Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En protokoll for å evaluere og kvantifisere retinale pigmenterte epitelpatologier i musemodeller av aldersrelatert makuladegenerasjon

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

Musemodeller kan være nyttige verktøy for å undersøke biologien til retinalpigmentert epitel (RPE). Det har blitt fastslått at mus kan utvikle en rekke RPE-patologier. Her beskriver vi en fenotypingsprotokoll for å belyse og kvantifisere RPE-patologier hos mus ved hjelp av lys, transmisjonselektron og konfokalmikroskopi.

Abstract

Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er en svekkende retinal lidelse i aldrende befolkninger. Det er allment antatt at dysfunksjon av retinalpigmentert epitel (RPE) er en viktig patobiologisk hendelse i AMD. For å forstå mekanismene som fører til RPE-dysfunksjon, kan musemodeller brukes av forskere. Det har blitt fastslått av tidligere studier at mus kan utvikle RPE-patologier, hvorav noen observeres i øynene til personer diagnostisert med AMD. Her beskriver vi en fenotypingsprotokoll for å vurdere RPE-patologier hos mus. Denne protokollen inkluderer fremstilling og evaluering av retinale tverrsnitt ved bruk av lysmikroskopi og transmisjonselektronmikroskopi, samt RPE-flatfester ved konfokalmikroskopi. Vi beskriver de vanlige typene murine RPE-patologier observert av disse teknikkene og måter å kvantifisere dem gjennom objektive metoder for statistisk testing. Som bevis på konsept bruker vi denne RPE-fenotypingsprotokollen for å kvantifisere RPE-patologiene observert hos mus som overuttrykker transmembranprotein 135 (Tmem135) og eldre C57BL/6J-mus av villtype C57BL/6J. Hovedmålet med denne protokollen er å presentere standard RPE-fenotypingsmetoder med objektive kvantitative vurderinger for forskere som bruker musemodeller av AMD.

Introduction

Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er en vanlig blindende sykdom som rammer populasjoner over 55 år1. Mange forskere mener at dysfunksjon i retinalpigmentert epitel (RPE) er en tidlig og avgjørende patobiologisk hendelse i AMD2. RPE er et monolag av polariserte celler som har til oppgave å opprettholde homeostasen til nærliggende fotoreceptorer og koroidale blodkar3. Det finnes en rekke modeller for å undersøke sykdomsassosierte mekanismer i RPE, inkludert cellekulturmodeller 4,5 og mus 6,7,8. En fersk rapport har beskrevet standardiserte protokoller og kvalitetskontrollkriterier for RPE-cellekulturmodeller4, men ingen rapport har forsøkt å standardisere fenotypingen av RPE i musemodeller. Faktisk mangler mange publikasjoner på musemodeller av AMD en fullstendig beskrivelse av RPE eller kvantifisering av RPE-patologiene i dem. Det overordnede målet med denne protokollen er å presentere standard RPE-fenotypingsmetoder med objektive kvantitative vurderinger for forskere som bruker AMD-musemodeller.

Tidligere publikasjoner har notert tilstedeværelsen av flere RPE-patologier hos mus gjennom tre bildebehandlingsteknikker. For eksempel tillater lysmikroskopi forskere å se brutto morfologi av murine retina (figur 1A) og oppdage RPE-patologier som RPE-tynning, vakuolisering og migrasjon. RPE-tynning i en AMD-musemodell eksemplifiseres av et avvik i RPE-høyden fra deres respektive kontroller (figur 1B). RPE-vakuolisering kan deles inn i to separate kategorier: mikrovakuolisering (figur 1C) og makrovakuolisering (figur 1D). RPE-mikrovakuolisering er oppsummert ved tilstedeværelsen av vakuoler i RPE som ikke påvirker dens totale høyde, mens makrovakuolisering indikeres av tilstedeværelsen av vakuoler som stikker ut i de ytre segmentene av fotoreceptorene. RPE-migrasjon kjennetegnes ved fokalaggregatet av pigment over RPE-monolaget i et retinalt tverrsnitt (figur 1E). Det skal bemerkes at migrerende RPE-celler i AMD-donorøyne utviser immunoreaktivitet mot immuncellemarkører, for eksempel klynge av differensiering 68 (CD68) 9, og kan representere immunceller som oppsluker RPE-rusk eller RPE som gjennomgår transdifferensiering 9. En annen bildebehandlingsteknikk kalt transmisjonselektronmikroskopi kan tillate forskere å visualisere ultrastrukturen til RPE og dens kjellermembran (figur 2A). Denne teknikken kan identifisere den dominerende sub-RPE-forekomsten hos mus, kjent som basal laminær forekomst (BLamD) (figur 2B)10. Til slutt kan konfokalmikroskopi avsløre strukturen til RPE-celler gjennom avbildning av RPE-flatfester (figur 3A). Denne metoden kan avdekke RPE-dysmorfi, avviket fra RPE fra sin klassiske bikakeform (figur 3B). Det kan også oppdage RPE multinukleasjon, tilstedeværelsen av tre eller flere kjerner i en RPE-celle (figur 3C). For et sammendrag av hvilke typer RPE-patologier som er tilstede i dagens AMD-musemodeller, henviser vi forskere til disse vurderingene fra litteraturen 6,7.

Forskere som studerer AMD bør være oppmerksomme på fordelene og ulempene ved å bruke mus til å undersøke RPE-patologier før fenotypingsprotokollen. Mus er fordelaktige på grunn av deres relativt korte levetid og kostnadseffektivitet, samt deres genetiske og farmakologiske manipulerbarhet. Mus viser også RPE-degenerative endringer, inkludert RPE-migrasjon, dysmorfi og multinukleering, som observeres i AMD-donorøyne 11,12,13,14,15,16,17; Dette antyder at lignende mekanismer kan ligge til grunn for utviklingen av disse RPE-patologiene hos mus og mennesker. Imidlertid er det viktige forskjeller som begrenser oversettbarheten av musestudier til human AMD. For det første har mus ikke en makula, en anatomisk distinkt region av den menneskelige netthinnen som er nødvendig for synsstyrke som fortrinnsvis påvirkes i AMD. For det andre er noen RPE-patologier hos mus, som RPE-tynning og vakuolisering, vanligvis ikke sett i AMD-donorøyne18. For det tredje utvikler mus ikke drusen, et kjennetegn ved AMD-patologi19. Drusen er lipid- og proteinholdige avleiringer med svært få kjellermembranproteiner som dannes mellom RPE basal lamina og det indre kollagenøse laget av Bruchs membran (BrM)19. Drusen skiller seg fra BLamD, den vanlige sub-RPE-forekomsten hos mus, både i sammensetning og anatomisk plassering. BLamDs er alders- og stressavhengige ekstracellulære matriksberikede abnormiteter som dannes mellom RPE basal lamina av BrM og de basale infoldingene av RPE20. Interessant nok har BLamDs en lignende proteinsammensetning og utseende hos både mus og mennesker 6,10,21. Nylig arbeid tyder på at BLamDs kan virke i patobiologien til AMD ved å påvirke utviklingen av AMD til sine senere stadier18,22; Dermed kan disse forekomstene representere syk RPE i musehinnen. Kunnskap om disse fordelene og begrensningene er avgjørende for forskere som er interessert i å oversette resultater fra musestudier til AMD.

I denne protokollen diskuterer vi metodene for å forberede øynene på lys, transmisjonselektron og konfokalmikroskopi for å visualisere RPE-patologier. Vi beskriver også hvordan man kvantifiserer RPE-patologier på en objektiv måte for statistisk testing. Som bevis på konsept bruker vi RPE-fenotypingsprotokollen for å undersøke de strukturelle RPE-patologiene observert i transmembranprotein 135- (Tmem135) som overuttrykker mus og alderen villtype (WT) C57BL/6J-mus. Oppsummert tar vi sikte på å beskrive fenotypingsmetodikken for å karakterisere RPE i AMD-musemodeller, siden det for øyeblikket ikke er noen standardprotokoller tilgjengelig. Forskere som er interessert i å undersøke og kvantifisere patologier av fotoreceptorene eller choroid, som også påvirkes i AMD-musemodeller, kan ikke finne denne protokollen nyttig for sine studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyreforsøk, er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Wisconsin-Madison, og er i samsvar med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.

1. Evaluering av mus RPE ved lysmikroskopi

  1. Lag en fiksativ buffer som har en endelig konsentrasjon på 2% paraformaldehyd og 2% glutaraldehyd ved romtemperatur (RT) i en glassflaske.
    MERK: Denne protokollen krever maksimalt 14 ml fiksativ buffer per mus.
    FORSIKTIG: Paraformaldehyd og glutaraldehyd er farlige stoffer. Følg standard driftsprosedyrer når du arbeider med disse stoffene.
  2. Klargjør et perfusjonssystem med gravitasjonsmating på en absorberende underpute for hjerteperfusjon i en avtrekkshette (tilleggsfigur 1A).
    1. Plasser 40 ml av fikseringsbufferen i sprøytesylinderen i perfusjonssystemet (tilleggsfigur 1B).
    2. Vri ventilen til den er parallell med slangelinjen for å la bufferen strømme gjennom slangelinjen (tilleggsfigur 1C). Skyll linjen med buffer til alle luftbobler er fjernet fra linjen.
    3. Vri ventilen til den er vinkelrett på slangelinjen for å hindre bufferen i å strømme inn i slangeledningen (tilleggsfigur 1D).
      MERK: Perfusjonssystemet er nå klart til bruk.
  3. Avlive musen ved å plassere den i et karbondioksid (CO 2) kammer og la CO2 strømme inn i kammeret med en strømningshastighet på 30% av kammervolumet per minutt. Når musen slutter å puste, la CO2 strømme inn i kammeret i minst 1 min. Kontroller at musen er død før du går videre til neste trinn.
    MERK: Eutanasi gjennom injeksjon av farmakologiske midler kan brukes i denne protokollen som et alternativ til CO2 -inhalasjon.
  4. Utfør hjerteperfusjon på den euthaniserte musen.
    1. Overfør musen til et grunt brett nær perfusjonssystemet med magen vendt oppover. Spray magen med 70% etanol (EtOH).
    2. Lag fire snitt for å eksponere bukhulen (tilleggsfigur 2A).
      1. Lag et 5 cm dårligere kutt ved hjelp av buet saks og tang gjennom huden og bukveggen lengst til venstre på musen som er rett under ribbeholderen.
      2. Fortsett å lage et 3 cm medialt kutt gjennom musens hud og bukvegg som begynner på toppen av det nedre kuttet.
      3. Lag ytterligere 5 cm dårligere kutt på enden av mediale kutt gjennom huden og bukveggen lengst til høyre på musen rett under ribbeholderen.
      4. Lag ytterligere 3 cm medialt snitt for å fjerne bukhudklaffen med buede tang.
    3. Skjær gjennom mellomgulvet og brystbenet for å eksponere hjertet (tilleggsfigur 2B).
      MERK: Vær forsiktig så du unngår nicking hjertet, arterier og vener. Nicking disse vil føre til en ineffektiv hjerteperfusjon.
    4. Sett målernålen inn i hjertets venstre ventrikkel. Vri ventilen til den er parallell med slangelinjen. Klipp høyre atrium med buet saks for å la blod og fikseringsmiddel komme ut av hjertet (tilleggsfigur 2C).
    5. La 10 ml fiksativ buffer trenge inn i musen i minst 1-2 minutter, eller til leveren blir blek i fargen og ingen blod strømmer ut av høyre atrium. Når perfusjonen er fullført, vri ventilen til den er vinkelrett på slangelinjen for å stoppe strømmen av bufferen.
  5. Enucleate øynene fra musen etter hjerteperfusjon.
    1. Fjern musen fra det grunne brettet og plasser musen på den absorberende undermatten i en avtrekkshette. Orienter musens hode slik at venstre øye vender mot eksperimentøren og høyre øye er ute av syne. Kommenter den øvre siden av øyet med et vevsmerkefargestoff.
    2. Trykk forsiktig ned med tommelen og pekefingeren rundt øyehulen for å forårsake fremspring av øyet fra øyehulen (tilleggsfigur 3A).
    3. Ta den buede saksen og hold den med bladet i en vinkel på 30° fra øyehulen. Fortsett å klippe rundt øyet med den buede saksen i en 30° vinkel (tilleggsfigur 3B).
      MERK: Det er greit å kutte overflødig vev fra øyehulen for å bevare integriteten til øyebollet.
    4. Fjern øyebollet fra hodet med buede tang og legg det på en absorberende underpute. Nick hornhinnen med et skalpellblad nummer 11 og legg øyet med buet tang i et 2 ml mikrorør med 2 ml fiksativ buffer. Merk 2 ml mikrorøret med museidentifikasjon og "venstre" for å indikere venstre øye.
      MERK: Nick i hornhinnen gjør det mulig for fikseringsmiddelet å lett trenge inn i øyet for bedre å bevare det.
    5. Gjenta trinn 1.5.1-1.5.4 for høyre øye.
  6. La øynene ruge i fiksativ buffer over natten på en shaker i et 4 ° Celsius (C) rom, med en hastighet på 75 rotasjoner per minutt (rpm).
  7. Erstatt fikseringsbufferen med 2 ml 1x fosfatbuffersaltvann (PBS). Inkuber øynene i 1x PBS i 10 min på en shaker ved RT og 75 o / min. Gjenta dette trinnet to ganger.
  8. Rengjør og dissekere øynene for å generere bakre segmenter.
    MERK: Det bakre segmentet er musens øyeboll med nevrale retina, RPE, choroid og sclera sans hornhinnen, iris og linse.
    1. Legg øyet i en petriskål fylt med 1x PBS under et dissekerende mikroskop (tilleggsfigur 4A).
    2. Løft forsiktig fett og muskler bort fra øyebollet med fintippede tang. Trim forsiktig fettet og muskelen med mikrodissekerende saks i parallell retning til øyebollet til øyebollet har en jevn blåaktig-svart farge (tilleggsfigur 4B).
      MERK: Ikke skjær vinkelrett, da dette skader øyeeplet. Også, hvis vevsmerkingsfargestoffet kommer av under behandlingen, kommentere den overordnede siden av øyebollet umiddelbart.
    3. Plasser fintippede tang på hornhinnen. Klipp rundt omkretsen av hornhinnen, begynner på punkteringsstedet, med mikrodissekerende saks, for å fjerne hornhinnen og iris fra øyebollet (tilleggsfigur 4C).
    4. Ta fintippede tang og fjern linsen forsiktig fra øyeeplet for å gi det bakre segmentet (tilleggsfigur 4D).
    5. Plasser det bakre segmentet tilbake i et 2 ml mikrorør med 2 ml 1x PBS. Oppbevar det bakre segmentet i et kjøleskap på 4 °C.
      MERK: Posterior segmenter kan forbli i 1x PBS ved 4 ° C i mange uker før videre behandling.
  9. Gjenta trinn 1.3-1.8 for å forberede øynene fra andre mus i studien.
  10. Behandle og bygg inn et av de bakre segmentene fra hver mus i parafin for seksjonering. Forsikre deg om at den øvre siden av det bakre segmentet er øverst.
    MERK: Forfatterne stoler på University of Wisconsin-Madison (UW) Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) laboratorium for å utføre disse oppgavene. Her publiseres protokoller ved hjelp av en lignende parafinbehandlings- og embeddingsmetode23,24.
  11. Trim og seksjon hver parafinblokk for å oppnå en 5 μm tykk retinalseksjon som inkluderer optisk nervehode, samt fire ytterligere 5 μm tykke retinalseksjoner som er 250 μm fra hverandre. Merk lysbildene med museidentifikasjon og seriedelnummeret (dvs. 1, 2, 3, 4 eller 5). Lagre lysbildene i en lysbildeboks.
    MERK: Forfatterne stoler på UW TRIP-laboratoriet for deres tjenester innen parafinseksjonering. Her publiseres protokoller med tilsvarende parafinsnittingsmetode25,26.
  12. Flekk lysbildene som inneholder retinale seksjoner med hematoksylin og eosin (H &E). En protokoll for H&E-farging finnes i tilleggsfigur 5.
    MERK: Alle trinn i H&E-fargeprosedyren må fullføres i en avtrekkshette.
  13. Samle sydde bilder av H&E-fargede retinale seksjoner med en skalastang ved hjelp av et lysmikroskop ved 20x forstørrelse.
  14. Kvantifiser RPE-tykkelsen i retinalbildene som inneholder optisk nervehode for hver prøve.
    1. Last ned og åpne Fiji ImageJ-programmet. Dra alle de sydde netthinnebildene som inneholder synsnervehodet, inn på oppgavelinjen i Fiji ImageJ. Kontroller at bildeskalaen er kalibrert i μm og ikke piksler.
      MERK: Bildeskalaen er plassert øverst til venstre i vinduet som inneholder et netthinnebilde i Fiji ImageJ-programmet. Hvis skalaen er angitt i piksler, se bruksanvisningen til Fiji ImageJ-programmet for å konvertere piksler til μm.
    2. Merk hvert 300 μm intervall i hvert bilde fra kanten av synsnervehodet til enden av netthinnen (ora serrata). Klikk på Straight ikonet i Fiji ImageJ oppgavelinjen. Klikk og dra en linje fra kanten av synsnervehodet mot ora serrata som er 300 μm lang. Klikk på penselverktøyet på oppgavelinjen Fiji ImageJ og klikk på slutten av 300 μm-linjen for å markere den.
    3. Mål RPE-tykkelsen ved hvert markert intervall. Klikk på Straight ikonet i Fiji ImageJ oppgavelinjen. Klikk og dra en linje fra toppen til bunnen av RPE (tilleggsfigur 6). Klikk på Analyser > mål i Fiji ImageJ-menylinjen for å få RPE-tykkelsen.
    4. Overfør målingene av RPE-tykkelse til et regneark og merk kolonnen som inneholder målinger med museidentifikasjon. Merk en ekstra kolonne med 'Markert intervall' og angi avstanden bort fra optiske nerveverdier (dvs. 300, 600, 900, etc.)
      MERK: Det første målte intervallet tilsvarer 300 μm unna synsnerven, det andre målte intervallet tilsvarer 600 μm unna, og så videre.
  15. Kvantifisere RPE-patologiske insidensrater basert på retinale bilder for hver prøve.
    1. Åpne Fiji ImageJ-programmet.
    2. Åpne Cell Counter-applikasjonen i Fiji ImageJ-programmet. Klikk på Plugins > Analyser > celleteller i menylinjen Fiji ImageJ. Dra et netthinnebilde inn på oppgavelinjen i Fiji ImageJ og klikk på Initialiser i celletellervinduet .
    3. Telle antall RPE-patologier per netthinneseksjon ved hjelp av Cell Counter-applikasjonen . Klikk på Type 1 under Tellere og klikk deretter på alle mikrovakuoliseringshendelser i bildet. Klikk på Type 2 under Tellere og klikk deretter på alle makrovakuoliseringshendelser i bildet. Klikk på Type 3 under Tellere og klikk deretter på alle individuelle migrasjonshendelser i bildet.
    4. Overfør tallene på RPE-patologiene til et regneark. Merk radene med enten mikrovakuolisering, makrovakuolisering eller migrasjon, og kolonnen med museidentifikasjon.
    5. Gjenta trinn 1.15.2–1.15.4 for andre bilder av eksemplet. Gjennomsnittlig antall RPE-patologier per prøve og divider med fem for å beregne forekomsten av hver RPE-patologi for prøven i regnearket.
  16. Utfør statistisk analyse på RPE-tykkelsene ved hvert intervall og RPE-patologiinsidensratene for å avgjøre om det er signifikante forskjeller mellom gruppene i studien.

2. Evaluering av mus RPE ved transmisjonselektronmikroskopi

  1. Skjær de andre bakre segmentene etter trinn 1,5-1,9 i to gjennom overordnet i to seksjoner med et barberblad. Kommenter den øvre siden av de seksjonerte bakre segmentene med vevsmerkefargestoff. Separer de seksjonerte bakre segmentene i nye 2 ml mikrorør som inneholder 2 ml 1x PBS og museidentifikasjon.
    MERK: Musens bakre segment er for stort til å behandle i ett stykke og må kuttes i to for transmisjonselektronmikroskopibehandling.
  2. Skyll vevet med 2 ml 0,1 M kakodylatbuffer, pH 7,2. Inkuber i 10 min på RT på benkeplaten. Gjenta dette trinnet to ganger til.
  3. Erstatt den 0,1 M kakodylatbufferen med 2 ml 2 % osmiumtetroxid (OsO4) fortynnet i 0,1 M kakodylatbuffer. Inkuber i 1,5 t ved RT i avtrekksdekselet.
    FORSIKTIG: OsO4 er et giftig stoff. Følg standard driftsprosedyrer når du arbeider med OsO4.
  4. Skyll vevet med 2 ml 0,1 M kakodylatbuffer i 10 min ved RT i avtrekksdekselet. Gjenta dette trinnet én gang.
  5. Dehydrer vevet med graderte EtOH-fortynninger fra 50 % til 100 % ved RT i avtrekkshetten. En protokoll for dehydreringsprosedyren finnes i tilleggsfigur 7.
  6. Fjern 100% EtOH fra vevet og tilsett 2 ml propylenoksid til vev. Inkuber ved RT i avtrekkshetten i 15 min. Fjern propylenoksydet fra vevet og tilsett 2 ml friskt propylenoksid til vevet. Inkuber ved RT i avtrekkshetten i 15 min.
    FORSIKTIG: Propylenoksid er et giftig stoff. Følg standard driftsprosedyrer når du arbeider med propylenoksid.
  7. Fjern propylenoksid fra vevet og tilsett 2 ml av en 1: 1 blanding av propylenoksid og harpiks til vevet. La stå over natten under et vakuum i avtrekkshetten på RT.
    FORSIKTIG: Harpiks er et farlig stoff for mennesker. Følg laboratoriets standard driftsprosedyrer når du arbeider med harpiks.
  8. Erstatt 1: 1-blandingen av propylenoksid og harpiks fra vev med 2 ml ren harpiks. La stå over natten under vakuum i avtrekkshetten på RT.
  9. Legg vevet i harpiks. Legg en etikett med museidentifikasjon i blyant og en dråpe harpiks i formen . Plasser vevet på harpiksdråpen. Fyll formen med harpiks og sett under vakuum i 1 time ved RT i avtrekkshetten.
  10. Flytt etikettene og prøvene med fintippet tang, med den bakre siden av den bakre øyekoppseksjonen øverst. La formen stå over natten ved 65 °C i en ovn i avtrekkshetten.
  11. Fjern formene fra ovnen. La formene avkjøles til RT på benkeplaten. Fjern blokkene fra formene.
    MERK: Blokkene er nå klare for trimming.
  12. Form harpiksblokkene med et barberblad for å danne en trapesform. Trim harpiksblokkene ved hjelp av en mikrotome til optisk nervehode er synlig. Fortsett å bruke en diamantkniv til å kutte semithin seksjoner fra harpiksblokkene med en tykkelse på 0,5 μm.
    MERK: Her er en publisert protokoll om mikrotomseksjonering27. Om ønskelig kan 0,5 μm tykke semitinseksjoner fra harpiksblokkene samles og farges for å evaluere prøvens integritet.
  13. Klipp en 70 nm tykk ultratynn seksjon fra hver trimmet blokk ved hjelp av en ultramicrotome. Samle en 70 nm tykk ultratynn seksjon på et 400-mesh tynnbar kobbergitter. Plasser rutenettet i en rutenettoppbevaringsboks og merk sporet med museidentifikasjon.
    MERK: Her er en publisert protokoll om ultramicrotome seksjonering28.
  14. Beis ristene med 2% uranylacetat i 5 min og deretter med 3,5% blycitratløsning i 5 min ved RT i avtrekkshetten.
    FORSIKTIG: Uranylacetat og blycitrat er farlige stoffer. Følg standard driftsprosedyrer når du arbeider med disse stoffene.
  15. Få bilder for hver prøve ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop ved en forstørrelse på 15.000x, hvor gitterlinjene i kobbergitteret krysser RPE og BrM.
    MERK: Det bør være minst 20 til 35 bilder per seksjon og 40 til 70 bilder per prøve.
  16. Kvantifiser BLamD-høyder i bildene for prøvene i studien.
    1. Åpne Fiji ImageJ-programmet. Dra alle bildene fra eksempeldelen til oppgavelinjen Fiji ImageJ. Kontroller at bildene er kalibrert i μm og ikke piksler.
    2. Mål BLamD-høyden i bildene. Klikk på Rett ikonet på oppgavelinjen i Fiji ImageJ. Klikk og dra en linje fra den elastiske laminaen til BrM til toppen av den høyeste forekomsten i bildet (tilleggsfigur 8). Klikk på Analyser > mål i Fiji ImageJ-menylinjen for å få BLamD-høyden i bildet.
      MERK: Hvis det ikke er noen BLamDs i bildet, tegner du en linje fra den elastiske lamina av BrM til den basale lamina av RPE.
    3. Overfør BLamD-høydene til et regneark og en etikett med museidentifikasjon.
  17. Beregn de kumulative frekvensene av BLamD-høyder per genotype og gjennomsnitt av BLamD-høyder per mus i regnearket. Utfør statistisk analyse på gjennomsnittet av BLamD-høyder for å avgjøre om det er signifikante forskjeller mellom gruppene i studien.

3. Evaluering av mus RPE gjennom konfokal mikroskopi

  1. Samle øyne fra musene. Avlive musene i henhold til prosedyren beskrevet i trinn 1.3. Enucleate øynene ved hjelp av trinn 1.5. Plasser øynene med buet tang i et 2 ml mikrorør med 2 ml 1x PBS og museidentifikasjon.
    MERK: Ikke mørktilpass musene, da interdigitalisering av fotoreceptorene og RPE-apikale prosesser muliggjør bedre visualisering av RPE gjennom konfokal mikroskopi.
  2. Rengjør og dissekere museøynene umiddelbart for å generere musens bakre øyekopper.
    MERK: Den bakre øyekoppen er forskjellig fra det bakre segmentet fordi den ikke inneholder nevrale netthinnen.
    1. Overfør øyet til en petriskål inneholdende 1x PBS under et dissekerende mikroskop (tilleggsfigur 9A).
    2. Fjern fett og muskler fra øyeeplet, som beskrevet i trinn 1.8.2 (tilleggsfigur 9B).
    3. Nick hornhinnen i øyebollet med et nummer 11 skalpellblad. Fjern hornhinnen og iris, som beskrevet i trinn 1.8.3 (tilleggsfigur 9C).
    4. Trekk ut linsen med fintippet tang. Ta to fintippede tang og skill forsiktig den nevrale netthinnen fra det bakre segmentet.
    5. Klipp forsiktig den nevrale netthinnen ved synsnervehodet for fjerning fra bakre øyekopp (tilleggsfigur 9D).
    6. Plasser den bakre øyekoppen i et nytt 2 ml mikrorør inneholdende 500 μL 1x PBS med museidentifikasjon.
  3. Fest de bakre øyekoppene med metanol (MeOH) (tilleggsfigur 10).
    MERK: Trinn 3.3 tar omtrent 2 timer og 40 minutter å fullføre.
    1. Tilsett 500 μL MeOH til vev. Inkuber på en shaker ved 75 o / min i 5 min ved RT.
    2. Fjern 500 μL oppløsning fra vevet og tilsett 500 μL MeOH. Inkuber i 5 min på en shaker ved 75 o / min i 5 minutter ved RT. Gjenta dette trinnet en gang til.
    3. Fjern hele løsningen fra vevet og tilsett 500 μL MeOH. Inkuber på en shaker ved 75 o / min i minst 2 timer ved RT.
      MERK: Som et alternativ til trinn 3.3.3 kan den bakre øyekoppen ruges over natten i MeOH på en shaker ved 75 o / min i et 4 ° C rom.
    4. Tilsett 500 μL 1x PBS til vevet. Inkuber på en shaker ved 75 o / min i 5 min ved RT.
    5. Fjern 500 μL oppløsning fra vevet og tilsett 500 μL 1x PBS. Inkuber på en shaker ved 75 o / min i 5 minutter ved RT. Gjenta dette trinnet en gang til.
    6. Fjern hele løsningen fra vevet og erstatt den med 500 μL 1x PBS.
      MERK: Vevet er helt festet av MeOH og kan oppbevares i et kjøleskap på 4 °C i minst 1 måned.
  4. Utfør immunfluorescensfarging av bakre øyekopper for å visualisere tette kryss og kjerner i RPE (tilleggsfigur 11).
    1. Fjern 500 μL 1x PBS fra prøvene og tilsett 100 μL fortynnet 10% normalt eselserum i 1x PBS-oppløsning. Inkuber på en shaker ved 75 o / min i 30 min ved RT.
    2. Fjern den fortynnede 10% normale eselserumoppløsningen fra prøvene og tilsett 100 μL av en 1:50 fortynning av et kaninpolyklonalt anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) antistoff i 1x PBS. Overfør prøvene til et rom på 4 °C og rug over natten på en shaker ved 75 o / min.
    3. Fjern antistofffortynningen fra prøvene og tilsett 2 ml 1x PBS. Inkuber på en shaker ved 75 o / min i 10 min ved RT. Gjenta dette trinnet to ganger til.
    4. Fjern 1x PBS fra prøver. Tilsett 100 μL av et 1:250 fortynning av et esel-antikanin IgG-antistoff med en 488 fluorofor-konjugert tag og en 1:250 fortynning av 4',6-diamidin-2'-fenylindoldihydroklorid (DAPI) i 1x PBS til prøvene. Dekk prøvene med aluminiumsfolie og inkuber på en shaker ved 75 o / min i 2 timer ved RT.
      MERK: Prøvene må være helt dekket med aluminiumsfolie for å forhindre fotobleking.
    5. Fjern antistoff- og DAPI-fortynningene fra prøvene. Tilsett 2 ml 1x PBS til prøvene, dekk til med aluminiumsfolie og inkuber på en shaker ved 75 o / min i 10 minutter ved RT. Gjenta dette trinnet tre ganger til.
      MERK: De stramme kryssene og kjernene til RPE er nå henholdsvis fullstendig merket og farget.
  5. Monter de bakre øyekoppene på mikroskoplysbilder.
    1. Merk et mikroskoplysbilde med museidentifikasjon. Overfør den bakre øyekoppen til et mikroskoplysbilde under et dissekerende mikroskop med den koroidale siden vendt ned. Legg til en dråpe på 1x PBS til den bakre øyekoppen for å forhindre at den tørker ut (tilleggsfigur 12).
    2. Klipp den bakre øyekoppen med et skalpellblad nummer 11 på fire steder som vil gi fire kvadranter som tilsvarer kardinalretningene (dvs. nord, øst, sør og vest). Dab overskudd 1x PBS med vev fra omkretsen av den bakre øyekoppen. Flat forsiktig ut den bakre øyekoppen med en kamelhårbørste og fintippet tang (tilleggsfigur 12).
      MERK: Det resulterende produktet er nå kjent som en RPE-flatmontering.
    3. Legg til en dråpe monteringsmedium til RPE-flatfestet og legg et deksel på toppen av det. Påfør klar neglelakk for å forsegle dekselet og la det tørke i minst 30 minutter ved RT i en lukket skuff. Legg lysbildene i en bæreboks og oppbevar esken i kjøleskap på 4 °C.
      MERK: Vær forsiktig så du ikke introduserer bobler på RPE-flatfestet. RPE-flatfester kan avbildes innen en tidsramme på 2 uker.
  6. Få et bilde av hver av de fire kvadrantene som omgir optisk nerve av RPE flat mount på et konfokalmikroskop ved 20x forstørrelse for hver prøve. Et eksempel på et RPE-flatmontert bilde finnes i tilleggsfigur 13A.
    MERK: Det kan være nødvendig å utføre z-stack-avbildning av RPE-flatfestene der flere bilder tas og stables for å kompensere for dimensjonsforskjeller på RPE-flatmonteringen.
  7. Spor de tette kryssene til RPE-cellene i hvert RPE-flatmonteringsbilde. Et eksempel på et sporet RPE-flatmonteringsbilde finnes i tilleggsfigur 13B.
    1. Åpne Fiji ImageJ-programmet. Dra et RPE-flatmontert bilde til Fiji ImageJ-oppgavelinjen. Kontroller at bildet er kalibrert i mikrometer og ikke piksler.
    2. Dobbeltklikk på ikonet for overleggspenselverktøyet på oppgavelinjen i Fiji ImageJ for å angi penselbredden til 3, gjennomsiktighet til 0 og farge til rød. Klikk Lukk-knappen i vinduet for overleggspenselverktøyet .
    3. Klikk på ikonet for Overlay Brush Tool . Klikk og dra på de stramme kryssene til alle RPE-celler som er helt inne i bildet.
      MERK: Hvis det gjøres en sporingsfeil, dobbeltklikker du på ikonet Overlay Brush Tool og klikker på Angre-boksen i vinduet Overlay Brush Tool for å fjerne sporingsfeilen fra bildet.
    4. Klikk på rektangelikonet på oppgavelinjen Fiji ImageJ. Klikk på bildet og dra rundt omkretsen av bildet. Klikk på Rediger > Fjern på Fiji ImageJ-menylinjen for å beholde de sporede linjene og fjerne eventuelle blå og grønne farger fra bildet.
    5. Lagre sporingsbildet på et passende sted med museidentifikasjon, kvadrantplassering (dvs. nord, sør, øst eller vest) og en CP-suffiksetikett.
      MERK: Ikke lagre RPE-sporingsbildet før du fullfører trinn 3.7.4.
  8. Beregn RPE-celleområdene for hver prøve.
    1. Angi et sted for å lagre filene fra RPE-områdeanalyse ved å opprette en mappe på datamaskinens skrivebordsskjerm. Generer undermapper for hvert RPE-sporingsbilde og merk undermappene med museidentifikasjon samt kvadrantplassering (dvs. nord, sør, øst eller vest).
    2. Installer og åpne Cell Profiler-programmet29. Last ned prosjektfilen Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1). Åpne filen Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj ved å klikke Fil > Åpne Project i menylinjen i Cell Profiler-programmet.
    3. Dra ett RPE-sporingsbilde til Bilde > Slipp filer og mapper her-boksen i Cell Profiler-programvinduet.
    4. Skriv inn plasseringen av mappen i Cell Profiler-programmet som tilsvarer RPE-sporingsbildet. Klikk på Output Settings-knappen nederst til venstre i Cell Profiler-programvinduet og skriv inn plasseringen av mappen i tekstboksene Standard Input Folder og Standard Output Folder .
    5. Klikk på Analyser bilder-knappen nederst til venstre i Cell Profiler-programvinduet. Etter at analysen er fullført, vises et Analyse fullført-vindu på skjermen. Klikk på OK-knappen i vinduet Analysen fullført .
      MERK: Denne handlingen vil generere en csv-fil og jpeg-bilde. CSV-filen inneholder områdene for RPE-cellene i sporingsbildet. JPEG-bildet vil tilsvare RPE-sporingsbildet, der hver RPE-celle vil bli merket med et tall (tilleggsfigur 13C).
    6. Overfør RPE-områdene fra csv-filen til et regneark. Merk regnearket med museidentifikasjon.
    7. Utfør en kvalitetskontroll av dataene ved å bekrefte at hvert RPE-område i csv-filen kobler til en fullstendig sporet RPE-celle i et jpeg-bilde. Fjern eventuelle verdier fra regnearket som ikke samsvarer med fullstendig sporede RPE-celler.
    8. Gå tilbake til Cell Profiler-programmet. Høyreklikk på RPE-sporingsbildenavnet i boksen Slipp filer og mapper her, og velg Fjern listen for å fjerne bildet fra Cell Profiler-programmet.
    9. Gjenta trinn 3.8.3–3.8.8 for å beregne RPE-størrelsene for de resterende tre RPE-sporingsbildene av utvalget.
  9. Kvantifiser gjennomsnittet av RPE-cellestørrelsen for hver prøve i regnearket.
  10. Kvantifiser RPE-celletettheten for hver prøve i regnearket. For å beregne RPE-celletettheten, divider det totale antall RPE-celler per kvadrant med det totale arealet av RPE-celler per kvadrant som ble detektert av Cell Profiler-programmet. Bestem gjennomsnittet av RPE-celletetthetene fra de fire kvadrantene per prøve.
  11. Kvantifiser antall multinukleerte RPE-celler per RPE flatmontering for hver prøve. Bruk Cell Counter-programmet i Fiji ImageJ-programmet, som beskrevet i trinn 1.15.1-1.15.3, for å telle antall RPE-celler med mer enn tre kjerner i fire kvadranter av prøven.
  12. Utfør statistisk analyse på RPE-cellestørrelse og tetthetsgjennomsnitt, samt antall multinukleerte RPE-celler for å avgjøre om det er signifikante forskjeller mellom gruppene i studien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fullføring av RPE-fenotypingsprotokollen beskrevet i denne artikkelen gir en kvantitativ analyse av strukturelle RPE-abnormiteter som ofte observeres i musemodeller av AMD. For å bekrefte effektiviteten av denne protokollen brukte vi den på mus som er kjent for å vise RPE-patologier, inkludert transgene mus som overuttrykker WT Tmem135 drevet av kyllingens beta-aktinpromotor (Tmem135 TG)30 og alderen C57BL/6J-mus31,32. Målet med disse forsøkene er å vise representative resultater som kan oppnås ved hjelp av metodene beskrevet i denne protokollen til forskere som er nye innen musemodeller.

Vi fulgte metodene i trinn 1 i protokollen for å behandle og evaluere øyne fra WT- og Tmem135 TG-mus for å evaluere RPE-patologier ved hjelp av lysmikroskopi. Vi fant at 4 måneder gamle Tmem135 TG-mus har en signifikant reduksjon i RPE-tykkelse ved to målte intervaller i forhold til aldersmatchet WT gjennom en ANOVA med post-hoc Tukey-test (figur 4). Disse resultatene indikerer at RPE er tynnere i de 4 måneder gamle Tmem135 TG-musene enn i aldersmatchede WT-mus ved 600 og 900 μm unna optisk nerve.

I tillegg, ved hjelp av metodene i trinn 1 i protokollen, beregnet vi forekomsten av RPE-patologier, inkludert mikrovakuolisering, makrovakuolisering og migrasjon av tre 25 dager gamle WT- og Tmem135 TG-mus (figur 5A). Den gjennomsnittlige frekvensen av RPE-mikrovakuoliseringspatologier per lysbilde i WT-mus var 0,67 ± 0,31 og i Tmem135 TG-mus 7,07 ± 0,61 (figur 5B). Det var ingen RPE-makrovakuolisering hos WT-mus, men det var i gjennomsnitt 5,33 ± 2,02 makrovakuoliseringshendelser i Tmem135 TG-mus (figur 5C). Til slutt var frekvensen av migrerende RPE-celler per lysbilde null i WT-mus og 0,4 ± 0,35 i Tmem135 TG-mus (figur 5D). Etter å ha utført en students t-test, var forekomsten av RPE-mikrovakuolisering og mikrovakuolisering signifikant forskjellig mellom WT- og Tmem135 TG-mus . Den høyere forekomsten av RPE-trekkceller i Tmem135 TG-mus var imidlertid ikke signifikant forskjellig sammenlignet med WT (p = 0,1161). Disse dataene viser at RPE-mikrovakuolisering og makrovakuolisering, men ikke migrasjon, er signifikant høyere i 25 dager gamle Tmem135 TG enn WT-mus.

Etter metodene i protokollen inkludert i trinn 2, forberedte vi retinalseksjoner fra 2 måneder gamle og 24 måneder gamle WT C57BL/6J-mus for transmisjonselektronmikroskopi for å analysere tilstedeværelsen og høydene til BLamDs. Vi fant BLamDs tilstede i 24 måneder gamle WT retinas som var spesielt fraværende i 2 måneder gamle WT retinas (figur 6A). Vi presenterte høyden på BLamDs i de 24 måneder gamle WT-netthinnene ved å beregne og plotte de kumulative frekvensene av deres forekomst. Kumulative frekvenser av BLamD-høydene ble grafet mot avsetningshøyden for å illustrere fordelingen av innskuddshøydene. Det er en forskyvning til høyre for linjen for de 24 måneder gamle WT BLamD-høydene sammenlignet med de 2 måneder gamle WT BLamD-høydene, noe som viser en økning av innskudd i 24 måneder gamle WT-mus (figur 6B). Denne grafen støttes av et større gjennomsnitt av BLamD-høyder i 24 måneder gamle WT-netthinner (1,01 μm ± 0,43 μm) enn 2 måneder gamle WT-retinaer (0,23 μm ± 0,017 μm), som var signifikant forskjellige ved en students t-test (figur 6C). Oppsummert konkluderer vi med at 24 måneder gamle WT-mus har store BLamDs i sub-RPE-rommet i netthinnen sammenlignet med 2 måneder gamle WT-mus.

Vi brukte metodene for å forberede øyne fra 4 måneder gamle WT- og Tmem135 TG-mus i trinn 3 for å generere RPE-flatfester for påvisning og analyse av RPE-dysmorfi og multinukleering. I denne protokollen definerte vi RPE-dysmorfi ved endringer i RPE-cellestørrelse og tetthet i en AMD-musemodell i forhold til kontrollene. Vi fant at RPE i 4 måneder gamle Tmem135 TG-mus er dysmorfe (figur 7A). RPE i Tmem135 TG retinas er større (806,89 μm 2 ± 252,67 vs. 291,69 μm 2 ± 26,31) og mindre tette (0,0014 celler / μm 2 ± 0,00039 vs 0,0033 celler / μm 2 ± 0,00024) enn aldersmatchede WT retinas (figur 7B, C). Videre var det flere multinukleerte RPE-celler i Tmem135 TG retinas sammenlignet med WT-kontroller (8,04 celler ± 5,54 vs. 0,33 celler ± 0,29) (figur 7D). Alle disse parametrene nådde statistisk signifikans med en students t-test. Sammen har 4 måneder gamle Tmem135 TG-mus flere dysmorfe og multinukleerte RPE-celler enn 4 måneder gamle WT-mus.

Figure 1
Figur 1 RPE-patologier påvist ved lysmikroskopi. Representative bilder av normal RPE i WT (A) og unormal RPE i Tmem135 TG mus (B-E). RPE-patologiene observert i Tmem135 TG-mus inkluderer RPE-tynning (B), makrovakuolisering (C), mikrovakuolisering (D) og migrasjon (E). Hver patologi er illustrert med en svart pil. Skala bar = 100 μm. Forstørrelse = 20x. Forkortelser: RGC = retinal ganglioncellelag, IPL = indre pleksiformt lag, INL = indre nukleært lag, OPL = ytre pleksiformt lag, ONL = ytre nukleært lag, IS = fotoreseptor indre segmenter, OS = fotoreceptor ytre segmenter, RPE = retinalt pigmentert epitel, Cho = choroid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: RPE-patologier påvist ved transmisjonselektronmikroskopi. Representative bilder av (A) RPE hos unge CFH-H/H og (B) 2 år gamle CFH-H/H-mus som har rikelig med basale laminære avleiringer (BLamDs). BLamDs er sporet med gule prikker i bildet. Skala bar = 800 nm. Forstørrelse = 15 000x. Forkortelser: N = kjerne, M = mitokondrion, P = pigmentgranulat, BI = basale infoldinger, EL = elastisk lamina, RPE = retinalpigmentert epitel, BrM = Bruchs membran, Cho = choroid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 RPE-patologier påvist ved konfokalmikroskopi. Representative bilder av (A) normal RPE av 8 måneder gammel WT og (B) unormal RPE av 8 måneder gamle Tmem135 TG-mus som viser RPE-dysmorfi. Den hvite firkanten er zoomet inn (C) for å skildre en multinukleert RPE-celle med tre kjerner. Den grønne fargen er anti-ZO1-assosierte RPE-tette kryss, og den blå fargen er DAPI-farging av RPE-kjerner. Skala bar = 50 μm. Forstørrelse = 20x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: RPE-tykkelse hos 4 måneder gamle villtype (WT) og Tmem135 TG-mus. (A) Representative bilder av netthinnen fra 4 måneder gamle WT og Tmem135 TG (TG) mus. Forstørrelse = 20x. Skala bar = 100 μm. (B) Linjediagrammer av RPE-tykkelsesmålingene i 4 måneder gamle WT (svart) og Tmem135 TG-mus (grønn) opptil 3,000 μm unna optisk nerve. Tall etter genotypen angir antall mus som brukes i denne studien. *p < 0,05, ANOVA med post-hoc Tukey-test. Alle data er gjennomsnittlige ± sd. Se forklaringen i figur 1 for forkortelser av netthinnelag. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: RPE-patologier i 25 dager gamle Tmem135 TG-mus. (A) Representative bilder av RPE-mikrovakuolisering, makrovakuolisering og migrasjon i tre 25 dager gamle Tmem135 TG (TG) mus. RPE-patologier er uthevet av svarte piler i hvert bilde. Forstørrelse = 40x. Skalastang = 20 μm. (B-D) Kvantifisering av RPE-mikro- og makrovakuolisering samt migrerende RPE-celler i 25 dager gamle WT- og Tmem135 TG-mus. Tall i parentes angir antall mus som ble brukt i denne studien. *p < 0,05 og ****p < 0,0001, student t-test. Alle data er gjennomsnittlige ± sd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Ultrastrukturell analyse av BLamDs i unge og eldre WT retinas . (A) Representative elektronmikrografer av 2 måneder gamle og 24 måneder gamle WT RPE. Forstørrelse = 15 000x. Skala bar = 800 nm. Et eksempel på en basal laminær forekomst (BLamD) er diagrammet med en parentes. (B) Kumulative frekvenser av BLamD-høydene. (C) BLamD høyde gjennomsnitt. Tall i parentes angir totalt antall mus per genotype som ble brukt i denne studien. **p < 0,01, student t-test. Alle data er gjennomsnittlige ± sd. Se forklaringen i figur 2 for forkortelser av netthinnelag. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: RPE flate fester avslører RPE-patologier i Tmem135 TG-mus. (A) Representative bilder av 4 måneder gamle WT og Tmem135 TG (TG) RPE flate fester med anti-ZO-1 i grønt og DAPI i blått. Forstørrelse = 20x. Skalastang = 100 μm. (B) RPE-cellestørrelse, (C) RPE-celletetthet og (D) RPE-multinukleasjon i 4 måneder gamle WT- og Tmem135 TG-mus. Tallet i parentes angir antall mus som ble brukt i studien. *p < 0,05, **p < 0,01 og ****p < 0,0001, student t-test. Alle data er gjennomsnittlige ± sd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Skjematisk fremstilling av oppsett og bruk av perfusjon i hjertet. (A) Perfusjonssystem med tyngdekraft. (B) Sprøytesylinder av perfusjonssystemet for fiksativ buffer. (C) Ventilen som skal dreies til den er parallell med slangelinjen for å la bufferen strømme gjennom slangelinjen. (D) Ventilen som skal dreies til den er vinkelrett på slangelinjen for å hindre bufferen i å strømme inn i slangeledningen. Bilde opprettet i Biorender. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Skjematisk prosedyre for hjerteperfusjon av mus. (A) Fire snitt laget for å eksponere bukhulen. (B) Kutt gjort gjennom mellomgulvet og brystbenet for å avsløre hjertet. (C) Gauge nål settes inn i venstre ventrikkel i hjertet. Ventilen dreies til den er parallell med slangelinjen. Høyre atrium er kuttet med buet saks for å tillate blod og fikseringsmiddel å komme ut. Bilde opprettet i Biorender. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 3: Skjematisk prosedyre for å enucleate øyne fra en mus. (A) Trykk forsiktig ned med tommelen og pekefingeren rundt øyehulen for å forårsake fremspring av øyet fra øyehulen. (B) Ta buet saks og hold dem med bladet i en 30° vinkel fra øyehulen. Fortsett å klippe rundt øyet med den buede saksen i en 30 ° vinkel. Fargede prikker representerer fingerplassering på musen eller buet saks. Bilde opprettet i Biorender. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 4: Bilder av disseksjon av øyet til mus for å gi musens bakre segment. (A) Øye overført til et dissekerende mikroskop. (B) Fett og muskler fjernet fra øyeeplet. (C) Hornhinnen og iris fjernet fra øyeeplet. (D) Linsen fjernet fra øyeeplet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 5: Fargeprosedyre for hematoksylineosin (H&E). Skjematisk fremstilling av H&E-prosedyren for å flekke parafin-innebygde retinale seksjoner. Pilene angir overføring mellom trinn. Tidspunktet for hvert trinn er gitt med rød skrift. Reagenser for farging leveres i svart skrift i glassfargebeholdere. Det skal være en glassfargebeholder forberedt for hvert reagens som er inkludert i diagrammet ovenfor. Alle trinn må fullføres i en avtrekkshette. Når du legger til en følgeseddel på et lysbilde, må du passe på at du ikke introduserer bobler i lysbildet. Etter at prosedyren er fullført, kan lysbilder lagres i en lysbildeboks. Bilde opprettet i Biorender. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 6: Eksempel på måling av RPE-tykkelse. Den svarte pilen viser en rød linje fra toppen til bunnen av RPE. Denne linjen kan måles for å bestemme tykkelsen på RPE. Skala bar = 100 μm. Forstørrelse = 20x. Boksområdet er zoomet ut for enklere visning av RPE. Se forklaringen i figur 1 for forkortelser av netthinnelag. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 7: EtOH dehydreringsprosedyre for musens bakre segmenter for TEM-behandling. Bilde opprettet i Biorender. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 8: Eksempel på BLamD-høydemåling. Den røde linjen viser den største BLamD i dette bildet. Gule prikker avgrenser BLamDs i bildet. Denne røde linjen kan måles for å bestemme høyden på denne BLamD i dette bildet. Skala bar = 800 nm. Forstørrelse = 15 000x. Se forklaringen i figur 2 for forkortelser av netthinnelag. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 9: Museøyedisseksjon for RPE-flatmontering. (A) Øye overført til en petriskål inneholdende 1x PBS under et dissekerende mikroskop. (B) Fett og muskler fjernet fra øyeeplet. (C) Hornhinnen og iris fjernet fra øyeeplet. (D) Linse og netthinne fjernet fra øyeeplet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 10: Metanol (MeOH) fikseringsprosedyre for bakre øyekopper hos mus. Bilde opprettet i Biorender. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 11: Immunfluorescensprosedyre for å merke tette kryss og kjerner av RPE-celler. Diagram som viser trinnene i immunfluorescensteknikk fra denne protokollen. Merk at denne teknikken tar 2 dager å fullføre. Alle trinn skjer ved RT og på en shaker med en hastighet på 75 o / min, med mindre det er spesifikt angitt i diagrammet. Det primære (1°) antistoffet som ble brukt i denne studien var kaninpolyklonalt anti-ZO1, og det sekundære (2º) antistoffet som ble brukt i denne studien var 488 fluoroforkonjugert eselantikanin IgG. Når det sekundære antistoffet og DAPI er tilsatt prøvene, må prøvene pakkes inn i aluminiumsfolie for å beskytte mot fotobleking av prøven. Bilde opprettet i Biorender. Forkortelser: NDS = normalt eselserum, Ab = antistoff. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 12: Avbildning av kutt for å gi fire kvadranter av mus RPE flatmontering. N = nord, E = øst, S = sør, W = vest. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 13: Eksempler på RPE-endepunkter for flatmonterte analyser. (A) RPE flatmontert bilde. (B) RPE grense spor bilde. (C) RPE Cell Profiler analysert bilde. Forstørrelse = 20x. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 1: Ikeda RPE Area Calculator.cpproj Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen introduserte vi en fenotypingsprotokoll for å vurdere de strukturelle RPE-patologiene til musemodeller. Vi beskrev trinnene som kreves for å behandle øynene for ulike bildebehandlingsteknikker, inkludert lys, transmisjonselektron og konfokal mikroskopi, samt kvantifisering av typiske patologier observert via disse bildebehandlingsmetodene. Vi beviste effektiviteten av vår RPE-fenotypingsprotokoll ved å undersøke Tmem135 TG og 24 måneder gamle WT-mus, siden disse musene viser RPE-patologier30,31,32. Denne protokollen kan brukes på enhver genetisk modifisert eller farmakologisk behandlet mus som kan ha RPE-patologier som RPE-tynning, vakuolisering, migrasjon og dysmorfi, samt BLamDs 6,7. Selv om RPE-patologiene observert i Tmem135 TG og 24 måneder gamle WT-mus er tilstede i andre AMD-musemodeller 7,30, er det viktig for forskeren å bli kjent med AMD-musemodellen som er valgt for studiene, da debutalderen og alvorlighetsgraden av RPE-patologiene til deres AMD-musemodell kan avvike fra Tmem135 TG og 24 måneder gamle WT-mus. Forskere må kanskje bruke flere mus til sine studier enn antall mus som brukes til å produsere de representative resultatene vist i denne artikkelen, hvis presentasjonen av RPE-patologier er variabel i deres respektive AMD-musemodell. Videre er mange AMD-musemodeller for tiden tilgjengelige for AMD-forskere, men har ikke fullstendige beskrivelser av deres RPE-patologier, noe som kan kreve at forskere utfører foreløpige studier for å skaffe seg denne informasjonen.

Selv om det kan gjøres endringer i hvordan museøyne behandles for de ulike bildebehandlingsmetodene, er det avgjørende å opprettholde den kvantitative evalueringen av strukturelle RPE-abnormiteter som beskrevet i protokollen. For eksempel ble fem H&E-fargede retinalseksjoner forberedt på å telle antall RPE-mikrovakuoliserings-, makrovakuoliserings- og migrasjonshendelser, slik at forskere kunne evaluere RPE-patologier på flere steder i musehinnen. Et annet eksempel er å bruke et 400-mesh tynn-bar kobberelektronmikroskopinett for å vurdere de ultrastrukturelle abnormiteter av RPE. Elektronmikroskopigitteret gir et rammeverk for å evaluere en retinalprøve systematisk og objektivt ved transmisjonselektronmikrografi, samt oppnå 40 til 70 bilder per retinalseksjon for å undersøke tilstedeværelsen av BLamDs. Dette kan ikke oppnås med et elektronmikroskopi-sporgitter, og vi foreslår at du ikke bruker dem med denne protokollen. Til slutt, å ta 20x forstørrelsesbilder fra de fire kvadrantene til en RPE-flatmontering, gjør det mulig for forskere å undersøke store områder av murine RPE for dysmorfi og multinukleering. Forskere står fritt til å utvide denne protokollen og undersøke flere retinale seksjoner for RPE-patologier i sine studier. Sammen tillater disse metodene forskere å samle rikelig med data for å trekke konklusjoner om strukturelle RPE-patologier som kan være tilstede i deres AMD-musemodeller.

Et annet sentralt trekk ved denne protokollen er konsistensen av RPE-fenotypingsmetodene. For eksempel ble alle øyne som ble brukt til lys- og transmisjonselektronmikroskopi orientert av den øvre siden av musehinnen for seksjonering. Det er viktig å opprettholde orienteringen av museøyet gjennom hele behandlingen for lys- og transmisjonselektronmikroskopi fordi museøyet har en topografisk fordeling av retinale celler33,34. Den anatomiske orienteringen til museøyet ble ikke opprettholdt for RPE flatmonteringspreparat, siden det ikke er observert bedre enn dårligere topografiske endringer i musens RPE-celle. Faktisk viser RPE i den menneskelige netthinnen topografiske endringer som utstråler bort fra optisk nervehode35, noe som tyder på at dette kan være tilfelle for mus RPE. Til slutt er bildeoppkjøpet beskrevet i denne protokollen avhengig av den anatomiske posisjoneringen av optisk nerve. Inkludering av disse metodologiske aspektene vil bidra til å reprodusere resultater av RPE-patologier for forskere når de jobber med sine AMD-musemodeller.

Forskere kan ønske å legge til flere analytiske funksjoner i RPE-fenotypingsprotokollen. Noen fenotypiske utfall som ikke er omtalt i denne protokollen, er undersøkelsen av BrM-tykkelse, RPE-apikale mikrovilli og andre RPE-ultrastrukturelle komponenter. Disse komponentene inkluderer mitokondrier, pigmentgranulater og andre organeller som fagosomer. Forskere kan bestemme størrelsen og antallet av disse komponentene i elektronmikrografene oppnådd med denne protokollen ved hjelp av Fiji ImageJ-programmet. Spesielt kan status for mitokondrier være et viktig fenotypisk utfall å vurdere, siden målretting av mitokondrier i RPE er en viktig terapeutisk strategi for AMD36. Et annet fenotypisk utfall er tilleggsmålinger av RPE-dysmorfi på RPE-flatfester. RPE-flatmonterte bilder oppnådd ved hjelp av protokollen kan undersøkes for RPE sekskantet form, antall nærliggende RPE-celler og andre egenskaper med REShAPE-programmet (https://github.com/nih-nei/REShAPE) 35. Et annet mulig fenotypisk utfall er om RPE-patologier forekommer i de sentrale eller perifere områdene av musehinnen. Disse ytterligere fenotypiske betraktningene vil ytterligere styrke RPE-fenotypingsprotokollen beskrevet i denne artikkelen.

Det er noen begrensninger i denne RPE-fenotypingsprotokollen. En begrensning av denne metoden er behovet for å ofre mus for å høste øynene for RPE-fenotyping. Som et alternativ tillater nye fremskritt innen spektral domene optisk koherenstomografi (SD-OCT) avbildning kvantifisering av RPE-tykkelse og patologier i levende mus37-39. Dette kan være en fordel for forskere som ønsker å utføre longitudinelle studier på sine AMD-musemodellkohorter. En annen begrensning ved denne metoden er mangelen på funksjonelle RPE-vurderinger hos mus. Hvis forskere er interessert i en funksjonell vurdering av RPE hos mus, anbefaler vi å utføre elektroretinografi og måle c-bølgekomponenten, da c-bølgen er en indikasjon på RPEs funksjonelle rolle i fototransduksjon40. En annen begrensning ved denne metoden er mangelen på biokjemiske målinger av RPE-markører hos mus. Hvis forskere ønsker å undersøke nivåene av RPE-markører, for eksempel cellulært retinaldehydbindende protein (CRABLP), retinalpigmentepitelspesifikt 65 kDa protein (RPE65), kalium innadrettende kanalunderfamilie J medlem 13 (KCNJ13) eller bestrophin 1 (BEST1), anbefaler vi å høste øyne for immunhistokjemi, kvantitativ sanntids PCR eller western blot-analyse.

Avslutningsvis kan denne RPE-fenotypingsprotokollen være en viktig ressurs for forskere som bruker musemodeller som rekapitulerer patologiske aspekter ved AMD. Denne protokollen tjener også til å standardisere hvordan RPE evalueres i AMD-musemodeller, som ikke tidligere er beskrevet i litteraturen. Standardisering av RPE-fenotyping vil være avgjørende for å oversette funnene fra mus til andre modeller av AMD, inkludert RPE-cellekulturmodeller4 og høyere organismemodeller, inkludert ikke-menneskelige primater. Det vil også hjelpe oss med å forstå de patobiologiske mekanismene som ligger til grunn for AMD-utvikling og potensielt utvikle nye terapier for denne blindende sykdommen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne av denne protokollen har ingen avsløringer og interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne anerkjenne Satoshi Kinoshita og University of Wisconsin (UW) Translational Research Initiatives in Pathology laboratory (TRIP) for å forberede vevene våre for lysmikroskopi. Denne kjernen støttes av UW Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin Carbone Cancer Center (P30 CA014520), og Office of The Director-NIH (S10OD023526). Konfokalmikroskopi ble utført ved UW Biochemistry Optical Core, som ble etablert med støtte fra UW Department of Biochemistry Endowment. Dette arbeidet ble også støttet av tilskudd fra National Eye Institute (R01EY022086 til A. Ikeda; R01EY031748 til C. Bowes Rickman; P30EY016665 til Institutt for oftalmologi og visuelle ved UW; P30EY005722 til Duke Eye Center; NIH T32EY027721 til M. Landowski; F32EY032766 til M. Landowski), Timothy William Trout formannskap (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); og et ubegrenset tilskudd fra Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 193
En protokoll for å evaluere og kvantifisere retinale pigmenterte epitelpatologier i musemodeller av aldersrelatert makuladegenerasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., … More

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter