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Biology

प्लांट सेल प्रकारों का अलगाव और प्रतिलेख विश्लेषण

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64913
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Joint Center for Single Cell Biology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University

Summary

उच्च-थ्रूपुट एससीआरएनए-सेक विधियों की व्यवहार्यता और प्रभावशीलता संयंत्र अनुसंधान में एकल-कोशिका युग की शुरुआत करती है। यहां प्रस्तुत विशिष्ट एराबिडोप्सिस थैलियाना रूट सेल प्रकारों और बाद में ट्रांसस्क्रिप्टम लाइब्रेरी निर्माण और विश्लेषण को अलग करने के लिए एक मजबूत और पूर्ण प्रक्रिया है।

Abstract

बहुकोशिकीय जीवों में, विकासात्मक प्रोग्रामिंग और पर्यावरणीय प्रतिक्रियाएं विभिन्न सेल प्रकारों में या कोशिकाओं के भीतर भी अत्यधिक भिन्न हो सकती हैं, जिसे सेलुलर विषमता के रूप में जाना जाता है। हाल के वर्षों में, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) तकनीकों के साथ संयुक्त एकल-कोशिका और सेल-प्रकार अलगाव एकल-कोशिका संकल्प पर जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण बन गए हैं। हालांकि, प्लांट सेल की दीवारों की उपस्थिति के कारण पौधे की कोशिकाओं को अलग करना अपेक्षाकृत अधिक कठिन है, जो पौधों में एकल-कोशिका दृष्टिकोण के आवेदन को सीमित करता है। यह प्रोटोकॉल प्लांट कोशिकाओं के साथ फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) आधारित सिंगल-सेल और सेल-टाइप अलगाव के लिए एक मजबूत प्रक्रिया का वर्णन करता है, जो डाउनस्ट्रीम मल्टी-ओमिक्स विश्लेषण और अन्य अध्ययनों के लिए उपयुक्त है। एराबिडोप्सिस रूट फ्लोरोसेंट मार्कर लाइनों का उपयोग करते हुए, हम प्रदर्शित करते हैं कि विशेष सेल प्रकार, जैसे कि जाइलम-पोल पेरिसाइकिल कोशिकाएं, पार्श्व जड़ प्रारंभिक कोशिकाएं, पार्श्व रूट कैप कोशिकाएं, कॉर्टेक्स कोशिकाएं और एंडोडर्मल कोशिकाएं, कैसे अलग होती हैं। इसके अलावा, स्मार्ट-सेक 2 का उपयोग करके एक प्रभावी डाउनस्ट्रीम ट्रांसस्क्रिप्टम विश्लेषण विधि भी प्रदान की जाती है। सेल अलगाव विधि और प्रतिलेख विश्लेषण तकनीकों को अन्य सेल प्रकारों और पौधों की प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और पौधे विज्ञान में व्यापक अनुप्रयोग क्षमता है।

Introduction

कोशिकाएं सभी जीवित जीवों की मौलिक इकाई हैं और संरचनात्मक और शारीरिक कार्य करती हैं। यद्यपि बहुकोशिकीय जीवों में कोशिकाएं स्पष्ट समकालिकता दिखाती हैं, विभिन्न प्रकार और व्यक्तिगत कोशिकाओं की कोशिकाएं विकास और पर्यावरणीय प्रतिक्रियाओं के दौरान अपने प्रतिलेख में अंतर पेश करती हैं। उच्च-थ्रूपुट एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) सेलुलर विषमता को समझने के लिए अभूतपूर्व शक्ति प्रदान करता है। पादप विज्ञान में एससीआरएनए-सेक को लागू करने से प्लांट सेल एटलस1 के सफलतापूर्वक निर्माण में योगदान दिया गया है, जिसका उपयोग पौधों के ऊतकों में दुर्लभ सेलुलर टैक्सा की पहचान करने के लिए किया गया है2, पौधे के ऊतकों में सेल प्रकारों की संरचना में अंतर्दृष्टि प्रदान की है, और इसका उपयोग सेलुलर पहचान और पौधे के विकास और भेदभाव के दौरान नियोजित महत्वपूर्ण कार्यों की पहचान करने के लिए किया गया है। इसके अलावा, नए मार्कर जीन4 की खोज करने और विभिन्न पौधों में एक ही सेल प्रकार के विकासवादी संरक्षण को प्रकट करने के लिए एससीआरएनए-सेक का उपयोग करके महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारकों5 के कार्यों का अध्ययन करने के लिए पौधे के ऊतकों 1,2,3 में स्थानिक विकास प्रक्षेपपथ का अनुमान लगाना संभव है।. अजैविक तनाव पौधे की वृद्धि और विकास पर सबसे महत्वपूर्ण पर्यावरणीय प्रभावों में से हैं। एकल-कोशिका प्रतिलेख अनुक्रमण के माध्यम से विभिन्न उपचार स्थितियों के तहत पौधे के ऊतकों में कोशिका प्रकारों की संरचना में परिवर्तन की खोज करके, कोई भी अजैविक तनाव प्रतिक्रिया तंत्र6 को हल कर सकता है।

एससीआरएनए अनुक्रमण का उपयोग करके सेल प्रकारों के बीच ट्रांसक्रिप्शनल विषमता को हल करने की क्षमता सेल अलगाव विधि और अनुक्रमण मंच पर निर्भर करती है। फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) प्रकाश प्रकीर्णन और कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति गुणों के आधार पर एससीआरएनए-सेक के लिए कोशिकाओं की उप-आबादी को अलग करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। ट्रांसजेनिक तकनीक द्वारा फ्लोरोसेंट मार्कर लाइनों के विकास ने एफएसीएस7 द्वारा सेल अलगाव की दक्षता में काफी सुधार किया है। स्मार्ट-सेक 28 का उपयोग करके एससीआरएनए-सेक का संचालन सेलुलर विषमता को विच्छेदित करने की क्षमता को और बढ़ाता है। स्मार्ट-सेक 2 विधि में जीन का पता लगाने के लिए अच्छी संवेदनशीलता है और कम प्रतिलेख इनपुट9 के साथ भी जीन का पता लगा सकती है। थोक सेल प्रकार संग्रह के अलावा, आधुनिक सेल सॉर्टर्स एक एकल-सेल इंडेक्स सॉर्टिंग प्रारूप प्रदान करते हैं, जो स्मार्ट-सेक 210 या अन्य मल्टीप्लेक्स आरएनए-सेक विधियों का उपयोग करके एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर ट्रांसस्क्रिप्टम विश्लेषण की अनुमति देता है, जैसे कि सीईएल-सेक 211। सिंगल-सेल या सेल-टाइप सॉर्टिंग का उपयोग संभावित रूप से कई अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जैसे कि समानांतर मल्टी-ओमिक्स अध्ययन12,13। यहां प्रस्तुत प्लांट सेल प्रकारों को अलग करने के लिए एक मजबूत और बहुमुखी प्रोटोकॉल है, जैसे कि जाइलम-पोल पेरिसाइकिल कोशिकाएं, पार्श्व रूट कैप कोशिकाएं, पार्श्व जड़ प्रारंभिक कोशिकाएं, कॉर्टेक्स कोशिकाएं, और एंडोडर्मल कोशिकाएं एफएसीएस द्वारा एराबिडोप्सिस थैलियाना मार्कर सेल लाइनों की जड़ों से। प्रोटोकॉल में डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिपटम विश्लेषण के लिए स्मार्ट-सेक 2 लाइब्रेरी का निर्माण शामिल है।

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Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल को ए थैलियाना वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) बीजों के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें निम्नलिखित रूट सेल प्रकारों के लिए कोई प्रतिदीप्ति और फ्लोरोसेंट मार्कर लाइनें नहीं हैं: जाइलम-पोल पेरिसाइकिल कोशिकाएं (जे0121), पार्श्व जड़ प्रारंभिक कोशिकाएं, पार्श्व रूट कैप कोशिकाएं (जे 3411), एंडोडर्मिस और कॉर्टेक्स कोशिकाएं (जे0571) (चित्रा 1 ए)। सभी मार्कर लाइनें एक वाणिज्यिक स्रोत (सामग्री की तालिका देखें) से प्राप्त की गई थीं, पार्श्व जड़ दीक्षा सेल मार्कर लाइन को छोड़कर, जो पहले प्रकाशित रिपोर्ट14 के बाद एक जंगली-प्रकार के एराबिडोप्सिस संयंत्र में जीएटीए 23 प्रमोटर-संचालित जीएफपी निर्माण को पेश करके उत्पन्न किया गया था।

1. पौधे सामग्री की तैयारी

  1. ए थालियाना डब्ल्यूटी बीज और फ्लोरोसेंट मार्कर लाइन बीज को 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर घूमने वाले इनक्यूबेटर में 20% ब्लीच में डालकर कीटाणुरहित करें।
  2. बीज को डबल-डिस्टिल्ड वाटर (डीडीएच2ओ) में तीन से पांच बार कुल्ला करें। इस चरण को एक बाँझ साफ बेंच पर करें।
  3. डब्ल्यूटी और रिपोर्टर लाइन के बीजों को आधी ताकत वाले मुराशिगे और स्कूग (एमएस) माध्यम पर 0.8% एगर (डब्ल्यू / वी) 15 के साथ प्लेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए स्ट्रैटिफाइंग करने के बाद पौधों को 5 दिनों (23 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे प्रकाश) के लिए लंबवत रूप से विकसित करें।

2. प्रोटोप्लास्टिंग

  1. प्रोटोप्लास्टिंग समाधान2,5 तैयार करें, जिसे समाधान ए और समाधान बी के रूप में संदर्भित किया जाता है (सामग्री की तालिका देखें)।
    1. समाधान ए तैयार करें जिसमें 400 एमएम मैनिटोल, 0.05% बीएसए, 20 एमएम एमईएस (पीएच 5.7), 10 एमएम सीएसीएल2, और 20 एमएम केसीएल ( सामग्री की तालिका देखें) शामिल हैं। समाधान ए को -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक स्टोर करें।
    2. समाधान A के एक नए एलिकोट में 1% (w/v) सेल्युलस R10, 1% (w/v) सेल्युलस RS, 1% (w/v) हेमिसेलुलेज़, 0.5% (w/v) पेक्टोलाइज़ और 1% (w/v) मैकेरोजाइम R10 जोड़कर समाधान B तैयार करें।
  2. प्रयोग शुरू करने से पहले धीरे से समाधान ए और समाधान बी को बर्फ पर पिघलाएं।
  3. एक साफ ब्लेड या कैंची का उपयोग करके जड़ों को काट लें, और जड़ों को ~ 0.5 सेमी टुकड़ों में काट लें। 1.5-2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर कोमल रोटेशन (लगभग 18 आरपीएम पर) के बाद समाधान बी के 1.5 मिलीलीटर में जड़ों को डुबोएं।
  4. 40 μm छन्नी जाल के माध्यम से रूट प्रोटोप्लास्ट को फ़िल्टर करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. घोल ए के 1-2 मिलीलीटर के साथ छन्नी जाल को धो लें।
  6. चरण 2.4 और चरण 2.5 के तरल पदार्थों को मिलाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें, समाधान ए के 500-600 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और फिर इसे तुरंत बर्फ पर रखें।
  7. सेल सॉर्टिंग के लिए पुन: निलंबित सेल समाधान को एक नए 5 एमएल टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें।

3. प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस)

  1. सॉर्टर पर उपकरण सेटअप चरणों को चालू करें और समाप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रतिदीप्ति चैनलों का चयन करें, ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए आधार रेखा निर्धारित करने के लिए नियंत्रण के रूप में एक डब्ल्यूटी प्लांट (कोई प्रतिदीप्ति नहीं) का उपयोग करें, और प्रतिदीप्ति तीव्रता और एफएससी / एसएससी सिंगल्स (चित्रा 2) के आधार पर सॉर्टिंग गेट को समायोजित करें।
  2. कोशिकाओं को क्षतिग्रस्त होने से बचाने के लिए 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब में समाधान ए (चरण 2.1.1) के 500 μL जोड़ें। प्रति ट्यूब 2,000-3,000 कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  3. छंटाई के बाद, तुरंत नमूने को बर्फ पर रखें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं वाली संग्रह ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें, और एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  4. क्रमबद्ध कोशिकाओं के 2 μL लें, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रतिदीप्ति की जांच करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  5. क्रमबद्ध कक्षों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें, या पुस्तकालय निर्माण के लिए तुरंत उनका उपयोग करें (चरण 4)।
  6. एकल-कक्ष अनुक्रमणिका सॉर्टिंग के लिए, 96-वेल प्लेट को एडाप्टर में रखें. प्लेट की स्थिति को कैलिब्रेट करें ताकि बूंद प्लेट के केंद्र छेद में गिर जाए। सॉर्ट करते समय एकल-सेल सॉर्टिंग मोड का चयन करें, सॉर्ट किए गए कक्षों की लक्ष्य संख्या 1 के रूप में दर्ज करें, और सॉर्ट करना शुरू करें।

4. स्मार्ट-सेक 2 पुस्तकालय तैयारी

  1. इनपुट की अल्ट्रा-कम मात्रा के परिणामस्वरूप, संदूषण मुक्त वातावरण में एकल-सेल प्रकार आरएनए-सेक लाइब्रेरी निर्माण करें। प्रयोग शुरू करने से पहले, बेंच को सतह विदूषक8 ( सामग्री की तालिका देखें) और 75% इथेनॉल के साथ साफ करें।
  2. 10% ट्राइटन एक्स -100 के 0.33 μL, RNase अवरोधक के 0.55 μL और 0.1 M DTT के 0.22 μL को मिलाकर लाइसिस बफर (मिश्रण ए) (तालिका 1) तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. क्रमबद्ध नमूने में मिश्रण ए के 1 μL जोड़ें, और एक बाँझ मूसल के साथ पीस लें। बेहतर नमूना मात्रा ≤0.5 μL है; मात्रा को 14 μL तक बनाने के लिए RNase-मुक्त पानी का उपयोग करें। प्रत्येक एकल सेल नमूने को 0.2 mL पतली दीवार वाली पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. मिश्रण बी तैयार करें जिसमें 0.44 μL ऑलिगो-dT 30 VN रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (RT) प्रतिक्रिया प्राइमर (100 μM) और dNTP के 4.4 μL (10mM) (तालिका 2) (सामग्री की तालिका देखें) शामिल हैं।
  5. प्रत्येक ट्यूब में नमूने के 14 μL में मिश्रण B के 4.4 μL जोड़ें, नमूने को मिश्रण करने के लिए धीरे से पिपेट करें, और 3 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, ओलिगो-डीटी को पॉली ए पूंछ में संकरण करने के लिए तुरंत नमूने को बर्फ पर रखें।
  6. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया मिश्रण (मिश्रण सी) (तालिका 3) तैयार करें (सामग्री की तालिका देखें)। नमूने वाले प्रत्येक ट्यूब में मिश्रण सी के 21.6 μL जोड़ें। एक सामान्य पीसीआर उपकरण पर आरटी प्रोग्राम चालू करें (तालिका 4)।
  7. बर्फ पर प्रवर्धन प्रतिक्रिया करें। 2x PCR पोलीमरेज़ मिश्रण के 44 μL और IS PCR प्राइमर (10 μM) के 0.88 μL (तालिका 5) ( सामग्री की तालिका देखें) के संयोजन से मिश्रण D तैयार करें। आरटी प्रतिक्रिया उत्पाद के 40 μL में 40.8 μL मिश्रण D जोड़ें, और पूर्वप्रवर्धन कार्यक्रम चलाएं (तालिका 6)।
  8. एम्प्योर एक्सपी मोतियों का उपयोग करके प्रवर्धन प्रतिक्रिया उत्पादों को शुद्ध करें ( सामग्री की तालिका देखें)। चरण 4.7 से प्रत्येक नमूने में 48 μL मोती (0.6: 1 अनुपात) जोड़ें, और धीरे से पाइपिंग द्वारा नमूने मिलाएं।
  9. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने को इनक्यूबेट करें। नमूने वाले 1.5 एमएल ट्यूबों को 5 मिनट के लिए चुंबकीय पृथक्करण स्टैंड पर रखें। मोतियों को परेशान किए बिना नमूने से सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक छोड़ दें।
  10. मोतियों को 80% इथेनॉल के 200 μL में पुन: निलंबित करके धोएं, और इथेनॉल युक्त सुपरनैटेंट को छोड़ने से पहले नमूने को चुंबकीय पृथक्करण स्टैंड ( सामग्री की तालिका देखें) पर 3 मिनट के लिए रखें।
  11. 10 मिनट के लिए नमूनों को हवा में सुखाएं, और हवा सुखाने के दौरान संदूषण और क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए ट्यूब को कवर करें।
  12. ddH2O के 20 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें, 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने को इनक्यूबेट करें, और फिर उन्हें 5 मिनट के लिए चुंबकीय पृथक्करण स्टैंड पर रखें।
  13. प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाले के 18 μL को बाहर निकालें, और नमूने को नए 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। डीएनए परिमाणीकरण किट का उपयोग करके सीडीएनए की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए नमूने के 1 μL का उपयोग करें, एक टुकड़ा विश्लेषक का उपयोग करके प्रत्येक प्रीलाइब्रेरी के आकार वितरण का निर्धारण करें ( सामग्री की तालिका देखें), और शेष नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
  14. अनुक्रमण लाइब्रेरी तैयारी किट का उपयोग करके चरण 4.13 के प्रीलाइब्रेरी उत्पाद से इलुमिना अनुक्रमण16 के लिए एक सीडीएनए लाइब्रेरी8 का निर्माण करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  15. एम्प्योर एक्सपी बीड्स का उपयोग करके पुस्तकालयों को (चरण 4.14 से) शुद्ध करें, शुद्ध पुस्तकालयों की मात्रा निर्धारित करें, और चरण 4.13 का पालन करते हुए प्रत्येक पुस्तकालय का आकार वितरण निर्धारित करें।
    नोट: प्रत्येक पुस्तकालय के बराबर नैनोमोल्स पूल करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि उनमें से किसी में भी इलुमिना इंडेक्स का समान संयोजन नहीं है। अन्यथा, पुस्तकालयों को वांछित अनुक्रमण आउटपुट के आधार पर एक अनुपात में पूल किया जा सकता है और इलुमिना अनुक्रमक के एक ही लेन पर एक साथ अनुक्रमित किया जा सकता है। आम तौर पर, प्रत्येक पुस्तकालय को 4-6 जीबी की गहराई तक अनुक्रमित करना, जो >10 मिलियन मैप किए गए रीड उत्पन्न करता है, एराबिडोप्सिस जीनोम का 20x-30x कवरेज प्रदान करता है। कम अनुक्रमण गहराई भी स्वीकार्य हैं लेकिन अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण के महत्व को प्रभावित कर सकती हैं।

5. आरएनए-सेक डेटा विश्लेषण

  1. ट्रिम-गलोर17 का उपयोग करके कच्चे पाठ को ट्रिम करें, इसके बाद हिसैट 2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2) का उपयोग करके संदर्भ जीनोम की मैपिंग करें, और पिकार्ड19 (broadinstitute.github.io/picard) का उपयोग करके पीसीआर डुप्लिकेट टुकड़ों को हटा दें।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए कम से कम तीन जैविक प्रतिकृतियों का उपयोग करके डीईसेक 220 के साथ विभेदित रूप से व्यक्त जीन (डीईजी) की कच्ची गिनती प्रसंस्करण और बाद में विश्लेषण करें। हीटमैप पैकेज के साथ जीन अभिव्यक्ति का क्लस्टरिंग करें, और एक अभिव्यक्ति हीटमैप में कल्पना करें।
    नोट: जीन और टीई (ट्रांसपोसेबल तत्व) के आरपीकेएम (प्रति किलोबेस प्रति मिलियन मैप किए गए पढ़ता है) मूल्यों की गणना स्ट्रिंगटी18 (github.com/gpertea/stringtie) के साथ की गई थी और जीनोम ब्राउज़र में कल्पना की गई थी।

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Representative Results

प्रोटोप्लास्ट अलगाव।
यह प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट ए थैलियाना रूट मार्कर लाइनों की प्रोटोप्लास्ट सॉर्टिंग के लिए प्रभावी है। इन मार्कर लाइनों को विशेष रूप से लक्षित सेल प्रकारों में व्यक्त जीन के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संलयन द्वारा विकसित किया गया है, या एन्हांसर ट्रैप लाइनों का उपयोग करके (चित्रा 1)। मॉडल पौधों और फसलों में विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों को व्यक्त करने वाले सेल प्रकारों में कई ऊतकों और अंगों को विच्छेदित किया गया है।

एफएसीएस आबादी, क्रमबद्ध कोशिकाएं, और लाइब्रेरी क्यूसी।
एक नियंत्रण के रूप में एक जंगली-प्रकार के पौधे का उपयोग करके और फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) जैसे गेट सेट करके, हमने रुचि की कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी और ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए एक आधार रेखा निर्धारित की और फ्लोरेसेंस-विशिष्ट चिह्नित कोशिकाओं को सफलतापूर्वक क्रमबद्ध किया (चित्रा 2)। अंतिम अनुक्रमण पुस्तकालयों की गुणवत्ता (चरण 4.15 से) टुकड़ा आकार वितरण विश्लेषण द्वारा निर्धारित की गई थी। लगभग 2,000 जाइलम-पोल पेरिसाइकिल कोशिकाओं, पार्श्व रूट प्रिमोर्डिया कोशिकाओं, एंडोडर्मिस / कॉर्टेक्स कोशिकाओं और पार्श्व रूट कैप कोशिकाओं के आरएनए-सेक लाइब्रेरी के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 ए-डी में दिखाए गए हैं।

अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण
अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता का मूल्यांकन कई विश्लेषण प्रक्रियाओं से किया जा सकता है, जैसे अनुक्रमण गहराई, मानचित्रण दर और फास्टक्यूसी रिपोर्ट। अनुक्रमण डेटा की सटीकता और संवेदनशीलता को सेल-प्रकार के समृद्ध जीन की एक श्रृंखला की उपस्थिति से प्रदर्शित किया जा सकता है, जिसे पृथक सेल प्रकारों और पूरे ऊतक के बीच डीईजी विश्लेषण से पहचाना जा सकता है। कुछ सेल प्रकारों में काफी उच्च अभिव्यक्ति स्तर वाले जीन को सेल-प्रकार समृद्ध जीन के रूप में पहचाना जा सकता है। इस बीच, ज्ञात मार्कर जीन के अभिव्यक्ति स्तर को दिखाने के लिए प्रत्येक सेल प्रकार के जीनोम-ब्राउज़र दृश्यों की तुलना साथ-साथ की जा सकती है और परीक्षण किया जा सकता है कि क्या मार्कर जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न को सेल-प्रकार अभिव्यक्ति डेटा में पुनर्निर्मित किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, चार रूट सेल प्रकारों में से किसी में समृद्ध जीन को क्लस्टर किया गया और हीटमैप में दिखाया गया, जिसने विभिन्न सेल प्रकारों के बीच जीन अभिव्यक्ति की विशिष्टता को दिखाया (चित्रा 4)। YUCCA3, MYB36, WOX5, और PFA1 की जांच की गई, और अभिव्यक्ति पैटर्न पहले की रिपोर्ट21,22,23,24 के अनुसार अपेक्षित थे। डेटा विश्लेषण पाइपलाइन और प्रतिनिधि कच्चे अनुक्रमण डेटा एक सार्वजनिक भंडार (github.com/gaolabsjtu/root_cell_types_RNAseq) में उपलब्ध हैं।

Figure 1
चित्रा 1: रूट और प्रोटोप्लास्ट तैयारी की विशिष्ट सेल प्रकार मार्कर लाइन। (ए, बाएं) एन्हांसर ट्रैप लाइन परिचय और छवियां। (ए, दाएं) रूट की विशिष्ट सेल प्रकार मार्कर लाइन। (बी) छंटाई से पहले प्रोटोप्लास्ट तैयारी की एक छवि। पार्श्व जड़ संस्थापक सेल, पेरिसाइकिल, एंडोडर्मिस / कॉर्टेक्स, पार्श्व रूट कैप और प्रोटोप्लास्ट के लिए स्केल सलाखों क्रमशः 25 μm, 100 μm, 100 μm, 75 μm और 20 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: विशिष्ट रूट सेल प्रकारों के लिए एफएसीएस की स्थापना। एक एफएसीएस प्रयोग का उदाहरण: (ए) एसएससी और एफएससी का उपयोग करने वाली प्रमुख आबादी; (बी) जीएफपी-पॉजिटिव (+) और जीएफपी-नेगेटिव (-) गेट; (सी) क्रमबद्ध कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र और (डी) प्रतिदीप्ति छवियां। स्केल बार 50 μm का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: स्मार्ट-सेक 2 अनुक्रमण पुस्तकालयों का आकार वितरण। जाइलम-पोल पेरिसाइकिल कोशिकाओं (ए), पार्श्व रूट प्रिमोर्डिया कोशिकाओं (बी), एंडोडर्मिस / कॉर्टेक्स कोशिकाओं (सी) और पार्श्व रूट कैप कोशिकाओं (डी) से उत्पन्न अनुक्रमण पुस्तकालयों (चरण 4.15 से) के प्रतिनिधि टुकड़े आकार वितरण। (ई) प्राइमर / एडेप्टर डिमर चोटियों के साथ एक छोटे आकार का पुस्तकालय, जिसे आकार चयन के बाद भी अनुक्रमित किया जा सकता है। (एफ) एक असामान्य आकार वितरण के साथ एक पुस्तकालय, जो असफल पुस्तकालय तैयारी का संकेत देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सेल-प्रकार-समृद्ध जीन विश्लेषण। प्रत्येक सेल प्रकार और पूरे रूट के बीच एक डीईजी विश्लेषण किया गया था; प्रत्येक सेल प्रकार में चार गुना से अधिक अपरेगुलेशन वाले जीन को सेल-प्रकार-समृद्ध जीन के रूप में पहचाना गया था। इन जीनों को हीटमैप (ऊपरी पैनल) प्लॉट में संयुक्त, क्लस्टर और विज़ुअलाइज़ किया गया था। सेल-प्रकार-समृद्ध जीन में कई ज्ञात मार्कर जीन शामिल थे; जीनोम ब्राउज़र (निचले पैनल) में दिखाने के लिए विशिष्ट मार्कर जीन जैसे YUCCA3, MYB36, WOX5 और PFA1 को चुना गया था। संक्षेप: एलआरपी = पार्श्व रूट प्रिमोर्डिया; एंडो/कोर = एंडोडर्मिस/कॉर्टेक्स; एलआरसी = पार्श्व रूट कैप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

घटक वॉल्यूम (μL)
10% ट्राइटन एक्स -100 0.33
RNase अवरोधक 0.55
डीटीटी (0.1 मीटर) 0.22

तालिका 1: सेल लाइसिस बफर (मिश्रण ए) की तैयारी के लिए प्रतिक्रिया घटक।

घटक वॉल्यूम (μL)
Oligo-dT30VN (100 μM) 0.44
dNTP (10 mM) 4.4

तालिका 2: मिश्रण बी की तैयारी के लिए प्रतिक्रिया घटक।

घटक वॉल्यूम (μL)
सुपरस्क्रिप्ट IV बफर (5x) 8.8
बीटाइन (5 मीटर) 8.8
डीटीटी (0.1 मीटर) 2.2
MgCl2 (1 M) 0.264
TSO (100 μM) 0.44
सुपरस्क्रिप्ट IV रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (200 U / μL) 2.2
RNase अवरोधक 1.1

तालिका 3: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर मिश्रण (मिश्रण सी) की तैयारी के लिए प्रतिक्रिया घटक।

चक्र तापमान (°C) समय
1 50 90 मिनट
2-11 55 2 मिनट
50 2 मिनट
12 70 15 मिनट
13 4 ∞

तालिका 4: एमआरएनए से सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) पीसीआर सेटिंग्स।

घटक वॉल्यूम (μL)
KAPA हाईफाई हॉटस्टार्ट रेडीमिक्स (2x) 44
आईएस पीसीआर प्राइमर (10 μM) 0.88

तालिका 5: पूर्व-प्रवर्धन प्रतिक्रिया मिश्रण (मिश्रण डी) की तैयारी के लिए प्रतिक्रिया घटक।

चक्र तापमान (°C) समय
1 98 5 मिनट
2-13 98 20 s
67 30 s
72 3 मिनट
14 72 5 मिनट
15 4 ∞

तालिका 6: पूर्व-प्रवर्धन प्रतिक्रिया के लिए पीसीआर प्रोग्राम सेटिंग्स।

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Discussion

स्मार्ट-सेक 2-आधारित प्रोटोकॉल कईसैकड़ों कोशिकाओं से विश्वसनीय अनुक्रमण पुस्तकालय उत्पन्न कर सकता है। प्रारंभिक सामग्री की गुणवत्ता प्रतिलेख विश्लेषण की सटीकता के लिए आवश्यक है। एफएसीएस रुचि की कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, लेकिन यह प्रक्रिया, विशेष रूप से प्रोटोप्लास्टिंग चरण, पौधे अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) या मैनुअल विच्छेदित कोशिकाओं का उपयोग इनपुट25,26 के रूप में भी किया जा सकता है, इसलिए यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग संभावित रूप से ज्ञात मार्कर जीन के साथ या बिना विभिन्न प्रकार की पौधों की प्रजातियों और सेल प्रकारों में किया जा सकता है।

संयंत्र सामग्री की तैयारी
प्लांट डेवलपमेंटल बायोलॉजी में, एफएसीएस का उपयोग आमतौर पर फ्लोरोसेंट मार्कर को व्यक्त करने वाले समृद्ध सेल आबादी को अलग करने के लिए किया जाता है। इस तरह के मार्कर को व्यक्त करने वाले पौधे प्रोटोप्लास्ट होते हैं, और प्रोटोप्लास्ट को अंततः सेल प्रकार-विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति के आधार पर शुद्ध उप-आबादी में क्रमबद्ध किया जाता है। इसलिए, फ्लोरोसेंट मार्कर का संकेत मजबूत और विशिष्ट होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, शोधकर्ता को यह जांचना चाहिए कि किन मार्करों को पहले से क्रमबद्ध किया जा सकता है। आवश्यक बीजों की संख्या अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करती है, जहां मार्कर व्यक्त किया जाता है, डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए कितनी कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, और कितनी प्रतिकृतियां क्रमबद्ध होती हैं। यदि अभिव्यक्ति प्रति पौधे बहुत कम कोशिकाओं के साथ एकल कोशिका प्रकार में होती है, तो आम तौर पर बड़ी संख्या में पौधों की आवश्यकता होती है यदि मार्कर को अधिक संख्या में कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। व्यक्तिगत मार्कर लाइनों के लिए आवश्यक बीजों की संख्या को अनुभवपूर्वक निर्धारित करना सबसे अच्छा है। छंटाई के लिए खिड़की को अनुकूलित करने के लिए प्रत्येक मार्कर लाइन के साथ प्रारंभिक प्रयोग करना विशेष रूप से सार्थक है और यह जानना कि पौधों की एक निश्चित संख्या से कितनी कोशिकाएं उत्पन्न होंगी। यदि प्रयोगात्मक सामग्री जड़ें हैं, तो जड़ों को आगर में डूबने से रोकने के लिए और साफ जड़ों को काटने की सुविधा के लिए, बीज चढ़ाना से पहले मध्यम युक्त आगर पर एक उपयुक्त आकार और आटोक्लेव जाल बिछाया जा सकता है। कम तापमान स्तरीकरण बीज अंकुरण और विकास में मदद करता है, इसलिए हम सुझाव देते हैं कि स्टरलाइज़ या चढ़ाना के बाद 2 दिनों के लिए बीज को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्ट्रैटिफाई करें और फिर पौधों को लंबवत रूप से विकसित करें।

प्रोटोप्लास्टिंग और एफएसीएस
स्तरीकरण के 5-6 दिनों के बाद प्रोटोप्लास्टिंग और सॉर्टिंग अच्छी तरह से काम करती है। समाधान ए और समाधान बी को 0.22 μm छन्नी का उपयोग करके फ़िल्टर किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, समाधान बी को -20 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक संग्रहीत करने से एंजाइमों की दक्षता कम हो जाती है। शुरू करने से पहले, समाधान A और समाधान B को बर्फ पर धीरे से पिघलाया जाना चाहिए, जिसमें लगभग 20 मिनट लगते हैं। समाधान B को हिलाया नहीं जाना चाहिए, क्योंकि समाधान B को हिलाने से एंजाइम बाधित हो सकते हैं और अत्यधिक बुलबुला गठन हो सकता है। समाधान ए के साथ छन्नी जाल को कई बार धोने से चरण 2.5 में प्राप्त कोशिकाओं की संख्या बढ़ सकती है। जैसा कि चरण 2.6 में वर्णित है, पूरे सुपरनैटेंट को एस्पिरेटेड नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि प्रोटोप्लास्ट गोली के पास नीचे हैं और उन्हें देखा नहीं जा सकता है। छंटाई से पहले, यह सुनिश्चित करना सबसे अच्छा है कि बेहतर सॉर्टिंग दक्षता प्राप्त करने के लिए प्रोटोप्लास्ट की एकाग्रता लगभग 105-10 6 सेल / एमएल है। एक नया प्रयोग स्थापित करते समय, छंटाई गेट स्थापित करने के लिए नियंत्रण के रूप में डब्ल्यूटी संयंत्र से एक ही ऊतक की आवश्यकता होती है। चरण 3.1 में, पहले प्रतिदीप्ति चैनलों (जैसे, पीई और एफआईटीसी) का चयन करना और एसएससी और एफएससी के अनुसार प्रमुख आबादी निर्धारित करने के लिए एक नियंत्रण नमूने का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अतिरिक्त, यह सुनिश्चित करने के लिए प्रतिदीप्ति चैनल के वोल्टेज को बदलकर गेट की स्थिति को समायोजित करने का सुझाव दिया जाता है कि नियंत्रण संकेत गेट के बाईं ओर स्थित है (यानी, नकारात्मक समूह 103 से नीचे स्थित है)। जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन को रोकने के लिए छंटाई का समय 30 मिनट या 60 मिनट से कम तक सीमित होना चाहिए, जो प्रोटोप्लास्टिंग या सॉर्टिंग के कारण हो सकता है। छंटाई के बाद, क्रमबद्ध कोशिकाओं की एक छोटी संख्या एकत्र की जानी चाहिए और प्रतिदीप्ति (चरण 3.4) के लिए जांच की जानी चाहिए। डाउनस्ट्रीम लाइब्रेरी निर्माण पर किसी भी प्रभाव से बचने के लिए सतह पर तैरनेवाला से जितना संभव हो उतना बफर हटाया जाना चाहिए (चरण 3.3)।

आरएनए-सेक लाइब्रेरी का निर्माण
आरएनए-सेक लाइब्रेरी के निर्माण के लिए, हम आरएनए के क्षरण को कम करने के लिए छंटाई के तुरंत बाद कोशिकाओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं। बहुत अधिक कोशिकाओं के साथ शुरू करना उचित नहीं है, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप अपर्याप्त प्रतिक्रियाओं के कारण खराब गुणवत्ता वाली लाइब्रेरी हो सकती है। चरण 4.7 और चरण 4.14 में पीसीआर चक्रों की संख्या आरएनए / सीडीएनए की इनपुट राशि पर निर्भर करती है। कम इनपुट होने पर चक्रों की संख्या बढ़ाई जा सकती है या अधिक इनपुट होने पर कम की जा सकती है। इसलिए, एक ही प्रवर्धन प्रक्रिया के साथ वास्तविक समय पीसीआर चलाने के लिए चरण 4.7 और चरण 4.14 से कुछ मिश्रित नमूने लेने की सिफारिश की जाती है और फिर प्रीलाइब्रेरी / लाइब्रेरी के औपचारिक प्रवर्धन से पहले क्यूपीसीआर के परिणामों के आधार पर चक्रों की अंतिम संख्या निर्धारित की जाती है। इसके अलावा, शुद्धिचरण 4.8 से पहले, एम्प्योर एक्सपी मोतियों को कम से कम 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बराबर किया जाना चाहिए और फिर अच्छी तरह से भंवर किया जाना चाहिए। शुद्धिकरण चरण में मोतियों की मात्रा 0.8: 1 अनुपात से ऊपर नहीं बढ़ाई जानी चाहिए। अन्यथा, यह प्राइमर डिमर के कैरीओवर को बढ़ाएगा। इसके अलावा, किसी को कठिन पुन: निलंबन को रोकने के लिए चरण 4.11 में मोतियों को अधिक सूखने से बचना चाहिए। एक योग्य प्री-लाइब्रेरी में लगभग 1.5-2 केबी का औसत आकार और छोटी मात्रा में छोटे (<500 बीपी) टुकड़े होने चाहिए। पुस्तकालयों में असामान्य आकार वितरण या छोटे आकार के प्राइमर / एडाप्टर डिमर चोटियां खराब गुणवत्ता के संकेतक हैं, और इन नमूनों को छोड़ दिया जाना चाहिए या मोती शुद्धिकरण (चरण 4.15) (चित्रा 3 ई-एफ) के आगे के दौर से गुजरना चाहिए।

सीमाओं
इस प्रोटोकॉल को अन्य पौधों के ऊतकों और अन्य पौधों की प्रजातियों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए लागू किया जा सकता है। हालांकि, सेल अलगाव प्रक्रिया प्रोटोप्लास्ट की तैयारी पर अत्यधिक निर्भर है। कुछ सेल प्रकारों को अलग करना मुश्किल होता है, जैसे संवहनी कोशिकाएं और महिला सेक्स कोशिकाएं, जो ऊतक के इंटीरियर में स्थित होती हैं और / या संख्या में कम होती हैं। उन कोशिकाओं के लिए जिनके लिए प्रोटोप्लास्ट तैयार करना मुश्किल है, प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक सॉर्टिंग (एफएएनएस) 27 एक वैकल्पिक विधि है जिसका उपयोग किया जा सकता है। इस बीच, एफएसीएस द्वारा विशिष्ट सेल प्रकार प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग फ्लोरोसेंट मार्कर लाइनों की उपलब्धता पर निर्भर करता है। ऐसी मार्कर लाइनों की कमी फसलों और बागवानी पौधों में इन तरीकों के उपयोग को सीमित करती है। फसलों में उच्च-थ्रूपुट सिंगल-सेल आरएनए-सेक तकनीक के अनुप्रयोग से नए सेल-प्रकार-विशिष्ट मार्कर जीन का पता चलेगा, जिसका उपयोग सेल-टाइप मार्कर लाइनों को विकसित करने और एफएसीएस-आधारित सेल-टाइप आरएनए-सेक और मल्टी-ओमिक्स अध्ययनों की अनुप्रयोग क्षमता को व्यापक बनाने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हमने इस प्रोटोकॉल को स्कूल ऑफ एग्रीकल्चर एंड बायोलॉजी, शंघाई जिओ टोंग विश्वविद्यालय की एकल-सेल मल्टी-ओमिक्स सुविधा में स्थापित किया, और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 32070608), शंघाई पुजियांग कार्यक्रम (अनुदान संख्या 20पीजे 1405800), और शंघाई जिओ टोंग विश्वविद्यालय (अनुदान संख्या कृषि-एक्स 20200202, 2019 टीपीबी 05) द्वारा समर्थित थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm strainer Sorfa  622110
Agar Yeasen 70101ES76
Agilent fragment analyzer Aglient Aglient 5200
Agilent high-sensitivity DNA kit Aglient DNF-474-0500
Ampure XP beads BECKMAN A63881
Betaine yuanye S18046-100g
Bleach Mr Muscle FnBn83BK 20% (v/v) bleach
BSA sigma 9048-46-8
CaCl2 yuanye S24109-500g
Cellulase R10 Yakult (Japan) 9012-54-8
Cellulase RS Yakult (Japan) 9012-54-8
Centrifuge tube (1.5 mL) Eppendolf 30121589
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants Beyotime R0127
dNTPs (10 mM) NEB N0447S
DTT (0.1 M)
invitrogen		 18090050
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 100092680
FACS BD FACS Melody BD-65745
FACS Sony SH800S
Filter tip  (1000 µL) Thermo Scientific TF112-1000-Q
Filter tip  (200 µL) Thermo Scientific TF140-200-Q
Filter tip (10 µL) Thermo Scientific TF104-10-Q
Filter tip (100 µL) Thermo Scientific TF113-100-Q
Fluorescent microscope Nikon Eclipse Ni-E
Four-Dimensional Rotating Mixer Kylin -Bell BE-1100
Hemicellulase sigma 9025-56-3
IS PCR primer 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) Roche  7958935001
KCl Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 7447-40-7
Macerozyme R10 Yakult (Japan) 9032-75-1
Magnetic separation stand invitrogen 12321D
Mannitol aladdin 69-65-8
MES aladdin 145224948
MgCl2  yuanye R21455-500ml
Microcentrifuges Eppendorf Centrifuge 5425
Micro-mini-centrifuge Titan Timi-10k
MS Phytotech M519
Nextera XT DNA Library Preparation Kit illumina FC-131-1024
oligo-dT30VN primer 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'
PCR instrument Thermal cycler A24811
Pectolyase Yakult (Japan) 9033-35-6
Plant marker lines Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit invitrogen Q33231
Qubit 2.0 fluorometer invitrogen Q32866
RNase inhibitor  Thermo Scientific EO0382
RNase-free water invitrogen 10977023
Solution A 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solution B 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %  (w/v)hemicellulase, 0.5 %  (w/v)pectolyase and 1 %  (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A
Sterile pestle BIOTREAT 453463
Strainer (40 µm ) Sorfa  251100
SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL) invitrogen 18090050
SuperScript IV buffer (5x) invitrogen 18090050
Test tube (5 mL) BD Falcon 352052
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) AXYGEN PCR-05-C
Triton X-100 Sangon Biotech A600198-0500
TSO primer 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'
Vortex Titan VM-T2

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References

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