Summary
본 프로토콜은 Cryo-EM 실험에서 기울어진 단일 입자 데이터 수집을 위한 일반화되고 구현하기 쉬운 체계를 설명합니다. 이러한 절차는 공기-물 계면의 부착으로 인해 우선적인 방향 편향을 겪는 샘플에 대한 고품질 EM 맵을 얻는 데 특히 유용합니다.
Abstract
초저온 전자 현미경(Cryo-EM)에 의한 단일 입자 분석(SPA)은 이제 고분해능 구조 생물학의 주류 기술입니다. SPA에 의한 구조 결정은 얇은 얼음 층 내에서 유리화된 거대 분자 물체에 대한 여러 가지 뚜렷한 견해를 얻는 데 의존합니다. 이상적으로, 균일하게 분포 된 무작위 투영 방향의 집합은 물체의 모든 가능한 뷰에 해당하며, 등방성 방향 분해능을 특징으로하는 재구성을 발생시킵니다. 그러나 실제로 많은 샘플은 공기-물 계면에 부착된 우선적인 방향의 입자로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 이로 인해 데이터 세트에서 균일하지 않은 각도 방향 분포가 발생하고 재구성에서 불균일한 푸리에 공간 샘플링이 발생하여 이방성 분해능을 특징으로 하는 맵으로 변환됩니다. 시편 스테이지를 기울이는 것은 배향 분포의 균일성을 개선하여 분해능 이방성을 극복하고 푸리에 공간 샘플링의 등방성을 극복할 수 있는 일반화 가능한 솔루션을 제공합니다. 현재 프로토콜은 자동화된 이미지 획득을 위한 소프트웨어인 Leginon을 사용하는 기울어진 단계의 자동화된 데이터 수집 전략을 설명합니다. 이 절차는 구현이 간단하고 추가 장비나 소프트웨어가 필요하지 않으며 생물학적 거대분자 이미징에 사용되는 대부분의 표준 투과 전자 현미경(TEM)과 호환됩니다.
Introduction
지난 10년 동안 직접 전자 검출기 1,2,3의 출현 으로 단일 입자 Cryo-EM 4,5,6을 사용하여 해결된 거대분자 및 거대분자 어셈블리의 고분해능 구조 수가 기하급수적으로 증가했습니다. 크기가 ~10kDa 이하이거나7 미만인 가장 작은 단백질을 제외하고 거의 모든 정제된 거대분자 종은 Cryo-EM을 사용하여 구조를 측정할 수 있을 것으로 예상됩니다. 그리드 준비 및 구조 결정에 필요한 출발 물질의 양은 핵 자기 공명 분광법 및 X선 결정학 4,5,6과 같은 다른 구조 결정 기술보다 적어도 한 단계 적습니다.
그러나 Cryo-EM에 의한 구조 결정의 주요 과제는 이미징을 위한 적절한 그리드 준비와 관련이 있습니다. 다양한 유리화 전략과 그리드를 사용하여 다양한 시료를 평가한 광범위한 연구에 따르면, Cryo-EM 그리드에서 시료를 유리화하는 대부분의 접근법은 거대분자가 공기-물 계면에 우선적으로 부착되는 것으로 나타났다8. 이러한 순응은 잠재적으로 4가지 차선의 결과를 초래할 수 있다: (1) 거대분자 샘플은 완전히 변성되며, 이 경우 성공적인 데이터 수집 및 처리가 불가능하다; (2) 샘플이 부분적으로 변성되며, 이 경우 손상되지 않은 거대분자 영역으로부터 구조적 통찰력을 얻을 수 있습니다. (3) 샘플은 기본 구조를 유지하지만 전자빔의 방향에 대한 입자 방향의 한 세트만 이미지에 표시됩니다. (4) 샘플은 본래의 구조를 유지하고, 전자빔의 방향에 대한 가능한 입자 방향이 전부는 아니지만 일부가 이미지에 표현된다. 사례 (3)과 (4)의 경우, 기울어진 데이터 수집은 재구성된 Cryo-EM 맵에 영향을 미치는 방향 분해능 이방성을 최소화하는 데 도움이 되며 다양한 샘플에 대한 일반화 가능한 솔루션을 제공합니다9. 기술적으로, 틸팅은 또한 사례 (2)에 도움이 될 수 있는데, 이는 변성이 아마도 공기-물 계면에서 발생하고 유사하게 데이터 내에서 표현되는 뚜렷한 방향의 수를 제한하기 때문입니다. 데이터 세트의 방향 편향 범위는 솔루션 첨가제를 실험하여 잠재적으로 변경할 수 있지만 광범위한 적용 가능성이 부족하면 이러한 시행착오 접근 방식이 방해를 받습니다. 시편 스테이지를 최적화된 단일 기울기 각도로 기울이는 것은 이미징 실험9 의 기하학적 구조를 변경하여 방향 분포를 개선하기에 충분합니다(그림 1). 전자빔에 대한 우선적으로 배향된 샘플의 기하학적 구성으로 인해, 우선적인 배향의 각 클러스터에 대해, 그리드를 기울이는 것은 클러스터 중심에 대해 조명 각도의 원뿔을 생성한다. 따라서 이것은 뷰를 분산시키고 결과적으로 푸리에 공간 샘플링과 방향 분해능의 등방성을 향상시킵니다.
실제로 무대를 기울이는 데는 몇 가지 단점이 있습니다. 시편 스테이지를 기울이면 시야 전체에 초점 그라데이션이 발생하여 CTF(대비 전달 함수) 추정의 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다. 기울어진 데이터 수집은 또한 기울어진 표본을 이미징할 때 증가된 충전 효과로 인해 빔으로 인한 입자 이동을 증가시킬 수 있습니다. 그리드 기울기는 또한 겉보기 얼음 두께의 증가로 이어지며, 이는 차례로 더 시끄러운 현미경 사진으로 이어지고 궁극적으로 재구성 5,9,10의 해상도에 영향을 미칠 수 있습니다. 프로토콜 및 토론 섹션에서 간략하게 설명된 고급 계산 데이터 처리 방식을 적용하여 이러한 문제를 극복하는 것이 가능할 수 있습니다. 마지막으로, 틸팅은 입자 겹침을 증가시켜 후속 이미지 처리 파이프라인을 방해할 수 있습니다. 이는 그리드 상의 입자 농도를 최적화하여 어느 정도 완화할 수 있지만 그럼에도 불구하고 중요한 고려 사항입니다. 여기에서는 Leginon 소프트웨어 제품군(자동 이미지 획득 소프트웨어)을 사용하여 기울어진 데이터 수집을 위해 구현하기 쉬운 프로토콜에 대해 설명하며, 오픈 액세스가 가능하고 광범위한 현미경11,12,13,14와 호환됩니다. 이 방법에는 버전 3.0 이상이 필요하며, 버전 3.3 이상에는 기울어진 데이터 수집을 가능하게 하는 전용 개선 사항이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜에는 추가 소프트웨어나 장비가 필요하지 않습니다. 전산 인프라스트럭처 및 설치 가이드에 대한 광범위한 지침은 다른 곳에서 제공된다15.
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Protocol
1. 시료 전처리
- 금박과 금 그리드 지지대(16)를 포함하는 그리드를 사용하는데, 이는 기울어진 데이터 수집이 빔-유도 모션(17)을 강조할 수 있기 때문이다.
참고: 본 연구를 위해, 그리드 상의 샘플은 가습된(80% 초과) 냉장실(~4°C)에서 수동 플런지 및 블로팅 기술18 을 사용하여 유리화되었습니다. - 절대적으로 필요한 경우가 아니면 구리 지지체와 카본 호일 또는 비정질 탄소의 연속 층이 포함된 그리드를 사용하지 마십시오.
참고: 그래핀/그래핀 옥사이드와 같은 대체 지지층은 비정질 탄소19,20에 비해 빔 유도 이동을 감소시키는 것으로 보입니다. - 그리드를 사전 선별하고 허용 가능한 얼음 두께와 입자 분포를 특징으로 하는 영역을 식별합니다. 너무 빽빽하게 채워진 입자가 포함된 그리드는 기울어진 데이터 수집 중에 입자가 겹치게 하여 다운스트림 데이터 처리 단계에 영향을 줄 수 있습니다.
알림: 이 단계는 입자 대비가 명확한 영역에 대해 초점이 흐려진 이미지를 육안으로 검사하여 얼음의 좋은 영역을 식별하기 때문에 주관적입니다. 일부 샘플은 얇은 얼음 영역에서 효율적으로 배포되지 않아 데이터 수집 중에 문제가 발생하기 때문에 모든 샘플에 대해 실현 가능하지 않을 수 있습니다(토론 섹션에 설명됨). - 단백질 샘플이 포함된 그리드를 유리화합니다. 여기에서는 시연 목적으로 금박 및 금 지지 그리드와 함께 0.1-0.5mg/mL 범위의 기아 중 DNA 보호(DPS) 단백질( 재료 표 참조)을 사용합니다.
참고: 단백질은 TEV 프로테아제 절단이 수행되지 않은 것을 제외하고는 이전에 기술된 바와 같이 정제되었다21. 관심 샘플의 단백질 농도 범위는 보편적으로 적용 가능한 이상적인 범위를 측정하기 어렵고 샘플마다 거의 확실하게 다르기 때문에 개별적으로 최적화해야 합니다.
2. 기울어진 데이터 수집 설정
- 현미경을 정렬하여 표본의 평행 조명을 보장하고 혼수 수차를 최소화합니다22.
참고: 현미경은 s가 없는 표준 SPA 데이터 수집을 위해 잘 정렬되어야 합니다.tage 기울기. 기울어진 데이터 수집에는 특별한 정렬이 필요하지 않지만 정렬이 잘 이루어지면 타겟팅 및 이미징이 원활하게 진행됩니다. 기울어진 데이터 수집과 기울어지지 않은 데이터 수집을 비교하는 일반적인 체계가 그림 2에 나와 있습니다. - 스테이지 틸트 없이 그리드 아틀라스를 기록하여 데이터 수집에 적합한 사각형을 식별하거나 Square Acquisition Node에서 사용되는 배율로 사각형을 수동으로 검사할 수 있습니다. 호일이 손상되지 않고 탈수된 것처럼 보이지 않으며 이상적인 얼음 두께를 가진 사각형을 찾으십시오.
참고: 정사각형 획득 노드는 Leginon의 멀티 스케일 이미징에 사용되는 저배율 노드입니다.- 일반적인 기울어지지 않은 자동 데이터 수집의 경우 전체 그리드 품질에 대한 개요와 데이터 수집에 적합한 영역의 초기 표시를 제공하는 그리드 아틀라스를 기록합니다.
- 그런 다음 아틀라스를 통해 적합한 사각형을 선택하고 대기열에 제출하십시오. 그런 다음 수동으로 구멍을 선택하거나 자동 EM 구멍 파인더를 통해 구멍 대상을 대기열에 넣고 제출합니다.
- 마지막으로 자동 EM 구멍 파인더를 사용하여 고배율 노출 대상을 제출합니다.
참고: 기울어진 데이터 수집의 경우, 특히 최적의 기울기 각도가 미리 결정되지 않았고 데이터 수집 중에 조정될 가능성이 있는 경우 일관된 결과를 위해 사각형을 수동으로 대기열에 넣어야 할 수 있습니다. 그리드 아틀라스는 데이터 수집에 사용된 기울기 각도가 이전에 설정된 경우 미리 정의된 스테이지 기울기를 사용하여 기록할 수도 있습니다.
- 시편 스테이지를 관심 있는 제곱으로 이동합니다.
- 유센트릭 높이 결정tage 15°에서 α-wobbler를 사용하여 위치tage 기울기±. Z-높이를 조정하여 s를 유센트릭 높이로 가져옵니다.tage 현미경용 키패드 패널을 사용합니다. α 흔들림 루틴 동안 이미지 이동이 최소화되었는지 확인합니다.
알림: 유센트릭 높이가 제대로 식별되지 않으면 s를 기울일 때 큰 이미지 이동이 관찰됩니다.tage 정사각형 배율에서. 이는 그리드에 국부적 변형이 있는 경우(예: 그리드가 파손되거나 이미지화된 영역 부근에서 심하게 구부러진 경우)에도 발생할 수 있습니다. 데이터 수집을 위해 이러한 영역을 피하는 것이 가장 좋지만, 데이터 수집을 위한 몇 안 되는 유망한 영역 중 하나인 경우 유센트릭 높이를 정확하게 추정하는 것이 필수적입니다. 그림 3 은 유센트릭 높이를 제대로 식별하지 않고 타겟팅하면 정사각형 배율에서 큰 이미지 이동이 발생할 수 있음을 보여줍니다. - 더 정확한 Z 높이를 찾고, 포커서 노드를 사용하고, 시뮬레이트를 누릅니다.
- 일반적으로 포커서 노드의 Z 높이를 Square Acquisition Node에서 사용되는 배율로 추정합니다.
참고: Focuser 노드 초점 시퀀스에는 데이터 수집 중 Hole Acquisition 노드 (Leginon 소프트웨어의 도구) 배율에서 미세한 Z 초점 추정이 포함될 수도 있습니다. - 포커서 노드에 대한 설정을 조정하고 사각형의 초기 대기열 중에 미세 Z 초점 옵션을 활성화/비활성화합니다.
알림: 자동 데이터 수집이 시작될 때 유센트릭 높이가 정확하게 식별되도록 하는 것이 중요하며, 이를 위해서는 미세 Z 초점을 다시 활성화해야 할 수 있습니다(2.10단계).
- 일반적으로 포커서 노드의 Z 높이를 Square Acquisition Node에서 사용되는 배율로 추정합니다.
- 표본 s를 기울입니다.tage 실제 유센트릭 높이에서 데이터 수집을 위해 원하는 기울기 각도로 이동하고 필요한 경우 s를 다시 중앙에 맞춥니다.tage. 이 연구에는 0°, 30° 및 60° 기울기 각도가 사용되었습니다. Square Acquisition 노드에서 Simulate 를 눌러 Hole Acquisition 노드 노출에 대한 타겟 대기열을 시작합니다.
알림: 2.2.1 단계에서 표시한 바와 같이 그리드 아틀라스는 미리 정의된 s를 사용하여 기록할 수 있습니다.tage 기울기, s를 기울일 필요가 없습니다.tage 이 단계에서 다시. 이는 잘 작동하며 데이터 수집에 사용되는 기울기 각도가 미리 정의된 경우 프로세스 속도를 높입니다. 현재 프로토콜은 새로운 표본을 염두에 두고 작성되었으며, 사용자는 데이터 수집을 위해 다양한 기울기 각도를 테스트할 수 있습니다. - Z 초점 대상과 고배율 노출에 적합한 구멍이 있는 영역을 선택합니다.
- Submit targets to queue for imaging(이미징을 위해 대기열에 대상 제출)을 누릅니다. 모든 사각형의 대기열이 완료될 때까지 Submit Queued Targets를 누르지 마십시오.
- 시편 스테이지를 기울이지 않은 상태로 되돌립니다. 다음 사각형으로 이동하고 적절한 수의 구멍 노출이 대기열에 포함될 때까지 2.3-2.8단계를 반복합니다.
- 구멍 타깃팅(Hole Targeting Node) 으로 이동하여 모든 사각형이 대기열에 들어간 후 대기열에 있는 타겟 제출(Submit Queued Targets) 을 누릅니다.
참고: 시간을 절약하기 위해 이전에 미세 Z 포커스를 비활성화한 경우(2.5단계) 대기열을 제출하기 전에 다시 활성화해야 합니다. - 고배율 노출 획득 노드에서 선택한 대상을 수동으로 검사하여 시편 스테이지가 기울어졌을 때 자동 EM 구멍 파인더가 이미지 획득에 적합한 영역을 정확하게 식별할 수 있는지 테스트합니다.
- 이 절차 중에 노출 획득 노드 설정에서 '선택한 대상에 대한 사용자 확인 허용'을 선택합니다. 사용자가 타겟팅 정확도에 만족하면 자동 데이터 수집을 위해 이 옵션을 선택 취소합니다.
참고: 고배율 노출 획득 노드의 대상은 일반적으로 빔-틸트 이미지 시프트 전략을 사용하여 이미지화되며, 이는 기울어진 데이터 수집 및 기울어지지 않은 데이터 수집23,24,25,26 모두에 대해 동일하게 작동합니다. 다운스트림 데이터 처리 단계에서 정확한 CTF 추정을 위해서는 빔-틸트 이미지 시프트 데이터 수집 전략에 대해 렌즈-코마 수차 보정을 수행해야 합니다.
- 이 절차 중에 노출 획득 노드 설정에서 '선택한 대상에 대한 사용자 확인 허용'을 선택합니다. 사용자가 타겟팅 정확도에 만족하면 자동 데이터 수집을 위해 이 옵션을 선택 취소합니다.
3. 데이터 처리
- 데이터 수집 중 녹화된 동영상의 동작 보정, CTF 추정, 입자 선택 및 초기 재구성 생성을 통해 즉석 데이터 처리(10,27,28,29)를 시작합니다.
참고: 본 연구에서는 cryoSPARC Live10 ( 재료 표 참조)을 전처리에 활용했습니다. 즉석 데이터 처리는 초기 Cryo-EM 재구성 및 각도 분포에 대한 근사치를 제공하여 사용자에게 분해능 이방성의 정도를 알릴 수 있습니다. 이들은, 차례로, 데이터 수집에 사용되는 틸트 각도가 충분히 높은지 아닌지에 대해 사용자를 안내하는 데 사용될 수 있다. - 재구성된 맵을 시각화하고 오일러 각도 분포를 플로팅하여 선호하는 입자 방향의 정도를 측정합니다.
참고: 오일러 각도 분포는 분해능 이방성의 잠재적 범위를 결정하기 위해 푸리에 공간 샘플링 분포로 직접 변환될 수 있습니다. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)는 사용자가 오일러 각도 분포의 품질을 평가하고 최적의 틸트 각도(30, 31)를 결정하는 것을 돕기 위해 개발되었다. 이 도구는 Github 리포지토리 https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui 에서 얻을 수 있습니다. - 필요한 경우 우선 방향의 영향을 극복하기 위해 데이터가 수집되는 스테이지 기울기 각도를 조정합니다. 3.2의 지도와 오일러 분포에서 알 수 있듯이 우선 방향이 문제로 남아 있는 경우 각도를 늘릴 수 있습니다. 대안적으로, 사용자는 데이터 수집을 그룹들로 분할하고, 20°, 30°, 및 40°와 같은 여러 상이한 틸트 각도를 사용하여 기록하기를 원할 수 있다.
참고: 대부분의 TEM에는 스테이지를 70°로 기울일 수 있는 기능이 있어야 하지만 일반적인 시편 스테이지 틸트(우리가 사용한) 범위는 20°-40°입니다.
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Representative Results
0.3mg/mL의 DPS를 사용하여 0°, 30° 및 60° 기울기에서 이미징을 시연했습니다. 서로 다른 기울기 각도의 데이터는 서로 다른 그리드 영역의 동일한 그리드에서 수집되었습니다. 더 높은 각도 기울기에 대한 CTF 해상도 적합은 이 연구에서 세 가지 데이터 세트를 비교할 때와 같이 더 좋지 않은 경향이 있습니다. 그림 4 는 비교 대표 이미지와 2D 분류 평균을 보여줍니다. 단백질 농도는 다른 기울기 각도에서 변하지 않지만 기울기 각도가 높을수록 입자 농도 측면에서 이미지 영역이 더 복잡해 보입니다. 이는 입자 겹침이 3D 재구성 및 각도 미세 조정을 복잡하게 만들 수 있기 때문에 데이터 처리에 문제가 될 수 있습니다. 반복적인 2D 분류는 일상적으로 0° 및 30° 기울어진 데이터 세트로 깨끗한 입자 스택을 생성하는 반면, 60° 데이터 세트는 클래스 평균이 인접 입자에 대한 중첩을 최소화하도록 입자 스택을 주의 깊게 정리해야 했습니다. 빨간색 상자 안의 그림 4C 의 클래스 평균은 입자 겹침의 예를 나타냅니다. 분류 중에 다시 센터링하면 인접 입자의 신호가 평균화될 수 있지만 입자가 크게 겹치면 입자 정렬 매개변수의 정확도가 저하되어 분해능이 낮은 재구성이 생성될 수 있습니다. 입자 겹침을 피하는 가장 좋은 방법은 최적의 얼음 두께와 입자 분포로 그리드를 미리 스크리닝하는 것입니다. 기울어진 데이터 수집으로부터의 개선을 평가하기 위한 메트릭들의 포괄적인 정량적 개요는 다른 곳(32)에서 설명된다.
그림 1: 기울어진 데이터 수집의 장점과 문제점에 대한 개요. 위쪽 패널에는 격자선 구멍의 클로즈업 뷰가 표시됩니다. 그리드 막대는 금색, 유리질 얼음 파란색 및 고분자 입자 빨간색입니다. 화살표는 전자빔의 방향을 나타냅니다. 아래쪽 패널은 위쪽 패널과 동일한 색 구성표를 가진 구멍 모음을 나타냅니다. 검은색 별은 고배율에서 노출 이미지를 획득하기 전의 미세 초점 대상을 나타냅니다. 틸트 각도는 'α'로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 기울어지지 않은 데이터 수집 전략과 기울어진 데이터 수집 전략을 비교하는 워크플로 다이어그램. 기울어지지 않은 데이터 수집과 기울어진 데이터 수집의 단계적 비교는 각 기울어진 사각형에 대해 유센트릭 높이를 수동으로 추정하고 다시 중심을 잡는 추가 단계를 보여줍니다(기울어진 데이터 수집을 위한 2 및 3). 워크플로의 나머지 부분은 두 전략 간에 비슷합니다. 여기에는 이미징에 적합한 정사각형 선택(기울어진 데이터 수집을 위한 1), 이미징을 위한 정사각형을 선택하여 대기열 체계를 시작하는 것(시뮬레이션이라고 함, 기울어지지 않은 데이터 수집을 위한 2 및 4, 각각), 유센트릭 높이 초점 타겟 및 대기열 구멍 확대 획득 타겟 제공(기울어지지 않은 데이터 수집을 위한 3 및 5, 각기). 마지막으로 선택된 고배율 노출 대상의 대기열을 제출합니다(기울어지지 않은 데이터 수집을 위한 4 및 6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 다양한 기울기 각도의 정사각형 배율에서 그리드의 대표 이미지. 유센트릭 Z 높이에서 가까운 곳과 먼 곳에서 수집된 이미지는 각각 상단 및 하단 패널에 표시됩니다. 빔의 광축은 빨간색 동심원 링의 중심으로 표시됩니다. 녹색 화살표는 관심 있는 제곱을 나타냅니다. 참조를 위해 관심 사각형 옆에 깨진 그리드 기능이 있습니다. 보기 쉽도록 대물렌즈 조리개가 제거되었습니다. 스케일 바 = 20 μM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 다양한 기울기 각도에서 수집된 대표적인 구멍 노출 및 2D 클래스 평균. 패널 (A), (B) 및 (C)는 시편 스테이지가 0°에서 기울어지지 않거나 30° 및 60°로 기울어진 상태에서 수행된 이미징을 나타냅니다. 과밀화의 영향을 받는 2D 클래스 평균은 (C)의 빨간색 상자에 표시됩니다. 스케일 바 = 100nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
공기-물 계면에 대한 시편 부착으로 인한 바람직한 입자 배향은 Cryo-EM SPA 4,5,6을 사용한 일상적인 고분해능 구조 측정의 마지막 주요 병목 현상 중 하나입니다. 여기에 제시된 데이터 수집 체계는 데이터 세트 내에서 입자의 방향 분포를 개선하기 위한 구현하기 쉬운 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 추가 장비나 소프트웨어가 필요하지 않으며 데이터 수집 속도에 영향을 미치지 않습니다. 기울어진 시편에 대한 데이터 수집 중에 다음 고려 사항이 중요합니다.
첫째, 이미징된 정사각형은 최적의 타겟팅을 위해 유센트릭 높이에 있어야 합니다. 유센트릭 높이는 작은 스테이지 틸트 각도(보통 0.5°-2°)로 틸트 페어 이미지를 기록하고 이미지 이동과 디포커스 사이의 사전 정의된 관계를 기반으로 초점을 식별하여 조정됩니다. 타겟 정사각형이 유센트릭 높이의 큰 조정을 필요로 하는 경우, 이는 정사각형 이미지의 상당한 이미지 이동을 초래하여 스테이지가 다시 기울어질 때 시야가 대물 조리개에 의해 차단될 수 있습니다.
둘째, 일반적으로 원형의 구멍은 중간 배율(Hole Acquisition Node 배율)에서 더 높은 기울기로 점점 더 길어집니다. 정확한 이미지 시프트 보정이 없는 경우, 주어진 노출 배율에 대해 유리체 얼음에 내장된 입자와 함께 호일의 일부가 이미지화될 수 있습니다. 따라서 이상적으로는 이미지 시프트 보정이 정확해야 합니다. 대안은 구멍 크기에 비해 이미지화된 영역이 감소하도록 배율을 높이는 것입니다. 더 높은 배율에서, 빔 틸트에 의한 이미지 이동의 오류는 유리체 얼음 영역으로 이동하는 사용자의 능력에 더 작은 영향을 미칠 것이다. 그러나 이것은 배율 증가에 비례하여 결과 현미경 사진의 입자 수를 줄이는 대가를 치르게 됩니다.
셋째, 자동 초점은 빔 유도 동작 증가 및 시편 두께 증가로 인해 기울어진 데이터 수집에 실패할 가능성이 더 큽니다. 따라서 정확한 초점을 달성하는 것은 때때로 기울어진 데이터 수집에 대한 몇 가지 문제를 제시할 수 있으며, 특히 초점 대상이 기울어지지 않은 데이터 수집을 위한 표준 관행인 4개의 구멍 중앙에 있는 금박인 경우 더욱 그렇습니다. 초점 추정 실패가 빈번한 경우 대안은 구멍의 가장자리를 초점 대상으로 설정하는 것입니다. 이는 빔 틸트에 의한 이미지 쌍과 후속 초점 조정 간의 정확한 위상 상관관계를 위한 충분한 신호를 제공해야 합니다. 경험상 구멍 가장자리에 초점을 맞추는 것이 자동 초점 실패로 이어지는 경우는 거의 없습니다.
마지막으로, 고배율 이미지가 그리드 중심에서 멀리 선택되는 경우, 틸트 축의 반대편에 있는 타겟 이미지 간의 초점 차이가 상당할 수 있습니다. 이 차이의 크기는 기울기 각도와 초점 지점으로부터의 거리에 따라 다릅니다. 예를 들어, 틸트 각도가 30°인 경우 그리드 표면에서 6μm 떨어져 있고 틸트 축에 정확히 수직으로 선택된 두 대상은 둘 사이의 디포커스 차이가 3μm입니다(관계: 델타 디포커스 = sin(틸트 각도) * (틸트 축으로부터의 거리)). 틸트 축을 따라 선택된 대상은 동일한 아웃포커스를 갖지만 다른 대상은 그 사이 어딘가에 있습니다. 보정 중에 Leginon에서 틸트 축이 정의되면 소프트웨어가 자동으로 디포커스 변화를 보정합니다. 그러나 사용자는 고배율 이미징 중에 더 큰 초점 구배를 가질 가능성이 있음을 인식해야 합니다. 큰 초점 구배는 최종 재구성(33)에 최소한으로 영향을 주어야 하지만, 앨리어싱 효과를 방지하기 위해 데이터 처리 동안 더 큰 박스 크기를 사용할 필요가 있을 수 있다. 이러한 상황에서는 데이터 수집 중에 더 좁은 디포커스 범위를 사용하는 것이 타당할 수 있으며, 디포커스의 무작위화는 스테이지를 기울이는 것에서 자연스럽게 발생합니다. 데이터 처리 중 파티클별 디포커스 조정은 최종 재구성의 해상도를 향상시킬 수 있습니다. 그러나 높은 스테이지 틸트 각도에서는 CTF 피팅의 정확한 모델링이 어려울 수 있으므로 데이터 품질을 모니터링하는 데 주의를 기울여야 하며 노출 큐레이션 중에 CTF가 적합합니다. 일반적으로 최적이 아닌 얼음 두께는 CTF 추정 적합치를 모델링할 때 정확도가 떨어집니다. 따라서 얼음이 얇은 지역에서는 입자 분포가 충분히 좋다고 가정할 때 주의해야 합니다.
개선되고 보다 균일한 방향 분포는 재구성된 Cryo-EM 맵의 방향 분해능을 개선합니다. 또한 보다 균일한 방향 분포는 샘플링 보정 계수를 개선하며, 이는 전역 해상도30,31과 직접 관련이 있습니다. 따라서, 배향 분포를 집합적으로 개선하면 원자 모델링 및 미세 조정의 정확도가 향상되어야 한다(9,30,31). 이는 원칙적으로 기울어진 데이터 수집의 일상적인 구현에 대한 강력한 사례를 제공합니다. 그러나 사용자가 알고 있어야 하는 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 첫째, 증가된 초점 구배 및 얼음 두께는 전체 전체 해상도에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 아마도 증가된 배경 소음과 증가된 빔-유도 모션의 조합으로 인한 것이며, 그 결과 발생하는 다른 간접적인 문제들과 결합될 수 있다(17). 이 효과는 얼음이 본질적으로 더 두꺼운 경우에 더 두드러질 것으로 예상됩니다. 그러나, 대부분의 샘플들은 어느 정도의 선호되는 배향을 겪고, 이는 차례로 샘플링 불균일성으로 이어질 수 있기 때문에, 기울어진 데이터 수집은 해로운 영향이 최소화되거나 완화되는 한 일반적으로 유익할 수 있다. 둘째, 심각한 우선 배향을 특징으로 하는 일부 샘플의 경우 스테이지를 60° 높이로 기울여야 할 수도 있습니다. 우리의 연구와 동료의 보고서에서 나온 일화적인 미공개 증거에 따르면 ~ 40 ° 기울기조차도 일부 표본의 해상도 이방성을 극복하기에는 충분하지 않습니다. Baldwin et al.31에 제시된 아이디어를 기반으로 일련의 분포에 대한 최적의 기울기 각도를 식별하기 위한 노력이 진행 중입니다. 마지막으로, 원칙적으로 완벽하게 병리학적인 단일 선호 방향을 특징으로 하는 샘플의 재구성은 데이터가 60° 기울기 각도로 수집되는 경우에도 여전히 30° 누락된 원뿔을 갖는다는 점에 유의해야 합니다. 시뮬레이션 실험에서 30° 누락된 원뿔은 실험적 해석에 큰 영향을 미치지 않을 것입니다. 60° 기울기는 아마도 가장 병리학적으로 우선적으로 지향된 표본에도 충분할 것입니다. 그러나 스테이지를 최대 60°까지 기울여야 하는 경우 입자 겹침으로 인해 데이터 처리가 복잡해지기 때문에 시야에서 입자 농도를 신중하게 최적화해야 합니다. 샘플 스테이지 설계의 한계로 인해 표준 TEM에서 60°(또는 일부 현미경 스테이지에서는 70°) 이상으로 기울일 수 없습니다. 이러한 경우 첨가제 및 시료 생화학을 사용한 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
현미경 검사, Leginon 설치 및 데이터 전송 인프라에 대한 도움을 주신 Bill Anderson, Charles Bowman 및 Jean-Christophe Ducom(TSRI)에게 감사드립니다. 또한 원고를 비판적으로 읽어 주신 Gordon Louie (Salk Institute)와 Yong Zi Tan (싱가포르 국립 대학교)에게도 감사드립니다. DPS 발현을 위한 플라스미드를 제공해 주신 Chris Russo(MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge)에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립 보건원 (U54AI150472, U54 AI170855 및 R01AI136680 DL), 국립 과학 재단 (NSF MCB-2048095 DL), 허스트 재단 (DL), Arthur and Julie Woodrow Chair (JPN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
References
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