se describió anteriormente22,23,24. Los ratones de control recibieron una dieta de comida a base de caseína sin suplementos de adenina (control). Las dietas control y ERC se mantuvieron durante todo el período de recuperación postoperatoria (POD).
1. Mediciones preoperatorias
- Evaluar las mediciones de resultados basales/preoperatorios, los diámetros de los vasos aortoilíacos y los parámetros de flujo hemodinámico mediante imágenes de ultrasonido dúplex y perfusión de las extremidades posteriores mediante Doppler láser como se describió anteriormente25.
- Determinar la fuerza de agarre unilateral de las extremidades posteriores y la evaluación de la marcha en cinta rodante para establecer la función basal de las extremidades posteriores como se describió anteriormente25,26.
- Evaluar la función renal midiendo la tasa de filtración glomerular (TFG) a través del aclaramiento de inulina FITC y/o el nivel de nitrógeno ureico en sangre sérico (BUN) como se describió anteriormente22,24,27.
2. Preparación quirúrgica
- Prepare las siguientes herramientas y suministros quirúrgicos (Tabla de materiales): un esterilizador de perlas calientes, lubricante para ojos, un recortador de plumas, preparaciones de alcohol, toallitas de clorhexidina, pinzas Graefe extrafinas, solución salina esterilizada al 0,9%, jeringas de aguja de 29 G y 31 G, 2 x 2 esponjas no tejidas, medianas redondas de un solo extremo (SC-9) y pequeñas de doble extremo duras, afiladas y puntiagudas (SC-4), cauterización a baja temperatura, pinzas Dumont rectas, pinzas Dumont en ángulo de 45°, tijeras de resorte Vannas rectas, tijeras de resorte Vannas curvadas, soportes de agujas de mango redondo, múltiples tamaños de suturas (seda 4-0, PGA 5-0, seda 6-0 y suturas de nylon 10-0), heparina, esponja de gelatina absorbible, un soporte de aguja recto y buprenorfina.
NOTA: Las bandas elásticas de fijación de extremidades y los retractores para el abdomen y las piernas fueron hechos a mano. - Esterilizar las preparaciones quirúrgicas usando autoclave con esterilización por vapor a 120-125 °C durante 30 minutos seguido de secado durante 30 minutos antes de la cirugía. Utilice una limpieza con etanol al 70% seguida de esterilización de perlas calientes (240-270 °C durante 3 min) entre cada cirugía animal.
- Prepare solución salina normal esterilizada al 0,9%, solución salina heparinizada (100 UI/ml) y buprenorfina (0,01 mg/ml) esterilizada con jeringas de aguja de 29-31 G.
3. Anestesia y posicionamiento
- Iniciar la anestesia de ratón en la cámara de inducción (0,8 mL/min, 2,5% de isoflurano). Una vez que el ratón esté adecuadamente anestesiado, coloque el ratón en posición supina en la estación quirúrgica cubierta por una cortina estéril. Reduzca la concentración de isoflurano a ~ 1.2% durante los pasos de afeitado y posicionamiento.
- Aplique el lubricante ocular para proteger los ojos de la sequedad durante la cirugía.
- Usando un recortador de plumas, afeite el vello abdominal para la operación y el vello de las piernas para las mediciones de perfusión postoperatorias. Limpie el cabello del campo quirúrgico.
- Fije las extremidades superiores e inferiores con bandas elásticas y tachuelas, verifique la profundidad de la anestesia monitoreando el reflejo de pellizco del dedo del pie y ajuste la anestesia según sea necesario. Realice la evaluación del patrón respiratorio cada 3-5 minutos durante todo el procedimiento quirúrgico para calibrar el nivel de anestesia.
4. Exploración del área objetivo quirúrgica
- Limpie el área de la piel afeitada varias veces, alternando entre la preparación de alcohol y las toallitas de clorhexidina en un patrón circular para desinfectar el campo quirúrgico.
- Hacer una laparotomía de la línea media desde el borde inferior del margen esternal hasta la sínfisis del pubis. Diseccionar la almohadilla de grasa del pubis para obtener un campo operativo más amplio.
- Abra la celiotomía para acceder al contenido peritoneal con retractores y eviscere los intestinos delgado y grueso utilizando hisopos de algodón redondos medianos de un solo extremo. Cubra los intestinos con una esponja no tejida empapada en solución salina.
- Una vez que se obtenga una exposición adecuada de la vasculatura retroperitoneal, cubra el intestino, los riñones y los uréteres restantes con pequeñas esponjas no tejidas empapadas en solución salina. Evacúe una vejiga distendida apretando suavemente la cúpula de la vejiga con hisopos de algodón redondos medianos de un solo extremo según sea necesario.
- Diseccionar cuidadosamente la fascia perivascular y el tejido adiposo desde aproximadamente 1 cm proximal hasta la bifurcación aórtica que se extiende hasta el nivel de la bifurcación ilíaca izquierda utilizando pinzas de Dumont rectas y pequeños hisopos de algodón duros, afilados y puntiagudos de doble extremo.
NOTA: La arteria ilíaca izquierda y la vena se mantienen adheridas entre sí mientras se aíslan las estructuras arteriovenosas en masa. Este paso proporcionará suficiente movilización de buques para facilitar la creación de AVF. - Si se encuentran pequeñas ramas venosas que se originan o convergen con la vena ilíaca común izquierda, ligarlas usando cauterización a baja temperatura con o sin sutura de seda 6-0 según sea necesario.
- Pase la punta de los fórceps en ángulo debajo del haz vascular ilíaco común izquierdo y extienda suavemente varias veces para movilizar los vasos de la musculatura retroperitoneal subyacente (Figura 1A).
5. Creación de una fístula arteriovenosa ilíaca común anastomosis
- Coloque dos suturas de seda 4-0 alrededor del haz arteriovenoso ilíaco común izquierdo aislado y úselas como ligaduras (por ejemplo, pinzas cruzadas) para el haz vascular. Crea un solo nudo con cada corbata de seda 4-0 y aplícalos secuencialmente de proximal a distal.
- Asegúrese de que las abrazaderas cruzadas de lazo de seda estén lo suficientemente separadas para aislar ~ 2 mm de longitud del vaso, y la aplicación secuencial de las ligaduras de sutura precipitará la congestión de la vena ilíaca izquierda.
- Usando las cuerdas de sutura de seda 4-0 como asas, gire el haz vascular arteriovenoso ilíaco izquierdo en el sentido de las agujas del reloj y ajuste la posición para ubicar temporalmente la vena anterior a la arteria (Figura 1B).
- Haga una venotomía longitudinal (~ 1 mm) con tijeras de resorte Vannas rectas y elimine suavemente la sangre residual de la luz venosa con solución salina al 0.9% (Figura 1C). Tenga cuidado durante este paso, ya que un lavado salino a alta presión puede causar interrupción venosa.
NOTA: La región de color rojo que permanece en la arteria ilíaca después del lavado venoso proporciona una ventana visual para el siguiente paso. - Coloque una sutura imbricada de nylon 10-0 a través de la pared posterior de la vena.
NOTA: Esta porción de la vena ilíaca debe estar en aposición inmediata a la pared anterior de la arteria ilíaca, y las paredes son naturalmente adherentes. La sutura debe atravesar ambas paredes y atar la sutura con un solo nudo (Figura 1D). Tenga en cuenta que una pequeña cantidad de sangrado, que se origina en la sangre estancada en la arteria ilíaca, aparecerá una vez que la aguja pase a través de ambas paredes. Si el sangrado intraluminal continúa durante este paso, las pinzas cruzadas de sutura de seda pueden estar demasiado flojas y deben apretarse aún más. - Agarre los extremos de la sutura imbricada y colóquelos bajo una tensión suave para desplazar la pared anterior de la pared posterior de la arteria ilíaca. Haga una incisión elíptica de ~ 1.0 mm x 0.3 mm con tijeras curvas de resorte Vannas, eliminando las paredes adherentes tanto de la arteria ilíaca como de la vena.
NOTA: La fístula arteriovenosa se crea una vez que se establece este canal común. Es posible lesionar las paredes laterales de la vena durante este paso, ya que la incisión de la vena ilíaca posterior / arteria ilíaca anterior se realiza a través de la exposición a la venotomía. Se debe tener precaución para evitar esta complicación, ya que esto puede reducir considerablemente el diámetro de la fístula y conducir al desarrollo de trombos. - Eliminar suavemente la sangre residual de la luz arterial expuesta con solución salina al 0,9% y solución salina heparinizada (100 UI/ml)28 (Figura 1E).
- Después de la creación de la FAV, reparar la venotomía inicial de la pared anterior utilizando dos o tres suturas de nylon 10-0 de manera interrumpida (Figura 1F).
- Restaure el haz vascular a su orientación anatómica original y coloque un pequeño trozo de esponja de gelatina absorbible empapada en solución salina adyacente a la venotomía reparada para facilitar la hemostasia.
- Afloje las ligaduras de pinza cruzada de un solo nudo 4-0 secuencialmente de distal a proximal. Controle de cerca el sitio de la venotomía para detectar sangrado excesivo mientras afloja cada sutura.
- Si la reparación no es adecuadamente hemostática, vuelva a aplicar las pinzas cruzadas y coloque otra sutura de nylon 10-0 en el sitio del sangrado. Si la hemostasia está asegurada, retire las suturas y luego la esponja de gelatina absorbible.
- Frote suavemente el haz vascular con pequeños hisopos de algodón duros, afilados y puntiagudos de doble extremo, que facilitan aún más la restauración del flujo sanguíneo. Confirme el éxito técnico de la operación mediante la visualización de sangre oxigenada pulsátil de color rojo brillante que ingresa a la vena ilíaca y se mezcla con sangre venosa oscura que regresa de la extremidad posterior.
- Inyectar solución salina heparinizada (0,2 UI/g)15 en la VCI para la anticoagulación sistémica a fin de mejorar los resultados de permeabilidad de la FAV.
NOTA: Aunque este paso ocurre después de la reconstrucción vascular (a diferencia del análogo humano donde la heparinización ocurre antes del pinzamiento cruzado del vaso), se observó una reducción en el sangrado intraoperatorio y una mejor permeabilidad de la FAV cuando se realizó en esta etapa del procedimiento. La inyección en un sitio cubierto por fascia y / o grasa es preferible para prevenir el sangrado del sitio de punción. - Vuelva a inspeccionar el sitio quirúrgico para detectar hemostasia después de la inyección de solución salina heparinizada. Si no hay problemas de sangrado, cierre la fascia de la línea media y luego la incisión de la piel con suturas absorbibles 5-0 PGA en forma de correr.
- Para operaciones simuladas, siga todos los pasos clave del procedimiento, excepto la formación de FAV. Aplique un solo nudo de la ligadura de seda 4-0 en el extremo proximal del haz arteriovenoso ilíaco izquierdo y haga coincidir los tiempos de pinza con las cirugías de FAV (por ejemplo, ~ 20 min, dependiendo de la competencia del microcirujano).
6. Cuidados y medición postoperatoria
- Después del cierre de la laparotomía, medir la perfusión sanguínea de los músculos tibiales anteriores bilaterales y las patas ventrales utilizando imágenes Doppler con láser.
NOTA: Los déficits unilaterales de perfusión confirmarán la desviación de la fístula del flujo arterial ("robo"). - Administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea y devolver el ratón a una jaula de ratón precalentada con ropa de cama blanda altamente absorbible con nido.
- Permita que el ratón se recupere en la jaula del ratón precalentada hasta que la anestesia desaparezca, lo que será obvio cuando el ratón sea ambulatorio e interactivo (~ 2 h). Durante la recuperación, dale al ratón fácil acceso a una dieta hidratada y blanda.
- Administrar buprenorfina y/o hidratación salina subcutánea cada 12 h hasta 48 h y realizar un seguimiento diario durante 5 días postoperatorio. Eutanasia a los animales con una condición de deterioro o necrosis tisular excesiva, clasificada como una puntuación de isquemia modificada ≥229.
- Utilice evaluaciones seriadas de ultrasonido dúplex para evaluar la permeabilidad de la fístula después de la operación; los ratones con trombosis de fístula se excluyen de los análisis posteriores a menos que el propósito de los experimentos sea caracterizar el fracaso de la maduración de la FAV.
- Determinar otras mediciones de resultados postoperatorios como la hemodinámica local, la fuerza de agarre y el rendimiento de la marcha durante el período de recuperación. Recolectar fístulas y tejidos musculares para evaluar la histomorfología al final del experimento durante el sacrificio25,27.
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Representative Results
Los animales expuestos a una dieta de adenina han reducido las tasas de filtración glomerular (control: 441,3 ± 54,2 μL/min vs. ERC: 165,1 ± 118,3 μL/min, p < 0,05) y un aumento de los niveles séricos de nitrógeno ureico en sangre (control: 20,39 ± 4,2 μL/min vs. ERC: 38,20 ± 10,65 μL/min, p < 0,05) en comparación con los animales que recibieron chow a base de caseína, confirmando la presencia de insuficiencia renal antes de la cirugía de fístula arteriovenosa.
Validación de la permeabilidad de la FAV
Aunque la confirmación visual intraoperatoria del éxito técnico es la identificación inicial de la permeabilidad de la fístula, no garantiza completamente la permeabilidad o la maduración fisiológica durante todo el período de estudio. Los resultados de permeabilidad postoperatoria (es decir, éxito o fracaso) se determinaron mediante imágenes de ultrasonido dúplex y examen histológico, como hemos demostrado previamente25. La Figura 2 muestra las imágenes representativas de ultrasonido Doppler de onda de pulso y Doppler color y secciones morfológicas de una anastomosis de fístula arteriovenosa, respectivamente. Una fístula permeable se visualiza directamente en el análisis Doppler color con hemodinámica turbulenta, así como ensanchamiento espectral en el sitio de la fístula. Los cambios adaptativos mediados por el flujo de los vasos de entrada y salida también confirman indirectamente la permeabilidad de la FAV. Específicamente, la aorta tiene una velocidad sistólica máxima y diastólica final elevada, la VCI desarrolla pulsatilidad con velocidad máxima elevada y la dilatación de los vasos tanto en la aorta como en la VCI es evidente (Figura 2A). En contraste, una fístula fallida o trombosada casi no tiene cambios en las mediciones de flujo de entrada o salida y no tiene turbulencia o ensanchamiento espectral dentro de la vasculatura ilíaca izquierda. Por lo general, la falla de la fístula por trombosis ocluye parcial o totalmente la arteria ilíaca izquierda, que se visualiza como flujo mínimo o nulo en el análisis Doppler de onda de pulso. La figura 2B muestra secciones histológicas seriadas de una FAV 2 semanas después de la creación quirúrgica. Las secciones tienen un espesor de 5 μm y están teñidas con tricrómico de Masson. La anastomosis quirúrgica de la arteria y la vena es obvia, y existe una arterialización venosa distinta (engrosamiento de la pared venosa y fibrosis con hiperplasia neointimal). La ecografía se realizó en el día 3 postoperatorio para descartar ratones con fracaso temprano de la FAV, y luego se obtuvieron mediciones seriadas no invasivas durante todo el período de estudio. La evaluación morfológica proporciona detalles de remodelación vascular específicos del período en el momento del sacrificio y se utilizó para confirmar los hallazgos de ultrasonido. Inicialmente se espera una tasa de permeabilidad de la FAV de aproximadamente el 50% (20%-30% de la muerte postoperatoria y 20%-30% del fracaso de la fístula)25 , pero la tasa de éxito quirúrgico mejora significativamente (~5%-10% de la tasa de fracaso) con la práctica y el aumento de la competencia.
Características fisiopatológicas tras la formación de fístulas arteriovenosas ilíacas
Alteración hemodinámica: Las características de la hemodinámica de la FAV y la perfusión distal de las extremidades posteriores deben cuantificarse para contextualizar la fisiopatología de las extremidades relacionadas con el acceso. Las mediciones de ultrasonido Doppler en modo B y de onda pulsada después de la cirugía revelaron dilatación de los vasos de entrada y salida (IVC: 1.4 veces en POD3 y 1.6 veces en POD13 e IRA: 1.4 veces en POD3 y 1.7 veces en POD13, p < 0.05) y aumentos en la velocidad sistólica máxima (velocidad sistólica máxima de IVC: 5.5 veces en POD3 y 4.9 veces en POD13 y velocidad sistólica máxima IRA: 2,8 veces en POD3 y 3,7 veces en POD13, P < 0,05) en comparación con los animales simulados (Figura 3A-D). Además, la isquemia unilateral de las extremidades posteriores fue aparente después de la operación, lo que confirma la hipoperfusión arterial mediada por robo distal a la fístula. Se espera que los déficits de perfusión de la pata izquierda sean ~ 20% de la extremidad contralateral, y el déficit de perfusión del músculo tibial anterior es ~ 60%. Los ratones recuperaron parcialmente estos déficits durante todo el período de estudio (Figura 3E, F).
Disfunción de las extremidades posteriores: se espera discapacidad de la extremidad ipsilateral después de la creación de la FAV, que implica una cojera leve (en la mayoría de los casos) a grave (pocos casos) en las piernas que puede durar varios días. La parálisis no resuelta de las extremidades posteriores y/o la necrosis de la pata pueden ser indicativas de un insulto isquémico grave causado por el tamaño de la fístula fuera del rango normal. La función neuromotora de las extremidades posteriores se cuantificó mediante pruebas de fuerza de agarre y análisis del patrón de marcha en cinta rodante, que se realizaron secuencialmente durante todo el período de recuperación. La fuerza de agarre unilateral esperada es ~ 50% de la extremidad contralateral en el día 4 postoperatorio, con recuperación gradual. Los ratones con FAV también requieren velocidades reducidas en la cinta rodante durante la evaluación de la marcha (<20 cm/min) (Figura 3G,H).
Figura 1: Pasos de microcirugía de la anastomosis de la fístula arteriovenosa . (A) Exposición del área objetivo quirúrgica, incluida la laparotomía de la línea media y el aislamiento de la arteria ilíaca/vena izquierda. (B) ligaduras de sutura 4-0 (p. ej., utilizadas como pinzas temporales de vasos) en el haz arteriovenoso ilíaco común izquierdo en los sitios proximal y distal. (C) Venotomía longitudinal en la pared anterior de la vena ilíaca. (D) Sutura imbricada 10-0 a través de la pared posterior de la vena ilíaca y la pared anterior de la arteria ilíaca. (E) Incisión elíptica con la distensión imbricante. (F) La venotomía longitudinal inicial de la Imagen C se repara mediante una sutura 10-0 interrumpida. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Validación de la permeabilidad de la fístula arteriovenosa . (A) Determinación ecográfica Doppler de la permeabilidad de la FAV. Las características de una fístula permeable incluyen dilatación arterial y venosa en imágenes en modo B, flujo turbulento en el análisis Doppler color de la vasculatura ilíaca izquierda, ensanchamiento espectral pulsátil en la evaluación Doppler de onda pulsada de los vasos ilíacos izquierdos, aumentos en la velocidad sistólica máxima y diastólica final de la aorta infrarrenal y pulsatilidad dentro de la VCI con aumentos en la velocidad sistólica máxima. La disminución o ausencia de flujo dentro de los vasos ilíacos sugiere falla/trombosis de la FAV. La técnica de ultrasonido dúplex proporciona datos morfológicos y fisiológicos. Las mediciones de velocidad son en milímetros por segundo. (B) Evaluación morfológica de la anastomosis de FAV 14 días después de la creación de la fístula. Las imágenes estaban manchadas con el tricrómico de Masson. Hay cambios anatómicos en la microscopía de sección seriada desde la anatomía arteriovenosa ilíaca común proximal (extremo izquierdo) hasta la distal (extremo derecho). La oclusión de la vasculatura por coágulo y/o hiperplasia neointimal excesiva confirma el fracaso de la FAV. Las imágenes tienen un aumento de 10x. A: Arteria ilíaca común, V: Vena ilíaca común. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Características fisiopatológicas antes y después de la formación de FAV. Cuantificación de imágenes ecográficas en (A) diámetro aórtico infrarrenal, (B) velocidad sistólica pico aórtico infrarrenal, (C) diámetro de la vena cava inferior y (D) velocidad sistólica máxima de la vena cava inferior preoperatoria y en los días 3 y 13 postoperatorios. Medición de perfusión sanguínea local (Doppler láser) en (E) tibial anterior y (F) pata ventral antes de la cirugía y durante todo el período de recuperación de 2 semanas. Las pruebas funcionales neuromotoras incluyeron (G) fuerza de agarre y (H) prueba en cinta rodante antes y después de la operación. Los datos se analizaron utilizando un ANOVA bidireccional, y la prueba post-hoc de Tukey se realizó cuando fue apropiado. Los valores son medias ± DE. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 vs. Control_Sham. #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001, #### p < 0.0001 vs. CKD_Sham. N = 6-10/grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La prevalencia de pacientes en hemodiálisis con ARHD después de la creación de FAV ha continuado aumentando30,31. De hecho, las complicaciones sintomáticas no resueltas 4,32,33 como dolor, debilidad, parestesia y/o rango de movimiento reducido pueden afectar negativamente el bienestar del paciente 4,32,33,34,35,36 y amenazar su capacidad para recibir tratamiento de hemodiálisis repetitiva de alta calidad. Aunque el logro de un acceso duradero a la hemodiálisis es una prioridad para los pacientes con ESRD, para los sujetos afectados por ARHD, estos síntomas potencialmente debilitantes deben abordarse para mejorar los resultados centrados en el paciente. En el presente estudio, como un hito preclínico importante en el campo de la investigación de ARHD, presentamos un procedimiento quirúrgico detallado para generar un modelo de ratón de FAV ilíaca, que facilita el examen de la fisiopatología de las extremidades asociadas a la FAV. Además de las alteraciones esperadas en la hemodinámica aortoilíaca y de la VCI, la creación de FAV ilíaca produjo características clínicamente relevantes de disfunción de las extremidades, incluida la isquemia tisular periférica con deterioro motor grueso.
Cada paso de microcirugía debe realizarse con un cuidado exquisito para evitar posibles traumatismos vasculares, que pueden causar cambios sustanciales tanto en la hemodinámica como en la patología de las extremidades. Durante la ligadura, el nudo de corbata de seda 4-0 solo debe apretarse lo suficiente como para evitar el flujo sanguíneo a través del sitio quirúrgico de interés. La tensión excesiva del nudo de ligadura de sutura puede dañar la pared del vaso, lo que puede causar sangrado indeseable y podría contribuir a la hiperplasia de la íntima, lo que lleva a una disminución de la permeabilidad de la FAV. En particular, la reparación de la venotomía es uno de los pasos más importantes del procedimiento quirúrgico. Una mordida demasiado grande en la pared de la vena puede provocar estenosis vascular y, en última instancia, trombosis, mientras que una reparación demasiado superficial puede causar dehiscencia con hemorragia. Del mismo modo, el sangrado también puede ocurrir si las suturas de reparación de venotomía están demasiado separadas. En nuestra experiencia, un intervalo de ~0.025-0.03 mm entre suturas es suficiente para crear una reparación hemostática.
Además de la reproducibilidad de la técnica quirúrgica, la utilización de un modelo animal específico de enfermedad o síntoma es una de las contribuciones más importantes del trabajo actual. En el presente estudio, los animales fueron expuestos a una dieta de 0,2% -0,15% de adenina durante 2-3 semanas antes y después de la cirugía de FAV para establecer disfunción renal y un medio urémico análogo a los pacientes con ESRD. En comparación con los modelos quirúrgicos de ERC (p. ej., nefrectomía 5/6), un modelo de dieta con adenina tiene varias ventajas, incluyendo tasas de mortalidad muy bajas y menor variación entre observadores27,37. En particular, la gravedad y las consecuencias fisiopatológicas pueden modificarse en función de la concentración y/o duración de la dieta de adenina38,39. Junto con la nefropatía inducida por la dieta, el modelo animal actual descrito en este documento puede sentar las bases para que los investigadores estudien los mecanismos fisiopatológicos por los cuales la uremia afecta la ARHD. Además, se pueden agregar modelos animales adicionales de enfermedad al modelo quirúrgico para probar la influencia de afecciones comórbidas altamente prevalentes, como diabetes, hipertensión o enfermedad arterial coronaria.
Aunque el procedimiento de FAV ilíaca presentado modela de manera reproducible aspectos clave de la fisiopatología de las extremidades relevantes para los pacientes en hemodiálisis con ARHD, existen algunas limitaciones y complicaciones dignas de discusión. En primer lugar, los ratones sometidos a este procedimiento no tienen verdadero "acceso vascular"; Por lo tanto, los experimentos que involucran tratamientos experimentales de hemodiálisis no son posibles. En segundo lugar, la gravedad de la disfunción de las extremidades se ve afectada por el tamaño de la comunicación arteriovenosa, por lo que la creación constante de FAV es fundamental para obtener resultados reproducibles. Por ejemplo, la creación de una FAV grande puede producir isquemia grave de las extremidades posteriores, que puede culminar en necrosis de las extremidades. Se alienta a los nuevos microcirujanos que comienzan el procedimiento a utilizar análisis histológicos de las FAV creadas para analizar el tamaño de la consistencia. En ratones sometidos a otros modelos de FAV, se ha reportado remodelación cardíaca, incluyendo hipertrofia y posiblemente insuficiencia cardíaca 40,41,42. Las alteraciones cardíacas en el modelo actual no se han evaluado rigurosamente, aunque hemos observado cualitativamente hipertrofia cardíaca en comparación con animales simulados. Además, se necesitan análisis futuros a largo plazo para evaluar cómo el sistema cardiovascular murino se adapta a la formación y maduración de la FAV ilíaca. Una preocupación adicional es que los ratones C57BL6 más jóvenes tienen la capacidad de generar respuestas de arteriogénesis y angiogénesis a estímulos isquémicos, lo que lleva a la formación de vasos colaterales, como lo demuestra la modesta recuperación en la perfusión de extremidades Doppler con láser en este estudio. Por lo tanto, es posible que los ratones se recuperen completamente de la patología de las extremidades de la FAV una vez que se hayan formado redes colaterales más robustas; sin embargo, se necesitan estudios futuros para mapear el crecimiento colateral y los cambios en la vasculatura distal.
Hasta la fecha, los mecanismos subyacentes por los cuales la función de la mano se ve afectada y / o exacerbada por la colocación de FAV no se comprenden completamente. Dado que el genoma del ratón está bien caracterizado y existe un fácil acceso a una amplia gama de modelos transgénicos para la manipulación de genes en ratones, este modelo quirúrgico de FAV ilíaca proporciona una herramienta útil para el descubrimiento biomédico que rodea a ARHD. En comparación con otros modelos de FAV con roedores, que emplean cirugía de vasculatura central (por ejemplo, modelo de fístula aorto-cava), o modelos animales grandes con FAV femoral o ilíaca, el modelo actual de FAV ilíaca con o sin uremia inducida por la dieta con adenina proporciona a los investigadores una plataforma experimental sólida que se puede utilizar para interrogar los mecanismos biológicos subyacentes asociados con la hemodiálisis ARHD y generar nuevas terapias dirigidas. Además, los modelos preclínicos generalmente se consideran cruciales para el desarrollo temprano y la validación de terapias farmacéuticas, de las cuales ninguna está disponible actualmente para tratar / prevenir la ARHD. En particular, este modelo también es susceptible a alteraciones tanto en el tamaño de la FAV como en la gravedad de la disfunción renal, lo que permite a los investigadores modular cuidadosamente la gravedad de la patología. En conclusión, este modelo preclínico único de FAV de ratón puede servir como una plataforma práctica para facilitar el desarrollo terapéutico preclínico destinado a reducir la discapacidad de la mano después de la colocación de FAV.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente al Dr. Guanyi Lu de la División de Cirugía Vascular y Terapia Endovascular de la Universidad de Florida por el apoyo técnico en el desarrollo del modelo de FAV ilíaca, así como la capacitación quirúrgica, y a Ravi Kumar del Departamento de Fisiología Aplicada y Kinesiología de la Universidad de Florida por el apoyo técnico para obtener las imágenes microquirúrgicas en vivo.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud y Corazón Nacional, Pulmón y Sangre, números de instituto R01-HL148697 (a S.T.S.), así como el número de subvención de la Asociación Americana del Corazón POST903198 (a K.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% Adenine diet | ENVIGO | TD.130899 | 20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P |
| 0.2% Adenine diet | ENVIGO | TD.130900 | 20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P |
| 10-0 Nylon suture | AD surgical | XXS-N1005T4 | |
| 29 G needle syringes | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G needle syringes | Advocate | U-100 insulin syringe | |
| 4-0 silk suture | AD surgical | S-S41813 | |
| 45-degree angled dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| 5-0 PGA suture | AD surgical | PSGU-518R13 | |
| 6-0 silk suture | AD surgical | S-S618R13 | |
| Absorbable gelatin sponge | ETHICON | 1975 | |
| Alcohol preps | Covidien | 5110-cs4000 | 70% isopropyl alcohol |
| Buprenorphine | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J mice | Jaxon Laboratory | ||
| Casein diet | ENVIGO | TD.130898 | 20% casein, 0.9% P |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-9 | Medium single-ended round cotton swab |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-4 | Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab |
| Curity non-woven sponges (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Curved Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Doppler ultrasound | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Extra fine graefe forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | 2 pairs |
| Eye lubricant | CLCMEDICA | Optixcare eye lube | |
| Heparin (5000 U/mL) | National Drug Codes List | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Low-temperature cautery | Bovie | AA04 | |
| Pen trimmer | Wahl | 5640-600 | |
| Powder-free surgical gloves | Ansell | 7824PF | |
| Round handled needle holders | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sterile towel drape | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilized 0.9% saline | National Drug Codes List | 46066-807-25 | |
| Straight dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Straight needle holder | Fine Science Tools | FST 12001-13 | |
| Straight vannas spring scissors | Fine Science Tools | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | National Drug Codes List | 17033-279-50 |
References
- Gameiro, J., Ibeas, J. Factors affecting arteriovenous fistula dysfunction: a narrative review. The Journal of Vascular Access. 21 (2), 134-147 (2020).
- Culleton, B. F., Asola, M. R. The impact of short daily and nocturnal hemodialysis on quality of life, cardiovascular risk and survival. Journal of Nephrology. 24 (4), 405 (2011).
- Huber, T. S., et al. Access-related hand ischemia and the hemodialysis fistula maturation study. Journal of Vascular Surgery. 64 (4), 1050-1058 (2016).
- Rehfuss, J. P., et al. The spectrum of hand dysfunction after hemodialysis fistula placement. Kidney International Reports. 2 (3), 332-341 (2017).
- Caplice, N. M., et al. Neoangiogenesis and the presence of progenitor cells in the venous limb of an arteriovenous fistula in the rat. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), 470-475 (2007).
- Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney International. 70 (2), 315-320 (2006).
- Croatt, A. J., et al. Characterization of a model of an arteriovenous fistula in the rat: the effect of L-NAME. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2530-2541 (2010).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. Journal of Surgical Research. 108 (1), 112-121 (2002).
- Kojima, T., et al. The relationship between venous hypertension and expression of vascular endothelial growth factor: hemodynamic and immunohistochemical examinations in a rat venous hypertension model. Surgical Neurology. 68 (3), 277-284 (2007).
- Misra, S., et al. The rat femoral arteriovenous fistula model: increased expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 at the venous stenosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 19 (4), 587-594 (2008).
- Nath, K. A., Kanakiriya, S. K., Grande, J. P., Croatt, A. J., Katusic, Z. S. Increased venous proinflammatory gene expression and intimal hyperplasia in an aorto-caval fistula model in the rat. The American Journal of Pathology. 162 (6), 2079-2090 (2003).
- Nath, K. A., et al. The murine dialysis fistula model exhibits a senescence phenotype: pathobiological mechanisms and therapeutic potential. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (5), 1493-1499 (2018).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), 1718-1725 (2013).
- Yang, S. T., et al. Adult mouse venous hypertension model: common carotid artery to external jugular vein anastomosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e50472 (2015).
- Wong, C. Y., et al. A novel murine model of arteriovenous fistula failure: the surgical procedure in detail. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53294 (2016).
- Krishnamoorthy, M. K., et al. Anatomic configuration affects the flow rate and diameter of porcine arteriovenous fistulae. Kidney International. 81 (8), 745-750 (2012).
- Wang, Y., et al. Venous stenosis in a pig arteriovenous fistula model-anatomy, mechanisms and cellular phenotypes. Nephrology Dialysis Transplantation. 23 (2), 525-533 (2008).
- Loveland-Jones, C. E., et al. A new model of arteriovenous fistula to study hemodialysis access complications. The Journal of Vascular Access. 15 (5), 351-357 (2014).
- Nugent, H. M., et al. Perivascular endothelial implants inhibit intimal hyperplasia in a model of arteriovenous fistulae: a safety and efficacy study in the pig. Journal of Vascular Research. 39 (6), 524-533 (2002).
- Butterfield, A. B., et al. Inverse effect of chronically elevated blood flow on atherogenesis in miniature swine. Atherosclerosis. 26 (2), 215-224 (1977).
- Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. The American Journal of Pathology. 164 (1), 81-89 (2004).
- Berru, F. N., et al. Chronic kidney disease exacerbates ischemic limb myopathy in mice via altered mitochondrial energetics. Scientific Reports. 9 (1), 15547 (2019).
- Khattri, R. B., Thome, T., Ryan, T. E. Tissue-specific 1H-NMR metabolomic profiling in mice with adenine-induced chronic kidney disease. Metabolites. 11 (1), 45 (2021).
- Thome, T., et al. Impaired muscle mitochondrial energetics is associated with uremic metabolite accumulation in chronic kidney disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (1), 139826 (2021).
- Kim, K., et al. Development of a murine iliac arteriovenous fistula model for examination of hemodialysis access-related limb pathophysiology. Journal of Vascular Surgery-Vascular Science. 2, 247-259 (2021).
- Castro, B., Kuang, S. Evaluation of muscle performance in mice by treadmill exhaustion test and whole-limb grip strength assay. Bio-protocol. 7 (8), 2237 (2017).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: a comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 321 (1), 106-119 (2021).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 20 (7), 946-950 (2009).
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Bello, A. K., et al. Assessment of global kidney health care status. Journal of the American Medical Association. 317 (18), 1864-1881 (2017).
- Levin, A., et al. Global kidney health 2017 and beyond: a roadmap for closing gaps in care, research, and policy. The Lancet. 390 (10105), 1888-1917 (2017).
- Hassabi, M., et al. Comparing strength and range of motion of the upper limb with AV fistula access with the contralateral upper limb among patients treated with hemodialysis. Researcher Bulletin of Medical Sciences. 22 (1), 1 (2017).
- Capitanini, A., Galligani, C., Lange, S., Cupisti, A. Upper limb disability in hemodialysis patients: evaluation of contributing factors aside from amyloidosis. Therapeutic Apheresis and Dialysis. 16 (3), 242-247 (2012).
- Altintepe, L., et al. Physical disability, psychological status, and health-related quality of life in older hemodialysis patients and age-matched controls. Hemodialysis International. 10 (3), 260-266 (2006).
- Castaneda, C., et al. Resistance training to reduce the malnutrition-inflammation complex syndrome of chronic kidney disease. American Journal of Kidney Diseases. 43 (4), 607-616 (2004).
- Hurton, S., et al. Upper extremity complications in patients with chronic renal failure receiving haemodialysis. Journal of Renal Care. 36 (4), 203-211 (2010).
- Mazumder, M. K., Giri, A., Kumar, S., Borah, A. A highly reproducible mice model of chronic kidney disease: Evidences of behavioural abnormalities and blood-brain barrier disruption. Life Sciences. 161, 27-36 (2016).
- Jia, T., et al. A novel model of adenine-induced tubulointerstitial nephropathy in mice. BioMed Central Nephrology. 14, 116 (2013).
- Kieswich, J. E., et al. A novel model of reno-cardiac syndrome in the C57BL/ 6 mouse strain. BioMed Central Nephrology. 19 (1), 346 (2018).
- Abassi, Z., Goltsman, I., Karram, T., Winaver, J., Hoffman, A. Aortocaval fistula in rat: a unique model of volume-overload congestive heart failure and cardiac hypertrophy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 729497 (2011).
- Brower, G. L., Levick, S. P., Janicki, J. S. Inhibition of matrix metalloproteinase activity by ACE inhibitors prevents left ventricular remodeling in a rat model of heart failure. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (6), 3057-3064 (2007).
- Francis, B. N., Abassi, Z., Heyman, S., Winaver, J., Hoffman, A. Differential regulation of ET (A) and ET (B) in the renal tissue of rats with compensated and decompensated heart failure. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 44, 362-365 (2004).
