Summary
Gjennomførbarheten og effektiviteten av scRNA-seq-metoder med høy gjennomstrømning varsler en enkeltcelle-epoke i planteforskning. Presentert her er en robust og komplett prosedyre for isolering av spesifikke Arabidopsis thaliana rotcelletyper og påfølgende transkriptombibliotekkonstruksjon og analyse.
Abstract
I multicellulære organismer kan utviklingsprogrammering og miljørespons være svært divergerende i forskjellige celletyper eller til og med i celler, som er kjent som cellulær heterogenitet. I de senere år har enkeltcelle- og celletypeisolasjon kombinert med neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS) blitt viktige verktøy for å studere biologiske prosesser ved encelleoppløsning. Imidlertid er isolering av planteceller relativt vanskeligere på grunn av tilstedeværelsen av plantecellevegger, noe som begrenser anvendelsen av enkeltcellede tilnærminger i planter. Denne protokollen beskriver en robust prosedyre for fluorescensaktivert cellesortering (FACS)-basert enkeltcelle- og celletypeisolasjon med planteceller, som er egnet for nedstrøms multi-omics-analyse og andre studier. Ved hjelp av Arabidopsis rotfluorescerende markørlinjer demonstrerer vi hvordan bestemte celletyper, som xylem-pol pericycle celler, laterale rot initialceller, laterale rot cap celler, cortex celler og endodermale celler, er isolert. Videre er det også gitt en effektiv nedstrøms transkriptomanalysemetode ved bruk av Smart-seq2. Celleisolasjonsmetoden og transkriptomanalyseteknikker kan tilpasses andre celletyper og plantearter og har et bredt anvendelsespotensial i plantevitenskap.
Introduction
Celler er den grunnleggende enheten i alle levende organismer og utfører strukturelle og fysiologiske funksjoner. Selv om cellene i flercellede organismer viser tilsynelatende synkronitet, presenterer celler av forskjellige typer og individuelle celler forskjeller i deres transkriptomer under utviklings- og miljøresponser. High-throughput enkeltcelle RNA-sekvensering (scRNA-seq) gir enestående kraft for å forstå cellulær heterogenitet. Bruk av scRNA-seq i plantevitenskap har bidratt til vellykket konstruksjon av et plantecelleatlas1, har blitt brukt til å identifisere sjeldne cellulære taxa i plantevev2, har gitt innsikt i sammensetningen av celletyper i plantevev, og har blitt brukt til å identifisere cellulær identitet og viktige funksjoner ansatt under planteutvikling og differensiering. I tillegg er det mulig å utlede spatiotemporale utviklingsbaner i plantevev 1,2,3 for å oppdage nye markørgener4 og studere funksjonene til viktige transkripsjonsfaktorer 5 ved hjelp av scRNA-seq for å avsløre evolusjonær bevaring av samme celletype i forskjellige planter 3. Abiotiske påkjenninger er blant de viktigste miljøpåvirkningene på plantevekst og utvikling. Ved å undersøke endringene i sammensetningen av celletyper i plantevev under ulike behandlingsbetingelser gjennom encellet transkriptomsekvensering, kan man også løse den abiotiske stressresponsmekanismen6.
Potensialet for å løse transkripsjonell heterogenitet mellom celletyper ved bruk av scRNA-sekvensering avhenger av celleisolasjonsmetoden og sekvenseringsplattformen. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) er en mye brukt teknikk for å isolere en underpopulasjon av celler for scRNA-seq basert på lysspredning og fluorescensegenskapene til cellene. Utviklingen av fluorescerende markørlinjer ved transgen teknologi har i stor grad forbedret effektiviteten av celleisolasjon av FACS7. Gjennomføring av scRNA-seq ved bruk av Smart-seq28 forbedrer ytterligere evnen til å dissekere den cellulære heterogeniteten. Smart-seq2-metoden har god sensitivitet for gendeteksjon og kan oppdage gener selv med lav transkripsjonsinngang9. I tillegg til bulkcelletypeinnsamling gir moderne cellesorterere et enkeltcelleindekssorteringsformat, noe som tillater transkriptomanalyse ved enkeltcelleoppløsning ved bruk av Smart-seq210 eller andre multipleksede RNA-seq-metoder, for eksempel CEL-seq211. Enkeltcelle- eller celletypesortering kan potensielt brukes til mange andre nedstrømsapplikasjoner, for eksempel parallelle multi-omics-studier12,13. Presentert her er en robust og allsidig protokoll for isolering av plantecelletyper, for eksempel xylem-pole pericycle celler, laterale rot cap celler, laterale rot initialceller, cortex celler og endodermale celler fra røttene til Arabidopsis thaliana markør cellelinjer av FACS. Protokollen innebærer videre å konstruere Smart-seq2-biblioteket for nedstrøms transkriptomanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll er optimalisert for A. thaliana wild-type (WT) frø uten fluorescens og fluorescerende markørlinjer for følgende rotcelletyper: xylem-pole pericycle celler (J0121), laterale rot initial celler, laterale rot cap celler (J3411), endodermis og cortex celler (J0571) (figur 1A). Alle markørlinjene ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell), bortsett fra den laterale rotinitieringscellemarkørlinjen, som ble generert ved å introdusere en GATA23-promotordrevet GFP-konstruksjon i en villtype Arabidopsis-plante etter en tidligere publisert rapport14.
1. Forberedelse av plantematerialet
- Steriliser A. thaliana WT-frø og fluorescerende markørlinjefrø ved å inkubere frøene i 20% blekemiddel i en roterende inkubator ved romtemperatur i 15 minutter.
- Skyll frøene i dobbeltdestillert vann (ddH2O) tre til fem ganger. Utfør dette trinnet på en steril ren benk.
- Plate WT og reporter line frø på halv styrke Murashige og Skoog (MS) medium med 0,8% agar (w / v) 15. Dyrk plantene vertikalt i 5 dager (16 timer lys ved 23 °C) etter lagdeling i 2 dager ved 4 °C.
2. Protoplasting
- Forbered protopsiste oppløsninger2,5, referert til som løsning A og oppløsning B (se materialtabell).
- Tilbered oppløsning A som inneholder 400 mM mannitol, 0,05 % BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2 og 20 mM KCl (se materialfortegnelse). Oppbevar oppløsning A ved -20 °C i opptil 1 måned.
- Klargjør oppløsning B ved å tilsette 1 % (w/v) cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v) hemicellulase, 0,5 % (w/v) pektolyase og 1 % (w/v) macerozyme R10 i en fersk alikot av løsning A. Oppbevar oppløsning B ved -20 °C i opptil 1 måned.
- Tine løsning A og løsning B forsiktig på is før du begynner eksperimentet.
- Klipp av røttene med et rent blad eller saks, og hakk røttene i ~ 0,5 cm biter. Senk røttene i 1,5 ml oppløsning B etterfulgt av forsiktig rotasjon (ved ca. 18 o / min) ved romtemperatur i 1,5-2 timer.
- Filtrer rotprotoplaster gjennom 40 μm silnett (se materialfortegnelse).
- Skyll silnettet med 1-2 ml løsning A.
- Kombiner væskene i trinn 2.4 og trinn 2.5, og sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten med en pipette, resuspender cellepelleten i 500-600 mikrol oppløsning A, og legg den deretter på is umiddelbart.
- Overfør den resuspenderte celleoppløsningen til et nytt 5 ml reagensrør for cellesortering.
3. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS)
- Slå på og fullfør trinnene for instrumentoppsett på sorteringsenheten (se Materialfortegnelse). Velg fluorescenskanaler, bruk et WT-anlegg (ingen fluorescens) som en kontroll for å bestemme grunnlinjen for autofluorescens, og juster sorteringsporten basert på fluorescensintensiteten og FSC/SSC-singleter (figur 2).
- Tilsett 500 μL oppløsning A (trinn 2.1.1) i et 1,5 ml oppsamlingsrør for å forhindre at cellene blir skadet. Samle 2000-3000 celler per rør.
- Etter sortering legges prøvene umiddelbart på is, sentrifugerer oppsamlingsrøret som inneholder cellene ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C, og fjerner supernatanten med en pipette.
- Ta 2 μL sorterte celler, og sjekk for fluorescens ved hjelp av et fluorescensmikroskop (se materialtabell).
- Lagre de sorterte cellene ved -80 °C, eller bruk dem umiddelbart til bibliotekkonstruksjon (trinn 4).
- For encelleindekssortering, plasser 96-brønnplaten i adapteren. Kalibrer posisjonen til platen slik at dråpen faller i midthullet på platen. Velg enkeltcellesorteringsmodus når du sorterer, skriv inn målnummeret for sorterte celler som 1, og start sorteringen.
4. Klargjøring av Smart-seq2-bibliotek
- Som et resultat av den ultra-lave mengden inngang, utfør encelle type RNA-seq bibliotekkonstruksjon i et forurensningsfritt miljø. Før du begynner forsøket, rengjør benken med en overflatedekontaminant8 (se materialtabell) og 75% etanol.
- Forbered lysisbuffer (blanding A) (tabell 1) ved å kombinere 0,33 μL 10% Triton X-100, 0,55 μL RNase-hemmer og 0,22 μL 0,1 M DTT (se materialtabell).
- Tilsett 1 μL blanding A i den sorterte prøven, og slip med en steril pestle. Det foretrukne prøvevolumet er ≤0,5 μL; bruk RNase-fritt vann for å gjøre opp volumet til 14 μL. Overfør hver enkelt celleprøve til et 0,2 ml tynnvegget PCR-rør.
- Forbered blanding B inneholdende 0,44 μL oligo-dT30VN revers transkripsjon (RT) reaksjonsprimer (100 μM) og 4,4 μL dNTP (10 mM) (tabell 2) (se materialtabell).
- Tilsett 4,4 μL blanding B til 14 μL prøven i hver tube, pipett forsiktig for å blande prøven, og inkuber prøven ved 72 °C i 3 minutter. Etter inkubering, legg straks prøvene på is for å hybridisere oligo-dT til poly A-halen.
- Forbered blandingen av reverstranskripsjonsreaksjonen (blanding C) (tabell 3) (se materialfortegnelse). Tilsett 21,6 μl blanding C til hvert rør som inneholder prøvene. Slå på RT-programmet på et vanlig PCR-instrument (tabell 4).
- Utfør forsterkningsreaksjonen på is. Tilbered blanding D ved å kombinere 44 μL 2x PCR-polymeraseblanding og 0,88 μL IS PCR-primer (10 μM) (tabell 5) (se materialtabell). Tilsett 40,8 μL blanding D til 40 μL RT-reaksjonsprodukt, og kjør forforsterkerprogrammet (tabell 6).
- Rens preamplifikasjonsreaksjonsproduktene ved hjelp av Ampure XP-perler (se materialfortegnelse). Tilsett 48 μl perler (forholdet 0,6:1) i hver prøve fra trinn 4,7, og bland prøvene forsiktig ved pipettering.
- Inkuber prøvene ved romtemperatur i 10 minutter. Plasser 1,5 ml rørene som inneholder prøvene på et magnetisk separasjonsstativ i 5 minutter. Kast forsiktig supernatanten fra prøvene uten å forstyrre perlene.
- Vask perlene ved å resuspendere dem i 200 μL 80% etanol, og legg prøvene på magnetseparasjonsstativet (se materialfortegnelse) i ytterligere 3 minutter før du kaster den etanolholdige supernatanten.
- Lufttørk prøvene i 10 minutter, og dekk til tuben for å forhindre forurensning og krysskontaminering under lufttørkingen.
- Resuspender perlene i 20 μL ddH2O, inkuber prøvene ved romtemperatur i 5 minutter, og legg dem deretter på magnetisk separasjonsstativ i 5 minutter.
- Pipetter ut 18 μl av supernatanten fra hvert rør, og overfør prøvene til nye 1,5 ml sentrifugerør. Bruk 1 μL av prøven til å vurdere kvaliteten på cDNA ved hjelp av et DNA-kvantifiseringssett, bestem størrelsesfordelingen av hvert prebibliotek ved hjelp av en fragmentanalysator (se materialfortegnelse), og lagre den gjenværende prøven ved -20 °C.
- Konstruer et cDNA-bibliotek8 for Illumina-sekvensering 16 fra prelibrary-produktet i trinn4.13 ved hjelp av et forberedelsessett for sekvenseringsbibliotek (se Materialfortegnelse).
- Rens bibliotekene (fra trinn 4.14) ved hjelp av Ampure XP-perlene, kvantifiser de rensede bibliotekene, og bestem størrelsesfordelingen av hvert bibliotek etter trinn 4.13.
MERK: Pool lik nanomoles av hvert bibliotek, slik at ingen av dem har samme kombinasjon av Illumina indeks. Ellers kan bibliotekene samles i et forhold basert på ønsket sekvenseringsutgang og sekvenseres sammen på samme bane i Illumina-sekvenseren. Vanligvis gir sekvensering av hvert bibliotek til en dybde på 4-6 GB, som gir >10 millioner kartlagte lesninger, 20x-30x dekning av Arabidopsis-genomet . Lavere sekvenseringsdybder er også akseptabelt, men kan påvirke betydningen av differensialuttrykksanalysen.
5. RNA-seq dataanalyse
- Trim råavlesningene ved hjelp av Trim-Galore17 etterfulgt av kartlegging til referansegenomet ved hjelp av hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2), og fjern PCR-dupliserte fragmenter ved hjelp av Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
- Utfør råtellingsbehandling og påfølgende analyse av differensielt uttrykte gener (DEG) med DESeq220 ved bruk av minst tre biologiske replikater for hver prøve. Utføre clustering av genuttrykket med Pheatmap-pakken, og visualisere i et uttrykksvarmekart.
MERK: RPKM-verdiene (avlesninger per kilobase per million kartlagte avlesninger) av genene og TEs (transposable elements) ble beregnet med Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) og visualisert i en genomleser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protoplast-isolasjon
Denne protokollen er effektiv for protoplastsortering av fluorescerende A. thaliana rotmarkørlinjer. Disse markørlinjene er utviklet ved fusjon av fluorescerende proteiner med gener uttrykt spesifikt i målcelletyper, eller ved bruk av forsterkerfellelinjer (figur 1). Tallrike vev og organer har blitt dissekert i celletyper som uttrykker spesifikke fluorescerende markører i modellplanter og avlinger.
FACS-populasjon, sorterte celler og biblioteks-QC
Ved å bruke en villtypeplante som kontroll- og innstillingsporter som fremoverspredning (FSC) og sidespredning (SSC), bestemte vi en stor populasjon av celler av interesse og en grunnlinje for autofluorescens og sorterte de fluorescensspesifikke merkede cellene (figur 2). Kvaliteten på de endelige sekvenseringsbibliotekene (fra trinn 4.15) ble bestemt av fragmentstørrelsesfordelingsanalysen. De representative resultatene av RNA-seq-biblioteket på ca. 2000 xylem-pole pericycle celler, laterale rot primordia celler, endodermis / cortex celler og laterale rot cap celler er vist i figur 3A-D.
Analyse av uttrykksmønstre
Kvaliteten på sekvenseringsdataene kan evalueres fra flere analyseprosedyrer, for eksempel sekvenseringsdybde, kartleggingshastighet og fastQC-rapporter. Nøyaktigheten og følsomheten til sekvenseringsdataene kan demonstreres ved tilstedeværelsen av en serie celletypeberikede gener, som kan identifiseres fra DEG-analysen mellom isolerte celletyper og hele vevet. Gener med signifikant høyere ekspresjonsnivåer i visse celletyper kan identifiseres som celletypeberikede gener. I mellomtiden kan genomleservisningene av hver celletype sammenlignes side om side for å vise ekspresjonsnivåene til kjente markørgener og teste om uttrykksmønsteret til markørgenene kan rekonstrueres i celletypeuttrykksdataene. Som et eksempel ble genene som er beriket i noen av de fire rotcelletypene gruppert og vist i varmekart, som viste spesifisiteten av genuttrykk blant forskjellige celletyper (figur 4). YUCCA3, MYB36, WOX5 og PFA1 ble undersøkt, og uttrykksmønstrene var som forventet i henhold til tidligere rapporter21,22,23,24. Dataanalysepipeliner og representative råsekvenseringsdata er tilgjengelige i et offentlig depot (github.com/gaolabsjtu/root_cell_types_RNAseq).
Figur 1: Den spesifikke markørlinjen for celletype for rot- og protoplastpreparat. (A, venstre) Enhancer overlappingslinjeintroduksjon og bilder. (A, høyre) Den spesifikke markørlinjen for celletypen til roten. (B) Et bilde av protoplastpreparatet før sortering. Skalastengene for lateral rotgrunnleggercelle, pericyklus, endodermis / cortex, lateral rothette og protoplaster representerer henholdsvis 25 μm, 100 μm, 100 μm, 75 μm og 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Etablering av FACS for spesifikke rotcelletyper. Eksempel på et FACS-eksperiment: (A) hovedbefolkningen som bruker SSC og FSC; (B) de GFP-positive (+) og GFP-negative (−) portene; (C) lysfeltet og (D) fluorescensbilder av de sorterte cellene. Skalastangen representerer 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Størrelsesfordeling av Smart-seq2-sekvenseringsbiblioteker. Representative fragmentstørrelsesfordelinger av sekvenseringsbibliotekene (fra trinn 4.15) generert fra xylem-pol pericycle celler (A), laterale rot primordia celler (B), endodermis / cortex celler (C) og laterale rot cap celler (D). (E) Et lite bibliotek med primer / adapter dimer topper, som fortsatt kan sekvenseres etter størrelsesvalg. (F) Et bibliotek med en unormal størrelsesfordeling, som indikerte mislykket bibliotekforberedelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Celletypeberiket genanalyse. En DEG-analyse ble utført mellom hver celletype og hele roten; Gener med mer enn fire ganger oppregulering i hver celletype ble identifisert som celletypeberikede gener. Disse genene ble kombinert, gruppert og visualisert i varmekartplottet (øvre panel). De celletypeberikede genene inkluderte mange kjente markørgener; typiske markørgener som YUCCA3, MYB36, WOX5 og PFA1 ble valgt å vise i genomleseren (nedre panel). Forkortelser: LRP = lateral root primordia; Endo/Cor = endodermis/cortex; LRC = lateral rothette. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Komponenter | Volum (μL) |
| 10% Triton X-100 | 0.33 |
| RNase-hemmer | 0.55 |
| DTT (0,1 M) | 0.22 |
Tabell 1: Reaksjonskomponenter for fremstilling av cellelysebuffer (blanding A).
| Komponenter | Volum (μL) |
| Oligo-dT30VN (100 μM) | 0.44 |
| dNTP (10 mM) | 4.4 |
Tabell 2: Reaksjonskomponenter for fremstilling av blanding B.
| Komponenter | Volum (μL) |
| Buffer for hevet skrift IV (5x) | 8.8 |
| Betaine (5 M) | 8.8 |
| DTT (0,1 M) | 2.2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.264 |
| TSO (100 μM) | 0.44 |
| SuperScript IV revers transkriptase (200 E/μL) | 2.2 |
| RNase-hemmer | 1.1 |
Tabell 3: Reaksjonskomponenter for fremstilling av PCR-blandingen med revers transkripsjon (blanding C).
| Sykkel | Temperatur (°C) | Tid |
| 1 | 50 | 90 min |
| 2-11 | 55 | 2 min |
| 50 | 2 min | |
| 12 | 70 | 15 min |
| 13 | 4 | ∞ |
Tabell 4: Omvendt transkripsjon (RT) PCR-innstillinger for syntetisering av cDNA fra mRNA.
| Komponenter | Volum (μL) |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | 44 |
| IS PCR-primer (10 μM) | 0.88 |
Tabell 5: Reaksjonskomponenter for fremstilling av pre-amplifikasjonsreaksjonsblandingen (blanding D).
| Sykkel | Temperatur (°C) | Tid |
| 1 | 98 | 5 min |
| 2-13 | 98 | 20 s |
| 67 | 30 s | |
| 72 | 3 min | |
| 14 | 72 | 5 min |
| 15 | 4 | ∞ |
Tabell 6: PCR-programinnstillinger for pre-amplifikasjonsreaksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Smart-seq2-baserte protokollen kan generere pålitelige sekvenseringsbiblioteker fra flere hundre celler8. Kvaliteten på utgangsmaterialet er avgjørende for nøyaktigheten av transkriptomanalysen. FACS er et kraftig verktøy for å forberede celler av interesse, men denne prosedyren, spesielt protoplastingstrinnet, må optimaliseres for planteapplikasjoner. Laserfangstmikrodisseksjon (LCM) eller manuelle dissekerte celler kan også brukes som input25,26, slik at protokollen som er gitt her potensielt kan brukes i en rekke plantearter og celletyper med eller uten kjente markørgener.
Forberedelse av plantematerialet
I planteutviklingsbiologi brukes FACS vanligvis til å isolere berikede cellepopulasjoner som uttrykker en fluorescerende markør. Plantene som uttrykker en slik markør er protoplasterte, og protoplaster blir etter hvert sortert i rene delpopulasjoner basert på uttrykket av den celletypespesifikke markøren. Derfor må signalet til den fluorescerende markøren være sterk og spesifikk. I tillegg bør forskeren sjekke hvilke markører som kan sorteres på forhånd. Antall frø som trengs, avhenger av uttrykksnivået, hvor markøren uttrykkes, hvor mange celler som trengs for nedstrømsapplikasjoner, og hvor mange replikater som sorteres. Hvis uttrykket er i en enkelt celletype med svært få celler per plante, er det generelt behov for et større antall planter enn hvis markøren uttrykkes i et høyere antall celler. Det er best å empirisk bestemme antall frø som kreves for individuelle markørlinjer. Det er spesielt meningsfylt å utføre foreløpige eksperimenter med hver markørlinje for å optimalisere vinduet for sortering og vite hvor mange celler som vil resultere fra et fast antall planter. Hvis forsøksmaterialet er røtter, for å forhindre at røttene synker ned i agaren og for å lette skjæringen av rene røtter, kan det legges et passende stort og autoklavert nett på den middels holdige agar før frøbelegget. Lagdeling ved lav temperatur bidrar til frøspredning og utvikling, så vi foreslår å stratifisere frøene ved 4 °C i 2 dager etter sterilisering eller plating og deretter dyrke plantene vertikalt.
Protoplasting og FACS
Protoplasting og sortering 5-6 dager etter stratifisering fungerer godt. Løsning A og løsning B må filtreres med en 0,22 μm sil. I tillegg vil lagring av løsning B ved -20 °C over lengre tidsperioder redusere enzymenes effektivitet. Før du begynner, skal løsning A og løsning B tines forsiktig på is, noe som tar ca. 20 minutter. Løsning B må ikke ristes, da risting av løsning B kan forstyrre enzymene og kan forårsake overdreven bobledannelse. Vasking av silnettet med løsning A flere ganger kan øke antall celler oppnådd i trinn 2.5. Som beskrevet i trinn 2.6 skal ikke hele supernatanten aspireres, da protoplaster er nederst nær pelleten og ikke kan sees. Før sortering er det best å sikre at konsentrasjonen av protoplaster er ca. 105-10 6 celler / ml for å oppnå bedre sorteringseffektivitet. Når du setter opp et nytt eksperiment, kreves det samme vevet fra WT-anlegget som en kontroll for å sette opp sorteringsporten. I trinn 3.1 anbefales det å velge fluorescenskanaler (f.eks. PE og FITC) først og bruke en kontrollprøve for å bestemme hovedpopulasjonen i henhold til SSC og FSC. I tillegg anbefales det å justere portens posisjon ved å endre spenningen til fluorescenskanalen for å sikre at styresignalet er plassert til venstre for porten (dvs. den negative gruppen ligger under 103). Sorteringstiden må være begrenset til 30 min eller mindre enn 60 min for å forhindre endringer i genuttrykk, som kan oppstå på grunn av protoplasting eller sortering. Etter sortering bør et lite antall sorterte celler samles inn og kontrolleres for fluorescens (trinn 3.4). Så mye buffer bør fjernes som mulig fra supernatanten for å unngå innvirkning på nedstrøms bibliotekkonstruksjon (trinn 3.3).
Bygging av RNA-seq-biblioteket
For konstruksjon av RNA-seq-biblioteket anbefaler vi å bruke celler umiddelbart etter sortering for å redusere nedbrytningen av RNA. Det er ikke tilrådelig å starte med for mange celler, da dette kan resultere i et bibliotek av dårlig kvalitet på grunn av utilstrekkelige reaksjoner. Antall PCR-sykluser i trinn 4.7 og trinn 4.14 avhenger av inngangsmengden av RNA/cDNA. Antall sykluser kan økes når det er mindre inngang eller senkes når det er mer inngang. Derfor anbefales det å ta noen av de blandede prøvene fra trinn 4.7 og trinn 4.14 for å kjøre sanntids PCR med samme forsterkningsprosedyre og deretter bestemme det endelige antallet sykluser basert på resultatene fra qPCR før den formelle forsterkningen av prebiblioteket/biblioteket. I tillegg, før rensetrinn 4.8, må Ampure XP-perlene likevektes ved romtemperatur i minst 10 minutter og deretter virveles godt. Volumet av perler i rensetrinnet bør ikke økes over forholdet 0,8:1. Ellers vil dette øke overføringen av primerdimerer. I tillegg bør man unngå overdrying av perlene i trinn 4.11 for å forhindre vanskelig resuspensjon. Et kvalifisert førbibliotek bør ha en gjennomsnittlig størrelse på ca. 1,5-2 kb og en liten mengde korte (<500 bp) fragmenter. Unormale størrelsesfordelinger eller små primer-/adapterdimertopper i biblioteker er indikatorer på dårlig kvalitet, og disse prøvene bør kastes eller gjennomgå ytterligere runder med perlerensing (trinn 4.15) (figur 3E-F).
Begrensninger
Denne protokollen kan brukes til å isolere celler fra andre plantevev og andre plantearter. Imidlertid er celleisolasjonsprosessen svært avhengig av fremstillingen av protoplastene. Noen celletyper er vanskelige å isolere, for eksempel vaskulære celler og kvinnelige kjønnsceller, som ligger i det indre av vevet og/eller er få i antall. For celler der det er vanskelig å fremstille protoplaster, er fluorescensaktivert kjernesortering (FANS)27 en valgfri metode som kan brukes. I mellomtiden avhenger bruk av denne protokollen for å oppnå spesifikke celletyper ved FACS av tilgjengeligheten av fluorescerende markørlinjer. Mangelen på slike markørlinjer begrenser bruken av disse metodene i avlinger og hagebruk. Anvendelsen av single-cell RNA-seq-teknologi med høy gjennomstrømning i avlinger vil avsløre nye celletypespesifikke markørgener, som videre kan brukes til å utvikle celletypemarkørlinjer og utvide applikasjonsevnen til FACS-baserte celle-type RNA-seq og multi-omics-studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi satte opp denne protokollen i single-cell multi-omics-anlegget ved School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, og ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 32070608), Shanghai Pujiang-programmet (Grant No. 20PJ1405800) og Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript IV buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| Test tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
- Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M.
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
