Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltpartikel-kryo-EM-dataindsamling med scenehældning ved hjælp af Leginon

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64136
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,4,5
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Jack H. Skirball Center for Chemical Biology and Proteomics, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of California San Diego, 4Graduate School of Biological Sciences, Section of Molecular Biology, University of California San Diego, 5Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Summary

Denne protokol beskriver et generelt og let at implementere skema til vippet enkeltpartikeldataindsamling i kryo-EM-eksperimenter. En sådan procedure er især nyttig til opnåelse af et EM-kort af høj kvalitet for prøver, der lider af præferenceorienteringsbias på grund af overholdelse af luft-vand-grænsefladen.

Abstract

Enkeltpartikelanalyse (SPA) ved kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er nu en almindelig teknik til strukturel biologi med høj opløsning. Strukturbestemmelse ved SPA er afhængig af at opnå flere forskellige visninger af et makromolekylært objekt forglasset i et tyndt lag is. Ideelt set ville en samling af ensartet fordelte tilfældige projektionsorienteringer udgøre alle mulige visninger af objektet, hvilket giver anledning til rekonstruktioner præget af isotrop retningsopløsning. Men i virkeligheden lider mange prøver af fortrinsvis orienterede partikler, der klæber til luft-vand-grænsefladen. Dette fører til ikke-ensartede vinkelorienteringsfordelinger i datasættet og inhomogen Fourier-rumprøveudtagning i rekonstruktionen, der oversættes til kort, der er kendetegnet ved anisotrop opløsning. Hældning af prøvestadiet giver en generaliserbar løsning til at overvinde opløsningsanisotropi i kraft af forbedring af ensartetheden af orienteringsfordelinger og dermed isotropien af Fourier-rumprøvetagning. Denne protokol beskriver en vippet fase automatiseret dataindsamlingsstrategi ved hjælp af Leginon, en software til automatiseret billedoptagelse. Proceduren er enkel at implementere, kræver ikke yderligere udstyr eller software og er kompatibel med de fleste standard transmissionselektronmikroskoper (TEM'er), der anvendes til billeddannelse af biologiske makromolekyler.

Introduction

Fremkomsten af direkte elektrondetektorer i løbet af det sidste årti 1,2,3 har ansporet en eksponentiel stigning i antallet af højopløsningsstrukturer af makromolekyler og makromolekylære samlinger løst ved hjælp af enkeltpartikelkryo-EM 4,5,6. Næsten alle oprensede makromolekylære arter forventes at kunne struktureres ved hjælp af cryo-EM, bortset fra de mindste proteiner ~10 kDa i størrelse eller under7. Den mængde udgangsmateriale, der er nødvendig til gitterforberedelse og strukturbestemmelse, er mindst en størrelsesorden mindre end andre strukturbestemmelsesteknikker, såsom kernemagnetisk resonansspektroskopi og røntgenkrystallografi 4,5,6.

En væsentlig udfordring for strukturbestemmelse ved cryo-EM involverer imidlertid passende gitterforberedelse til billeddannelse. En omfattende undersøgelse, der evaluerede forskellige prøver ved hjælp af forskellige forglasningsstrategier og gitre, foreslog, at de fleste tilgange til forglasningsprøver på kryo-EM-gitter fører til præferencevedhæftning af makromolekyler til luft-vand-grænsefladen8. En sådan vedhæftning kan potentielt forårsage fire suboptimale resultater: (1) den makromolekylære prøve denaturerer fuldstændigt, i hvilket tilfælde ingen vellykket dataindsamling og -behandling er mulig; (2) prøven denaturerer delvist, i hvilket tilfælde det kan være muligt at opnå strukturel indsigt fra områder af makromolekylet, der ikke er beskadiget; (3) prøven bevarer sin oprindelige struktur, men kun ét sæt partikelorienteringer i forhold til elektronstrålens retning er repræsenteret på billederne; (4) prøven bevarer sin oprindelige struktur, og nogle, men ikke alle mulige partikelorienteringer i forhold til elektronstrålens retning er repræsenteret på billederne. I tilfælde (3) og (4) vil vippet dataindsamling hjælpe med at minimere retningsbestemt opløsningsanisotropi, der påvirker det rekonstruerede kryo-EM-kort og giver en generaliserbar løsning til en lang række prøver9. Teknisk set kan hældning også gavne tilfælde (2), da denatureringen formodentlig forekommer ved luft-vand-grænsefladen og tilsvarende begrænser antallet af forskellige retninger, der er repræsenteret i dataene. Omfanget af orienteringsbias i datasættet kan potentielt ændres ved at eksperimentere med løsningsadditiver, men manglen på bred anvendelighed hæmmer disse trial-and-error-tilgange. Hældning af prøvetrinnet i en enkelt optimeret hældningsvinkel er tilstrækkelig til at forbedre fordelingen af orienteringer i kraft af ændring af geometrien i billeddannelseseksperimentet9 (figur 1). På grund af den geometriske konfiguration af den fortrinsvis orienterede prøve i forhold til elektronstrålen genererer hældning af gitteret for hver klynge af præferenceorienteringer en kegle af belysningsvinkler i forhold til klyngecentroiden. Derfor spreder dette synspunkterne ud og forbedrer følgelig Fourier-rumprøvetagning og isotropien af retningsbestemt opløsning.

Der er i praksis nogle ulemper ved at vippe scenen. Hvis prøvetrinnet vippes, introduceres en fokusgradient på tværs af synsfeltet, hvilket kan påvirke nøjagtigheden af CTF-estimater (contrast transfer function). Vippet dataindsamling kan også føre til øget stråleinduceret partikelbevægelse forårsaget af øgede opladningseffekter ved billeddannelse af vippede prøver. Gitterhældning fører også til en stigning i tilsyneladende istykkelse, hvilket igen fører til mere støjende mikrografier og i sidste ende kan påvirke opløsningen af rekonstruktioner 5,9,10. Det kan være muligt at løse disse problemer ved at anvende avancerede beregningsmæssige databehandlingsordninger, der kort beskrives i protokol- og diskussionsafsnittene. Endelig kan hældning føre til øget partikeloverlapning, hvilket forhindrer den efterfølgende billedbehandlingsrørledning. Selvom dette til en vis grad kan afbødes ved at optimere partikelkoncentrationen på nettet, er det ikke desto mindre en vigtig overvejelse. Her beskrives en protokol, der er enkel at implementere, til vippedataindsamling ved hjælp af Leginon softwarepakken (en automatiseret billedoptagelsessoftware), tilgængelig åben adgang og kompatibel med en bred vifte af mikroskoper11,12,13,14. Metoden kræver mindst version 3.0 eller nyere, med version 3.3 og senere, der indeholder dedikerede forbedringer for at muliggøre vippet dataindsamling. Ingen yderligere software eller udstyr er nødvendig for denne protokol. Omfattende instruktioner om beregningsinfrastruktur og installationsvejledninger findes andetsteds15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af prøver

  1. Brug gitre, der indeholder guldfolie og guldgitterunderstøttelse16 (se materialetabel), fordi vippet dataindsamling kan fremhæve stråleinduceret bevægelse17.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev prøver på gitter forglasset ved hjælp af manuel nedsænknings- og blottingteknik18 i et befugtet (større end 80%) kølerum (~ 4 ° C).
  2. Undgå at bruge gitter, der indeholder kobberstøtte og kulstoffolie eller et kontinuerligt lag af amorft kulstof, medmindre det er absolut nødvendigt, da disse gitre kan føre til større stråleinduceret bevægelse16 , når prøvetrinnet vippes.
    BEMÆRK: Alternative støttelag, såsom grafen/grafenoxid, ser ud til at reducere stråleinduceret bevægelse sammenlignet med amorft kulstof19,20.
  3. Forscreene gitre og identificere regioner, der er kendetegnet ved acceptabel istykkelse og partikelfordeling. Gitre, der indeholder for tæt pakkede partikler, vil føre til partikeloverlapning under vippet dataindsamling, hvilket kan påvirke downstream-databehandlingstrinnene.
    BEMÆRK: Disse trin er subjektive, da identifikation af gode isområder udføres ved visuelt at inspicere defokuserede billeder for områder, hvor partikelkontrasten er klar. Dette er muligvis ikke muligt for alle prøver, da nogle prøver ikke distribueres effektivt i områder med tynd is, hvilket fører til udfordringer under dataindsamling (beskrevet i diskussionsafsnittet).
  4. Vitrificer gitterene, der indeholder din proteinprøve. Her bruger vi til demonstrationsformål DNA-beskyttelse under sultprotein (DPS) (se materialetabel) i et interval fra 0,1-0,5 mg / ml med guldfolie og guldstøttegitter.
    BEMÆRK: Proteinet blev renset som beskrevet tidligere, bortset fra at der ikke blev udført TEV-proteasespaltning21. Proteinkoncentrationsområdet for en prøve af interesse skal optimeres individuelt, da det er svært at måle et ideelt interval, der er universelt anvendeligt og næsten helt sikkert vil variere mellem forskellige prøver.

2. Opsætning af vippet dataindsamling

  1. Juster mikroskopet for at sikre parallel belysning af prøven og minimere koma aberrationer22.
    BEMÆRK: Mikroskopet skal være godt justeret til standard SPA-dataindsamling uden scenehældning. Der kræves ingen særlige justeringer for at indsamle vippede data, men en god justering vil sikre, at målretning og billeddannelse forløber problemfrit. Figur 2 indeholder en generel ordning, der sammenligner indsamling af vippede og ikke-tilterede data.
  2. Optag et gitteratlas uden fasehældning for at identificere firkanter, der er egnede til dataindsamling, eller inspicer kvadrater manuelt ved den forstørrelse, der bruges i Square Acquisition Node. Se efter firkanter, hvor folien er intakt, ikke ser dehydreret ud og har ideel istykkelse.
    BEMÆRK: Square Acquisition Node er den node med lav forstørrelse, der bruges til billeddannelse i flere skalaer i Leginon.
    1. For typisk automatiseret dataindsamling skal du registrere et gitteratlas, som giver et overblik over den overordnede netkvalitet og en indledende indikation af egnede områder til dataindsamling.
    2. Vælg derefter passende firkanter gennem atlasset og send dem til køen. Derefter, enten gennem manuel udvælgelse af huller eller gennem den automatiserede EM-hulfinder, kø og indsend hulmålene.
    3. Endelig skal du bruge den automatiserede EM-hulfinder til at indsende mål for høj forstørrelseseksponering.
      BEMÆRK: Ved vippet dataindsamling skal firkanter muligvis sættes i kø manuelt for at opnå ensartede resultater, især hvis den optimale hældningsvinkel ikke er forudbestemt og sandsynligvis vil blive justeret under dataindsamlingen. Gitteratlasset kunne også registreres ved hjælp af en foruddefineret fasehældning, hvis hældningsvinklen, der blev brugt til dataindsamling, tidligere var blevet fastlagt.
  3. Flyt prøvefasen til en firkant af interesse.
  4. Bestem den eucentriske højde for scenepositionen ved hjælp af α-wobbler ved ± 15° scenehældning. Juster Z-højden for at bringe scenen til eucentrisk højde ved hjælp af tastaturets panel til mikroskopet. Sørg for, at billedskiftet er minimalt under α-wobble-rutinen.
    BEMÆRK: Hvis den eucentriske højde ikke identificeres korrekt, observeres et stort billedskift, når scenen vippes ved kvadratforstørrelsen. Dette kan også ske, hvis der er lokale deformationer på gitteret, for eksempel hvis gitteret er brudt eller alvorligt bøjet i nærheden af det afbildede område. Selvom det er bedst at undgå sådanne regioner til dataindsamling, er det bydende nødvendigt nøjagtigt at estimere eucentrisk højde, hvis disse repræsenterer en af de få lovende regioner til dataindsamling. Figur 3 viser, hvordan målretning uden korrekt identifikation af eucentrisk højde kan forårsage store billedforskydninger i kvadratforstørrelsen.
  5. Find en mere nøjagtig Z-højde, brug noden Focuser, og tryk på Simuler.
    1. Anslå typisk Z-højden i fokusnoden ved den forstørrelse, der bruges i Square Acquisition Node.
      BEMÆRK: Fokusnodefokussekvensen kan også omfatte en fin Z-fokusestimering ved Hole Acquisition-noden (et værktøj i Lemininon-software) forstørrelse under dataindsamling.
    2. Juster indstillingerne for fokuseringsnoden , og aktiver/deaktiver indstillingen for fint Z-fokus under den første kø af firkanter.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at sikre, at eucentrisk højde identificeres nøjagtigt, når automatiseret dataindsamling begynder, hvilket kan kræve genaktivering af fin Z-fokus (trin 2.10).
  6. Vip prøvetrinnet til den ønskede hældningsvinkel for dataindsamling i den sande eucentriske højde, og centrer trinnet igen, hvis det er nødvendigt. 0°, 30° og 60° hældningsvinkler blev brugt til denne undersøgelse. Tryk på Simuler i noden Firkantet anskaffelse for at begynde at sætte mål i kø for eksponeringer for huloptagelsesnode .
    BEMÆRK: Som angivet i trin 2.2.1 kan gitteratlasset registreres ved hjælp af en foruddefineret fasehældning, hvilket overflødiggør behovet for at vippe scenen igen på dette trin. Dette fungerer godt og fremskynder processen, hvis hældningsvinklen, der bruges til dataindsamling, er foruddefineret. Den nuværende protokol er skrevet med nye prøver i tankerne, hvor brugeren måske ønsker at teste forskellige hældningsvinkler til dataindsamling.
  7. Vælg et Z-fokusmål og områder med huller, der er egnede til eksponering med høj forstørrelse.
  8. Tryk på Send mål til kø for at blive afbildet. Tryk ikke på Send mål i kø, før du er færdig med at sætte alle firkanter i kø.
  9. Bring prøvestadiet tilbage til dets uvippede tilstand. Gå til næste kvadrat, og gentag trin 2.3-2.8, indtil et tilstrækkeligt antal huleksponeringer er sat i kø.
  10. Gå til noden Målretning efter hul , og tryk på Send mål i kø, når alle firkanter er sat i kø .
    BEMÆRK: Hvis fint Z-fokus tidligere var deaktiveret for at spare tid (trin 2.5), skal det genaktiveres, før køen sendes.
  11. Undersøg manuelt mål, der er valgt af noden Eksponeringserhvervelse med høj forstørrelse, for at teste, om den automatiserede EM-hulfinder nøjagtigt kan identificere egnede områder til billedoptagelse, når prøvetrinnet vippes.
    1. Under denne procedure skal du vælge "Tillad brugerbekræftelse af valgte mål" i indstillingerne for Eksponeringsoptagelse . Når brugeren er tilfreds med målretningsnøjagtigheden, skal du fravælge denne indstilling for automatisk dataindsamling.
      BEMÆRK: Mål i noden Eksponeringsanskaffelse med høj forstørrelse afbildes typisk ved hjælp af en strålevippende billedskiftstrategi, som fungerer lige godt til både vippet og ikke-vippet dataindsamling23,24,25,26. For nøjagtig CTF-estimering i downstream-databehandlingstrin skal objektiv-koma-aberrationskalibreringen udføres for dataindsamlingsstrategien for strålehældningsbilledskift.

3. Databehandling

  1. Start on-the-fly databehandling 10,27,28,29 med bevægelseskorrektion af optagede film, CTF-estimering, partikelvalg og generering af indledende rekonstruktioner under dataindsamling.
    BEMÆRK: Til nærværende undersøgelse er cryoSPARC Live10 (se materialetabel) blevet anvendt til forbehandling. On-the-fly databehandling giver en indledende cryo-EM-rekonstruktion og en tilnærmelse til vinkelfordelingen, som kan informere brugeren om omfanget af opløsningsanisotropi. Disse kan igen bruges til at vejlede brugeren om, hvorvidt hældningsvinklen, der bruges til dataindsamling, er tilstrækkelig høj.
  2. Visualiser det rekonstruerede kort og plot Euler-vinkelfordelingen for at måle omfanget af foretrukne partikelretninger.
    BEMÆRK: Euler-vinkelfordelingerne kan konverteres direkte til Fourier-rumprøvefordelinger for at bestemme det potentielle omfang af opløsningsanisotropi. En grafisk brugergrænseflade (GUI) er udviklet til at hjælpe brugeren med at evaluere kvaliteten af en Euler-vinkelfordeling og bestemme en optimal hældningsvinkel30,31. Værktøjet kan hentes fra Github-lageret, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.
  3. Juster om nødvendigt den fasehældningsvinkel, hvor data indsamles, for at overvinde virkningerne af præferenceorientering. Vinklen kan øges, hvis præferenceorienteringen forbliver et problem, som det fremgår af kortet og Euler-fordelingen i 3.2. Alternativt kan brugeren opdele dataindsamlingen i grupper og registrere ved hjælp af flere forskellige hældningsvinkler, såsom 20°, 30° og 40°.
    BEMÆRK: Selvom de fleste TEM'er skal have evnen til at vippe scenen til 70 °, varierer almindelige prøvestadiehældninger (som vi har brugt) fra 20 ° -40 °.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DPS ved 0,3 mg/ml blev brugt til at demonstrere billeddannelse ved 0°, 30° og 60° hældninger. Data fra forskellige hældningsvinkler blev indsamlet på det samme gitter i forskellige gitterområder. CTF-opløsning, der passer til hældninger med højere vinkel, har tendens til at være dårligere, som det var tilfældet, når man sammenlignede de tre datasæt i denne undersøgelse. Figur 4 viser sammenlignende repræsentative billeder og 2D-klassificeringsgennemsnit. Selvom proteinkoncentrationen er uændret på tværs af de forskellige hældningsvinkler, får en højere hældningsvinkel det afbildede område til at virke mere overfyldt med hensyn til partikelkoncentration. Dette kan være problematisk for databehandling, fordi partikeloverlapning kan komplicere 3D-rekonstruktioner og vinkelforbedringer. Iterativ 2D-klassificering producerede rutinemæssigt en ren stak partikler med 0° og 30° vippede datasæt, mens 60°-datasættet krævede omhyggelig rengøring af partikelstablerne for at sikre, at klassegennemsnit viser minimal overlapning for tilstødende partikler. Klassegennemsnittet fra figur 4C i den røde boks repræsenterer et eksempel på partikeloverlapning. Selvom re-centrering under klassificering kan resultere i, at signalet fra nabopartikler bliver gennemsnitligt, kan betydelig partikeloverlapning kompromittere nøjagtigheden af partikeljusteringsparametre, hvilket giver rekonstruktioner kendetegnet ved lavere opløsning. Den bedste løsning til at undgå partikeloverlapning er at forhåndsscreene gitre med optimal istykkelse og partikelfordeling. En omfattende kvantitativ oversigt over målepunkterne til evaluering af forbedringer fra vippet dataindsamling er beskrevet andetsteds32.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over fordele og udfordringer ved vippet dataindsamling. Toppanelet viser et nærbillede af et gitterhul. Gitterstænger er i guld, glasagtige isblå og makromolekylære partikler røde. Pile angiver elektronstrålens retning. Bundpanelet repræsenterer en samling huller med samme farveskema som i toppanelet. Den sorte stjerne repræsenterer det fine fokusmål før eksponeringsbilledoptagelse ved høj forstørrelse. Hældningsvinklen er angivet som 'α'. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsprocesdiagram, der sammenligner dataindsamlingsstrategi for ikke-tilslået og vippet. Trinvis sammenligning af ikke-vippet og vippet dataindsamling viser det ekstra trin med manuelt at estimere den eucentriske højde og centrere igen for hver skrå firkant (2 og 3 for vippet dataindsamling). Resten af arbejdsgangen er ens mellem de to strategier. Disse omfatter valg af en passende firkant til billeddannelse (1 til vippet og ikke-vippet dataindsamling), initiering af et køskema ved at vælge en firkant til billeddannelse (kaldet simulering; 2 og 4 til henholdsvis ikke-vippet og vippet dataindsamling), hvilket giver et eucentrisk højdefokusmål og mål for erhvervelse af køhulsforstørrelse (3 og 5 til ikke-vippet og vippet dataindsamling, henholdsvis). og endelig indsende køen af udvalgte eksponeringsmål med høj forstørrelse (4 og 6 for henholdsvis ikke-vippet og vippet dataindsamling). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative billeder af gitteret ved kvadratisk forstørrelse med forskellige hældningsvinkler. Billeder indsamlet nær og langt fra eucentrisk Z-højde vises på henholdsvis øverste og nederste paneler. Strålens optiske akse er angivet med midten af de røde koncentriske ringe. Den grønne pil angiver kvadratet af interesse. Der er en brudt gitterfunktion ved siden af firkanten af interesse til reference. Den objektive blænde fjernes for at lette visningen. Skalabjælke = 20 μM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative huleksponeringer og 2D-klassegennemsnit indsamlet ved forskellige hældningsvinkler. Panelerne (A), (B) og (C) henviser til billeddannelse, der udføres med prøvetrinnet utilslået ved 0° eller vippet til 30° og 60°. 2D-klassegennemsnit, der påvirkes af overbelægning, vises i den røde boks i (C). Skala bar = 100 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Foretrukken partikelorientering forårsaget af prøvens vedhæftning til luft-vand-grænsefladen er en af de sidste store flaskehalse for rutinemæssig strukturbestemmelse med høj opløsning ved hjælp af cryo-EM SPA 4,5,6. Dataindsamlingsskemaet, der præsenteres her, giver en let at implementere strategi til forbedring af orienteringsfordelingen af partikler inden for et datasæt. Vi bemærker, at protokollen ikke kræver yderligere udstyr eller software og ikke påvirker dataindsamlingshastigheden. Følgende overvejelser er vigtige under dataindsamling for vippede prøver.

For det første skal den afbildede firkant være i eucentrisk højde for optimal målretning. Eucentrisk højde justeres ved at optage vippeparbilleder ved små scenehældningsvinkler (normalt 0,5°-2°) og identificere fokus baseret på et foruddefineret forhold mellem billedskift og defokusering. Hvis målkvadratet kræver en stor justering i eucentrisk højde, vil dette resultere i en betydelig billedforskydning af det firkantede billede, således at synsfeltet kan blive blokeret af objektivblænden, når scenen vippes igen.

For det andet bliver det normalt cirkulære hul mere og mere aflangt med højere hældninger ved medium forstørrelse (huloptagelsesknudeforstørrelse ). I mangel af nøjagtige billedforskydningskalibreringer er det muligt, at en del af folien kan afbildes sammen med partikler indlejret i glasagtig is for en given eksponeringsforstørrelse. Derfor skal billedforskydningskalibreringerne ideelt set være nøjagtige. Et alternativ er at øge forstørrelsen, så det afbildede område i forhold til hulstørrelsen falder. Ved højere forstørrelse vil fejl i strålehældningsinduceret billedskift have en mindre effekt på en brugers evne til at navigere til et område med glasagtig is. Dette kommer imidlertid på bekostning af at mindske antallet af partikler i de resulterende mikrografier, proportionalt med en stigning i forstørrelsen.

For det tredje har autofokus større chance for at mislykkes til vippet dataindsamling på grund af øget stråleinduceret bevægelse og øget prøvetykkelse. Således kan opnåelse af nøjagtigt fokus lejlighedsvis give nogle udfordringer for vippet dataindsamling, især hvis fokusmålet er guldfolien i midten af fire huller, hvilket er standardpraksis for ikke-tilslået dataindsamling. I tilfælde af hyppige fokusestimeringsfejl er et alternativ at indstille kanten af et hul som fokusmål. Dette skal give et tilstrækkeligt signal til nøjagtig fasekorrelation mellem strålehældningsinducerede billedpar og efterfølgende fokusjustering. Det er vores erfaring, at fokus på kanten af et hul sjældent resulterer i autofokusfejl.

Og endelig, når billeder med høj forstørrelse vælges langt fra gittercentret, kan forskellen i fokus mellem målrettede billeder på modsatte sider af hældningsaksen være betydelig. Størrelsen af denne forskel afhænger af hældningsvinklen og afstanden fra fokuspunktet. For eksempel vil to mål, der er 6 μm fra hinanden på gitterets overflade og valgt nøjagtigt vinkelret på hældningsaksen, ved en hældningsvinkel på 30° have en forskel på 3 μm i defokusering mellem dem (forholdet er: deltadefokusering = sin (hældningsvinkel) * (afstand fra hældningsakse)). Mål, der vælges langs hældningsaksen, vil have samme defokusering, mens andre vil falde et sted imellem. Hvis hældningsaksen er defineret i Leginon under kalibrering, kompenserer softwaren automatisk for ændringen i defokusering. Brugere skal dog være opmærksomme på, at muligheden for at have større fokusgradienter under billeder med høj forstørrelse ikke desto mindre eksisterer. Store fokusgradienter bør påvirke den endelige rekonstruktionminimalt 33, men det kan være nødvendigt at bruge større boksstørrelser under databehandling for at forhindre aliasingeffekter. Under disse omstændigheder kan det være berettiget at bruge et smallere defokuseringsområde under dataindsamling, og randomisering af defokusering kommer naturligt fra at vippe scenen. Defokusering pr. partikeldefokusering under databehandling kan forbedre opløsningerne af endelige rekonstruktioner. Da nøjagtig modellering af CTF-tilpasninger imidlertid kan være udfordrende for høje hældningsvinkler, skal man sørge for at overvåge kvaliteten af dataene, og CTF-tilpasningen under eksponeringskuratering. Generelt resulterer suboptimal istykkelse i dårligere nøjagtighed i modellering af CTF-estimeringspasninger. Derfor skal man være opmærksom på billedet i områder, hvor isen er tynd, forudsat at partikelfordelingen er tilstrækkelig god i disse områder.

En forbedret og mere ensartet orienteringsfordeling fører til en tilsvarende forbedring i retningsopløsningen af de rekonstruerede cryo-EM-kort. Desuden forbedrer en mere ensartet orienteringsfordeling stikprøvekompensationsfaktoren, som direkte vedrører global resolution30,31. Således bør kollektiv forbedring af orienteringsfordelingen forbedre nøjagtigheden af atommodellering og forfining 9,30,31. Dette vil i princippet være et stærkt argument for rutinemæssig gennemførelse af vippet dataindsamling. Der er dog flere forbehold, som brugeren skal være opmærksom på. For det første kan den øgede fokusgradient og istykkelse påvirke den samlede globale opløsning, formodentlig på grund af en kombination af øget baggrundsstøj og øget stråleinduceret bevægelse kombineret med andre indirekte problemer, der opstår som følge heraf17. Denne effekt forventes at være mere udtalt i tilfælde, hvor isen i sagens natur er tykkere. Da de fleste prøver imidlertid lider af en vis grad af foretrukken orientering, hvilket igen kan føre til manglende ensartethed i stikprøven, kan vippet dataindsamling generelt være gavnlig, så længe de skadelige virkninger minimeres eller afbødes. For det andet kan det være nødvendigt at vippe scenen så højt som 60° for nogle prøver, der er kendetegnet ved alvorlig præferenceorientering. Anekdotiske upublicerede beviser fra vores arbejde og kollegers rapporter tyder på, at selv ~ 40 ° hældninger er utilstrækkelige til at overvinde opløsningsanisotropi for nogle prøver. Bestræbelser på at identificere en optimal hældningsvinkel for et sæt fordelinger er i gang, baseret på ideerne beskrevet i Baldwin et al.31. Endelig skal det bemærkes, at en rekonstruktion fra en prøve, der er karakteriseret ved en perfekt patologisk enkelt foretrukken orientering, i princippet stadig vil have en 30° manglende kegle, selv når dataene indsamles i en hældningsvinkel på 60°. I simulerede eksperimenter er det usandsynligt, at en manglende kegle på 30° vil påvirke eksperimentelle fortolkninger meget. En hældning på 60° er sandsynligvis tilstrækkelig til selv de mest patologisk fortrinsvis orienterede prøver. I tilfælde, hvor scenen muligvis skal vippes med så meget som 60 °, skal koncentrationen af partikler i synsfeltet optimeres omhyggeligt, da partikeloverlapning vil komplicere databehandlingen. Det er ikke muligt at vippe til mere end 60° (eller 70° på udvalgte mikroskoptrin) på standard TEM'er på grund af begrænsninger i prøvetrinnets design. I sådanne tilfælde kan yderligere optimering med additiver og prøvebiokemi være påkrævet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Bill Anderson, Charles Bowman og Jean-Christophe Ducom (TSRI) for hjælp med mikroskopi, Leginon installationer og dataoverførselsinfrastruktur. Vi takker også Gordon Louie (Salk Institute) og Yong Zi Tan (National University of Singapore) for den kritiske læsning af manuskriptet. Vi takker Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) for at give os plasmidet til ekspression af DPS. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra US National Institutes of Health (U54AI150472, U54 AI170855 og R01AI136680 til DL), National Science Foundation (NSF MCB-2048095 til DL), Hearst Foundations (til DL) og Arthur og Julie Woodrow Chair (til J. P. N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216 Structura Biotechnology
DPS protein Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector Gatan
Leginon software suite C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids Quantifoil N1-A14nAu30-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
  3. Li, X. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. , (2022).
  5. Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
  6. Wu, M., Lander, G. C. Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis. Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).
  7. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  8. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. Elife. 7, 34257 (2018).
  9. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  10. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  11. Potter, C. S., et al. Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  12. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  13. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  14. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  15. NYSBC.org Homepage. , Available from: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage (2022).
  16. Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346, 1377-1380 (2014).
  17. Russo, C. J., Henderson, R. Charge accumulation in electron cryomicroscopy. Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).
  18. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).
  19. Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
  20. Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Naydenova, K., et al. CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects. IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).
  22. Herzik, M. A. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 125-144 (2021).
  23. Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV. IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).
  24. Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM. IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).
  25. Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).
  26. Cheng, A., et al. High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).
  27. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  28. Structura Biotechnology Inc. , Available from: https://cryosparc.com/live (2022).
  29. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  30. Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).
  31. Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).
  32. Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 161-187 (2021).
  33. Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading). Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 185
Enkeltpartikel-kryo-EM-dataindsamling med scenehældning ved hjælp af Leginon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aiyer, S., Strutzenberg, T. S.,… More

Aiyer, S., Strutzenberg, T. S., Bowman, M. E., Noel, J. P., Lyumkis, D. Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon. J. Vis. Exp. (185), e64136, doi:10.3791/64136 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter