Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein verallgemeinertes und einfach zu implementierendes Schema für die Datenerfassung von gekippten Einzelpartikeln in Kryo-EM-Experimenten. Ein solches Verfahren ist besonders nützlich, um eine qualitativ hochwertige EM-Karte für Proben zu erhalten, die aufgrund der Einhaltung der Luft-Wasser-Grenzfläche unter einer bevorzugten Orientierungsverzerrung leiden.
Abstract
Die Einzelpartikelanalyse (SPA) mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) ist heute eine gängige Technik für die hochauflösende Strukturbiologie. Die Strukturbestimmung durch SPA beruht auf der Gewinnung mehrerer unterschiedlicher Ansichten eines makromolekularen Objekts, das in einer dünnen Eisschicht verglast ist. Im Idealfall würde eine Sammlung von gleichmäßig verteilten zufälligen Projektionsorientierungen alle möglichen Ansichten des Objekts ergeben, was zu Rekonstruktionen führt, die durch eine isotrope Richtungsauflösung gekennzeichnet sind. In der Realität leiden jedoch viele Proben unter bevorzugt orientierten Partikeln, die an der Luft-Wasser-Grenzfläche haften. Dies führt zu ungleichmäßigen Winkelorientierungsverteilungen im Datensatz und inhomogenem Fourier-Raum-Sampling in der Rekonstruktion, was sich in Karten niederschlägt, die durch anisotrope Auflösung gekennzeichnet sind. Die Neigung des Probentisches bietet eine verallgemeinerbare Lösung zur Überwindung der Auflösungsanisotropie durch die Verbesserung der Gleichmäßigkeit der Orientierungsverteilungen und damit der Isotropie der Fourier-Raumabtastung. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine automatisierte Datenerfassungsstrategie mit geneigter Stufe unter Verwendung von Leginon, einer Software zur automatisierten Bilderfassung. Das Verfahren ist einfach zu implementieren, erfordert keine zusätzliche Ausrüstung oder Software und ist mit den meisten Standard-Transmissionselektronenmikroskopen (TEMs) kompatibel, die für die Abbildung biologischer Makromoleküle verwendet werden.
Introduction
Das Aufkommen von Direktelektronendetektorenin den letzten zehn Jahren 1,2,3 hat zu einem exponentiellen Anstieg der Anzahl hochauflösender Strukturen von Makromolekülen und makromolekularen Anordnungen geführt, die mit Einzelpartikel-Kryo-EM 4,5,6 gelöst wurden. Es wird erwartet, dass fast alle gereinigten makromolekularen Spezies für die Strukturbestimmung mittels Kryo-EM geeignet sind, mit Ausnahme der kleinsten Proteine mit einer Größe von ~10 kDa oder unter7. Die Menge an Ausgangsmaterial, die für die Gittervorbereitung und Strukturbestimmung benötigt wird, ist mindestens um eine Größenordnung geringer als bei anderen Strukturbestimmungstechniken wie Kernspinresonanzspektroskopie und Röntgenkristallographie 4,5,6.
Eine grundsätzliche Herausforderung bei der Strukturbestimmung mittels Kryo-EM besteht jedoch in der geeigneten Gittervorbereitung für die Bildgebung. Eine umfangreiche Studie, in der verschiedene Proben unter Verwendung unterschiedlicher Vitrifikationsstrategien und -gitter ausgewertet wurden, deutete darauf hin, dass die meisten Ansätze zur Vitrifizierung von Proben auf Kryo-EM-Gittern zu einer bevorzugten Adhärenz von Makromolekülen an der Luft-Wasser-Grenzfläche führen8. Eine solche Adhärenz kann potenziell zu vier suboptimalen Ergebnissen führen: (1) Die makromolekulare Probe denaturiert vollständig, in diesem Fall ist keine erfolgreiche Datenerhebung und -verarbeitung möglich; (2) Die Probe denaturiert teilweise, in diesem Fall kann es möglich sein, strukturelle Einblicke aus Regionen des Makromoleküls zu erhalten, die nicht beschädigt sind. (3) Die Probe behält ihre native Struktur bei, aber in den Bildern wird nur ein Satz von Teilchenorientierungen relativ zur Richtung des Elektronenstrahls dargestellt. (4) Die Probe behält ihre native Struktur bei, und einige, aber nicht alle möglichen Partikelorientierungen relativ zur Richtung des Elektronenstrahls sind in den Bildern dargestellt. In den Fällen (3) und (4) hilft die geneigte Datenerfassung bei der Minimierung der Anisotropie der Richtungsauflösung, die sich auf die rekonstruierte Kryo-EM-Karte auswirkt, und bietet eine verallgemeinerbare Lösung für eine Vielzahl von Proben9. Technisch gesehen kann die Neigung auch im Fall (2) von Vorteil sein, da die Denaturierung vermutlich an der Luft-Wasser-Grenzfläche stattfindet und in ähnlicher Weise die Anzahl der in den Daten dargestellten unterschiedlichen Orientierungen begrenzt. Das Ausmaß der Orientierungsverzerrung im Datensatz kann möglicherweise durch das Experimentieren mit Lösungsadditiven verändert werden, aber ein Mangel an breiter Anwendbarkeit behindert diese Trial-and-Error-Ansätze. Das Kippen des Probentisches um einen einzigen optimierten Neigungswinkel reicht aus, um die Verteilung der Orientierungen durch Änderung der Geometrie des Abbildungsexperiments9 zu verbessern (Abbildung 1). Aufgrund der geometrischen Konfiguration der bevorzugt ausgerichteten Probe in Bezug auf den Elektronenstrahl erzeugt die Neigung des Gitters für jeden Cluster bevorzugter Orientierungen einen Kegel von Beleuchtungswinkeln in Bezug auf den Cluster-Schwerpunkt. Dadurch werden die Ansichten ausgeweitet und folglich die Fourier-Raumabtastung und die Isotropie der Richtungsauflösung verbessert.
In der Praxis gibt es einige Nachteile, wenn man die Bühne kippt. Durch das Kippen des Probentisches wird ein Fokusgradient über das Sichtfeld eingeführt, der sich auf die Genauigkeit der CTF-Schätzungen (Contrast Transfer Function) auswirken kann. Die geneigte Datenerfassung kann auch zu einer erhöhten strahlinduzierten Partikelbewegung führen, die durch erhöhte Aufladungseffekte bei der Abbildung geneigter Proben verursacht wird. Die Gitterneigung führt auch zu einer Zunahme der scheinbaren Eisdicke, was wiederum zu verrauschten Schliffbildern führt und letztendlich die Auflösung von Rekonstruktionen beeinflussenkann 5,9,10. Es kann möglich sein, diese Probleme zu überwinden, indem fortgeschrittene computergestützte Datenverarbeitungsschemata angewendet werden, die in den Protokoll- und Diskussionsabschnitten kurz beschrieben werden. Schließlich kann das Kippen zu einer erhöhten Partikelüberlappung führen, was die nachfolgende Bildverarbeitungspipeline behindert. Obwohl dies bis zu einem gewissen Grad durch die Optimierung der Partikelkonzentration im Netz gemildert werden kann, ist dies dennoch ein wichtiger Aspekt. Hier wird ein einfach zu implementierendes Protokoll für die geneigte Datenerfassung mit der Leginon Software Suite (einer automatisierten Bilderfassungssoftware) beschrieben, das frei zugänglich und mit einer breiten Palette von Mikroskopenkompatibel ist 11,12,13,14. Die Methode erfordert mindestens Version 3.0 oder höher, wobei die Version 3.3 ab Version 3.3 dedizierte Verbesserungen enthält, um eine geneigte Datenerfassung zu ermöglichen. Für dieses Protokoll ist keine zusätzliche Software oder Ausrüstung erforderlich. Ausführliche Anweisungen zur Recheninfrastruktur und zu Installationsanleitungen finden Sie an anderer Stelle15.
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Protocol
1. Probenvorbereitung
- Verwenden Sie Gitter, die Goldfolie und Goldgitterträger16 enthalten (siehe Materialtabelle), da eine geneigte Datenerfassung die strahlinduzierte Bewegung17 verstärken kann.
HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden Proben auf Gittern mit der manuellen Tauch- und Blotting-Technik18 in einem befeuchteten (mehr als 80%) Kühlraum (~4 °C) verglast. - Vermeiden Sie die Verwendung von Gittern, die Kupferträger und Kohlenstofffolie oder eine durchgehende Schicht aus amorphem Kohlenstoff enthalten, es sei denn, dies ist unbedingt erforderlich, da diese Gitter zu einer größeren strahlinduzierten Bewegung16 führen können, wenn der Probentisch geneigt wird.
HINWEIS: Alternative Trägerschichten, wie z. B. Graphen/Graphenoxid, scheinen die strahlinduzierte Bewegung im Vergleich zu amorphem Kohlenstoff19,20 zu reduzieren. - Screenen Sie Gitter vor und identifizieren Sie Regionen, die sich durch akzeptable Eisdicke und Partikelverteilung auszeichnen. Gitter, die zu dicht gepackte Partikel enthalten, führen bei der geneigten Datenerfassung zu Partikelüberlappungen, die sich auf nachgelagerte Datenverarbeitungsschritte auswirken können.
HINWEIS: Diese Schritte sind subjektiv, da die Identifizierung guter Eisbereiche durch visuelle Inspektion von unscharfen Bildern auf Regionen erfolgt, in denen der Partikelkontrast klar ist. Dies ist möglicherweise nicht für alle Proben möglich, da sich einige Proben nicht effizient in Bereichen mit dünnem Eis verteilen, was zu Herausforderungen bei der Datenerfassung führt (siehe Abschnitt Diskussion). - Vitrifizieren Sie die Gitter, die Ihre Proteinprobe enthalten. Hier verwenden wir zu Demonstrationszwecken das Protein DNA Protection during Starvation (DPS) (siehe Materialtabelle) in einem Bereich von 0,1-0,5 mg/ml mit Goldfolie und Goldträgergittern.
HINWEIS: Das Protein wurde wie zuvor beschrieben gereinigt, mit der Ausnahme, dass keine TEV-Protease-Spaltung durchgeführt wurde21. Der Proteinkonzentrationsbereich für eine interessierende Probe muss individuell optimiert werden, da es schwierig ist, einen idealen Bereich zu messen, der universell anwendbar ist und mit ziemlicher Sicherheit zwischen verschiedenen Proben variieren wird.
2. Einrichten der geneigten Datenerfassung
- Richten Sie das Mikroskop aus, um eine parallele Beleuchtung der Probe zu gewährleisten und Komaaberrationen zu minimieren22.
HINWEIS: Das Mikroskop muss für die standardmäßige SPA-Datenerfassung ohne Tischneigung gut ausgerichtet sein. Für die geneigte Datenerfassung sind keine speziellen Ausrichtungen erforderlich, aber eine gute Ausrichtung stellt sicher, dass das Targeting und die Bildgebung reibungslos ablaufen. Ein allgemeines Schema zum Vergleich der geneigten und ungekippten Datenerfassung ist in Abbildung 2 dargestellt. - Zeichnen Sie einen Rasteratlas ohne Tischneigung auf, um Quadrate zu identifizieren, die für die Datenerfassung geeignet sind, oder überprüfen Sie Quadrate manuell mit der Vergrößerung, die im Square Acquisition Node verwendet wird. Suchen Sie nach Quadraten, bei denen die Folie intakt ist, nicht dehydriert aussieht und eine ideale Eisdicke aufweist.
HINWEIS: Der quadratische Erfassungsknoten ist der Knoten mit geringer Vergrößerung, der für die Multiskalen-Bildgebung in Leginon verwendet wird.- Für die typische ungekippte automatisierte Datenerfassung ist ein Gitteratlas zu erstellen, der einen Überblick über die Gesamtnetzqualität und einen ersten Hinweis auf geeignete Bereiche für die Datenerfassung gibt.
- Wählen Sie anschließend geeignete Quadrate durch den Atlas aus und senden Sie sie an die Warteschlange. Stellen Sie dann entweder durch manuelle Auswahl der Bohrlöcher oder durch den automatisierten EM-Bohrlochfinder die Bohrlochziele in die Warteschlange und übermitteln Sie sie.
- Verwenden Sie schließlich den automatisierten EM-Lochsucher, um Belichtungsziele mit hoher Vergrößerung einzureichen.
HINWEIS: Bei der geneigten Datenerfassung müssen Quadrate möglicherweise manuell in die Warteschlange gestellt werden, um konsistente Ergebnisse zu erzielen, insbesondere wenn der optimale Neigungswinkel nicht im Voraus festgelegt wurde und wahrscheinlich während der Datenerfassung angepasst wird. Der Rasteratlas könnte auch mit einer vordefinierten Tischneigung aufgezeichnet werden, wenn zuvor der für die Datenerfassung verwendete Neigungswinkel festgelegt wurde.
- Verschieben Sie den Probentisch auf ein interessantes Quadrat.
- Bestimmen Sie die euzentrische Höhe für die Bühnenposition mit α-Wobbler bei ± 15°-Bühnenneigung. Stellen Sie die Z-Höhe ein, um den Tisch auf euzentrische Höhe zu bringen, indem Sie die Tastatur für das Mikroskop verwenden. Stellen Sie sicher, dass die Bildverschiebung während der α-Wobble-Routine minimal ist.
HINWEIS: Wenn die euzentrische Höhe nicht richtig identifiziert wird, wird beim Kippen des Tisches bei quadratischer Vergrößerung eine große Bildverschiebung beobachtet. Dies kann auch passieren, wenn es zu lokalen Verformungen auf dem Gitter kommt, zum Beispiel wenn das Gitter in der Nähe des abgebildeten Bereichs gebrochen oder stark verbogen ist. Obwohl es am besten ist, solche Regionen für die Datenerhebung zu vermeiden, ist es unerlässlich, die euzentrische Höhe genau abzuschätzen, wenn diese eine der wenigen vielversprechenden Regionen für die Datenerhebung darstellen. Abbildung 3 zeigt, wie das Anvisieren ohne ordnungsgemäße Identifizierung der euzentrischen Höhe zu großen Bildverschiebungen bei der quadratischen Vergrößerung führen kann. - Suchen Sie eine genauere Z-Höhe, verwenden Sie den Okularauszugsknoten und drücken Sie Simulieren.
- Schätzen Sie in der Regel die Z-Höhe im Okularauszugsknoten bei der Vergrößerung, die im quadratischen Erfassungsknoten verwendet wird.
HINWEIS: Die Fokussequenz des Okularauszugsknotens kann während der Datenerfassung auch eine feine Z-Fokusschätzung an der Vergrößerung des Locherfassungsknotens (ein Werkzeug in der Leginon-Software) enthalten. - Passen Sie die Einstellungen für den Fokusknoten an und aktivieren/deaktivieren Sie die Option "Feiner Z-Fokus" während der ersten Warteschlange von Quadraten.
HINWEIS: Es ist wichtig sicherzustellen, dass die euzentrische Höhe genau identifiziert wird, wenn die automatisierte Datenerfassung beginnt, was möglicherweise eine erneute Aktivierung des feinen Z-Fokus erfordert (Schritt 2.10).
- Schätzen Sie in der Regel die Z-Höhe im Okularauszugsknoten bei der Vergrößerung, die im quadratischen Erfassungsknoten verwendet wird.
- Kippen Sie den Probentisch auf den gewünschten Neigungswinkel, um die Daten auf der wahren euzentrischen Höhe zu erfassen, und zentrieren Sie den Tisch bei Bedarf neu. Für diese Studie wurden Neigungswinkel von 0°, 30° und 60° verwendet. Drücken Sie im Knoten "Quadratische Erfassung" auf "Simulieren", um mit der Warteschlange für die Belichtung von Bohrlocherfassungsknoten zu beginnen.
HINWEIS: Wie in Schritt 2.2.1 angegeben, kann der Rasteratlas mit einer vordefinierten Bühnenneigung aufgezeichnet werden, wodurch die Notwendigkeit entfällt, den Tisch in diesem Schritt erneut zu kippen. Dies funktioniert gut und beschleunigt den Prozess, wenn der für die Datenerfassung verwendete Neigungswinkel vordefiniert ist. Das aktuelle Protokoll wurde unter Berücksichtigung neuer Proben geschrieben, wobei der Benutzer möglicherweise verschiedene Neigungswinkel für die Datenerfassung testen möchte. - Wählen Sie ein Z-Fokusziel und Bereiche mit Löchern, die für Belichtungen mit hoher Vergrößerung geeignet sind.
- Klicken Sie auf Ziele senden, um sich für die Bildgebung in die Warteschlange einzureihen . Drücken Sie nicht auf Ziele in der Warteschlange senden, bis Sie alle Felder in die Warteschlange gestellt haben.
- Bringen Sie den Probentisch wieder in seinen ungekippten Zustand. Gehen Sie zum nächsten Quadrat und wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.8, bis eine ausreichende Anzahl von Lochbelichtungen in der Warteschlange steht.
- Gehen Sie zum Hole Targeting Node und klicken Sie auf Submit Queued Targets, sobald alle Quadrate in der Warteschlange stehen.
HINWEIS: Wenn der feine Z-Fokus zuvor deaktiviert wurde, um Zeit zu sparen (Schritt 2.5), muss er vor dem Senden der Warteschlange erneut aktiviert werden. - Untersuchen Sie manuell die vom Belichtungserfassungsknoten mit hoher Vergrößerung ausgewählten Ziele, um zu testen, ob der automatisierte EM-Lochsucher geeignete Bereiche für die Bildaufnahme genau identifizieren kann, wenn der Probentisch geneigt ist.
- Wählen Sie während dieses Verfahrens in den Einstellungen des Knotens "Belichtungserfassung die Option "Benutzerüberprüfung ausgewählter Ziele zulassen" aus. Wenn der Benutzer mit der Targeting-Genauigkeit zufrieden ist, deaktivieren Sie diese Option für die automatisierte Datenerfassung.
HINWEIS: Ziele im Belichtungserfassungsknoten mit hoher Vergrößerung werden in der Regel mit einer Strahl-Neigungs-Bildverschiebungsstrategie abgebildet, die sowohl für die geneigte als auch für die nicht geneigte Datenerfassunggleichermaßen gut funktioniert 23,24,25,26. Für eine genaue CTF-Schätzung in nachgelagerten Datenverarbeitungsschritten muss die Kalibrierung der Linsen-Koma-Aberration für die Strahl-Neigungs-Bildverschiebungs-Datenerfassungsstrategie durchgeführt werden.
- Wählen Sie während dieses Verfahrens in den Einstellungen des Knotens "Belichtungserfassung die Option "Benutzerüberprüfung ausgewählter Ziele zulassen" aus. Wenn der Benutzer mit der Targeting-Genauigkeit zufrieden ist, deaktivieren Sie diese Option für die automatisierte Datenerfassung.
3. Datenverarbeitung
- Initiieren Sie die On-the-fly-Datenverarbeitung 10,27,28,29 mit Bewegungskorrektur von aufgezeichneten Filmen, CTF-Schätzung, Partikelauswahl und Generierung erster Rekonstruktionen während der Datenerfassung.
HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde cryoSPARC Live10 (siehe Materialtabelle) für die Vorverarbeitung verwendet. Die On-the-fly-Datenverarbeitung liefert eine erste Kryo-EM-Rekonstruktion und eine Näherung für die Winkelverteilung, die den Benutzer über das Ausmaß der Auflösungsanisotropie informieren kann. Diese können wiederum verwendet werden, um den Benutzer darüber zu informieren, ob der für die Datenerfassung verwendete Neigungswinkel ausreichend hoch ist oder nicht. - Visualisieren Sie die rekonstruierte Karte und zeichnen Sie die Euler-Winkelverteilung auf, um die Ausdehnung der bevorzugten Partikelorientierungen zu messen.
ANMERKUNG: Die Euler-Winkelverteilungen können direkt in Fourier-Raum-Abtastverteilungen umgewandelt werden, um das potenzielle Ausmaß der Auflösungsanisotropie zu bestimmen. Eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) wurde entwickelt, um den Benutzer bei der Bewertung der Qualität einer Euler-Winkelverteilung und der Bestimmung eines optimalen Neigungswinkels30,31 zu unterstützen. Das Tool kann aus dem Github-Repository bezogen werden, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui. - Passen Sie bei Bedarf den Neigungswinkel der Bühne an, in dem die Daten erfasst werden, um die Auswirkungen der bevorzugten Ausrichtung zu überwinden. Der Winkel kann vergrößert werden, wenn die bevorzugte Orientierung ein Problem bleibt, wie die Karte und die Euler-Verteilung in 3.2 zeigen. Alternativ kann der Benutzer die Datenerfassung in Gruppen aufteilen und mit verschiedenen Neigungswinkeln aufzeichnen, z. B. 20°, 30° und 40°.
HINWEIS: Obwohl die meisten TEMs in der Lage sein müssen, den Tisch auf 70° zu neigen, liegen die üblichen Probentischneigungen (die wir verwendet haben) zwischen 20° und 40°.
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Representative Results
DPS bei 0,3 mg/ml wurde verwendet, um die Bildgebung bei 0°-, 30°- und 60°-Neigungen zu demonstrieren. Daten aus verschiedenen Neigungswinkeln wurden auf demselben Gitter in verschiedenen Gitterregionen gesammelt. Die CTF-Auflösung für höhere Neigungen ist tendenziell schlechter, wie es beim Vergleich der drei Datensätze in dieser Studie der Fall war. Abbildung 4 zeigt vergleichende repräsentative Bilder und 2D-Klassifizierungsmittelwerte. Obwohl die Proteinkonzentration über die verschiedenen Neigungswinkel hinweg unverändert bleibt, lässt ein höherer Neigungswinkel den abgebildeten Bereich in Bezug auf die Partikelkonzentration überfüllter erscheinen. Dies kann für die Datenverarbeitung problematisch sein, da Partikelüberlappungen 3D-Rekonstruktionen und Winkelverfeinerungen erschweren können. Die iterative 2D-Klassifizierung erzeugte routinemäßig einen sauberen Stapel von Partikeln mit den um 0° und 30° geneigten Datensätzen, während der 60°-Datensatz eine sorgfältige Reinigung der Partikelstapel erforderte, um sicherzustellen, dass die Klassendurchschnitte eine minimale Überlappung für benachbarte Partikel aufweisen. Der Klassendurchschnitt aus Abbildung 4C im roten Kasten stellt ein Beispiel für eine Partikelüberlappung dar. Obwohl die Neuzentrierung während der Klassifizierung dazu führen kann, dass das Signal benachbarter Partikel gemittelt wird, kann eine erhebliche Partikelüberlappung die Genauigkeit der Partikelausrichtungsparameter beeinträchtigen und zu Rekonstruktionen führen, die durch eine geringere Auflösung gekennzeichnet sind. Die beste Lösung, um Partikelüberlappungen zu vermeiden, besteht darin, Gitter mit optimaler Eisdicke und Partikelverteilung vorzusieben. Ein umfassender quantitativer Überblick über die Metriken zur Bewertung von Verbesserungen durch geneigte Datenerhebung wird an anderer Stelle32 beschrieben.
Abbildung 1: Überblick über Vorteile und Herausforderungen bei der geneigten Datenerfassung. Das obere Feld zeigt eine Nahaufnahme eines Gitterlochs. Die Gitterstäbe sind in Gold, Glaseis blau und makromolekulare Partikel rot. Pfeile zeigen die Richtung des Elektronenstrahls an. Das untere Feld stellt eine Sammlung von Löchern mit dem gleichen Farbschema wie im oberen Bereich dar. Der schwarze Stern stellt das Feinfokusziel vor der Belichtungsaufnahme bei hoher Vergrößerung dar. Der Neigungswinkel wird als "α" angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Workflow-Diagramm zum Vergleich der nicht geneigten und geneigten Datenerfassungsstrategie. Der schrittweise Vergleich der ungekippten und geneigten Datenerfassung zeigt den zusätzlichen Schritt der manuellen Schätzung der euzentrischen Höhe und der Neuzentrierung für jedes geneigte Quadrat (2 und 3 für die geneigte Datenerfassung). Der Rest des Workflows ist zwischen den beiden Strategien ähnlich. Dazu gehören die Auswahl eines geeigneten Quadrats für die Bildgebung (1 für die geneigte und nicht geneigte Datenerfassung), die Initiierung eines Warteschlangenschemas durch Auswahl eines Quadrats für die Bildgebung (als Simulation bezeichnet; 2 bzw. 4 für die ungekippte bzw. geneigte Datenerfassung), die Bereitstellung eines euzentrischen Höhenfokusziels und der Vergrößerungsziele für die Warteschlangenlochvergrößerung (3 und 5 für die ungeneigte und geneigte Datenerfassung), jeweils). und schließlich das Einreichen der Warteschlange ausgewählter Belichtungsziele mit hoher Vergrößerung (4 bzw. 6 für die Datenerfassung mit ungekippter bzw. geneigter Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Aufnahmen des Gitters bei quadratischer Vergrößerung mit unterschiedlichen Neigungswinkeln. Bilder, die in der Nähe und in der Ferne von der euzentrischen Z-Höhe aufgenommen wurden, werden auf den oberen bzw. unteren Feldern angezeigt. Die optische Achse des Strahls wird durch die Mitte der roten konzentrischen Ringe angezeigt. Der grüne Pfeil zeigt das interessierende Quadrat an. Es gibt ein unterbrochenes Raster-Feature neben dem interessierenden Quadrat als Referenz. Die Objektivblende wird entfernt, um die Betrachtung zu erleichtern. Maßstabsbalken = 20 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Lochbelichtungen und 2D-Klassenmittelwerte, die bei verschiedenen Neigungswinkeln erfasst wurden. Die Tafeln (A), (B) und (C) beziehen sich auf die Bildgebung, bei der der Probentisch um 0° nicht geneigt oder um 30° und 60° geneigt ist. 2D-Klassendurchschnitte, die von Überfüllung betroffen sind, werden im roten Kasten in (C) angezeigt. Maßstabsleiste = 100 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die bevorzugte Partikelorientierung, die durch die Anhaftung der Probe an der Luft-Wasser-Grenzfläche verursacht wird, ist einer der letzten großen Engpässe bei der routinemäßigen hochauflösenden Strukturbestimmung mit Kryo-EM SPA 4,5,6. Das hier vorgestellte Datenerhebungsschema bietet eine einfach zu implementierende Strategie zur Verbesserung der Orientierungsverteilung von Partikeln innerhalb eines Datensatzes. Wir weisen darauf hin, dass das Protokoll keine zusätzliche Ausrüstung oder Software erfordert und die Geschwindigkeit der Datenerfassung nicht beeinträchtigt. Die folgenden Überlegungen sind bei der Datenerfassung für geneigte Proben wichtig.
Erstens muss sich das abgebildete Quadrat in euzentrischer Höhe befinden, um optimal zielen zu können. Die euzentrische Höhe wird durch die Aufnahme von Neigungspaarbildern bei kleinen Neigungswinkeln (normalerweise 0,5°-2°) und die Identifizierung des Fokus basierend auf einer vordefinierten Beziehung zwischen Bildverschiebung und Unschärfe eingestellt. Wenn das anvisierte Quadrat eine große Anpassung der euzentrischen Höhe erfordert, führt dies zu einer signifikanten Bildverschiebung des quadratischen Bildes, so dass beim erneuten Kippen des Tisches das Sichtfeld durch die Objektivblende blockiert werden kann.
Zweitens wird das normalerweise kreisförmige Loch zunehmend länglich mit höheren Neigungen bei mittlerer Vergrößerung (Locherfassungsknoten-Vergrößerung). In Ermangelung genauer Bildverschiebungskalibrierungen ist es möglich, dass ein Teil der Folie zusammen mit Partikeln, die in Glaseis eingebettet sind, für eine bestimmte Belichtungsvergrößerung abgebildet wird. Daher müssen die Bildverschiebungskalibrierungen im Idealfall genau sein. Eine Alternative besteht darin, die Vergrößerung so zu erhöhen, dass der abgebildete Bereich relativ zur Lochgröße abnimmt. Bei höherer Vergrößerung hätten Fehler in der durch die Strahlneigung induzierten Bildverschiebung einen geringeren Einfluss auf die Fähigkeit eines Benutzers, zu einem Bereich mit Glaseis zu navigieren. Dies geht jedoch zu Lasten der Verringerung der Anzahl der Partikel in den resultierenden Schliffbildern, proportional zu einer Zunahme der Vergrößerung.
Drittens hat der Autofokus eine größere Wahrscheinlichkeit, bei der geneigten Datenerfassung aufgrund erhöhter strahlinduzierter Bewegung und erhöhter Probendicke zu versagen. Daher kann das Erreichen einer genauen Fokussierung gelegentlich einige Herausforderungen für die geneigte Datenerfassung darstellen, insbesondere wenn das Fokusziel die Goldfolie in der Mitte von vier Löchern ist, was bei der ungeneigten Datenerfassung üblich ist. Bei häufigen Fehlern bei der Fokusschätzung besteht eine Alternative darin, die Kante eines Lochs als Fokusziel festzulegen. Dies muss ein ausreichendes Signal für eine genaue Phasenkorrelation zwischen Strahlneigungs-induzierten Bildpaaren und der anschließenden Fokuseinstellung liefern. Unserer Erfahrung nach führt die Fokussierung auf den Rand eines Lochs selten zu einem Ausfall des Autofokus.
Und schließlich, wenn Bilder mit hoher Vergrößerung weit von der Rastermitte entfernt ausgewählt werden, kann der Fokusunterschied zwischen Zielbildern auf gegenüberliegenden Seiten der Neigungsachse signifikant sein. Die Größe dieser Differenz hängt vom Neigungswinkel und der Entfernung vom Fokuspunkt ab. Bei einem Neigungswinkel von 30° weisen beispielsweise zwei Ziele, die auf der Oberfläche des Gitters 6 μm voneinander entfernt sind und genau senkrecht zur Neigungsachse ausgewählt wurden, einen Unterschied von 3 μm in der Unschärfe zwischen ihnen auf (die Beziehung ist: Delta-Unschärfe = Sünde (Neigungswinkel) * (Abstand von der Neigungsachse)). Ziele, die entlang der Neigungsachse ausgewählt werden, haben die gleiche Unschärfe, während andere irgendwo dazwischen liegen. Wird die Neigungsachse bei der Kalibrierung in Leginon definiert, kompensiert die Software die Unschärfeänderung automatisch. Benutzer müssen sich jedoch darüber im Klaren sein, dass die Möglichkeit größerer Fokusgradienten bei der Bildgebung mit hoher Vergrößerung besteht. Große Fokusverläufe sollten die endgültige Rekonstruktion33 nur minimal beeinflussen, es kann jedoch erforderlich sein, während der Datenverarbeitung größere Boxgrößen zu verwenden, um Aliasing-Effekte zu vermeiden. Unter diesen Umständen kann die Verwendung eines engeren Unschärfebereichs während der Datenerfassung gerechtfertigt sein, und die Randomisierung der Unschärfe erfolgt natürlich durch Kippen der Bühne. Defokusanpassungen pro Partikel während der Datenverarbeitung können die Auflösung der endgültigen Rekonstruktionen verbessern. Da die genaue Modellierung von CTF-Anpassungen jedoch bei hohen Neigungswinkeln des Stadiums eine Herausforderung darstellen kann, muss darauf geachtet werden, die Qualität der Daten zu überwachen, und die CTF-Anpassungen während der Belichtungskuration. Im Allgemeinen führt eine suboptimale Eisdicke zu einer schlechteren Genauigkeit bei der Modellierung von CTF-Schätzanpassungen. Daher muss darauf geachtet werden, dass in Bereichen, in denen das Eis dünn ist, abgebildet wird, vorausgesetzt, dass die Partikelverteilung in diesen Bereichen ausreichend gut ist.
Eine verbesserte und gleichmäßigere Orientierungsverteilung führt zu einer entsprechenden Verbesserung der Richtungsauflösung der rekonstruierten Kryo-EM-Karten. Darüber hinaus verbessert eine gleichmäßigere Orientierungsverteilung den Abtastkompensationsfaktor, der in direktem Zusammenhang mit der globalen Auflösung30,31 steht. Daher sollte die kollektive Verbesserung der Orientierungsverteilung die Genauigkeit der atomaren Modellierung und Verfeinerung verbessern 9,30,31. Dies wäre im Prinzip ein starkes Argument für die routinemäßige Implementierung der geneigten Datenerhebung. Es gibt jedoch einige Vorbehalte, die der Benutzer beachten muss. Erstens können sich der erhöhte Fokusgradient und die erhöhte Eisdicke auf die globale Gesamtauflösung auswirken, vermutlich aufgrund einer Kombination aus erhöhtem Hintergrundrauschen und erhöhter strahlinduzierter Bewegung, kombiniert mit anderen indirekten Problemen, die sich daraus ergeben17. Es wird erwartet, dass dieser Effekt in Fällen, in denen das Eis von Natur aus dicker ist, stärker ausgeprägt ist. Da die meisten Stichproben jedoch unter einer gewissen Vorzugsorientierung leiden, was wiederum zu einer Ungleichmäßigkeit der Stichproben führen kann, kann eine geneigte Datenerhebung im Allgemeinen von Vorteil sein, solange die nachteiligen Auswirkungen minimiert oder gemildert werden. Zweitens kann es erforderlich sein, den Tisch bei einigen Proben, die sich durch eine starke Vorzugsorientierung auszeichnen, um bis zu 60° zu neigen. Anekdotische unveröffentlichte Beweise aus unserer Arbeit und den Berichten von Kollegen deuten darauf hin, dass selbst ~40°-Neigungen nicht ausreichen, um die Auflösungsanisotropie für einige Proben zu überwinden. Es werden Anstrengungen unternommen, um einen optimalen Neigungswinkel für eine Reihe von Verteilungen zu identifizieren, basierend auf den Ideen von Baldwin et al.31. Schließlich ist zu beachten, dass im Prinzip eine Rekonstruktion aus einer Probe, die durch eine vollkommen pathologische einzige bevorzugte Orientierung gekennzeichnet ist, auch dann noch einen fehlenden Kegel von 30° aufweisen würde, wenn die Daten in einem Neigungswinkel von 60° erfasst werden. In simulierten Experimenten ist es unwahrscheinlich, dass ein um 30° fehlender Kegel die experimentellen Interpretationen stark beeinflusst. Eine Neigung von 60° ist wahrscheinlich selbst für die pathologisch am meisten bevorzugten Proben ausreichend. In Fällen, in denen der Tisch jedoch um bis zu 60° geneigt werden muss, muss die Partikelkonzentration im Sichtfeld sorgfältig optimiert werden, da die Partikelüberlappung die Datenverarbeitung erschwert. Es ist nicht möglich, auf Standard-TEM auf mehr als 60° (oder 70° auf ausgewählten Mikroskoptischen) zu neigen, da das Probentischdesign eingeschränkt ist. In solchen Fällen kann eine zusätzliche Optimierung mit Additiven und Probenbiochemie erforderlich sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Bill Anderson, Charles Bowman und Jean-Christophe Ducom (TSRI) für ihre Hilfe bei der Mikroskopie, den Leginon-Installationen und der Datenübertragungsinfrastruktur. Wir danken auch Gordon Louie (Salk Institute) und Yong Zi Tan (National University of Singapore) für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) für die Bereitstellung des Plasmids für die Expression von DPS. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der US National Institutes of Health (U54AI150472, U54 AI170855 und R01AI136680 an DL), der National Science Foundation (NSF MCB-2048095 an DL), der Hearst Foundations (an DL) und des Arthur and Julie Woodrow Chair (an J. P. N.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
References
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