Summary
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite taraması için hayvanların kullanılmasına bir alternatif sunar. Preklinik toksisite taramasında hiPSC-CM'lerin yaygın olarak benimsenmesinin bir sınırlaması, hücrelerin olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotipidir. Burada hiPSC-CM'lerin sağlam ve hızlı olgunlaşması için protokoller sunulmaktadır.
Abstract
İnsan kaynaklı kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite testi için hayvanlara ve hayvan hücrelerine olan bağımlılığı değiştirmek ve azaltmak için kullanılır. İki boyutlu tek katmanlı formatlarda, hiPSC-CM'ler, optimal bir hücre dışı matris (ECM) üzerinde kültürlendiğinde yetişkin insan kalp kası hücrelerinin yapısını ve işlevini özetler. İnsan perinatal kök hücre kaynaklı ECM (olgunlaşmaya neden olan hücre dışı matriks-MECM), kaplamadan sonraki 7 gün içinde hiPSC-CM yapısını, işlevini ve metabolik durumunu olgunlaştırır.
Olgun hiPSC-CM monokatmanları da klinik olarak ilgili ilaçlara beklendiği gibi yanıt verir ve aritmilere ve kardiyotoksisiteye neden olma riski vardır. HiPSC-CM monokatmanlarının olgunlaşması, şimdiye kadar düzenleyici bilim ve güvenlik taraması için bu değerli hücrelerin yaygın olarak benimsenmesinin önünde bir engeldi. Bu makalede, hiPSC-CM elektrofizyolojik ve kontraktil fonksiyonun kaplanması, olgunlaşması ve yüksek verimli, fonksiyonel fenotiplemesi için doğrulanmış yöntemler sunulmaktadır. Bu yöntemler, ticari olarak temin edilebilen saflaştırılmış kardiyomiyositlerin yanı sıra, yüksek verimli, odaya özgü farklılaşma protokolleri kullanılarak şirket içinde üretilen kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler için de geçerlidir.
Yüksek verimli elektrofizyolojik fonksiyon, voltaja duyarlı boyalar (VSD'ler; emisyon: 488 nm), kalsiyuma duyarlı floroforlar (CSF'ler) veya genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri (GCaMP6) kullanılarak ölçülür. Her fonksiyonel parametrenin optik kayıtları için yüksek verimli bir optik haritalama cihazı kullanılır ve elektrofizyolojik veri analizi için özel özel bir yazılım kullanılır. MECM protokolleri, pozitif inotrop (izoprenalin) ve insan Ether-a-go-go-ilişkili gen (hERG) kanalına özgü blokerler kullanılarak ilaç taraması için uygulanır. Bu kaynaklar, diğer araştırmacıların yüksek verimli, klinik öncesi kardiyotoksisite taraması, kardiyak ilaç etkinlik testi ve kardiyovasküler araştırmalar için olgun hiPSC-CM'leri başarıyla kullanmalarını sağlayacaktır.
Introduction
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler) uluslararası ölçekte doğrulanmıştır ve in vitro kardiyotoksisite taraması için mevcuttur1. Son derece saf hiPSC-CM'ler neredeyse sınırsız sayıda üretilebilir, kriyoprezerve edilebilir ve çözülebilir. Yeniden kaplama üzerine, aynı zamanda yeniden canlanırlar ve insan kalbini anımsatan bir ritimle büzülmeye başlarlar 2,3. Dikkat çekici bir şekilde, bireysel hiPSC-CM'ler birbirleriyle çiftleşir ve tek bir doku olarak atan fonksiyonel sinsiti oluşturur. Günümüzde, hiPSC'ler rutin olarak hasta kan örneklerinden türetilmektedir, bu nedenle in vitro hiPSC-CM kardiyotoksisite tarama testleri 4,5 kullanılarak herhangi bir kişi temsil edilebilir. Bu, çeşitli popülasyonlardan önemli temsillerle "Bir Tabakta Klinik Çalışmalar" gerçekleştirme fırsatı yaratır6.
Mevcut hayvan ve hayvan hücresi kardiyotoksisitesi tarama yaklaşımlarına göre kritik bir avantaj, hiPSC-CM'lerin tüm insan genomunu kullanması ve insan kalbine genetik benzerliklere sahip bir in vitro sistem sunmasıdır. Bu özellikle farmakogenomik ve kişiselleştirilmiş tıp için caziptir - ilaç ve diğer tedavi geliştirme için hiPSC-CM'lerin kullanımının daha doğru, kesin ve güvenli ilaç reçeteleri sağlayacağı tahmin edilmektedir. Gerçekten de, iki boyutlu (2D) hiPSC-CM tek katmanlı testlerin, aritmilere neden olduğu bilinen bir klinik olarak kullanılan ilaç paneli kullanılarak ilaç kardiyotoksisitesinin öngörücü olduğu kanıtlanmıştır 1,7,8,9. HiPSC-CM'lerin geniş potansiyeline ve ilaç geliştirmeyi kolaylaştırma ve daha ucuz hale getirme vaadine rağmen, bu yeni tahlilleri kullanma konusunda isteksizlik olmuştur10,11,12.
Şimdiye kadar, hiPSC-CM tarama testlerinin yaygın olarak benimsenmesi ve kabul edilmesinin önemli bir sınırlaması, olgunlaşmamış, fetal benzeri görünümlerinin yanı sıra işlevleridir. HiPSC-CM olgunlaşmasının kritik konusu ad nauseum13,14,15,16 bilimsel literatüründe gözden geçirilmiş ve tartışılmıştır. Benzer şekilde, 2D monokatmanlarda hücre dışı matriks (ECM) manipülasyonları ve 3D mühendislik kalp dokularının (EHT'ler) geliştirilmesi de dahil olmak üzere hiPSC-CM olgunlaşmasını teşvik etmek için birçok yaklaşım kullanılmıştır17,18. Şu anda, 3D EHT'lerin kullanımının 2D tek katmanlı yaklaşımlara göre üstün olgunlaşma sağlayacağına dair yaygın bir inanç var. Bununla birlikte, 2D monolayer'lar, 3D EHT'lere kıyasla daha yüksek bir hücre kullanımı verimliliği ve kaplamada daha fazla başarı sağlar; 3D EHT'ler daha fazla sayıda hücre kullanır ve genellikle sonuçları karıştırabilecek diğer hücre tiplerinin dahil edilmesini gerektirir. Bu nedenle, bu makalede, elektriksel ve mekanik olarak bağlanmış hücrelerin 2D tek katmanları olarak kültürlenmiş hiPSC-CM'leri olgunlaştırmak için basit bir yöntem kullanmaya odaklanılmıştır.
Gelişmiş hiPSC-CM olgunlaşması, bir ECM kullanılarak 2D tek katmanlarda elde edilebilir. HiPSC-CM'lerin 2D monokatmanları, bir Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu hücresi (fare ECM) tarafından salgılanan bazal membran matrisi ile kaplanmış yumuşak, esnek bir polidimetilsiloksan örtü kayması kullanılarak olgunlaştırılabilir. 2016 yılında raporlar, bu yumuşak ECM koşulunda kültürlenen hiPSC-CM'lerin işlevsel olarak olgunlaştığını ve yetişkin kalp değerlerine (~ 50 cm / s) yakın aksiyon potansiyeli iletim hızları gösterdiğini göstermiştir18. Ayrıca, bu olgun hiPSC-CM'ler, hiperpolarize dinlenme zarı potansiyeli ve Kir2.1'in ekspresyonu da dahil olmak üzere yetişkin kalbini anımsatan birçok elektrofizyolojik özellik göstermiştir. Daha yakın zamanlarda, raporlar, 2D hiPSC-CM'lerin yapısal olgunlaşmasını destekleyen insan perinatal kök hücre kaynaklı bir ECM kaplaması tanımladı19. Burada, yüksek verimli elektrofizyolojik ekranlarda kullanılmak üzere yapısal olarak olgun 2D hiPSC-CM tek katmanlara kullanımı kolay yöntemler sunulmaktadır. Ayrıca, voltaja duyarlı boyalar (VSD'ler) ve kalsiyuma duyarlı problar ve proteinler kullanarak 2D hiPSC-CM tek katmanlı elektrofizyolojik fonksiyonun otomatik olarak elde edilmesi ve analizi için optik bir haritalama cihazının doğrulanmasını sağlıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde hiPSC kullanımı Michigan Üniversitesi HPSCRO Komitesi (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee) tarafından onaylanmıştır. Malzeme ve ekipman listesi için Malzeme Tablosu'na bakın. Medya ve kompozisyonları için Tablo 1'e bakınız.
1. Olgunlaşmaya neden olan hücre dışı matris (MECM) üzerinde olgunlaşma için ticari olarak temin edilebilen kriyokorunmuş hiPSC-CM'lerin çözülmesi ve kaplanması
- Tüm reaktifleri oda sıcaklığına ısıtın ve MECM plakalarını Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) veya kalsiyum ve magnezyum içeren fosfat tamponlu salin (PBS) ile kardiyomiyosit kaplamadan önce 1 saat boyunca yeniden sulandırın (96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 200 μL tampon).
- MECM plakalarını kardiyomiyosit kaplamadan önce 1 saat boyunca HBSS veya kalsiyum ve magnezyum içeren HBSS veya PBS ile 2 kez yıkayın (96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 200 μL tampon) ve kuyucukları nemli tutun.
- 37 °C su banyosu hazırlayın.
- Kardiyomiyosit tüplerini sıvı azot tankından çıkarın, tüpleri kuru buza aktarın ve basıncı serbest bırakmak için tüp kapaklarını hafifçe açın.
NOT: Tüplerdeki basıncın serbest bırakılması son derece önemlidir! Tüplerin içinde çok fazla basınç oluşursa, patlayabilirler. - Tüp kapaklarını tekrar kapatın ve 4 dakika boyunca çözülmesi için su banyosuna yerleştirin.
NOT: Kısmi çözülme nedeniyle hücre hasarını önlemek için tamamen çözülmelerine izin verin. - Hücreler çözüldükten sonra, açmadan önce tüplere% 70 etanol püskürtün. Hücreleri 1 mL pipetle 15 mL konik tüplere aktarın. Hücrelerin ozmolaritedeki değişikliklere uyum sağlamasına izin vermek için her 1 mL eklendiğinde tüpü çalkalayarak yavaşça 8 mL kaplama ortamı damlatın.
- Kriyoviali, 1 mL cam pipet kullanarak 1 mL kaplama ortamı ile yıkayın. Ardından, yıkamayı yavaşça 15 mL konik tüpe damlatın.
- Tüpleri 5 dakika boyunca ~ 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve peletleri 1 mL kaplama ortamında yeniden askıya alın. Bir aliquot çıkarın ve bir hemositometre ile canlı hücre sayımı yapın. 7.5 × 105 hücre/mL elde etmek için ek kaplama ortamı ekleyin.
NOT: 96 kuyucuğun hazırlanması için yaklaşık 10 mL hücre süspansiyonu gereklidir. - Çok kanallı pipet kullanarak MECM kaplı 96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 100 μL hücre süspansiyonu dağıtın.
NOT: Kaplama sırasında hücre çökelmesinden kaçındığınızdan ve tüm kuyucuklarda eşit hücre yoğunluğu elde ettiğinizden emin olun. - Ortamı bakım ortamına (200 μL / kuyu) değiştirmeden önce hücreleri 37 ° C,% 5 CO 2'de2 gün boyunca inkübe edin. Çözme işleminden sonraki 5. günde bakım ortamını değiştirin. EP tahlillerini daha önce 8,9'da açıklandığı gibi 7. günde veya daha sonra gerçekleştirin. Hücre kültürünü genişletmeyi seçerken ortamı her geçen gün değiştirin.
2. hiPSC kardiyak yönelimli farklılaşma ve hiPSC-CM saflaştırma
- Ticari olarak temin edilebilen 1x etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi, kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS (HBSS--) ve bir Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücresi (fare ECM) tarafından oda sıcaklığına salgılanan çözünür bazal membran matrisi ile kaplanmış 6 delikli plakalar.
- Farklılaşmış kolonileri faz-kontrast mikroskobu ile işaretleyin ve aspirat / ablate edin. Her bir kuyucuğu 1 mL HBSS ile yıkayın--. >10 farklılaşma noktası içeren kuyucuklarda iki yıkama yapın.
- HBSS'yi aspire edin - ve her bir kuyucuğa 1 mL EDTA çözeltisi ekleyin. Plakaları 37 ° C'de 5 dakikaya kadar inkübe edin. 3 dakika sonra plakaları kontrol edin ve yarı saydam beyaz, görünür kolonileri arayın.
- EDTA çözeltisini aspire edin ve tek bir kuyucuğa 1 mL ekleyin. Tüm kök hücreleri kuyudan ayırmak için 10 mL'lik bir cam pipet kullanarak süspansiyonu tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri 2 mL hiPSC ortamı ile yerinden çıkarın ve hücre süspansiyonunu bir toplama tüpüne aktarın. Aspirasyonu ve yerinden çıkarmayı sonraki kuyucuklarla tekrarlayın.
NOT: Cam pipetin ucuyla kolonileri kaldırmak için sert bir şekilde yerinden çıkarın. - Kök hücreleri sayın ve ses seviyesini plaka 8.0 × 105 hücre / kuyuya ayarlayın. Kök hücreler %90 birleşime ulaşana kadar hücreleri hiPSC ortamında (2 mL/kuyu) kültürleyin (bu sefer bundan böyle D0 olarak anılacaktır).
- 4 μM CHIR99021 ile desteklenmiş 2 mL bazal farklılaşma ortamı hazırlayın.
- D0'da, 6 delikli bir kök hücre plakasının her bir kuyucuğunu, kuyu başına 1 mL HBSS ile yıkayın. HBSS'yi 4 μM CHIR99021 ile desteklenmiş bazal farklılaşma ortamı ile değiştirin.
- D1'de hiçbir şey yapmayın.
- D2'de, 4 μM IWP4 ile desteklenmiş bazal farklılaşma ortamı hazırlayın.
- Ortamı, kuyu başına 2 mL IWP4 takviyeli bazal farklılaşma ortamı ile değiştirin.
- D3'te, ventriküler spesifik bir farklılaşma için hiçbir şey yapmayın. Atriyal spesifik bir farklılaşma için, ortamı aspire edin ve kuyu başına 4 μM IWP4 ve 1 μM retinoik asit (RA) çözeltisi ile desteklenmiş 2 mL bazal ortam ekleyin.
- D4'te, ortamı aspire edin ve ventriküler farklılaşma için kuyucuk başına 2 mL bazal ortam ekleyin. Atriyal bir farklılaşma için, ortamı aspire edin ve kuyucuk başına 1 μM RA çözeltisi ile desteklenmiş 2 mL bazal ortam ekleyin.
- D5'te hiçbir şey yapmayın.
- D6'da, ortamı aspire edin ve kuyucuk başına 2 mL bazal ortam ekleyin (hem atriyal hem de ventriküler farklılaşma için).
- D7'de hiçbir şey yapmayın.
- D8'de, ortamı aspire edin ve 2 mL kardiyomiyosit bakım ortamı ekleyin. Hücre ayrılana kadar ortamı her gün değiştirin veya kronik bir ilaca maruz kalma planını izleyin.
3. MACS ile hiPSC-CM saflaştırma (manyetikle aktive edilmiş hücre sıralama)
- Hücre kültürü ortamını aspire edin ve her bir kuyucuğu 1 mL HBSS ile yıkayın--. 1 mL% 0.25 tripsin / EDTA ekleyerek ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2'de inkübe ederek hücreleri ayırın. Tripsin / EDTA'yı inaktive etmek için her bir kuyucuktaki hücreleri 2 mL kaplama ortamı ile yeniden askıya alın ve tekilleştirin.
- Altı kuyucuktan hücreleri 70 μm süzgeçli 50 mL'lik bir konik tüpe toplayın. Ardından, süzgeci 3 mL kaplama ortamı ile yıkayın. Hücreleri sayın.
- Süspansiyonu 5 dakika boyunca ~ 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri 20 mL buz gibi soğuk MACS ayırma tamponu ile yıkayın. Ardından, 5 dakika boyunca ~ 300 × g'da tekrar santrifüjleyin.
- Pelet, 5 × 106 hücre başına 80 μL soğuk MACS ayırma tamponunda tekrar askıya alın. 5 × 106 hücre başına 20 μL soğuk kardiyomiyosit olmayan tükenme kokteyli (insan) ekleyin. Hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- 5 × 106 hücre başına 4 mL soğuk MACS ayırma tamponu ekleyerek numuneyi yıkayın. Numuneyi 5 dakika boyunca ~ 300 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı aspire edin.
- Pelet, 5 × 106 hücre başına 80 μL soğuk MACS ayırma tamponunda tekrar askıya alın. 5 × 106 hücre başına 20 μL soğuk anti-biyotin mikroboncuk ekleyin. Hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
- Numuneler inkübe edilirken, pozitif tükenme sütunlarını (30 μm ön ayırma filtreleriyle donatılmış) MACS ayırıcısına yerleştirin ve etiketli 15 mL toplama tüplerini sütunların altına yerleştirin. Her 5 × 106 hücre için bir sütun gereklidir.
- Her sütunu 3 mL soğuk MACS ayırma arabelleği ile astarlayın. Antikorla muamele edilmiş hücre süspansiyonunu 5 × 106 hücre başına 2 mL MACS ayırma tamponu ile karıştırın ve sütuna ekleyin.
NOT: Santrifüj yapmayın! Bu adımda santrifüjlemenin kardiyomiyosit verimi üzerinde zararlı etkileri vardır. - Her sütuna 2 mL MACS ayırma arabelleği ekleyin ve 12 mL akış kardiyomiyosit süspansiyonu toplanana kadar akışı toplayın.
NOT: Kolonların tamamen kurumasına asla izin vermeyin. - Kardiyomiyositleri 5 dakika boyunca ~ 300 × g'da santrifüj edin, süpernatanı atın ve kardiyomiyositleri 1 mL kaplama ortamında askıya alın.
- Konsantrasyonu belirlemek için hücreleri sayın, hacmi istenen tohumlama yoğunluğuna ayarlayın ve hücreleri plakalayın. Saflaştırılmış kardiyomiyositleri, yukarıda 1.9-1.11 (7.5 × 105 hücre/kuyu) adımlarında açıklandığı gibi, MECM 96 kuyucuklu plakalar üzerine plakalayın.
4. Voltaja duyarlı boyalar (VSD'ler) ve kalsiyuma duyarlı floroforlar (CSF'ler) kullanarak optik haritalama
- HBSS'de mL HBSS başına 1 μL VSD boyası ve mL HBSS başına 10 μL yükleme adjuvanı ekleyerek kalsiyum ve magnezyum ile uygun miktarda VSD hazırlayın.
NOT: Tipik olarak, 96 delikli bir plaka 10 mL VSD çözeltisi gerektirir. - Alternatif olarak, HBSS'yi 5 μM BOS ile desteklenmiş kalsiyum ve magnezyum ile hazırlayın. Kardiyomiyosit bakım ortamını aspire edin ve 96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 100 μL VSD veya BOS ile değiştirin. Hücreleri hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Boyaları çıkarın ve tahlil ortamı veya HBSS ile değiştirin. Yüksek verimli optik haritalama cihazı ile temel veri optik haritalamasının elde edilmesi için 37 °C'de dengeleyin.
- Hücreleri akut maruz kalma testi için ilaçlarla tedavi edin veya kronik olarak ilgilenilen ilaçlara maruz kalan hücreleri haritalayın.
- 96 kuyucuklu plakalarda kardiyotoksisite testi için, doz başına en az altı kuyucuklu bir bileşiğin dört dozunu kullanın. Klinik etkili terapötik plazma konsantrasyonunun bir dozu da dahil olmak üzere, etkili terapötik plazma konsantrasyonunun altından üstüne kadar değişen dozları kullanın.
- İlaçları dimetil sülfoksit içinde seyreltin, -20 ° C'de stok çözeltileri olarak saklayın ve daha sonra HBSS'de istenen konsantrasyonlara seyreltin.
- İlaç uygulamasından önce, bölüm 5'te açıklandığı gibi, temel elektrofizyoloji ölçümlerini yapın. İlaçlar uygulandıktan sonra, kronik çalışmalar için en az 30 dakika sonra elektrofizyoloji kayıtları yapın. Optik haritalama, veri toplama ve analiz yordamları için aşağıdaki bölümlere bakın.
5. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) kullanarak optik haritalama
- Yukarıda açıklandığı gibi, olgun hiPSC-CM'ler yapmak için MECM kaplı 96 delikli plakalar kullanarak, ticari olarak temin edilebilen veya MACS saflaştırılmış hiPSC-CM'ler. Akıcı monokatmanlar oluşturmak için, her 96 delikli plakanın kuyucuğu başına 7.5 × 104 CM plaka. Kaplama ortamı kullanın.
- Kaplama ortamında 48 saat sonra, kardiyomiyosit bakım ortamına geçin.
- Çözülme ve yeniden kaplanmadan sonraki 4. günde, çok sayıda enfeksiyonda (MOI) = 5 hücrelere GCaMP6m (AdGCaMP6m) eksprese etmek için rekombinant adenovirüs ekleyin. CM tahlil ortamını kullanarak virüsü ekleyin.
NOT: Burada, GCaMP6m kullanan deneyler, ticari bir satıcıdan iCell2 kardiyomiyositlerinde gerçekleştirilmiştir. - 5. günde, adGCaMP6m ortamını çıkarın ve taze RPMI + B27 (kardiyomiyosit bakım ortamı) ile değiştirin.
- 7. günde, spontan kasılmaları ve karşılık gelen kalsiyum geçicilerini görselleştirmek için mikroskopi veya optik haritalama görüntüleyici kullanarak CM'leri gözlemleyin.
- 7. günde veya daha sonra, ilaç taraması için, GCaMP6m'yi ifade eden olgun hiPSC-CM monokatmanlarının 96 kuyucuklu plakalarını, temel veri toplama için inkübatörden optik haritalama görüntüleyicisine doğrudan aktarın.
- Elektrofizyoloji verilerinin toplanmasını takiben, CM'lerin plakalarını, sonraki bir zaman noktasında ölçümler için doku kültürü inkübatörüne geri döndürün.
- Temel kayıtları takiben, her ilacın en az dört dozunu ve doz başına en az altı kuyucuğu kullanarak ilaçları uygulayın. Veri toplamadan önce hücrelerdeki ilaçları en az 30 dakika boyunca dengeleyin. Veri elde etmeden önce ve veri toplama sırasında kuyu sıcaklığını ~ 37 ° C'ye ısıtın.
- Tüm plakanın temel kayıtlarını takiben, sağlam ilaç yanıt verilerini sağlamak için her kuyucuğa izoproterenol (500 nM) ekleyin. İzoproterenolün tek katmanlı atım hızı, kasılma genliği (kalsiyum geçici genliği) ve kalsiyum geçici süresi (bkz. Şekil 6) üzerindeki etkilerini, bölüm 5'te açıklandığı gibi ölçün.
6. Optik haritalama verilerinin ve analizinin elde edilmesi
- Optik haritalama aygıtı kamerasının, aydınlatıcının ve plaka ısıtıcısının açık olduğundan emin olun.
- Edinme yazılımını açın ve dosya kaydetme konumunu belirleyin.
- Ön çekmeceyi açın ve plakayı plaka ısıtıcısının üzerine yerleştirin.
- Koyu Çerçeve düğmesine tıklayarak koyu bir çerçeve elde edin.
- Süre (10-30 sn) ve Kare Çekim Hızı'nı (ör. 100 fps; daha yüksek zamansal çözünürlük için 250 fps) seçin ve Almayı Başlat'ı tıklatın.
- Analiz yazılımını açın ve İçe Aktar/Filtre Uygula sekmesinde, tek bir dosyaya gözat'ı veya bir plakayı yeniden oluşturmak için Birden Çok Döşeme'yi seçin.
- Parametre Modu'nu (APD veya CaTD) seçin, Piksel Başına Uzaklık girin ve kuyucukların görüntüdeki konumunu belirlemek için Kuyu Sihirbazı'nı kullanın. Sonraki sekmeye geçmek için Kaydet'i İşleme'yi tıklatın.
- YG'ler (ilgi alanları) sekmesini açın ve YG'leri Manuel, Otomatik veya YG'leri Hiç Kullanma'yı çizmeyi seçin, bu da analiz için tüm kuyuyu dikkate alır. YG'ler seçildikten sonra, bir sonraki adıma geçmek için İşlem/Kaydet düğmesini tıklatın. YG'leri görselleştirmek için Kutuları Gizle ve Yalnızca Filtrelenmiş Olanları Göster kutularını işaretleyin.
- Analiz sekmesini açın ve ekranın sağ üst tarafında, Otomatik Vuruş Algılamanın Doğruluğunu onaylamak için her bir Kuyu veya YG'yi seçin. Add Beat/Save Beats tuşuna basarak ya da bir Individual Beat seçip klavyede Delete tuşuna basarak izlere Beats ekleyin veya İzlerden Beat'leri kaldırın.
- İsteğe bağlı olarak, plaka için seçilen parametrelerin ısı haritalarını oluşturmak için Ortalama Isı Haritaları özelliğini kullanın.
- Her bir kuyu veya YG için verileri görselleştirmek üzere Analiz sekmesindeki Zaman-Uzay Grafiği düğmesine tıklayın. Vuruş algılamanın doğru olduğundan emin olduktan sonra, Dışa Aktar sekmesine ilerleyin ve Dosya Biçimi'ni seçin. Dışa Aktar'a basın ve verilerin verileceği klasör oluşturun. Veri dosyalarını açmaya devam edin ve seçilen istatistiksel analiz rutinini çalıştırın.
NOT: Tüm parametreler tek bir dosyada verildiği için .xlxs dosyaları tercih edilir; Diğer biçimler (.csv veya .tsv) parametre başına bir dosya oluşturur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
faz kontrastı ve immünofloresan konfokal görüntüleme ile karakterize hiPSC-CM matürasyonu
MECM kaplamalı 96 delikli plakalar kullanılarak ticari olarak temin edilebilen hiPSC-CM'lerin ECM aracılı olgunlaşması için zaman çizelgesi Şekil 1A'da sunulmuştur. Bu veriler, laboratuvara kriyokorunmuş hücre şişeleri olarak gelen ticari olarak temin edilebilen kardiyomiyositler kullanılarak toplanır. Her flakon >5 × 106 canlı kardiyomiyosit içerir. Hücreler ~% 98 saftır ve kalite kontrol için titizlikle test edilmiştir (her şişe ile analiz sertifikası verilir). Çok sayıda CM, CM'lerin aynı hücre grubunu kullanarak farklı ECM kombinasyonlarına çözülmesini ve kaplanmasını sağlar. Şekil 1'de, hiPSC-CM'ler fare ECM veya MECM kaplı plakalar üzerine kaplanmıştır. MECM üzerine kaplanan hiPSC-CM'ler olgunlaşır ve fare ECM'sinde kaplanan aynı hiPSC-CM grubundan yapısal olarak farklı hale gelir. Yani, olgun hücreler çubuk şeklinde olurken, olgunlaşmamış hücreler dairesel bir şekli korur. Bu, faz kontrast görüntülemede ve kardiyak miyofilamentlerin boyanmasında görülebilir (Şekil 1B; troponin I [TnI], kırmızı). HiPSC-CM'lerin yapısal olgunlaşmasının daha kapsamlı bir doğrulaması Şekil 2'de sunulmuştur. α-aktinin antikoru ile boyanmış CM'lerin geniş bir görüş alanı (20x objektif), her ECM koşulunda kültürlenen hücrelerin tipik şeklini gösterir. α-aktin, kardiyak miyofilamentlerde düzenli aralıklarla düzenlenmiş kritik bir yapısal proteindir. Şekil 1'deki TnI boyaması ile tutarlı olarak, α-aktinin boyaması, MECM üzerinde kültürlenen hiPSC-CM'lerin olgunlaşmasını da gösterir. Çubuk şeklinde olgun bir fenotipi teşvik etmenin yanı sıra, MECM ayrıca daha büyük sarkomer organizasyonunu da indükler (60x görüntüler). Mitokondriyal içerik ve aktivite, fare ECM'sinde kültürlenen hücreler ile MECM arasında da farklıdır (Şekil 2B). Fetal-immatür hiPSC-CM mitokondriyal içeriği perinükleer boşlukla sınırlıdır ve sitozolde çok az mitokondri bulunur. Buna karşılık, olgun hiPSC-CM'lerin mitokondriyal içeriği hücre boyunca dağıtılır. Mitokondriyal değerlendirme, yerleşik bir protokol19 kullanır.
hiPSC kardiyak yönelimli diferansiyasyon ve kalp kamarası spesifikasyonu
Burada saflaştırılmış, odaya özgü hiPSC-CM'lerin şirket içi üretimi ve olgunlaşması için bir protokol verilmiştir (Şekil 3A). Bu, daha önce yayınlanmış bir rapor20'ye dayanmaktadır. Ticari olarak temin edilebilen, mıknatısla aktive edilen hücre sıralama (MACS) kiti kullanılarak hiPSC-CM saflaştırma için ayrıntılı prosedürler sunulmaktadır. Yakın zamanda MACS saflaştırmanın kullanımını doğruladık ve metabolik bazlı hiPSC-CM saflaştırmaya kıyasla MACS kullanmanın faydalarını gösterdik; tipik olarak, %95'in üzerinde hiPSC-CM saflığı21 beklenir. İlk CM içeriği% < ise, MACS saflaştırmasının sadece ~% 85'e ulaşabileceğini belirtmek önemlidir. Bu durumlarda, CM olmayanların tükenmesini takiben CM zenginleştirmesi gerekli olabilir. Farklılaşmadan kaynaklanan ilk CM içeriği% >50 ise, MACS kitini kullanarak hücre popülasyonundan CM olmayanların tükenmesi% >95 saflık elde edebilir; Bu durumda, CM'lerin daha da zenginleştirilmesi veya pozitif seçimi gerekli değildir. Odaya özgü hiPSC-CM'ler, yukarıda özetlendiği ve Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterildiği gibi MECM kaplı 96 delikli plakalar kullanılarak da olgunlaştırılabilir. Atriyal spesifik hücrelerin (hiPSC-ACM), ventriküler spesifik hücrelerden (hiPSC-VCM) anlamlı derecede daha hızlı spontan atım hızına ve daha kısa aksiyon potansiyeli süresi 80'e (APD80) sahip olması beklenmelidir. Bunlar, VSD'ler ve optik haritalama sistemi kullanılarak kaydedilen aksiyon potansiyelleri için tipik elektrofizyolojik verilerdir (Şekil 3B-D).
Yüksek verimli kardiyak elektrofizyolojik optik haritalama
Bilimsel titizlik, yüksek verimli bir şekilde gerçekleştirilebiliyorsa, herhangi bir tahlil için önemli ölçüde artırılır. Kardiyotoksisite tarama verileri Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6 ve Şekil 7'de sunulmuş olup, 96 delikli bir plakada olgun hiPSC-CM monokatmanları kullanılarak yüksek verimli elektrofizyolojik taramayı göstermektedir. APD80 gibi parametreler için tüm plaka ısı haritaları (Şekil 4A), bir plaka içindeki belirli bir parametrenin kuyudan kuyuya tekrarlanabilirliğini ortaya koymaktadır. Ayrıca, tüm plakalı ısı haritaları, veri kümesindeki aykırı değerlerin hızlı bir şekilde incelenmesini sağlar. Örneğin, Şekil 4A'da sunulan plakanın E4 kuyusunda, bu kuyucuğun sarı görünen kuyu ile gösterilen çok daha büyük bir APD80 değerine sahip olduğu, diğer kuyuların ise çivit mavisi olduğu açıktır. Olgun 2D hiPSC-CM monokatmanlarının tipik aksiyon potansiyelleri (Şekil 4B), kültürde izole edilen ve test edilen yetişkin kardiyomiyositlerin aksiyon potansiyeli morfolojisini hatırlatmaktadır. Ayrıca, tipik bir aksiyon potansiyeli spontan ritmi Şekil 4C'de gösterilmiştir. Şekil 4C'deki veriler, A satırının, 1-12 sütunlarının bir zaman-uzay grafiğidir. Şekil 4A'daki plaka haritasındaki beyaz çizgi bunu göstermektedir. Her bir kuyucuktaki zaman içindeki her parlak floresan flaş, tek bir spontan aktivasyonu temsil eder. Şekil 5 ve Şekil 6, hücre içi kalsiyum geçicilerini ölçmek için GCaMP6m genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesinin (GECI) kullanılmasının faydasını göstermektedir; Şekil 6 ayrıca klasik kardiyak pozitif inotrop izoproterenol'e beklenen cevabı göstermektedir. İzoproterenol'e yanıt olarak, β1-adrenerjik reseptörlerin aktivasyonu pozitif kronotropiye (Şekil 6A), pozitif inotropiye (Şekil 6B) ve pozitif lusitropiye (Şekil 6C) neden olur. İzoproterenol'e verilen bu yanıtlar, hiPSC-CM β1-adrenerjik reseptörlerin ve hücre içi sinyal kaskadlarının önemli ölçüde olgunlaştığını gösterir.
Şekil 7'de, ritmi izlemek ve kontraktilite için vekil bir belirteç olarak hizmet etmek için GCaMP6m kalsiyum floresansı kullanılarak insan Ether-a-go-go-ile ilişkili gen (hERG) kanal blokerlerine hiPSC-CM yanıtı gösterilmiştir. E-4031, spontan atım hızını yavaşlatan ve kalsiyum geçici süresini (CaTD80) ve üçgenlemeyi (CaT üçgenlemesi) artıran hERG'ye özgü bir kanal blokeridir. Şekil 7A, E-4031 hERG kanal blokajının neden olduğu erken depolarizasyonların tespitini göstermektedir. Domperidon, vandetanib ve sotalol dahil olmak üzere diğer hERG kanal blokerleri de test edildi ve sonuçlar Şekil 7E-G'de gösterilmiştir. Bu bileşikler ve dozlar, son hiPSC-CM validasyon çalışması 1,7,9'a dayanarak seçildi.
Şekil 1: Ticari olarak temin edilebilen veya diğer kaynaklı kriyokorunmuş hiPSC-CM'lerin hızlı olgunlaşması için zaman çizelgesi . (A) Kaplama ortamında asılı duran çözülmüş kardiyomiyositler, 0. günde MECM'ye uygulanır. 2. günde, ortam bakım ortamı ile değiştirilir ve harcanan ortam 5. günde değiştirilir. Hücreler 2 gün daha kültürlenir ve 7. günde, hiPSC-CM'lerin olgun sinsiti, aşağı akış uygulamaları için kayıt çözeltisi ile yüklenebilir veya daha uzun süre kültürlenebilir. (B) Fare ECM veya MECM üzerine kaplanmış kardiyomiyositlerin sinsitinin kontrast fazı, fare ECM'sine kaplanmış kardiyomiyositlerin, MECM üzerine kaplanmış kardiyomiyositlere kıyasla daha fazla daireselliğe sahip olduğunu göstermektedir; Ayrıca, TnI için immün boyama, fare ECM'sine kaplanmış kardiyomiyositlerin, MECM üzerine kaplanmış dolikomorfik ve iyi yapılandırılmış hiPSC-CM'lerin aksine, radyal simetri morfolojisini ve düzensiz sarkomerleri koruduğunu göstermektedir. Ölçek çubukları = 100 μm (B, üst); 50 μm (B, daha düşük). Kısaltmalar: hiPSC-CM'ler = insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler; ECM = hücre dışı matris; MECM = olgunlaşmaya neden olan ECM; 96wp = 96 delikli plaka; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TnI = troponin I. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir fare ECM veya bir MECM üzerine kaplanmış hiPSC-CM'lerin sarkomer organizasyonunun karşılaştırılması. (A) α-aktinine karşı immün boyalı fare ECM kültürlü hiPSC-CM'ler, matris üzerine kaplanmış ve çubuk şeklinde morfoloji sunan aynı partiden hiPSC-CM'lerin aksine, kardiyomiyosit boyunca dağılmış daha düşük bir sarkomer yoğunluğu ile radyal morfolojiyi gösterir (20x). (60x) Konfokal mikroskopi ile hiPSC-CM'lerin gözlemlenmesi, bir fare ECM'sinde kültürlenen hiPSC-CM'lerin, MECM'de kültürlenen aynı partiden hiPSC-CM'lerin aksine, sarkomerlerin daha yoğun bir perimetral dağılımı ve düşük yoğunluklu radyal sarkomerlerin radyal simetri morfolojisine sahip olduğunu göstermektedir. Hücrelerin uzun ekseni boyunca organize edilmiş homojen bir sarkomer dağılımı sunarlar. Ölçek çubukları = 100 μm (üst); 50 μm (daha düşük). (B) Fare ECM'sinde veya MECM'de kültürlenen hiPSC-CM'lerin, yüksek transmembran potansiyeli olan mitokondrileri boyayan mitokondriyal bir boya ile boyanması, fare ECM'sinde kültürlenen kardiyomiyositlerde MECM'ye kıyasla daha düşük bir boyama yoğunluğu gösterir. Ayrıca, MECM'de kültürlenen hiPSC-CM'ler, perinükleer mitokondri birikimi gösteren fare ECM'sinde kültürlenen hiPSC-CM'lerin aksine, kardiyomiyositlerde homojen olarak dağılmış mitokondrilere sahiptir. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltmalar: hiPSC-CM'ler = insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler; ECM = hücre dışı matris; MECM = olgunlaşmaya neden olan ECM; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Odaya özgü kardiyomiyositlerin üretimi. (A) Odaya özgü kardiyomiyositlerin üretimi için protokoller, GSK3'ün 0. günden 2. güne kadar inhibisyonu ile Wnt sinyallemesinin thr uyarılması ve bu yolun 2. ila 4. günler arasında inhibisyonu ile aynı Wnt sinyal yolağı manipülasyonunu paylaşır. Oda spesifikasyonu, retinoik asit yolunun aktivasyonu ve 3. ve 6. günler arasında Wnt sinyal manipülasyonu ile elde edilir. (B) Oda spesifikasyonunun bir sonucu olarak, atriyal kardiyomiyositler, ventriküler kardiyomiyositlere kıyasla daha hızlı bir spontan depolarizasyon oranı sunar. (C) Ventriküler hiPSC-CM'lerin atriyal hiPSC-CM'lere kıyasla daha yavaş atım oranları vardır; bu nedenle, repolarizasyonun %80'indeki aksiyon potansiyeli süresi, hiPSC-ACM'lerde hiPSC-VCM'lere kıyasla daha kısadır. Kısaltmalar: hiPSC-CM'ler = insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler; hiPSC-ACM = atriyal insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler; hiPSC-VCM = ventriküler insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bir optik haritalama cihazı ile elde edilen ve Pulse ile analiz edilen optik haritalama. (A) Film filtrasyonundan sonra 96 delikli bir plakada değerlendirilen parametrelerin bütünsel olarak gözlemlenmesi ve optik haritalama cihazı ile eşleştirilmiş 96 delikli plakalarda ilgilenilen bölgelerin belirlenmesi için bir ısı haritası örneği. Bu örnekte, bir aykırı değer kuyusunu (E4) ve veri üretemeyen kuyuları (H3, 4 ve 5 kuyuları) gösteren bir APD80% ısı haritası. (B) Ayrıca, kullanıcı dostu arayüz, seçilen kuyucuklardan ortalama aksiyon potansiyeli morfolojisinin kolayca çizilmesini sağlar. (C) Ek veri görselleştirme araçları mevcuttur; Bu örnekte, A satırındaki kuyuları kesen yatay çizgiden (panel A) oluşturulan bir zaman-uzay grafiği, 10 saniyelik bir süre boyunca her bir kuyucuğun yatay bir bölümünde (A satırı boyunca beyaz çizgi) aktivasyonu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hücre içi kalsiyum geçici değişikliklerinin genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesi ile haritalanması için zaman çizelgesi. 4. günde, ticari olarak temin edilebilen kardiyomiyositleri, Şekil 1A'da belirtildiği gibi, MECM kaplı 96 delikli bir plakada kapladıktan sonra, hücreler bir gecede CM tahlil ortamında 5 MOI virüs ile dönüştürülmelidir. Ortam, 6. güne kadar CDI bakım ortamı ile değiştirilir ve Nautilus ile hücre içi kalsiyum geçici değişikliklerinin hızlı veya sürekli izlenmesini sağlamak için 7. ve 11. günler arasında fenol kırmızısı olmadan CDI bakım ortamına değiştirilir. (B) Çözülme sonrası 7, 9 ve 10. günlerde optik haritalama ile değerlendirilen AdGCaMP6f ile transdüke edilen hiPSC-CM'ler, kalsiyuma duyarlı boyaların yeniden uygulanmasına gerek kalmadan aynı plakanın uzun süre boyunca günlük optik haritalanmasına izin veren kararlı, hücre içi kalsiyum aracılı floresan değişikliklerinin varlığını gösterir. Kısaltmalar: GECI = genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi; CM = kardiyomiyosit; MOI = enfeksiyonun çokluğu; 96wp = 96 delikli plaka; BSA = sığır serum albümini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: HiPSC-CM'lerin olgun fonksiyonel sinsitisinden elde edilen verilerin Nautilus ile görsel olarak karşılaştırılması ve Pulse ile analiz edilmesi için ısı haritalarının hızlı ve kolay kullanımı. (A) İzoproterenol ile muamele edilen hiPSC-CM'ler, ısı haritalarının incelenmesiyle gözlemlendiği ve eşleştirilmiş t-testi ile doğrulandığı gibi, vuruş oranında bir artış gösterir. (B) Benzer şekilde, izoproterenol işleminden önce ve sonra hücrelerin haritalanması, ısı haritalarının görsel olarak karşılaştırılması ve eşleştirilmiş t-testi ile β-adrenerjik stimülasyonun inotropik etkisini gösterir. (C) Son olarak, verilerin görsel karşılaştırması için ısı haritalarının kullanılması, eşleştirilmiş t-testi ile doğrulanan β-adrenerjik stimülasyonun bir başka kanonik etkisi olan lusitropiyi göstermektedir (p < 0.0001). Bir dairenin olmaması, söz konusu belirli kuyu için veri toplama / analizinde başarısızlığı gösterir. Kısaltmalar: hiPSC-CM'ler = insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler; ISO = izoproterenol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: hERG kanal blokerleri kullanılarak GECI kardiyotoksisite tarama testinin doğrulanması. (A) HBSS'deki bazal kuyucuklardan ve 500 nM E-4031 varlığında temsili spontan kalsiyum akısı izleri. (B-D) Sırasıyla başlangıç ve +E-4031 etkilerinin atım hızı, kalsiyum geçici süre 80 (CaTD80) ve kalsiyum geçici üçgenleme (CaT üçgenlemesi) üzerindeki etkilerinin ölçülmesi. *,** önemli bir farkı belirtir; eşlenmemiş t-testi; p < 0.01; n = 8 her grupta. (E) Başka bir hERG blokeri olan domperidonun GECI tespiti. (F) Vandetanib tarafından indüklenen hERG bloğunun GECI tespiti. (G) Yüksek dozda sotalol ile hERG bloğunun GECI tespiti. Kısaltmalar: GECI = genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi; hERG = insan Ether-a-go-go-go ile ilişkili gen. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Medya ve kompozisyonları Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HiPSC-CM'ler kullanılarak in vitro kardiyotoksisite taramasına birkaç farklı yaklaşım vardır. HiPSC-CM'lerin kullanımı ile ilgili yakın tarihli bir "En İyi Uygulamalar" makalesi, çeşitli in vitro tahlilleri, birincil okumalarını ve daha da önemlisi, insan kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonunu ölçmek için her bir tahlilin granülerliğini sunmuştur20. Membran delici elektrotların kullanılmasına ek olarak, insan kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonunun en doğrudan ölçümü VSD'ler tarafından sağlanır. VSD testi okumaları, aksiyon potansiyel süresi, aksiyon potansiyeli yayılma hızı, aksiyon potansiyeli yukarı inme, aksiyon potansiyeli üçgenlemesi, vuruş hızı, vuruş düzenliliği ve aksiyon potansiyeli süresi heterojenlikleri dahil olmak üzere kritik elektrofizyolojik parametrelerin doğrudan görselleştirilmesini ve nicelleştirilmesini sağlar. Benzer şekilde, kalsiyuma duyarlı problar hiPSC-CM tek katmanlı ritim, hız ve olay süreleri hakkında bilgi sunar. Floresan problar kullanılarak yapılan hiPSC-CM kalsiyum geçici ölçümleri de her kasılmanın kontraktilitesi ve kasılma mukavemeti hakkında bilgi sağlar. Bu yazıda, yüksek verimli VSD ve kalsiyum geçici ölçüm testlerinde olgun hiPSC-CM'lerin (96 delikli plakalar) kullanımı için yöntemler sunulmaktadır. Optik haritalama yöntemlerine ek olarak, yüksek verimli EP veri analizi için yazılım sunulmaktadır.
Burada özetlenen yöntemler, kardiyotoksisite taraması ve düzenleyici bilim alanları için önemli bir ilerlemedir. Burada, yüksek verimli tarama plakalarında (96 delikli plakalar) 2D hiPSC-CM monokatmanlarının hızlı olgunlaşması ve elektrofizyolojik kaydı için yöntemler sunduk. Burada gösterilen bir MECM (7 gün) kullanılarak hızlı olgunlaşma, olgunlaşmanın 30-100 gün içinde gerçekleşmesini gerektiren önceki yaklaşımlara göre büyük bir ilerlemedir22,23. Her deney için manuel uygulama gerektiren diğer ECM'lerle karşılaştırıldığında, MECM plakaları ECM ile önceden kaplanır ve laboratuvara kullanıma hazır olarak gelir. MECM'nin bu yönü, diğer ECM kaplamalarının kullanılmasından daha kolay, daha az değişken ve daha verimli olmasını sağlar. Önemli olarak, bu yaklaşım hem kriyoprezervasyonlu, ticari olarak temin edilebilen hiPSC-CM'ler hem de odaya özgü olabilen "ev yapımı" hiPSC-CM'ler için kullanılabilir. Olgun hiPSC-CM'lerin farklı, çubuk şeklindeki yapısı nedeniyle (Şekil 1 ve Şekil 2), diğer ECM'leri kullanan protokollere kıyasla, burada akıcı tek katmanlı oluşum için daha fazla sayıda hücrenin gerekli olduğunu belirtmek önemlidir. Özellikle, fare ECM'sini kullanırken (hücreler sürekli yayılan bir krep fenotipine sahiptir), kuyu başına 50.000 hiPSC-CM'yi plakalarız, ancak MECM'yi kullanırken, kuyu başına 75.000 hiPSC-CM'yi plakalarız. Kuyu başına düşen CM sayısı, hücreler yama kelepçesi veya tek hücre gerektiren diğer görüntüleme teknikleri gibi tek hücreli analizler için kullanılacaksa da azaltılabilir.
Ticari olarak temin edilebilen hiPSC-CM'ler, bu hücrelerin Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) liderliğindeki uluslararası çabalar tarafından kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesi nedeniyle düzenleyici bilim için avantajlar sunmaktadır. Bununla birlikte, ticari olarak temin edilebilen hücreler, son derece alakalı toksisite bilgisi sağlayan, ancak insan kalbini taklit eden odaya özgü özelliklerden yoksun olan düğüm, atriyal ve ventriküler hiPSC-CM'lerin bir karışımıdır. Odaya özgü hiPSC-CM'ler, atriyal ve ventriküler kardiyomiyositler arasındaki iyi bilinen elektrofizyolojik farklılıkları yeniden yaratır ve odaya özgü anti-aritmik tedavilerin geliştirilmesi için in vitro bir test sağlar (Şekil 3B-D). Örneğin, atriyal fibrilasyona özgü ilaçlar artık sağlam ve titiz veri toplama için 96 delikli plakalara kaplanmış hiPSC-ACM tek katmanları kullanılarak test edilebilir ve geliştirilebilir. Benzer şekilde, bir bileşiğin yüksek riskli bir ventriküler aritmi olan Torsades de Pointes'e (TdP) neden olup olmadığını belirlemek için tarama yaparken, atriyal ve nodal hücrelerin ventriküler kardiyak tek katmanları "kirleten" olmaması en uygunudur. Bu nedenle, bugüne kadar FDA liderliğindeki hiPSC-CM doğrulama çabaları ticari olarak temin edilebilen CM'leri kullanmaya odaklanmış olsa da, gelecekteki düzenleyici bilim önerilerinin, toksisite taramasını insan kalp durumunun daha da öngörücü hale getirmek için odaya özgü hücrelerin kullanımına yönelmesi muhtemeldir. Burada özetlenen yöntemler önceki raporlara dayanmaktadır ve pluripotent kök hücrelerden türetilen odaya özgü kardiyomiyositlerin üretimi için sağlam bir yaklaşım sağlamaktadır21.
Bu protokoller ile sahada tipik olarak kullanılanlar arasındaki en büyük fark, kullanılan saflaştırma yaklaşımıdır. Kendi laboratuvarlarında hiPSC-CM üreten laboratuvarların çoğu, metabolik aracılı kardiyomiyosit seçimine güvenmektedir22. Burada, daha sağlıklı fenotiplere sahip CM'ler üreten klinik olarak onaylanmış bir hücre işleme yaklaşımı kullanarak hiPSC-CM'leri saflaştırmak için MACS kullanmaya güveniyoruz23. Metabolik meydan okuma yaklaşımı etkilidir, ancak miyokard iskemisi24'ü simüle eden bir medya formülasyonu kullanır. HiPSC-CM'lerin MACS saflaştırılmasını kullanırken, hücre popülasyonundan manyetik tükenme için CM olmayanları hedefleyen CM olmayan tükenme kokteylini kullanmak önemlidir. CM olmayan tükenme yaklaşımının kullanılması, CM'lerin manyetik kolonda yaşadığı kayma stresini en aza indirir ve CM popülasyonunun doğrudan manyetik etiketlemesine göre tercih edilir. Odaya özgü hücrelerin MACS saflaştırılmasının kullanılması, diğer laboratuvarların araştırma ve toksisite testi için sağlıklı CM'ler üretmesini sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TB, StemBioSys, Inc.'in bir çalışanıdır. AMR ve JC, StemBioSys, Inc.'in eski danışmanlarıdır.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibeleri HL148068-04 ve R44ES027703-02 (TJH) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
- Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
- Strauss, D. G., Blinova, K.
- Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
- Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
- da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
- Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
- Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).
