Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En protokol til evaluering og kvantificering af retinale pigmenterede epitelpatologier i musemodeller af aldersrelateret makuladegeneration

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

Musemodeller kan være nyttige værktøjer til at undersøge biologien af det retinale pigmenterede epitel (RPE). Det er blevet fastslået, at mus kan udvikle en række RPE-patologier. Her beskriver vi en fænotypeprotokol til belysning og kvantificering af RPE-patologier hos mus ved hjælp af lys, transmissionselektron og konfokal mikroskopi.

Abstract

Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) er en invaliderende retinal lidelse i aldrende befolkninger. Det er almindeligt antaget, at dysfunktion af retinal pigmenteret epitel (RPE) er en vigtig patobiologisk begivenhed i AMD. For at forstå de mekanismer, der fører til RPE-dysfunktion, kan musemodeller bruges af forskere. Det er blevet fastslået ved tidligere undersøgelser, at mus kan udvikle RPE-patologier, hvoraf nogle observeres i øjnene hos personer diagnosticeret med AMD. Her beskriver vi en fænotypeprotokol til vurdering af RPE-patologier hos mus. Denne protokol omfatter forberedelse og evaluering af retinale tværsnit ved hjælp af lysmikroskopi og transmissionselektronmikroskopi såvel som RPE-fladmonteringer ved konfokal mikroskopi. Vi beskriver de almindelige typer murin RPE-patologier, der observeres ved disse teknikker og måder at kvantificere dem gennem upartiske metoder til statistisk testning. Som bevis på konceptet bruger vi denne RPE-fænotypeprotokol til at kvantificere RPE-patologierne observeret hos mus, der overudtrykker transmembranprotein 135 (Tmem135) og ældre vildtype C57BL/6J-mus. Hovedformålet med denne protokol er at præsentere standard RPE-fænotypemetoder med upartiske kvantitative vurderinger for forskere, der bruger musemodeller af AMD.

Introduction

Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) er en almindelig blindende sygdom, der rammer befolkninger over 55år 1. Mange forskere mener, at dysfunktion i retinal pigmenteret epitel (RPE) er en tidlig og afgørende patobiologisk begivenhed i AMD2. RPE er et monolag af polariserede celler, der har til opgave at opretholde homeostase af nærliggende fotoreceptorer og choroidale blodkar3. Der findes en række modeller til at undersøge sygdomsassocierede mekanismer inden for RPE, herunder cellekulturmodeller4,5 og mus 6,7,8. En nylig rapport har beskrevet standardiserede protokoller og kvalitetskontrolkriterier for RPE-cellekulturmodeller4, men ingen rapport har forsøgt at standardisere fænotypningen af RPE i musemodeller. Faktisk mangler mange publikationer om musemodeller af AMD en komplet beskrivelse af RPE eller kvantificering af RPE-patologierne i dem. Det overordnede mål med denne protokol er at præsentere standard RPE-fænotypemetoder med upartiske kvantitative vurderinger for forskere, der bruger AMD-musemodeller.

Tidligere publikationer har bemærket tilstedeværelsen af flere RPE-patologier hos mus gennem tre billeddannelsesteknikker. For eksempel giver lysmikroskopi forskere mulighed for at se den grove morfologi af murine nethinden (figur 1A) og opdage RPE-patologier såsom RPE-udtynding, vakuolisering og migration. RPE-udtynding i en AMD-musemodel eksemplificeres ved en afvigelse i RPE-højden fra deres respektive kontroller (figur 1B). RPE-vakuolisering kan opdeles i to separate kategorier: mikrovakuolisering (figur 1C) og makrovakuolisering (figur 1D). RPE-mikrovakuolisering opsummeres ved tilstedeværelsen af vakuoler i RPE, der ikke påvirker dens samlede højde, mens makrovakuolisering indikeres ved tilstedeværelsen af vakuoler, der stikker ud i de ydre segmenter af fotoreceptorerne. RPE-migration kendetegnes ved pigmentets fokalaggregat over RPE-monolaget i et nethindetværsnit (figur 1E). Det skal bemærkes, at migrerende RPE-celler i AMD-donorøjne udviser immunreaktivitet over for immuncellemarkører, såsom klynge af differentiering 68 (CD68)9, og kan repræsentere immunceller, der opsluger RPE-affald eller RPE, der gennemgår transdifferentiering9. En anden billeddannelsesteknik kaldet transmissionselektronmikroskopi kan give forskere mulighed for at visualisere ultrastrukturen af RPE og dens kældermembran (figur 2A). Denne teknik kan identificere den fremherskende sub-RPE-aflejring hos mus, kendt som den basale laminære aflejring (BLamD) (figur 2B)10. Endelig kan konfokal mikroskopi afsløre strukturen af RPE-celler gennem billeddannelse af RPE-flade monteringer (figur 3A). Denne metode kan afdække RPE-dysmorfi, afvigelsen af RPE fra dens klassiske bikageform (figur 3B). Det kan også detektere RPE-multinucleation, tilstedeværelsen af tre eller flere kerner i en RPE-celle (figur 3C). For et resumé af de typer RPE-patologier, der findes i nuværende AMD-musemodeller, henviser vi forskere til disse anmeldelser fra litteraturen 6,7.

Forskere, der studerer AMD, bør være opmærksomme på fordele og ulemper ved at bruge mus til at undersøge RPE-patologier inden fænotypeprotokollen. Mus er fordelagtige på grund af deres relativt korte levetid og omkostningseffektivitet samt deres genetiske og farmakologiske manipulerbarhed. Mus udviser også RPE-degenerative ændringer, herunder RPE-migration, dysmorfi og multinucleation, der observeres i AMD-donorøjne 11,12,13,14,15,16,17; dette tyder på, at lignende mekanismer kan ligge til grund for udviklingen af disse RPE-patologier hos mus og mennesker. Der er dog vigtige forskelle, der begrænser oversætteligheden af musestudier til human AMD. For det første har mus ikke en makula, en anatomisk distinkt region af den menneskelige nethinde, der er nødvendig for synsstyrke, der fortrinsvis påvirkes i AMD. For det andet ses nogle RPE-patologier hos mus, som RPE-udtynding og vakuolisering, typisk ikke i AMD-donorøjne18. For det tredje udvikler mus ikke drusen, et kendetegn ved AMD-patologi19. Drusen er lipid- og proteinholdige aflejringer med meget få kældermembranproteiner, der dannes mellem RPE basal lamina og det indre kollagenøse lag af Bruchs membran (BrM)19. Drusen adskiller sig fra BLamD, den almindelige sub-RPE-aflejring i mus, både i deres sammensætning og anatomiske placering. BLamD'er er alders- og stressafhængige ekstracellulære matrixberigede abnormiteter, der dannes mellem RPE basal lamina af BrM og de basale indfoldninger af RPE20. Interessant nok har BLamD'er en lignende proteinsammensætning og udseende hos både mus og mennesker 6,10,21. Nyligt arbejde tyder på, at BLamD'er kan virke i AMD's patobiologi ved at påvirke udviklingen af AMD til dets senere stadier18,22; således kan disse aflejringer repræsentere syg RPE i musens nethinden. Viden om disse fordele og begrænsninger er afgørende for forskere, der er interesserede i at oversætte resultater fra musestudier til AMD.

I denne protokol diskuterer vi metoderne til at forberede øjnene på lys, transmissionselektron og konfokal mikroskopi for at visualisere RPE-patologier. Vi beskriver også, hvordan man kvantificerer RPE-patologier på en upartisk måde til statistisk testning. Som bevis på konceptet bruger vi RPE-fænotypeprotokollen til at undersøge de strukturelle RPE-patologier, der observeres i transmembranprotein 135- (Tmem135), der overudtrykker mus og ældre vildtypemus (WT) C57BL/6J-mus. Sammenfattende sigter vi mod at beskrive fænotypemetoden til at karakterisere RPE i AMD-musemodeller, da der i øjeblikket ikke er nogen standardprotokoller tilgængelige. Forskere, der er interesseret i at undersøge og kvantificere patologier af fotoreceptorerne eller choroid, som også påvirkes i AMD-musemodeller, finder muligvis ikke denne protokol nyttig til deres studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der involverer dyreforsøgspersoner, er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Wisconsin-Madison og er i overensstemmelse med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.

1. Evaluering af mus RPE ved lysmikroskopi

  1. Lav en fikseringsbuffer, der har en endelig koncentration af 2% paraformaldehyd og 2% glutaraldehyd ved stuetemperatur (RT) i en glasflaske.
    BEMÆRK: Denne protokol kræver højst 14 ml fikseringsbuffer pr. mus.
    FORSIGTIG: Paraformaldehyd og glutaraldehyd er farlige stoffer. Følg standardprocedurerne, når du arbejder med disse stoffer.
  2. Der fremstilles et tyngdekraftsfødeperfusionssystem på en absorberende underpude til hjerteperfusion i en stinkhætte (supplerende figur 1A).
    1. 40 ml af fikseringsbufferen anbringes i sprøjtecylinderen i perfusionssystemet (supplerende figur 1B).
    2. Drej ventilen, indtil den er parallel med slangeledningen, så bufferen kan strømme gennem slangeledningen (supplerende figur 1C). Skyl ledningen med buffer, indtil alle luftbobler er fjernet fra linjen.
    3. Drej ventilen, indtil den er vinkelret på slangeledningen for at forhindre bufferen i at strømme ind i slangeledningen (supplerende figur 1D).
      BEMÆRK: Perfusionssystemet er nu klar til brug.
  3. Aflive musen ved at placere den i et kuldioxid (CO 2) kammer og lad CO2 strømme ind i kammeret med en strømningshastighed på 30% af kammerets volumen pr. Minut. Når musen holder op med at trække vejret, skal du lade CO2 strømme ind i kammeret i mindst 1 min. Kontroller, at musen er død, før du går videre til næste trin.
    BEMÆRK: Eutanasi gennem injektion af farmakologiske midler kan anvendes i denne protokol som et alternativ til CO2 -indånding.
  4. Udfør hjerteperfusion på den euthaniserede mus.
    1. Overfør musen til en lav bakke nær perfusionssystemet med maven opad. Spray maven med 70% ethanol (EtOH).
    2. Lav fire snit for at blotlægge bughulen (supplerende figur 2A).
      1. Opret et 5 cm ringere snit ved hjælp af buet saks og tang gennem huden og abdominalvæggen på den fjerneste venstre side af musen, der er direkte under ribbenburet.
      2. Fortsæt med at lave et 3 cm medialt snit gennem musens hud og abdominalvæg, der begynder øverst på det ringere snit.
      3. Lav et andet 5 cm ringere snit i slutningen af det mediale snit gennem huden og abdominalvæggen på den fjerneste højre side af musen direkte under ribbenburet.
      4. Lav et andet 3 cm medialt snit for at fjerne mavehudklappen med buede tang.
    3. Skær gennem mellemgulvet og brystbenet for at blotte hjertet (supplerende figur 2B).
      BEMÆRK: Vær forsigtig med at undgå at hakke hjertet, arterierne og venerne. Nicking disse vil føre til en ineffektiv hjerteperfusion.
    4. Indsæt målernålen i hjertets venstre ventrikel. Drej ventilen, indtil den er parallel med slangeledningen. Klip det højre atrium med buet saks for at lade blod og fikseringsmiddel komme ud af hjertet (supplerende figur 2C).
    5. Lad 10 ml fikseringsbuffer trænge ind i musen i mindst 1-2 minutter, eller indtil leveren bliver bleg i farven, og intet blod strømmer ud af højre atrium. Når perfusionen er afsluttet, drejes ventilen, indtil den er vinkelret på slangeledningen for at stoppe bufferstrømmen.
  5. Enucleate øjnene fra musen efter hjerteperfusion.
    1. Fjern musen fra den lave bakke, og placer musen på den absorberende underpude i en stinkhætte. Orienter musens hoved, så venstre øje vender mod eksperimentatoren, og højre øje er ude af syne. Kommenter den overlegne side af øjet med et vævsmarkeringsfarvestof.
    2. Tryk forsigtigt ned med tommel- og pegefinger rundt om øjenhulen for at forårsage fremspring af øjet fra øjenhulen (supplerende figur 3A).
    3. Tag buet saks og hold den med bladet i en vinkel på 30° fra øjenhulen. Fortsæt med at klippe rundt om øjet med den buede saks i en vinkel på 30° (supplerende figur 3B).
      BEMÆRK: Det er okay at skære overskydende væv fra øjenhulen for at bevare øjeæblets integritet.
    4. Fjern øjeæblet fra hovedet med buede tang og læg det på en absorberende underpude. Nick hornhinden med et nummer 11 skalpelblad og placer øjet med buede tang i et 2 ml mikrorør med 2 ml fikseringsbuffer. Mærk 2 ml mikrorøret med museidentifikation og 'venstre' for at angive venstre øje.
      BEMÆRK: Nick i hornhinden gør det muligt for fikseringsmidlet let at trænge ind i øjet for bedre at bevare det.
    5. Gentag trin 1.5.1-1.5.4 for højre øje.
  6. Lad øjnene inkubere i fikseringsbuffer natten over på en ryster i et rum på 4 °C (C) med en hastighed på 75 rotationer pr. minut (rpm).
  7. Udskift den fikserende buffer med 2 ml 1x fosfatbuffersaltvand (PBS). Inkuber øjnene i 1x PBS i 10 min på en ryster ved RT og 75 o / min. Gentag dette trin to gange.
  8. Rens og disseker øjnene for at generere bageste segmenter.
    BEMÆRK: Det bageste segment er musens øjeæble med neurale nethinden, RPE, choroid og sclera sans hornhinden, iris og linse.
    1. Placer øjet i en petriskål fyldt med 1x PBS under et dissekerende mikroskop (supplerende figur 4A).
    2. Løft forsigtigt fedt og muskler væk fra øjeæblet med pincet. Trim forsigtigt fedt og muskler med mikrodissekerende saks parallelt med øjeæblet, indtil øjeæblet har en ensartet blålig-sort farve (supplerende figur 4B).
      BEMÆRK: Skær ikke vinkelret, da dette beskadiger øjeæblet. Hvis vævsmarkeringsfarvestoffet kommer ud under behandlingen, skal du straks notere den overlegne side af øjeæblet.
    3. Placer finspidsede tang på hornhindens punkteringssted. Skær rundt om hornhindens omkreds, begyndende på punkteringsstedet, med mikrodissekerende saks for at fjerne hornhinden og iris fra øjeæblet (supplerende figur 4C).
    4. Tag finspidsede pincet, og fjern forsigtigt linsen fra øjeæblet for at give det bageste segment (supplerende figur 4D).
    5. Placer det bageste segment tilbage i et 2 ml mikrorør med 2 ml 1x PBS. Opbevar det bageste segment i et køleskab på 4 °C.
      BEMÆRK: Bageste segmenter kan forblive i 1x PBS ved 4 °C i mange uger før videre behandling.
  9. Gentag trin 1.3-1.8 for at forberede øjnene fra andre mus i undersøgelsen.
  10. Behandl og integrer et af de bageste segmenter fra hver mus i paraffin til sektionering. Sørg for, at den øverste side af det bageste segment er øverst.
    BEMÆRK: Forfatterne stoler på University of Wisconsin-Madison (UW) Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) laboratorium for at udføre disse opgaver. Her er offentliggjorte protokoller ved hjælp af en lignende paraffinbehandling og indlejringsmetode23,24.
  11. Trim og snit hver paraffinblok for at opnå en 5 μm tyk retinal sektion, der inkluderer synsnervehovedet, samt fire yderligere 5 μm tykke retinale sektioner, der er 250 μm fra hinanden. Mærk diasene med museidentifikation og serienummeret (dvs. 1, 2, 3, 4 eller 5). Gem diasene i en diasboks.
    BEMÆRK: Forfatterne stoler på UW TRIP-laboratoriet for deres tjenester inden for paraffinsektionering. Her er offentliggjorte protokoller ved hjælp af lignende paraffinsektioneringsmetode25,26.
  12. Plet diasene, der indeholder retinale sektioner med hæmatoxylin og eosin (H&E). En protokol over H&E-farvning findes i supplerende figur 5.
    BEMÆRK: Alle trin i H&E-farvningsproceduren skal udføres i en stinkhætte.
  13. Indsaml syede billeder af H&E-farvede nethindesektioner med en skalabjælke ved hjælp af et lysmikroskop ved 20x forstørrelse.
  14. Kvantificer RPE-tykkelsen i nethindebillederne, der indeholder synsnervehovedet for hver prøve.
    1. Download og åbn Fiji ImageJ-programmet. Træk alle de syede nethindebilleder, der indeholder synsnervehovedet, ind på proceslinjen i Fiji ImageJ. Kontroller, at billedskalaen er kalibreret i μm og ikke pixel.
      BEMÆRK: Billedskalaen er placeret i øverste venstre hjørne af vinduet, der indeholder et nethindebillede i Fiji ImageJ-programmet. Hvis skalaen er indstillet i pixels, henvises til brugervejledningen til Fiji ImageJ-programmet for at konvertere pixels til μm.
    2. Marker hvert 300 μm interval i hvert billede fra kanten af synsnervehovedet til enden af nethinden (ora serrata). Klik på ikonet Lige i proceslinjen Fiji ImageJ. Klik og træk en linje fra kanten af synsnervehovedet mod ora serrata, der er 300 μm lang. Klik på penselværktøjet i proceslinjen Fiji ImageJ, og klik på slutningen af 300 μm-linjen for at markere den.
    3. Mål RPE-tykkelsen ved hvert markeret interval. Klik på ikonet Lige i proceslinjen Fiji ImageJ. Klik og træk en linje fra toppen til bunden af RPE (supplerende figur 6). Klik på Analyser > mål i Fiji ImageJ-menulinjen for at opnå RPE-tykkelsen.
    4. Overfør RPE-tykkelsesmålingerne til et regneark, og mærk kolonnen med målinger med museidentifikation. Mærk en ekstra kolonne med 'Markeret interval', og indtast afstanden væk fra synsnerveværdier (dvs. 300, 600, 900 osv.)
      BEMÆRK: Det første målte interval svarer til 300 μm væk fra synsnerven, det andet målte interval svarer til 600 μm væk osv.
  15. Kvantificer forekomsten af RPE-patologi baseret på retinale billeder for hver prøve.
    1. Åbn Fiji ImageJ-programmet.
    2. Åbn Cell Counter-applikationen i Fiji ImageJ-programmet. Klik på Plugins > Analyze > Cell Counter i Fiji ImageJ menulinjen. Træk et nethindebillede ind i Fiji ImageJ-proceslinjen, og klik på Initialiser i vinduet Celletæller .
    3. Tæl antallet af RPE-patologier pr. nethindesektion ved hjælp af celletællerapplikationen . Klik på Type 1 under Tællere, og klik derefter på alle mikrovakuoliseringshændelser i billedet. Klik på Type 2 under Tællere, og klik derefter på alle makrovakuoliseringshændelser i billedet. Klik på Type 3 under Tællere, og klik derefter på alle individuelle migreringshændelser i billedet.
    4. Overfør antallet af RPE-patologierne til et regneark. Mærk rækkerne med enten mikrovakuolisering, makrovakuolisering eller migrering og kolonnen med museidentifikation.
    5. Gentag trin 1.15.2-1.15.4 for andre billeder af eksemplet. Gennemsnit antallet af RPE-patologier pr. prøve og divider med fem for at beregne forekomsten af hver RPE-patologi for prøven i regnearket.
  16. Udfør statistisk analyse af RPE-tykkelserne ved hvert interval og RPE-patologiens incidensrater for at afgøre, om der er signifikante forskelle mellem grupperne i undersøgelsen.

2. Evaluering af mus RPE ved transmissionselektronmikroskopi

  1. Skær de andre bageste segmenter efter trin 1,5-1,9 i halve gennem det overlegne mærke i to sektioner med et barberblad. Kommenter den overlegne side af de sektionerede bageste segmenter med vævsmarkeringsfarvestof. Adskil de sektionsdelte bageste segmenter i nye 2 ml mikrorør, der indeholder 2 ml 1x PBS og museidentifikation.
    BEMÆRK: Musens bageste segment er for stort til at behandle i ét stykke og skal skæres i halve til transmissionselektronmikroskopibehandling.
  2. Skyl vævene med 2 ml 0,1 M cacodylatbuffer, pH 7,2. Inkuber i 10 minutter ved RT på bordpladen. Gentag dette trin to gange mere.
  3. Udskift 0,1 M cacodylatbufferen med 2 ml 2% osmiumtetroxid (OsO4) fortyndet i 0,1 M cacodylatbuffer. Der inkuberes i 1,5 time ved RT i stinkhætten.
    FORSIGTIG: OsO4 er et giftigt stof. Følg standardprocedurerne, når du arbejder med OsO4.
  4. Skyl vævene med 2 ml 0,1 M cacodylatbuffer i 10 minutter ved RT i stinkhætten. Gentag dette trin én gang.
  5. Dehydrer vævene med graduerede EtOH-fortyndinger fra 50% til 100% ved RT i stinkhætten. En protokol for dehydreringsproceduren findes i supplerende figur 7.
  6. Fjern 100% EtOH fra vævene og tilsæt 2 ml propylenoxid til væv. Inkuber ved RT i stinkhætten i 15 min. Propylenoxidet fjernes fra vævene og tilsættes 2 ml frisk propylenoxid til vævene. Inkuber ved RT i stinkhætten i 15 min.
    FORSIGTIG: Propylenoxid er et giftigt stof. Følg standardprocedurerne, når du arbejder med propylenoxid.
  7. Fjern propylenoxid fra vævene og tilsæt 2 ml af en 1: 1 blanding af propylenoxid og harpiks til vævene. Lad natten over stå under vakuum i stinkhætten på RT.
    FORSIGTIG: Harpiks er et farligt stof for mennesker. Følg laboratoriets standardprocedurer, når du arbejder med harpiks.
  8. Udskift 1:1-blandingen af propylenoxid og harpiks fra væv med 2 ml ren harpiks. Lad natten over stå under vakuum i damphætten på RT .
  9. Integrer vævene i harpiks. Placer en etiket med museidentifikation med blyant og en dråbe harpiks i formen. Placer vævet på dråben harpiks. Fyld formen med harpiks og læg den under vakuum i 1 time ved RT i stinkdækslet.
  10. Flyt etiketterne og prøverne med finspidsede pincet, med den bageste side af den bageste øjenkopsektion øverst. Lad formen stå natten over ved 65 °C i en ovn i stinkhætten.
  11. Fjern formene fra ovnen. Lad formene køle af til RT på bordpladen. Fjern blokkene fra formene.
    BEMÆRK: Blokkene er nu klar til trimning.
  12. Form harpiksblokkene med et barberblad for at danne en trapezform. Trim harpiksblokkene ved hjælp af et mikrotom, indtil synsnervehovedet er synligt. Fortsæt med at bruge en diamantkniv til at skære halvtynde sektioner fra harpiksblokkene med en tykkelse på 0,5 μm.
    BEMÆRK: Her er en offentliggjort protokol om mikrotomsektionering27. Om ønsket kan 0,5 μm tykke halvtynde sektioner fra harpiksblokkene opsamles og farves for at evaluere prøvens integritet.
  13. Skær en 70 nm tyk ultratynd sektion fra hver trimmet blok ved hjælp af et ultramikrotom. Saml en 70 nm tyk ultratynd sektion på et 400-mesh tyndstanget kobbergitter. Placer gitteret i en gitteropbevaringsboks, og mærk pladsen med museidentifikation.
    BEMÆRK: Her er en offentliggjort protokol om ultramicrotome sektionering28.
  14. Plet ristene med 2% uranylacetat i 5 minutter og derefter med 3,5% blycitratopløsning i 5 minutter ved RT i damphætten.
    FORSIGTIG: Uranylacetat og blycitrat er farlige stoffer. Følg standardprocedurerne, når du arbejder med disse stoffer.
  15. Få billeder til hver prøve ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop ved en forstørrelse på 15.000x, hvor gitterlinjerne i kobbergitteret skærer RPE og BrM.
    BEMÆRK: Der skal være mindst 20 til 35 billeder pr. sektion og 40 til 70 billeder pr. prøve.
  16. Kvantificer BLamD-højder i billederne til prøverne i undersøgelsen.
    1. Åbn Fiji ImageJ-programmet. Træk alle billeder fra eksempelsektionen til proceslinjen Fiji ImageJ. Kontroller, at billederne er kalibreret i μm og ikke pixel.
    2. Mål BLamD-højden i billederne. Klik på ikonet Lige på proceslinjen Fiji ImageJ. Klik og træk en linje fra BrM's elastiske lamina til toppen af den højeste aflejring i billedet (supplerende figur 8). Klik på Analysér > måling i Fiji ImageJ-menulinjen for at få BLamD-højden i billedet.
      BEMÆRK: Hvis der ikke er nogen BLamD'er i billedet, skal du tegne en linje fra BrM's elastiske lamina til RPE'ens basale lamina.
    3. Overfør BLamD-højderne til et regneark og en etiket med museidentifikation.
  17. Beregn de kumulative frekvenser af BLamD-højder pr. genotype og gennemsnit af BLamD-højder pr. mus i regnearket. Udfør statistisk analyse på gennemsnittet af BLamD-højder for at afgøre, om der er signifikante forskelle mellem grupper i undersøgelsen.

3. Evaluering af mus RPE gennem konfokal mikroskopi

  1. Saml øjne fra musene. Aflive musene i henhold til proceduren beskrevet i trin 1.3. Enucleate øjnene ved hjælp af trin 1.5. Placer øjnene ved hjælp af buede tang i et 2 ml mikrorør med 2 ml 1x PBS og museidentifikation.
    BEMÆRK: Mørktilpas ikke musene, da interdigitaliseringen af fotoreceptorerne og RPE-apikale processer giver mulighed for bedre visualisering af RPE gennem konfokal mikroskopi.
  2. Rens og disseker museøjnene med det samme for at generere musens bageste øjenkopper.
    BEMÆRK: Den bageste øjekop er forskellig fra det bageste segment, fordi den ikke indeholder den neurale nethinde.
    1. Overfør øjet til en petriskål indeholdende 1x PBS under et dissekerende mikroskop (supplerende figur 9A).
    2. Fedt og muskler fjernes fra øjeæblet som beskrevet i trin 1.8.2 (supplerende figur 9B).
    3. Nick hornhinden i øjeæblet med et nummer 11 skalpelblad. Hornhinden og iris fjernes som beskrevet i trin 1.8.3 (supplerende figur 9C).
    4. Træk linsen ud med pincet med fin spids. Tag to finspidsede tang og adskil forsigtigt nethinden fra det bageste segment.
    5. Skær forsigtigt nethinden ved synsnervehovedet for at fjerne det fra den bageste øjenkop (supplerende figur 9D).
    6. Anbring den bageste øjekop i et nyt 2 ml mikrorør indeholdende 500 μL 1x PBS med museidentifikation.
  3. De bageste øjenkopper fastgøres med methanol (MeOH) (supplerende figur 10).
    BEMÆRK: Trin 3.3 tager ca. 2 timer og 40 minutter at gennemføre.
    1. Der tilsættes 500 μL MeOH til vævene. Inkuber på en ryster ved 75 o / min i 5 minutter ved RT.
    2. 500 μL opløsning fjernes fra vævene, og der tilsættes 500 μL MeOH. Inkuber i 5 minutter på en ryster ved 75 o/min i 5 minutter ved RT. Gentag dette trin endnu en gang.
    3. Hele opløsningen fjernes fra vævene, og der tilsættes 500 μL MeOH. Der inkuberes på en ryster ved 75 omdr./min. i mindst 2 timer ved RT.
      BEMÆRK: Som alternativ til trin 3.3.3 kan det bageste øjekop inkuberes natten over i MeOH på en ryster ved 75 o/min i et rum på 4 °C.
    4. Tilsæt 500 μL 1x PBS til vævene. Inkuber på en ryster ved 75 o / min i 5 minutter ved RT.
    5. 500 μL opløsning fjernes fra vævene, og der tilsættes 500 μL 1x PBS. Inkuber på en ryster ved 75 o / min i 5 minutter ved RT. Gentag dette trin endnu en gang.
    6. Fjern hele opløsningen fra vævene og erstat den med 500 μL 1x PBS.
      BEMÆRK: Vævet er fuldt fastgjort af MeOH og kan opbevares i et 4 °C køleskab i mindst 1 måned.
  4. Udfør immunfluorescensfarvning af de bageste øjenkopper for at visualisere tætte kryds og kerner i RPE (supplerende figur 11).
    1. Fjern 500 μL 1x PBS fra prøverne og tilsæt 100 μL fortyndet 10% normalt æselserum i 1x PBS-opløsning. Inkuber på en ryster ved 75 o / min i 30 minutter ved RT.
    2. Den fortyndede 10% normale æselserumopløsning fjernes fra prøverne, og der tilsættes 100 μL af en 1:50 fortynding af et kaninpolyklonalt anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) antistof i 1x PBS. Prøverne overføres til et rum på 4 °C og inkuberes natten over på en ryster ved 75 o/min.
    3. Antistoffortyndingen fjernes fra prøverne, og der tilsættes 2 ml 1x PBS. Inkuber på en ryster ved 75 o / min i 10 minutter ved RT. Gentag dette trin to gange mere.
    4. Fjern 1x PBS fra prøverne. Der tilsættes 100 μL af en 1:250 fortynding af et æselantikanin IgG-antistof med et 488 fluoroforkonjugeret mærke og en 1:250 fortynding af 4',6-diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) i 1x PBS til prøverne. Prøverne dækkes med aluminiumsfolie og inkuberes på en ryster ved 75 o / min i 2 timer ved RT.
      BEMÆRK: Prøverne skal være helt dækket med aluminiumsfolie for at forhindre fotoblegning.
    5. Antistof- og DAPI-fortyndingerne fjernes fra prøverne. Tilsæt 2 ml 1x PBS til prøverne, dæk igen med aluminiumsfolie, og inkuber på en ryster ved 75 o / min i 10 minutter ved RT. Gentag dette trin tre gange mere.
      BEMÆRK: De tætte kryds og kerner i RPE er nu henholdsvis fuldt mærket og farvet.
  5. Monter de bageste øjenkopper på mikroskopglas.
    1. Mærk et mikroskopglas med museidentifikation. Overfør den bageste øjenkop til et mikroskopglas under et dissekerende mikroskop med den koroidale side nedad. Tilsæt en dråbe 1x PBS til den bageste øjenkop for at forhindre, at den tørrer ud (supplerende figur 12).
    2. Skær den bageste øjekop ved hjælp af et skalpelblad nummer 11 på fire steder, der giver fire kvadranter svarende til kardinalretningerne (dvs. nord, øst, syd og vest). Dup overskydende 1x PBS med væv fra omkredsen af den bageste øjenkop. Flad forsigtigt den bageste øjenkop med en kamelhårbørste og finspidsede pincet (supplerende figur 12).
      BEMÆRK: Det resulterende produkt er nu kendt som en RPE flat mount.
    3. Tilføj en dråbe monteringsmedium til RPE-fladbeslaget, og placer et dæksel oven på det. Påfør klar neglelak for at forsegle dækslet, og lad det tørre i mindst 30 minutter ved RT i en lukket skuffe. Anbring lysbillederne i en lysbilledholderboks, og opbevar kassen i et køleskab på 4 °C.
      BEMÆRK: Pas på at undgå at indføre bobler på den flade RPE-holder. RPE flat mounts kan afbildes inden for en 2 ugers tidsramme.
  6. Få et billede af hver af de fire kvadranter, der omgiver synsnerven i RPE-fladmonteringen på et konfokalmikroskop ved 20x forstørrelse for hver prøve. Et eksempel på et RPE-fladmonteret billede findes i supplerende figur 13A.
    BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at udføre z-stack-billeddannelse af de flade RPE-monteringer, hvor der tages og stables flere billeder for at kompensere for dimensionsforskelle i den flade RPE-montering.
  7. Spor de tætte samlinger af RPE-cellerne inden for hvert RPE-fladmonteret billede. Et eksempel på et sporet RPE-fladmonteret billede findes i supplerende figur 13B.
    1. Åbn Fiji ImageJ-programmet. Træk et fladmonteret RPE-billede til proceslinjen i Fiji ImageJ. Kontroller, at billedet er kalibreret i mikrometer og ikke pixel.
    2. Dobbeltklik på ikonet Overlay Brush Tool på proceslinjen Fiji ImageJ for at indstille penselbredden til 3, gennemsigtigheden til 0 og farven til rød. Klik på knappen Luk i vinduet Overlejringspenselværktøj .
    3. Klik på ikonet Overlay Brush Tool . Klik og træk på de tætte kryds af alle RPE-celler, der er helt inde i billedet.
      BEMÆRK: Hvis der begås en sporingsfejl, skal du dobbeltklikke på ikonet Overlay Brush Tool og klikke på feltet Fortryd i vinduet Overlay Brush Tool for at fjerne sporingsfejlen fra billedet.
    4. Klik på rektangelikonet på proceslinjen Fiji ImageJ. Klik på billedet og træk rundt om billedets omkreds. Klik på Rediger > Ryd på Fiji ImageJ-menulinjen for at bevare de sporede linjer og fjerne eventuelle blå og grønne farver fra billedet.
    5. Gem sporingsbilledet på et passende sted med museidentifikation, kvadrantplacering (dvs. nord, syd, øst eller vest) og en CP-suffiksetiket.
      BEMÆRK: Gem ikke RPE-sporingsbilledet, før du har fuldført trin 3.7.4.
  8. Beregn RPE-cellearealerne for hver prøve.
    1. Angiv et sted for at gemme filerne fra RPE-områdeanalyse ved at oprette en mappe på computerens skrivebordsskærm. Opret undermapper for hvert RPE-sporingsbillede, og mærk undermapperne med museidentifikation samt kvadrantplacering (dvs. nord, syd, øst eller vest).
    2. Installer og åbn programmet Cell Profiler29. Download projektfilen Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1). Åbn filen Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj ved at klikke på Filer > Åbn projekt i menulinjen i programmet Cell Profiler.
    3. Træk et RPE-sporingsbillede til feltet Billede > slip filer og mapper her i programvinduet Celleprofil.
    4. Indtast placeringen af mappen i Cell Profiler-programmet, der svarer til RPE-sporingsbilledet. Klik på knappen Outputindstillinger i nederste venstre hjørne af Cell Profiler-programvinduet, og indtast placeringen af mappen i tekstfelterne Standard inputmappe og Standard outputmappe.
    5. Klik på knappen Analysér billeder i nederste venstre hjørne af Cell Profiler-programvinduet. Når analysen er afsluttet, vises et vindue Analyse fuldført på skærmen. Klik på OK knappen i vinduet Analyse fuldført .
      BEMÆRK: Denne handling genererer en csv-fil og et jpeg-billede. CSV-filen indeholder områderne for RPE-cellerne i sporingsbilledet. JPEG-billedet svarer til RPE-sporingsbilledet, hvor hver RPE-celle mærkes med et tal (supplerende figur 13C).
    6. Overfør RPE-områderne fra csv-filen til et regneark. Mærk regnearket med museidentifikation.
    7. Udfør en kvalitetskontrolundersøgelse af dataene ved at bekræfte, at hvert RPE-område i csv-filen linker til en fuldt sporet RPE-celle i et jpeg-billede. Fjern eventuelle værdier fra regnearket, der ikke svarer til fuldt sporede RPE-celler.
    8. Gå tilbage til programmet Celleprofil. Højreklik på RPE-sporingsbillednavnet i feltet Slip filer og mapper her, og vælg Ryd listen for at fjerne billedet fra Cell Profiler-programmet.
    9. Gentag trin 3.8.3-3.8.8 for at beregne RPE-størrelserne for de resterende tre RPE-sporingsbilleder af prøven.
  9. Kvantificer gennemsnittet af RPE-cellestørrelsen for hvert eksempel i regnearket.
  10. Kvantificer RPE-celletæthederne for hver prøve i regnearket. Hvis du vil beregne RPE-celletætheden, skal du dividere det samlede antal RPE-celler pr. kvadrant med det samlede areal af RPE-celler pr. kvadrant, der blev registreret af programmet Cell Profiler. Bestem gennemsnittet af RPE-celletæthederne fra de fire kvadranter pr. prøve.
  11. Kvantificer antallet af multinucleated RPE-celler pr. RPE flat mount for hver prøve. Brug programmet Celletæller i Fiji ImageJ-programmet, som beskrevet i trin 1.15.1-1.15.3, til at tælle antallet af RPE-celler med mere end tre kerner i fire kvadranter af prøven.
  12. Udfør statistisk analyse af RPE-cellestørrelsen og densitetsgennemsnittet samt antallet af multinucleated RPE-celler for at afgøre, om der er signifikante forskelle mellem grupper i undersøgelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Færdiggørelse af RPE-fænotypeprotokollen beskrevet i denne artikel giver en kvantitativ analyse af de strukturelle RPE-abnormiteter, der almindeligvis observeres i musemodeller af AMD. For at bekræfte effektiviteten af denne protokol brugte vi den i mus, der vides at vise RPE-patologier, herunder transgene mus, der overudtrykker WT Tmem135 drevet af kyllingens beta-actinpromotor (Tmem135 TG)30 og alderen C57BL/6J-mus31,32. Formålet med disse eksperimenter er at vise repræsentative resultater, der kunne opnås ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i denne protokol, til forskere, der er nye inden for musemodeller.

Vi overholdt metoderne i trin 1 i protokollen til at behandle og evaluere øjne fra WT- og Tmem135 TG-mus for at evaluere RPE-patologier ved hjælp af lysmikroskopi. Vi fandt ud af, at 4 måneder gamle Tmem135 TG-mus har en signifikant reduktion i RPE-tykkelse med to målte intervaller i forhold til aldersmatchet WT gennem en ANOVA med post-hoc Tukey-test (figur 4). Disse resultater indikerer, at RPE er tyndere i de 4 måneder gamle Tmem135 TG-mus end i aldersmatchede WT-mus ved 600 og 900 μm væk fra synsnerven.

Derudover beregnede vi ved hjælp af metoderne i trin 1 i protokollen forekomsten af RPE-patologier, herunder mikrovakuolisering, makrovakuolisering og migration af tre 25 dage gamle WT- og Tmem135 TG-mus (figur 5A). Den gennemsnitlige frekvens af RPE-mikrovakuoliseringspatologier pr. dias i WT-mus var 0,67 ± 0,31, og hos Tmem135 TG-mus var 7,07 ± 0,61 (figur 5B). Der var ingen RPE-makrovakuolisering i WT-mus, men der var i gennemsnit 5,33 ± 2,02 makrovakuoliseringshændelser i Tmem135 TG-mus (figur 5C). Endelig var raterne af migrerende RPE-celler pr. dias nul i WT-mus og 0,4 ± 0,35 i Tmem135 TG-mus (figur 5D). Efter at have udført en elevs t-test var forekomsten af RPE-mikrovakuolisering og mikrovakuolisering signifikant forskellig mellem WT- og Tmem135 TG-mus. Den højere forekomst af RPE-migrerende celler i Tmem135 TG-mus var imidlertid ikke signifikant forskellig sammenlignet med WT (p = 0,1161). Disse data viser, at RPE-mikrovakuolisering og makrovakuolisering, men ikke migration, er signifikant højere i 25 dage gamle Tmem135 TG end WT-mus.

Efter metoderne i protokollen inkluderet i trin 2 forberedte vi retinale sektioner fra 2 måneder gamle og 24 måneder gamle WT C57BL / 6J-mus til transmissionselektronmikroskopi for at analysere tilstedeværelsen og højderne af BLamD'er. Vi fandt BLamD'er til stede i 24 måneder gamle WT-nethinder, der især var fraværende i 2 måneder gamle WT-nethinden (figur 6A). Vi præsenterede højderne af BLamD'erne i de 24 måneder gamle WT-nethinde ved at beregne og plotte de kumulative frekvenser af deres forekomst. Kumulative frekvenser af BLamD-højderne blev graferet mod aflejringshøjde for at illustrere fordelingen af aflejringshøjderne. Der er et skift til højre for linjen for de 24 måneder gamle WT BLamD-højder sammenlignet med de 2 måneder gamle WT BLamD-højder, hvilket viser en stigning i aflejringer i 24 måneder gamle WT-mus (figur 6B). Denne graf understøttes af et større gennemsnit af BLamD-højder i 24 måneder gamle WT-nethinde (1,01 μm ± 0,43 μm) end 2 måneder gamle WT-nethinde (0,23 μm ± 0,017 μm), der var signifikant forskellige ved en studerendes t-test (figur 6C). Sammenfattende konkluderer vi, at 24 måneder gamle WT-mus har store BLamD'er i under-RPE-rummet på deres nethinde sammenlignet med 2 måneder gamle WT-mus.

Vi anvendte metoderne til klargøring af øjne fra 4 måneder gamle WT- og Tmem135 TG-mus i trin 3 til at generere RPE-fladmonteringer til påvisning og analyse af RPE-dysmorfi og multinucleation. I denne protokol definerede vi RPE-dysmorfi ved ændringer i RPE-cellestørrelse og tæthed i en AMD-musemodel i forhold til deres kontroller. Vi fandt ud af, at RPE i 4 måneder gamle Tmem135 TG-mus er dysmorfe (figur 7A). RPE i Tmem135 TG nethinden er større (806,89 μm 2 ± 252,67 vs. 291,69 μm 2 ± 26,31) og mindre tætte (0,0014 celler/μm 2 ± 0,00039 vs. 0,0033 celler/μm 2 ± 0,00024) end aldersmatchede WT nethinden (figur 7B,C). Desuden var der flere multinucleated RPE-celler i Tmem135 TG-nethinden sammenlignet med WT-kontroller (8,04 celler ± 5,54 vs. 0,33 celler ± 0,29) (figur 7D). Alle disse parametre nåede statistisk signifikans med en studerendes t-test. Sammen har 4 måneder gamle Tmem135 TG-mus flere dysmorfe og multinucleerede RPE-celler end 4 måneder gamle WT-mus.

Figure 1
Figur 1: RPE-patologier påvist ved lysmikroskopi. Repræsentative billeder af normal RPE i WT (A) og unormal RPE i Tmem135 TG-mus (B-E). RPE-patologierne observeret i Tmem135 TG-mus inkluderer RPE-udtynding (B), makrovakuolisering (C), mikrovakuolisering (D) og migration (E). Hver patologi er illustreret med en sort pil. Skalabjælke = 100 μm. Forstørrelse = 20x. Forkortelser: RGC = retinal ganglion cellelag, IPL = indre plexiformlag, INL = indre nukleare lag, OPL = ydre plexiformlag, ONL = ydre nukleare lag, IS = fotoreceptor indre segmenter, OS = fotoreceptor ydre segmenter, RPE = retinal pigmenteret epitel, Cho = choroid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: RPE-patologier påvist ved transmissionselektronmikroskopi. Repræsentative billeder af (A) RPE i unge CFH-H/H og (B) 2-årige CFH-H/H-mus, der har rigelige basale laminære aflejringer (BLamDs). BLamD'er spores med gule prikker i billedet. Skalabjælke = 800 nm. Forstørrelse = 15.000x. Forkortelser: N = kerne, M = mitokondrier, P = pigmentgranulat, BI = basale indfoldninger, EL = elastisk lamina, RPE = retinal pigmenteret epitel, BrM = Bruchs membran, Cho = choroid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: RPE-patologier påvist ved konfokal mikroskopi. Repræsentative billeder af (A) normal RPE hos 8 måneder gammel WT og (B) unormal RPE hos 8 måneder gamle Tmem135 TG-mus, der udviser RPE-dysmorfi. Den hvide firkant zoomes ind (C) for at vise en multinucleated RPE-celle med tre kerner. Den grønne farve er anti-ZO1-associerede RPE-tætte kryds, og den blå farve er DAPI-farvning af RPE-kerner. Skalabjælke = 50 μm. Forstørrelse = 20x. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: RPE-tykkelse i 4 måneder gamle vildtype- (WT) og Tmem135 TG-mus. (A) Repræsentative billeder af nethinden fra 4 måneder gamle WT- og Tmem135 TG-mus (TG). Forstørrelse = 20x. Skalabjælke = 100 μm. (B) Linjegrafer over RPE-tykkelsesmålingerne i 4 måneder gamle WT (sort) og Tmem135 TG-mus (grøn) op til 3.000 μm væk fra synsnerven. Tal efter genotypen angiver antallet af mus, der blev brugt i denne undersøgelse. *p < 0,05, ANOVA med post-hoc Tukey test. Alle data er gennemsnitlige ± sd. Se forklaringen til figur 1 for forkortelser af retinale lag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: RPE-patologier hos 25 dage gamle Tmem135 TG-mus. (A) Repræsentative billeder af RPE-mikrovakuolisering, makrovakuolisering og migration i tre 25 dage gamle Tmem135 TG (TG) mus. RPE-patologier fremhæves med sorte pile i hvert billede. Forstørrelse = 40x. Skalabjælke = 20 μm. (B-D) Kvantificering af RPE-mikro- og makrovakuolisering samt migrerende RPE-celler i 25 dage gamle WT- og Tmem135 TG-mus. Tal i parentes angiver antallet af mus, der blev brugt i denne undersøgelse. *p < 0,05 og ****p < 0,0001, elevens t-test. Alle data er gennemsnitlige ± sd. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Ultrastrukturel analyse af BLamD'er i unge og ældre WT-nethinder . (A) Repræsentative elektronmikrografier af 2 måneder gamle og 24 måneder gamle WT RPE. Forstørrelse = 15.000x. Skalabjælke = 800 nm. Et eksempel på en basal laminær aflejring (BLamD) er skitseret med en parentes. (B) Kumulative frekvenser af BLamD-højderne. (C) BLamD højde gennemsnit. Tal i parentes angiver det samlede antal mus pr. genotype, der blev anvendt i denne undersøgelse. **p < 0,01, elevens t-test. Alle data er gennemsnitlige ± sd. Se figur 2-forklaringen for forkortelser af retinale lag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: RPE flat mounts afslører RPE-patologier i Tmem135 TG-mus. (A) Repræsentative billeder af 4 måneder gamle WT og Tmem135 TG (TG) RPE flat mounts med anti-ZO-1 i grøn og DAPI i blå. Forstørrelse = 20x. Skalabjælke = 100 μm. (B) RPE-cellestørrelse, (C) RPE-celletæthed og (D) RPE-multinucleation i 4 måneder gamle WT- og Tmem135 TG-mus. Tallet i parentes angiver antallet af mus, der blev brugt i undersøgelsen. *p < 0,05, **p < 0,01 og ****p < 0,0001, elevens t-test. Alle data er gennemsnitlige ± sd. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Skematisk oversigt over opsætning og brug af hjerteperfusion. A) Tyngdekraft-tilførsel perfusionssystem. B) Sprøjtecylinder i perfusionssystemet til fikseringsbuffer. C) Ventilen drejes, indtil den er parallel med rørledningen, således at bufferen kan strømme gennem rørledningen. D) Ventil drejes, indtil den er vinkelret på rørledningen for at forhindre bufferen i at strømme ind i rørledningen. Billede oprettet i Biorender. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Skematisk oversigt over proceduren for hjerteperfusion af en mus. (A) Fire snit foretaget for at blotlægge bughulen. (B) Skær lavet gennem mellemgulvet og brystbenet for at udsætte hjertet. (C) Gauge nål indsat i venstre ventrikel af hjertet. Ventilen drejes, indtil den er parallel med rørledningen. Det højre atrium skæres med buet saks for at tillade blod og fikseringsmiddel at komme ud. Billede oprettet i Biorender. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Skematisk procedure for at fjerne øjne fra en mus. (A) Tryk forsigtigt ned med tommel- og pegefinger rundt om øjenhulen for at forårsage fremspring af øjet fra øjenhulen. (B) Tag en buet saks og hold dem med bladet i en vinkel på 30° fra øjenhulen. Fortsæt med at skære rundt om øjet med den buede saks i en vinkel på 30°. Farvede prikker repræsenterer fingerplacering på musen eller buet saks. Billede oprettet i Biorender. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Billeder af museøjedissektion for at give musens bageste segment. (A) Øje overført til et dissekerende mikroskop. (B) Fedt og muskler fjernet fra øjeæblet. (C) Hornhinde og iris fjernet fra øjeæblet. (D) Linsen fjernet fra øjeæblet. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Hæmatoxylin eosin (H&E) farvningsprocedure. Skematisk afbildning af H&E-proceduren til farvning af paraffinindlejrede retinale sektioner. Pile angiver overførsel mellem trin. Tidspunktet for hvert trin er angivet med rød skrifttype. Reagenser til farvning leveres i sort skrifttype i glasfarvningsbeholdere. Der skal være en glasfarvningsbeholder forberedt til hvert reagens, der er inkluderet i ovenstående diagram. Alle trin skal udføres i en stinkhætte. Når du føjer en følgeseddel til et lysbillede, skal du passe på ikke at indføre bobler på lysbilledet. Efter afslutningen af proceduren kan dias gemmes i en diasboks. Billede oprettet i Biorender. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 6: Eksempel på måling af RPE-tykkelse. Den sorte pil viser en rød linje fra toppen til bunden af RPE. Denne linje kan måles for at bestemme tykkelsen af RPE. Skalabjælke = 100 μm. Forstørrelse = 20x. Der er zoomet ud på boksområdet, så RPE nemmere kan ses. Se forklaringen til figur 1 for forkortelser af retinale lag. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 7: EtOH-dehydreringsprocedure for bageste musesegmenter til TEM-behandling. Billede oprettet i Biorender. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 8: Eksempel på BLamD højdemåling. Den røde linje viser den største BLamD i dette billede. Gule prikker afgrænser BLamD'er på billedet. Denne røde linje kan måles for at bestemme højden af denne BLamD i dette billede. Skalabjælke = 800 nm. Forstørrelse = 15.000x. Se figur 2-forklaringen for forkortelser af retinale lag. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 9: Museøjedissektion for RPE-fladmontering. (A) Øje overført til en petriskål indeholdende 1x PBS under et dissekerende mikroskop. (B) Fedt og muskler fjernet fra øjeæblet. (C) Hornhinde og iris fjernet fra øjeæblet. (D) Linsen og nethinden fjernet fra øjeæblet. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 10: Proceduren for fiksering af methanol (MeOH) af bageste øjenkopper med mus. Billede oprettet i Biorender. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 11: Immunofluorescensprocedure til mærkning af tætte kryds og kerner af RPE-celler. Diagram, der viser trin i immunofluorescensteknik fra denne protokol. Bemærk, at denne teknik tager 2 dage at gennemføre. Alle trin forekommer ved RT og på en ryster med en hastighed på 75 o / min, medmindre det specifikt er angivet i diagrammet. Det primære (1°) antistof, der blev anvendt i denne undersøgelse, var kaninpolyklonalt anti-ZO1, og det sekundære (2º) antistof, der blev anvendt i denne undersøgelse, var 488 fluoroforkonjugerede æselantikanin IgG. Når det sekundære antistof og DAPI er tilsat prøverne, skal prøverne pakkes ind i aluminiumsfolie for at beskytte mod fotoblegning af prøven. Billede oprettet i Biorender. Forkortelser: NDS = normalt æselserum, Ab = antistof. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 12: Afbildning af snit for at give fire kvadranter af mus RPE fladmonteret. N = nord, E = øst, S = syd, W = vest. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 13: Eksempler på RPE-fladmonterede analyseendepunkter. (A) RPE fladmonteret billede. (B) RPE-grænsesporingsbillede. (C) RPE Cell Profiler analyseret billede. Forstørrelse = 20x. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 1: Ikeda RPE Area Calculator.cpproj Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel introducerede vi en fænotypeprotokol til vurdering af musemodellernes strukturelle RPE-patologier. Vi beskrev de trin, der kræves til behandling af øjnene til forskellige billeddannelsesteknikker, herunder lys, transmissionselektron og konfokal mikroskopi, samt kvantificering af typiske patologier observeret via disse billeddannelsesmetoder. Vi beviste effektiviteten af vores RPE-fænotypeprotokol ved at undersøge Tmem135 TG og 24 måneder gamle WT-mus, da disse mus viser RPE-patologier30,31,32. Denne protokol kan anvendes på enhver genetisk modificeret eller farmakologisk behandlet mus, der kan rumme RPE-patologier såsom RPE-udtynding, vakuolisering, migration og dysmorfi samt BLamDs 6,7. Selvom RPE-patologierne observeret i Tmem135 TG og 24 måneder gamle WT-mus er til stede i andre AMD-musemodeller 7,30, er det vigtigt for forskeren at blive fortrolig med AMD-musemodellen, der er valgt til deres studier, da debutalderen og sværhedsgraden af RPE-patologierne i deres AMD-musemodel kan afvige fra Tmem135 TG og 24 måneder gamle WT-mus. Forskere skal muligvis bruge flere mus til deres undersøgelser end antallet af mus, der bruges til at producere de repræsentative resultater vist i denne artikel, hvis præsentationen af RPE-patologier er variabel i deres respektive AMD-musemodel. Desuden er mange AMD-musemodeller i øjeblikket tilgængelige for AMD-forskere, men har ikke komplette beskrivelser af deres RPE-patologier, hvilket kan kræve, at forskere udfører foreløbige undersøgelser for at erhverve disse oplysninger.

Selvom der kan foretages ændringer i, hvordan museøjne behandles for de forskellige billeddannelsesmetoder, er det afgørende at opretholde den kvantitative evaluering af strukturelle RPE-abnormiteter som beskrevet i protokollen. For eksempel blev fem H&E-farvede nethindesektioner forberedt til at tælle antallet af RPE-mikrovakuolisering, makrovakuolisering og migrationshændelser, hvilket gjorde det muligt for forskere at evaluere RPE-patologier flere steder i musens nethinden. Et andet eksempel er at bruge et 400-mesh tyndstang kobberelektronmikroskopigitter til at vurdere RPE's ultrastrukturelle abnormiteter. Elektronmikroskopigitteret giver en ramme til systematisk og upartisk evaluering af en nethindeprøve ved transmissionselektronmikrografi samt opnå 40 til 70 billeder pr. Nethindesektion for at undersøge tilstedeværelsen af BLamD'er. Dette kan ikke opnås med et elektronmikroskopi-slotgitter, og vi foreslår ikke at bruge dem med denne protokol. Endelig gør optagelse af 20x forstørrelsesbilleder fra de fire kvadranter i en RPE fladmontering det muligt for forskere at undersøge store områder af murine RPE for dysmorfi og multinucleation. Forskere kan frit udvide denne protokol og undersøge yderligere retinale sektioner for RPE-patologier i deres studier. Sammen giver disse metoder forskere mulighed for at indsamle rigelige data for at drage konklusioner om de strukturelle RPE-patologier, der kan være til stede i deres AMD-musemodeller.

Et andet centralt træk ved denne protokol er konsistensen af RPE-fænotypemetoderne. For eksempel blev alle øjne, der blev brugt til lys- og transmissionselektronmikroskopi, orienteret af den overlegne side af musens nethinden til sektionering. Det er vigtigt at opretholde museøjets orientering gennem hele dets behandling for lys- og transmissionselektronmikroskopi, fordi museøjet har en topografisk fordeling af retinale celler33,34. Den anatomiske orientering af museøjet blev ikke opretholdt for RPE fladmonteret forberedelse, da overlegen til ringere topografiske ændringer af musens RPE-celle ikke er blevet observeret. Faktisk viser RPE i den menneskelige nethinden topografiske ændringer, der udstråler væk fra synsnervehovedet35, hvilket tyder på, at dette kan være tilfældet for mus RPE. Endelig er billedoptagelsen beskrevet i denne protokol afhængig af den anatomiske positionering af synsnerven. Inkludering af disse metodologiske aspekter vil hjælpe med at reproducere resultaterne af RPE-patologier for forskere, når de arbejder med deres AMD-musemodeller.

Forskere kan ønske at tilføje flere analytiske funktioner til RPE fænotypeprotokollen. Nogle fænotypiske resultater, der ikke er vist i denne protokol, er undersøgelsen af BrM-tykkelse, RPE apikale mikrovilli og andre RPE ultrastrukturelle komponenter. Disse komponenter omfatter mitokondrier, pigmentgranulater og andre organeller som fagosomer. Forskere kan bestemme størrelsen og antallet af disse komponenter i elektronmikrografierne opnået med denne protokol ved hjælp af Fiji ImageJ-programmet. Især kan mitokondriernes status være et vigtigt fænotypisk resultat at overveje, da målretning af mitokondrier i RPE er en vigtig terapeutisk strategi for AMD36. Et andet fænotypisk resultat er yderligere målinger af RPE-dysmorfi på RPE-flade monteringer. RPE-fladmonterede billeder opnået ved hjælp af protokollen kan undersøges for RPE sekskantet form, antal nærliggende RPE-celler og andre egenskaber med REShAPE-programmet (https://github.com/nih-nei/REShAPE)35. Et andet muligt fænotypisk resultat er, om RPE-patologier forekommer i de centrale eller perifere områder af musens nethinden. Disse yderligere fænotypiske overvejelser vil yderligere styrke RPE-fænotypeprotokollen, der er beskrevet i denne artikel.

Der er et par begrænsninger i denne RPE-fænotypeprotokol. En begrænsning af denne metode er behovet for at ofre mus for at høste deres øjne til RPE-fænotypning. Som et alternativ muliggør nye fremskridt inden for spektral domæne optisk kohærenstomografi (SD-OCT) billeddannelse kvantificering af RPE-tykkelse og patologier hos levende mus37-39. Dette kan være en fordel for forskere, der ønsker at udføre longitudinelle undersøgelser på deres AMD-musemodelkohorter. En anden begrænsning af denne metode er manglen på funktionelle RPE-vurderinger hos mus. Hvis forskere er interesseret i en funktionel vurdering af RPE i mus, anbefaler vi at udføre elektroretinografi og måle c-bølgekomponenten, da c-bølgen er vejledende for RPE's funktionelle rolle i fototransduktion40. En anden begrænsning af denne metode er manglen på biokemiske målinger af RPE-markører hos mus. Hvis forskere ønsker at undersøge niveauerne af RPE-markører, såsom cellulært retinaldehydbindende protein (CRABLP), retinal pigmentepitelspecifikt 65 kDa-protein (RPE65), kalium indadrettet kanal underfamilie J medlem 13 (KCNJ13) eller bestrophin 1 (BEST1), anbefaler vi at høste øjne til immunhistokemi, kvantitativ realtids PCR eller western blot-analyse.

Afslutningsvis kan denne RPE-fænotypeprotokol være en vigtig ressource for forskere, der bruger musemodeller, der rekapitulerer patologiske aspekter af AMD. Denne protokol tjener også til at standardisere, hvordan RPE evalueres i AMD-musemodeller, som ikke tidligere er beskrevet i litteraturen. Standardisering af RPE-fænotypning ville være afgørende for at oversætte resultaterne fra mus til andre modeller af AMD, herunder RPE-cellekulturmodeller4 og højere organismemodeller, herunder ikke-menneskelige primater. Det ville også hjælpe med vores forståelse af de patobiologiske mekanismer, der ligger til grund for AMD-udvikling og potentielt udvikle nye terapier til denne blændende sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne af denne protokol har ingen afsløringer og interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Satoshi Kinoshita og University of Wisconsin (UW) Translational Research Initiatives in Pathology laboratory (TRIP) for at forberede vores væv til lysmikroskopi. Denne kerne understøttes af UW Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin Carbone Cancer Center (P30 CA014520) og Office of The Director-NIH (S10OD023526). Konfokal mikroskopi blev udført på UW Biochemistry Optical Core, som blev etableret med støtte fra UW Department of Biochemistry Endowment. Dette arbejde blev også støttet af tilskud fra National Eye Institute (R01EY022086 til A. Ikeda; R01EY031748 til C. Bowes Rickman; P30EY016665 til Institut for Oftalmologi og Visuelle Videnskaber ved UW; P30EY005722 til Duke Eye Center; NIH T32EY027721 til M. Landowski; F32EY032766 til M. Landowski), Timothy William Trout formandskab (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); og en ubegrænset bevilling fra Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 193
En protokol til evaluering og kvantificering af retinale pigmenterede epitelpatologier i musemodeller af aldersrelateret makuladegeneration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., … More

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter