Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Протокол оценки и количественной оценки патологий пигментного эпителия сетчатки на мышиных моделях возрастной макулярной дегенерации

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

Мышиные модели могут быть полезными инструментами для исследования биологии пигментного эпителия сетчатки (RPE). Установлено, что у мышей может развиться целый ряд патологий РПЭ. Здесь мы описываем протокол фенотипирования для выяснения и количественной оценки патологий RPE у мышей с использованием световой, просвечивающей электронной и конфокальной микроскопии.

Abstract

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является изнурительным заболеванием сетчатки у стареющего населения. Широко распространено мнение, что дисфункция пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) является ключевым патобиологическим событием при ВМД. Чтобы понять механизмы, которые приводят к дисфункции RPE, исследователи могут использовать модели мышей. Предыдущими исследованиями было установлено, что у мышей могут развиваться патологии РПЭ, некоторые из которых наблюдаются в глазах людей с диагнозом ВМД. Здесь мы описываем протокол фенотипирования для оценки патологий RPE у мышей. Этот протокол включает в себя подготовку и оценку поперечных срезов сетчатки с использованием световой микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии, а также плоских креплений RPE с помощью конфокальной микроскопии. Мы подробно описываем распространенные типы патологий RPE у мышей, наблюдаемые с помощью этих методов, и способы их количественной оценки с помощью объективных методов статистического тестирования. В качестве доказательства концепции мы используем этот протокол фенотипирования RPE для количественной оценки патологий RPE, наблюдаемых у мышей с сверхэкспрессией трансмембранного белка 135 (Tmem135) и старых мышей C57BL / 6J дикого типа. Основная цель этого протокола — представить стандартные методы фенотипирования RPE с объективными количественными оценками для ученых, использующих мышиные модели ВМД.

Introduction

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является распространенным заболеванием, приводящим к слепоте, которое поражает население старше 55 лет1. Многие исследователи считают, что дисфункция пигментного эпителия сетчатки (RPE) является ранним и важным патобиологическим событием при ВМД2. RPE представляет собой монослой поляризованных клеток, которым поручено поддерживать гомеостаз соседних фоторецепторов и хориоидальных кровеносных сосудов3. Существует множество моделей для исследования связанных с заболеванием механизмов в RPE, включая моделиклеточных культур 4,5 и мышей 6,7,8. В недавнем отчете были описаны стандартизированные протоколы и критерии контроля качества для моделей клеточных культур RPE4, но ни в одном отчете не было предпринято попыток стандартизировать фенотипирование RPE на моделях мышей. На самом деле, во многих публикациях, посвященных мышиным моделям ВМД, отсутствует полное описание РПЭ или количественная оценка патологий РПЭ в них. Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы представить стандартные методы фенотипирования RPE с непредвзятыми количественными оценками для ученых, использующих модели мышей AMD.

В предыдущих публикациях отмечалось наличие нескольких патологий RPE у мышей с помощью трех методов визуализации. Например, световая микроскопия позволяет исследователям просматривать общую морфологию сетчатки мышей (рис. 1A) и выявлять патологии RPE, такие как истончение RPE, вакуолизация и миграция. Истончение RPE в модели мыши AMD иллюстрируется отклонением высоты RPE от соответствующих элементов управления (рис. 1B). Вакуолизацию РПЭ можно разделить на две отдельные категории: микровакуолизация (рис. 1C) и макровакуолизация (рис. 1D). Микровакуолизация РПЭ суммируется наличием вакуолей в РПЭ, которые не влияют на его общую высоту, тогда как макровакуолизация обозначается наличием вакуолей, выступающих во внешние сегменты фоторецепторов. Миграция РПЭ отличается фокальным агрегатом пигмента над монослоем РПЭ в поперечном сечении сетчатки (рис. 1Е). Следует отметить, что мигрирующие клетки RPE в донорских глазах ВМД проявляют иммунореактивность к маркерам иммунных клеток, таким как кластер дифференцировки 68 (CD68)9, и могут представлять собой иммунные клетки, поглощающие обломки RPE, или RPE, подвергающиеся трансдифференцировке 9. Другой метод визуализации, называемый просвечивающей электронной микроскопией, может позволить исследователям визуализировать ультраструктуру RPE и его базальной мембраны (рис. 2A). Этот метод может идентифицировать преобладающее отложение суб-RPE у мышей, известное как базальное ламинарное отложение (BLamD) (рис. 2B)10. Наконец, конфокальная микроскопия может выявить структуру клеток RPE с помощью визуализации плоских креплений RPE (рис. 3A). Этот метод позволяет выявить дисморфию СИЗД, отклонение РПЭ от его классической сотовой формы (рис. 3Б). Он также может обнаруживать многоядерность RPE, наличие трех или более ядер в ячейке RPE (рис. 3C). Для краткого изложения типов патологий RPE, присутствующих в современных моделях мышей AMD, мы отсылаем исследователей к этим обзорам из литературы 6,7.

Исследователи, изучающие ВМД, должны знать о преимуществах и недостатках использования мышей для исследования патологий РПЭ до протокола фенотипирования. Мыши выгодны из-за их относительно короткой продолжительности жизни и экономической эффективности, а также их генетической и фармакологической манипулятивности. У мышей также наблюдаются дегенеративные изменения RPE, включая миграцию RPE, дисморфию и многоядерность, которые наблюдаются в донорских глазахAMD 11,12,13,14,15,16,17; это говорит о том, что подобные механизмы могут лежать в основе развития этих патологий RPE у мышей и людей. Тем не менее, есть ключевые различия, которые ограничивают переводимость исследований на мышах на ВМД человека. Во-первых, у мышей нет макулы, анатомически обособленной области сетчатки человека, необходимой для остроты зрения, которая преимущественно поражается при ВМД. Во-вторых, некоторые патологии RPE у мышей, такие как истончение RPE и вакуолизация, обычно не наблюдаются в донорских глазахAMD 18. В-третьих, у мышей не развиваются друзы, что является отличительной чертой патологии ВМД19. Друзы представляют собой липид- и белковые отложения с очень небольшим количеством белков базальной мембраны, которые образуются между базальной пластинкой RPE и внутренним коллагеновым слоем мембраны Бруха (BrM)19. Друзы отличаются от BLamD, распространенного суб-РПЭ у мышей, как по составу, так и по анатомическому расположению. BLamD представляют собой зависимые от возраста и стресса аномалии, обогащенные внеклеточным матриксом, которые образуются между базальной пластинкой RPE BrM и базальными складками RPE20. Интересно, что BLamD имеют схожий белковый состав и внешний вид как у мышей, так и у людей 6,10,21. Недавняя работа предполагает, что BLamD могут влиять на патобиологию ВМД, влияя на прогрессирование ВМД до более поздних стадий18,22; таким образом, эти отложения могут представлять собой пораженный RPE в сетчатке мыши. Знание этих преимуществ и ограничений имеет решающее значение для исследователей, заинтересованных в переводе результатов исследований на мышах в AMD.

В этом протоколе мы обсуждаем методы подготовки глаз к световой, просвечивающей электронной и конфокальной микроскопии для визуализации патологий RPE. Мы также описываем, как непредвзято количественно оценивать патологии RPE для статистического тестирования. В качестве доказательства концепции мы используем протокол фенотипирования RPE для исследования структурных патологий RPE, наблюдаемых у мышей с избыточной экспрессией трансмембранного белка 135- (Tmem135) и старых мышей дикого типа (WT) C57BL / 6J. Таким образом, мы стремимся описать методологию фенотипирования, чтобы охарактеризовать RPE в моделях мышей AMD, поскольку в настоящее время нет доступных стандартных протоколов. Исследователи, заинтересованные в изучении и количественной оценке патологий фоторецепторов или сосудистой оболочки, которые также поражаются на моделях мышей с ВМД, могут не счесть этот протокол полезным для своих исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Висконсин-Мэдисон и соответствуют Заявлению Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения.

1. Оценка СИЗОД мыши с помощью световой микроскопии

  1. Сделайте фиксирующий буфер с конечной концентрацией 2% параформальдегида и 2% глутарового альдегида при комнатной температуре (RT) в стеклянной бутылке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола требуется не более 14 мл фиксирующего буфера на мышь.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид и глутаровый альдегид являются опасными веществами. Пожалуйста, следуйте стандартным рабочим процедурам при работе с этими веществами.
  2. Подготовьте гравитационную перфузионную систему на абсорбирующей подкладке для сердечной перфузии в вытяжном шкафу (дополнительный рисунок 1A).
    1. Поместите 40 мл фиксирующего буфера в цилиндр шприца перфузионной системы (дополнительный рисунок 1B).
    2. Поверните клапан до тех пор, пока он не станет параллелен трубопроводной линии, чтобы буфер мог течь через трубопроводную линию (дополнительный рисунок 1C). Промывайте леску буфером до тех пор, пока все пузырьки воздуха не будут удалены из линии.
    3. Поверните клапан до тех пор, пока он не станет перпендикулярным трубопроводной линии, чтобы предотвратить попадание буфера в трубопровод (дополнительный рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионная система теперь готова к использованию.
  3. Усыпьте мышь, поместив ее в камеру углекислого газа (CO 2), и позвольте CO2 поступать в камеру со скоростью потока 30% от объема камеры в минуту. Как только мышь перестанет дышать, дайте CO2 течь в камеру в течение не менее 1 минуты. Убедитесь, что мышь мертва, прежде чем переходить к следующему шагу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия путем инъекции фармакологических агентов может быть использована в этом протоколе в качестве альтернативы ингаляции CO2 .
  4. Проведите сердечную перфузию на усыпленной мыши.
    1. Переместите мышь в неглубокий лоток рядом с перфузионной системой брюшком вверх. Сбрызните живот 70% этанолом (EtOH).
    2. Сделайте четыре разреза, чтобы обнажить брюшную полость (дополнительный рисунок 2А).
      1. Создайте нижний разрез на 5 см с помощью изогнутых ножниц и щипцов через кожу и брюшную стенку на самой дальней левой стороне мыши, которая находится непосредственно под грудной клеткой.
      2. Приступайте к 3-сантиметровому медиальному разрезу кожи и брюшной стенки мыши, который начинается в верхней части нижнего разреза.
      3. Сделайте еще один нижний разрез на 5 см в конце медиального разреза через кожу и брюшную стенку на самой дальней правой стороне мыши непосредственно под грудной клеткой.
      4. Сделайте еще 3 см медиальный разрез, чтобы удалить кожный лоскут живота изогнутыми щипцами.
    3. Разрежьте диафрагму и грудину, чтобы обнажить сердце (дополнительный рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить сердце, артерии и вены. Их зазубрины приведут к неэффективной сердечной перфузии.
    4. Введите манометрическую иглу в левый желудочек сердца. Поверните клапан до тех пор, пока он не станет параллелен трубопроводной линии. Разрежьте правое предсердие изогнутыми ножницами, чтобы кровь и фиксатор выходили из сердца (дополнительный рисунок 2C).
    5. Дайте 10 мл фиксирующего буфера проникнуть в мышь в течение как минимум 1-2 минут или до тех пор, пока печень не станет бледной и кровь не вытечет из правого предсердия. После завершения перфузии поверните клапан до тех пор, пока он не станет перпендикулярным трубопроводной линии, чтобы остановить поток буфера.
  5. Энуклеировать глаза у мыши после сердечной перфузии.
    1. Извлеките мышь из неглубокого лотка и поместите мышь на впитывающую подкладку в вытяжном шкафу. Сориентируйте голову мыши так, чтобы левый глаз был обращен к экспериментатору, а правый глаз был вне поля зрения. Аннотируйте верхнюю сторону глаза тканевым маркировочным красителем.
    2. Осторожно надавите большим и указательным пальцами на глазницу, чтобы вызвать выпячивание глаза из глазницы (дополнительный рисунок 3A).
    3. Возьмите изогнутые ножницы и держите их лезвием под углом 30° от глазницы. Продолжайте резать вокруг глаза изогнутыми ножницами под углом 30 ° (дополнительный рисунок 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно срезать лишнюю ткань из глазницы, чтобы сохранить целостность глазного яблока.
    4. Извлеките глазное яблоко из головы изогнутыми щипцами и поместите его на впитывающую подкладку. Прорежьте роговицу лезвием скальпеля No 11 и поместите глаз изогнутыми щипцами в микротрубку объемом 2 мл с 2 мл фиксирующего буфера. Пометьте микротрубку объемом 2 мл с идентификацией мыши и «слева», чтобы указать на левый глаз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зазубрины в роговице позволяют фиксатору легко проникать в глаз, чтобы лучше сохранить его.
    5. Повторите шаги 1.5.1-1.5.4 для правого глаза.
  6. Дайте глазам инкубироваться в фиксирующем буфере в течение ночи на шейкере в комнате с температурой 4 ° C со скоростью 75 оборотов в минуту (об/мин).
  7. Замените фиксирующий буфер 2 мл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS). Инкубируйте глаза в 1x PBS в течение 10 минут на шейкере при RT и 75 об/мин. Повторите этот шаг дважды.
  8. Очистите и рассеките глаза, чтобы сформировать задние сегменты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Задний сегмент - это глазное яблоко мыши с нервной сетчаткой, RPE, сосудистой оболочкой и склерой без роговицы, радужной оболочки и хрусталика.
    1. Поместите глаз в чашку Петри, наполненную 1x PBS, под препарирующим микроскопом (дополнительный рисунок 4A).
    2. Аккуратно отодвиньте жир и мышцы от глазного яблока щипцами с тонкими наконечниками. Аккуратно обрежьте жир и мышцы микрорассекающими ножницами параллельно глазному яблоку до тех пор, пока глазное яблоко не приобретет однородный голубовато-черный цвет (дополнительный рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не режьте в перпендикулярном направлении, так как это повредит глазное яблоко. Кроме того, если краситель для маркировки ткани отслоился во время обработки, немедленно повторно аннотируйте верхнюю сторону глазного яблока.
    3. Поместите щипцы с тонким наконечником в место прокола роговицы. Разрежьте по периметру роговицы, начиная с места прокола, микрорассекающими ножницами, чтобы удалить роговицу и радужную оболочку глазного яблока (дополнительный рисунок 4C).
    4. Возьмите щипцы с тонкими наконечниками и осторожно извлеките хрусталик из глазного яблока, чтобы получить задний сегмент (дополнительный рисунок 4D).
    5. Поместите задний сегмент обратно в микропробирку объемом 2 мл с 2 мл 1x PBS. Храните задний сегмент в холодильнике при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Задние сегменты могут оставаться в 1x PBS при 4 ° C в течение многих недель перед дальнейшей обработкой.
  9. Повторите шаги 1.3-1.8, чтобы подготовить глаза других мышей в исследовании.
  10. Обработайте и вставьте один из задних сегментов от каждой мыши в парафин для секции. Убедитесь, что верхняя сторона заднего сегмента находится сверху.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения этих задач авторы полагаются на лабораторию трансляционных исследований в патологии (TRIP) Университета Висконсин-Мэдисон (UW). Здесь опубликованы протоколы, использующие аналогичный метод обработки и встраивания парафинов23,24.
  11. Обрежьте и разделите каждый парафиновый блок, чтобы получить срез сетчатки толщиной 5 мкм, который включает головку зрительного нерва, а также четыре дополнительных участка сетчатки толщиной 5 мкм, которые находятся на расстоянии 250 мкм друг от друга. Пометьте слайды идентификатором мыши и серийным номером секции (например, 1, 2, 3, 4 или 5). Храните слайды в коробке для слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы полагаются на лабораторию UW TRIP за свои услуги в области парафинового сечения. Здесь опубликованы протоколы с использованием аналогичного метода парафинового сечения25,26.
  12. Окрашивайте предметные стекла, содержащие участки сетчатки, гематоксилином и эозином (H&E). Протокол окрашивания H&E можно найти на дополнительном рисунке 5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы процедуры окрашивания H&E должны быть выполнены в вытяжном шкафу.
  13. Соберите сшитые изображения срезов сетчатки, окрашенных H&E, с помощью масштабной линейки с помощью светового микроскопа с 20-кратным увеличением.
  14. Количественно определите толщину RPE на изображениях сетчатки, содержащих головку зрительного нерва, для каждого образца.
    1. Скачайте и откройте программу Fiji ImageJ. Перетащите все сшитые изображения сетчатки, содержащие головку зрительного нерва, на панель задач Fiji ImageJ. Убедитесь, что масштаб изображения откалиброван в мкм, а не в пикселях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шкала изображения расположена в верхнем левом углу окна, содержащего изображение сетчатки глаза в программе Fiji ImageJ. Если масштаб установлен в пикселях, обратитесь к руководству по эксплуатации программы Fiji ImageJ для преобразования пикселей в мкм.
    2. Отметьте интервал каждые 300 мкм на каждом изображении от края головки зрительного нерва до конца сетчатки (ora serrata). Нажмите на значок «Прямой » на панели задач Fiji ImageJ. Щелкните и перетащите линию от края головки зрительного нерва к ora serrata длиной 300 мкм. Нажмите на инструмент « Кисть » на панели задач Fiji ImageJ и щелкните конец линии 300 мкм, чтобы отметить его.
    3. Измерьте толщину СИЗОД на каждом отмеченном интервале. Нажмите на значок «Прямой » на панели задач Fiji ImageJ. Щелкните и перетащите линию сверху вниз RPE (дополнительный рисунок 6). Нажмите « Анализ > измерение » в строке меню Fiji ImageJ, чтобы получить толщину RPE.
    4. Перенесите измерения толщины RPE в электронную таблицу и пометьте столбец, содержащий измерения, с помощью идентификации мыши. Пометьте дополнительный столбец «Отмеченный интервал» и введите расстояние от значений зрительного нерва (например, 300, 600, 900 и т. Д.).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первый измеренный интервал соответствует 300 мкм от зрительного нерва, второй измеренный интервал соответствует 600 мкм и так далее.
  15. Количественно оцените показатели заболеваемости патологией RPE на основе изображений сетчатки для каждого образца.
    1. Откройте программу Fiji ImageJ.
    2. Откройте приложение Cell Counter в программе Fiji ImageJ. Нажмите « Плагины» > «Проанализировать счетчик ячеек > » в строке меню Fiji ImageJ. Перетащите изображение сетчатки глаза на панель задач Fiji ImageJ и нажмите « Инициализировать » в окне счетчика ячеек .
    3. Подсчитайте количество патологий РПЭ на срез сетчатки с помощью приложения Cell Counter . Нажмите « Тип 1 » в разделе « Счетчики», а затем нажмите на все события микровакуумизации на изображении. Нажмите « Тип 2 » в разделе «Счетчики», а затем щелкните все события макровакуолизации на изображении. Нажмите « Тип 3 » в разделе «Счетчики», а затем щелкните все отдельные события миграции на изображении.
    4. Перенесите номера патологий РПЭ в электронную таблицу. Пометьте строки микровакуолизацией, макровакуолизацией или миграцией, а столбец — идентификацией мыши.
    5. Повторите шаги 1.15.2-1.15.4 для других изображений образца. Усредните количество патологий RPE на выборку и разделите на пять, чтобы рассчитать частоту заболеваемости каждой патологией RPE для образца в электронной таблице.
  16. Проведите статистический анализ толщины РПЭ в каждом интервале и частоты заболеваемости патологией РПЭ, чтобы определить, есть ли существенные различия между группами в исследовании.

2. Оценка РПЭ мыши методом просвечивающей электронной микроскопии

  1. Разрежьте другие задние сегменты, полученные после шагов 1,5-1,9, пополам через верхнюю отметку на две части с помощью бритвенного лезвия. Повторно аннотируйте верхнюю сторону секционированных задних сегментов тканевым маркировочным красителем. Разделите срезанные задние сегменты на новые микропробирки по 2 мл, содержащие 2 мл 1x PBS и идентификацию мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Задний сегмент мыши слишком велик, чтобы его можно было обработать одним куском, и его необходимо разрезать пополам для обработки просвечивающей электронной микроскопией.
  2. Промойте ткани 2 мл 0,1 М какодилатного буфера, рН 7,2. Инкубировать в течение 10 минут при RT на столешнице. Повторите этот шаг еще два раза.
  3. Замените 0,1 М какодилатный буфер 2 мл 2% тетраоксида осмия (OsO4), разбавленного в 0,1 М какодилатном буфере. Инкубировать в течение 1,5 ч при RT в вытяжном шкафу.
    ВНИМАНИЕ: OsO4 является ядовитым веществом. Пожалуйста, следуйте стандартным рабочим процедурам при работе с OsO4.
  4. Промойте салфетки 2 мл 0,1 М какодилатного буфера в течение 10 мин при RT в вытяжном шкафу. Повторите этот шаг один раз.
  5. Обезвоживайте ткани с помощью градуированных разведений EtOH в диапазоне от 50% до 100% при RT в вытяжном шкафу. Протокол процедуры обезвоживания можно найти на дополнительном рисунке 7.
  6. Удалите 100% EtOH из тканей и добавьте 2 мл оксида пропилена в ткани. Инкубировать при РТ в вытяжном шкафу в течение 15 минут. Удалите оксид пропилена из тканей и добавьте в ткани 2 мл свежего оксида пропилена. Инкубировать при РТ в вытяжном шкафу в течение 15 минут.
    ВНИМАНИЕ: Оксид пропилена является токсичным веществом. Пожалуйста, следуйте стандартным рабочим процедурам при работе с оксидом пропилена.
  7. Удалите оксид пропилена из тканей и добавьте к тканям 2 мл смеси оксида пропилена и смолы в соотношении 1:1. Оставьте на ночь под вакуумом в вытяжном шкафу при RT.
    ВНИМАНИЕ: Смола является опасным веществом для человека. Пожалуйста, следуйте стандартным рабочим процедурам лаборатории при работе со смолой.
  8. Замените смесь пропилена и смолы из тканей в соотношении 1:1 на 2 мл чистой смолы. Оставьте на ночь под вакуумом в вытяжном шкафу при RT.
  9. Встройте салфетки в смолу. Поместите в форму этикетку с идентификацией мыши карандашом и каплю смолы. Расположите салфетку на капле смолы. Заполните форму смолой и поместите под вакуум на 1 ч при RT в вытяжной шкаф.
  10. Переместите метки и образцы щипцами с тонкими наконечниками так, чтобы задняя сторона задней части наглазника была сверху. Оставьте форму на ночь при температуре 65 °C в духовке в вытяжном шкафу.
  11. Достаньте формочки из духовки. Дайте формам остыть до RT на столешнице. Выньте блоки из формочек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь блоки готовы к обрезке.
  12. Сформируйте смоляные блоки лезвием бритвы, чтобы получилась трапеция. Обрежьте блоки смолы с помощью микротома до тех пор, пока головка зрительного нерва не станет видна. Продолжайте использовать алмазный нож для вырезания полутонких срезов из блоков смолы толщиной 0,5 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведен опубликованный протокол по секционированиюмикротомов 27. При желании полутонкие срезы смоляных блоков толщиной 0,5 мкм могут быть собраны и окрашены для оценки целостности образца.
  13. Вырежьте ультратонкий срез толщиной 70 нм из каждого обрезанного блока с помощью ультрамикротома. Соберите ультратонкий срез толщиной 70 нм на тонкой медной сетке размером 400 меш. Поместите сетку в ящик для хранения сетки и пометьте слот идентификацией мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вот опубликованный протокол по секционированиюультрамикротома 28.
  14. Окрашивайте решетки 2% уранилацетатом в течение 5 мин, а затем 3,5% раствором цитрата свинца в течение 5 мин при RT в вытяжном шкафу.
    ВНИМАНИЕ: Уранилацетат и цитрат свинца являются опасными веществами. Пожалуйста, следуйте стандартным рабочим процедурам при работе с этими веществами.
  15. Получение изображений для каждого образца с помощью просвечивающего электронного микроскопа при увеличении 15 000x, где линии сетки медной сетки пересекают RPE и BrM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На секцию должно приходиться не менее 20–35 изображений, а на образец — от 40 до 70 изображений.
  16. Количественно определите высоту BLamD на изображениях образцов в исследовании.
    1. Откройте программу Fiji ImageJ. Перетащите все изображения из раздела образца на панель задач Fiji ImageJ. Убедитесь, что изображения откалиброваны в мкм, а не в пикселях.
    2. Измерьте высоту BLamD на изображениях. Щелкните значок «Прямой » на панели задач Fiji ImageJ. Щелкните и перетащите линию от упругой пластинки BrM к вершине самого высокого месторождения на изображении (дополнительный рисунок 8). Нажмите «Анализировать» > «Измерить » в строке меню Fiji ImageJ, чтобы получить высоту BLamD на изображении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если на изображении нет BLamD, то проведите линию от эластичной пластинки BrM до базальной пластинки RPE.
    3. Перенесите высоты BLamD в электронную таблицу и метку с идентификацией мыши.
  17. Рассчитайте кумулятивные частоты высот BLamD на генотип и средние значения высот BLamD на мышь в электронной таблице. Проведите статистический анализ средних значений роста BLamD, чтобы определить, есть ли существенные различия между группами в исследовании.

3. Оценка RPE мыши с помощью конфокальной микроскопии

  1. Соберите глазки у мышей. Усыпьте мышей в соответствии с процедурой, описанной в шаге 1.3. Энуклеировать глаза, используя шаг 1.5. Поместите глаза с помощью изогнутых щипцов в микропробирку объемом 2 мл с 2 мл 1x PBS и идентификацией мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не адаптируйте мышей к темноте, так как взаимное оцифровывание фоторецепторов и апикальных отростков RPE позволяет лучше визуализировать RPE с помощью конфокальной микроскопии.
  2. Немедленно очистите и препарируйте глаза мыши, чтобы создать задние наглазники мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Задний наглазник отличается от заднего сегмента, потому что он не содержит нервную сетчатку.
    1. Перенесите глаз в чашку Петри, содержащую 1x PBS, под препарирующим микроскопом (дополнительный рисунок 9A).
    2. Удалите жир и мышцы из глазного яблока, как описано на шаге 1.8.2 (дополнительный рисунок 9B).
    3. Прорежьте роговицу глазного яблока лезвием скальпеля No 11. Удалите роговицу и радужную оболочку, как описано в шаге 1.8.3 (дополнительный рисунок 9C).
    4. Вытащите линзу щипцами с тонкими наконечниками. Возьмите два щипца с тонким наконечником и аккуратно отделите нервную сетчатку от заднего сегмента.
    5. Аккуратно разрежьте нервную сетчатку на головке зрительного нерва для удаления из заднего наглазника (дополнительный рисунок 9D).
    6. Поместите задний наглазник в новую микропробирку объемом 2 мл, содержащую 500 мкл 1x PBS с идентификацией мыши.
  3. Зафиксируйте задние наглазники метанолом (MeOH) (дополнительный рисунок 10).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 3.3 занимает около 2 часов 40 минут.
    1. Добавьте 500 мкл MeOH в ткани. Инкубировать на шейкере при 75 об/мин в течение 5 мин при RT.
    2. Удалите 500 мкл раствора из тканей и добавьте 500 мкл MeOH. Инкубировать в течение 5 мин на шейкере при 75 об/мин в течение 5 мин при RT. Повторите этот шаг еще раз.
    3. Удалите весь раствор из тканей и добавьте 500 мкл MeOH. Инкубировать на шейкере при 75 об/мин не менее 2 ч при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы шагу 3.3.3 задний наглазник можно инкубировать в течение ночи в MeOH на шейкере при 75 об/мин в помещении с температурой 4 °C.
    4. Добавьте 500 мкл 1x PBS в ткани. Инкубировать на шейкере при 75 об/мин в течение 5 мин при RT.
    5. Удалите 500 мкл раствора из тканей и добавьте 500 мкл 1x PBS. Инкубировать на шейкере при 75 об/мин в течение 5 мин при RT. Повторите этот шаг еще раз.
    6. Удалите весь раствор из тканей и замените его 500 мкл 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани полностью фиксируются MeOH и могут храниться в холодильнике при температуре 4 ° C не менее 1 месяца.
  4. Выполните иммунофлуоресцентное окрашивание задних наглазников, чтобы визуализировать плотные соединения и ядра RPE (дополнительный рисунок 11).
    1. Удалите 500 мкл 1x PBS из образцов и добавьте 100 мкл разбавленной 10% нормальной ослиной сыворотки в 1x раствор PBS. Инкубировать на шейкере при 75 об/мин в течение 30 мин при RT.
    2. Удалите из образцов разбавленный 10% раствор нормальной ослиной сыворотки и добавьте 100 мкл разведения 1:50 поликлонального антитела кролика против Zonula Occludens-1 (ZO-1) в 1x PBS. Перенесите образцы в помещение с температурой 4 °C и инкубируйте в течение ночи на шейкере при 75 об/мин.
    3. Удалите разведение антител из образцов и добавьте 2 мл 1x PBS. Инкубировать на шейкере при 75 об/мин в течение 10 мин при RT. Повторите этот шаг еще два раза.
    4. Удалите 1x PBS из образцов. Добавьте к образцам 100 мкл разведения 1:250 антитела IgG против кролика осла с 488-флуорофро-конъюгированной меткой и разведение 4',6-диамидин-2'-фенилиндол-дигидрохлорида (DAPI) в соотношении 1:250 в 1x PBS. Накройте образцы алюминиевой фольгой и выдержите на шейкере при 75 об/мин в течение 2 ч при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть полностью покрыты алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотообесцвечивание.
    5. Удалите антитела и разведения DAPI из образцов. Добавьте 2 мл 1x PBS к образцам, снова накройте алюминиевой фольгой и инкубируйте на шейкере при 75 об/мин в течение 10 мин при RT. Повторите этот шаг еще три раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотные соединения и ядра РПЭ теперь полностью промаркированы и окрашены соответственно.
  5. Установите задние наглазники на предметные стекла микроскопа.
    1. Пометьте предметное стекло микроскопа идентификацией мыши. Перенесите задний наглазник на предметное стекло микроскопа под рассекающим микроскопом хориоидальной стороной вниз. Добавьте каплю 1x PBS в задний наглазник, чтобы предотвратить его высыхание (дополнительный рисунок 12).
    2. Разрежьте задний наглазник с помощью лезвия скальпеля No 11 в четырех местах, которые дадут четыре квадранта, соответствующие сторонам света (т. е. север, восток, юг и запад). Нанесите лишний 1x PBS тканью по периметру заднего наглазника. Аккуратно разгладьте заднюю чашечку глаза с помощью верблюжьей расчески и щипцов с тонкими наконечниками (дополнительный рисунок 12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный продукт теперь известен как плоское крепление RPE.
    3. Добавьте каплю монтажного носителя к плоскому креплению СИЗОД и поместите поверх него покровное стекло. Нанесите прозрачный лак для ногтей, чтобы запечатать покровное стекло, и дайте ему высохнуть не менее 30 минут при RT в закрытом ящике. Поместите слайды в несущую коробку и храните коробку в холодильнике при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать образования пузырьков на плоском креплении СИЗОД. Плоские крепления СИЗОД могут быть изготовлены в течение 2 недель.
  6. Получите изображение каждого из четырех квадрантов, окружающих зрительный нерв плоского крепления RPE, на конфокальном микроскопе с 20-кратным увеличением для каждого образца. Пример образа плоского монтажа RPE можно найти на дополнительном рисунке 13A.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться выполнить визуализацию плоских креплений RPE с z-стеком, где делается несколько изображений и складывается друг на друга, чтобы компенсировать разницу в размерах плоского крепления RPE.
  7. Проследите плотные соединения ячеек RPE в каждом образе плоского монтирования RPE. Пример трассированного образа плоского крепления RPE можно найти на дополнительном рисунке 13B.
    1. Откройте программу Fiji ImageJ. Перетащите образ плоского монтирования RPE на панель задач Fiji ImageJ. Убедитесь, что изображение откалибровано в микрометрах, а не в пикселях.
    2. Дважды щелкните значок инструмента «Наложенная кисть » на панели задач Fiji ImageJ, чтобы установить ширину кисти равной 3, прозрачность — 0 и цвет — красный. Нажмите кнопку «Закрыть » в окне инструмента «Наложенная кисть ».
    3. Нажмите на значок инструмента «Наложенная кисть». Щелкните и перетащите курсор на плотные соединения всех ячеек RPE, которые полностью находятся в изображении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае ошибки трассировки дважды щелкните значок инструмента «Наложенная кисть» и щелкните поле «Отменить» в окне инструмента «Наложенная кисть», чтобы удалить ошибку трассировки с изображения.
    4. Щелкните значок «Прямоугольник » на панели задач Fiji ImageJ. Нажмите на изображение и перетащите по периметру изображения. Нажмите «Правка» > «Очистить » в строке меню Fiji ImageJ, чтобы сохранить прорисованные линии и удалить все синие и зеленые цвета из изображения.
    5. Сохраните изображение трассировки в соответствующем месте с идентификацией мыши, местоположением квадранта (т. е. север, юг, восток или запад) и меткой суффикса CP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не сохраняйте образ трассировки RPE до выполнения шага 3.7.4.
  8. Рассчитайте площади ячеек RPE для каждого образца.
    1. Назначьте место для сохранения файлов из анализа области RPE, создав папку на экране рабочего стола компьютера. Создайте вложенные папки для каждого образа трассировки RPE и пометьте вложенные папки идентификатором мыши, а также местоположением квадранта (т. е. север, юг, восток или запад).
    2. Установите и откройте программу Cell Profiler29. Загрузите файл проекта Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1). Откройте файл Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj, выбрав Файл > Открыть проект в строке меню программы Cell Profiler.
    3. Перетащите одно изображение трассировки RPE в поле Image > Drop Files and Folders Here в окне программы Cell Profiler.
    4. Введите расположение папки в программу Cell Profiler, соответствующее образу трассировки RPE. Нажмите кнопку « Настройки вывода » в левом нижнем углу окна программы «Профилировщик ячеек» и введите местоположение папки в текстовых полях «Папка ввода по умолчанию» и « Папка вывода по умолчанию ».
    5. Нажмите кнопку «Анализировать изображения» в левом нижнем углу окна программы Cell Profiler. После завершения анализа на экране появится окно «Анализ завершен». Нажмите кнопку «ОК» в окне «Анализ завершен».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие сгенерирует файл csv и изображение в формате jpeg. CSV-файл будет содержать области для ячеек RPE в образе трассировки. Изображение в формате jpeg будет соответствовать изображению трассировки RPE, где каждая ячейка RPE будет помечена номером (дополнительный рисунок 13C).
    6. Перенесите области RPE из CSV-файла в электронную таблицу. Пометьте электронную таблицу идентификацией мыши.
    7. Выполните обследование данных для контроля качества, убедившись, что каждая область RPE в CSV-файле связана с полностью трассированной ячейкой RPE на изображении jpeg. Удалите из электронной таблицы все значения, которые не соответствуют полностью трассированным ячейкам RPE.
    8. Вернитесь к программе Cell Profiler. Щелкните правой кнопкой мыши имя образа трассировки RPE в поле « Перетащите файлы и папки сюда» и выберите « Очистить список», чтобы удалить образ из программы «Профилировщик ячеек».
    9. Повторите шаги 3.8.3–3.8.8, чтобы вычислить размеры СИЗОД для оставшихся трех образов трассировки СИЗД образца.
  9. Количественно определите средний размер ячейки RPE для каждого образца в электронной таблице.
  10. Количественно определите плотность ячеек RPE для каждого образца в электронной таблице. Чтобы рассчитать плотность ячеек RPE, разделите общее количество ячеек RPE на квадрант на общую площадь ячеек RPE на квадрант, обнаруженную программой Cell Profiler. Определите среднее значение плотности клеток RPE из четырех квадрантов на образец.
  11. Количественно определите количество многоядерных ячеек RPE на плоское крепление RPE для каждого образца. Используйте приложение Cell Counter в рамках программы Fiji ImageJ, как описано в шагах 1.15.1-1.15.3, чтобы подсчитать количество ячеек RPE с более чем тремя ядрами в четырех квадрантах образца.
  12. Проведите статистический анализ среднего размера и плотности клеток RPE, а также количества многоядерных клеток RPE, чтобы определить, есть ли существенные различия между группами в исследовании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Завершение протокола фенотипирования RPE, описанного в этой статье, обеспечивает количественный анализ структурных аномалий RPE, обычно наблюдаемых в мышиных моделях AMD. Чтобы подтвердить эффективность этого протокола, мы использовали его на мышах, которые, как известно, проявляют патологии RPE, включая трансгенных мышей, которые сверхэкспрессируют WT Tmem135, управляемых куриным промотором бета-актина (Tmem135 TG)30, и мышей в возрасте C57BL / 6J 31,32. Цель этих экспериментов состоит в том, чтобы показать репрезентативные результаты, которые могут быть получены с использованием методов, описанных в этом протоколе, исследователям, плохо знакомым с мышиными моделями.

Мы придерживались методов, описанных в Шаге 1 протокола, для обработки и оценки глаз мышей WT и Tmem135 TG для оценки патологий РПЭ с помощью световой микроскопии. Мы обнаружили, что у 4-месячных мышей Tmem135 TG наблюдается значительное уменьшение толщины RPE через два измеренных интервала по сравнению с WT того же возраста с помощью ANOVA с пост-хок тестом Тьюки (рис. 4). Эти результаты показывают, что RPE тоньше у 4-месячных мышей Tmem135 TG, чем у мышей WT того же возраста на расстоянии 600 и 900 мкм от зрительного нерва.

Кроме того, используя методы шага 1 протокола, мы рассчитали частоту патологий RPE, включая микровакуолизацию, макровакуолизацию и миграцию трех 25-дневных мышей WT и Tmem135 TG (рис. 5A). Средняя частота патологий микровакуолизации РПЭ на предметное стекло у мышей WT составила 0,67 ± 0,31, а у мышей Tmem135 TG составила 7,07 ± 0,61 (рис. 5B). Макровакуолизация RPE у мышей WT отсутствовала, но в среднем у мышей Tmem135 TG было 5,33 ± 2,02 события макровакуолизации (рис. 5C). Наконец, частота мигрирующих клеток RPE на слайде была равна нулю у мышей WT и 0,4 ± 0,35 у мышей Tmem135 TG (рис. 5D). После выполнения t-критерия студента частота микровакуолизации и микровакуолизации RPE значительно различалась между мышами WT и Tmem135 TG. Однако более высокая частота мигрирующих клеток RPE у мышей Tmem135 TG существенно не отличалась от WT (p = 0,1161). Эти данные показывают, что микровакуолизация и макровакуолизация RPE, но не миграция, значительно выше у 25-дневных мышей Tmem135 TG, чем у мышей WT.

Следуя методам протокола, включенным в Шаг 2, мы подготовили срезы сетчатки 2-месячных и 24-месячных мышей WT C57BL/6J для просвечивающей электронной микроскопии для анализа наличия и высоты BLamD. Мы обнаружили, что BLamD присутствуют в сетчатке WT 24-месячного возраста, которые заметно отсутствовали в сетчатке WT 2-месячного возраста (рис. 6A). Мы представили высоты BLamD в сетчатке WT возрастом 24 месяца, вычислив и построив график кумулятивные частоты их возникновения. Кумулятивные частоты высот BLamD были построены на графике по отношению к высоте залежей, чтобы проиллюстрировать распределение высот залежей. Наблюдается сдвиг вправо от линии для 24-месячных высот WT BLamD по сравнению с 2-месячными высотами WT BLamD, что свидетельствует об увеличении отложений у 24-месячных мышей WT (рис. 6B). Этот график подтверждается более высокими средними высотами BLamD в сетчатке WT 24-месячного возраста (1,01 мкм ± 0,43 мкм), чем сетчатки WT 2-месячного возраста (0,23 мкм ± 0,017 мкм), которые значительно отличались по t-критерию студента (рис. 6C). Таким образом, мы пришли к выводу, что 24-месячные мыши WT имеют большие BLamD в суб-RPE пространстве сетчатки по сравнению с 2-месячными мышами WT.

На шаге 3 мы применили методы подготовки глаз 4-месячных мышей WT и Tmem135 TG для создания плоских креплений RPE для обнаружения и анализа дисморфии и многоядерности RPE. В этом протоколе мы определили дисморфию RPE по изменениям размера и плотности клеток RPE в модели мыши AMD по сравнению с их контролем. Мы обнаружили, что RPE у 4-месячных мышей Tmem135 TG являются дисморфическими (рис. 7A). RPE в сетчатке Tmem135 TG больше (806,89 мкм 2 ± 252,67 против 291,69 мкм 2 ± 26,31) и менее плотный (0,0014 клеток / мкм 2 ± 0,00039 против 0,0033 клеток / мкм 2 ± 0,00024), чем сетчатки WT того же возраста (рис. 7B, C). Кроме того, в сетчатке Tmem135 TG было больше многоядерных клеток RPE по сравнению с контрольной группой WT (8,04 клеток ± 5,54 против 0,33 клеток ± 0,29) (рис. 7D). Все эти параметры достигли статистической значимости с помощью t-критерия Стьюдента. Вместе 4-месячные мыши Tmem135 TG имеют больше дисморфических и многоядерных клеток RPE, чем 4-месячные мыши WT.

Figure 1
Рисунок 1: Патологии РПЭ, выявленные с помощью световой микроскопии. Репрезентативные изображения нормального RPE у WT (A) и аномального RPE у мышей Tmem135 TG (B-E). Патологии RPE, наблюдаемые у мышей Tmem135 TG, включают истончение RPE (B), макровакуолизацию (C), микровакуолизацию (D) и миграцию (E). Каждая патология проиллюстрирована черной стрелкой. Масштабная линейка = 100 мкм. Увеличение = 20x. Сокращения: RGC = слой ганглиозных клеток сетчатки, IPL = внутренний плексиформный слой, INL = внутренний ядерный слой, OPL = внешний плексиформный слой, ONL = внешний ядерный слой, IS = внутренние сегменты фоторецепторов, OS = внешние сегменты фоторецепторов, RPE = пигментный эпителий сетчатки, Cho = сосудистая оболочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Патологии RPE, обнаруженные с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Репрезентативные изображения (A) RPE у молодых мышей CFH-H/H и (B) 2-летних мышей CFH-H/H с обильными базальными ламинарными отложениями (BLamD). BLamD на изображении обозначены желтыми точками. Масштабная линейка = 800 нм. Увеличение = 15 000x. Сокращения: N = ядро, M = митохондрия, P = пигментная гранула, BI = базальные складки, EL = эластичная пластинка, RPE = пигментный эпителий сетчатки, BrM = мембрана Бруха, Cho = сосудистая оболочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Патологии РПЭ, выявленные с помощью конфокальной микроскопии. Репрезентативные изображения (A) нормального RPE 8-месячного WT и (B) аномального RPE 8-месячных мышей Tmem135 TG, которые проявляют дисморфию RPE. Белый квадрат увеличен (C), чтобы изобразить многоядерную ячейку RPE с тремя ядрами. Зеленый цвет - это плотные соединения RPE, связанные с анти-ZO1, а синий цвет - окрашивание ядер RPE DAPI. Масштабная линейка = 50 мкм. Увеличение = 20x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Толщина RPE у 4-месячных мышей дикого типа (WT) и Tmem135 TG. (A) Репрезентативные изображения сетчатки 4-месячных мышей WT и Tmem135 TG (TG). Увеличение = 20х. Масштабная линейка = 100 мкм. (B) Линейные графики измерений толщины RPE у 4-месячных мышей WT (черный) и Tmem135 TG (зеленый) на расстоянии до 3,000 мкм от зрительного нерва. Цифры после генотипа обозначают количество мышей, использованных в этом исследовании. *p < 0,05, ANOVA с пост-хок тестом Тьюки. Все данные являются средними ± sd. Аббревиатуры слоев сетчатки см. в легенде на рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Патологии RPE у 25-дневных мышей Tmem135 TG. (A) Репрезентативные изображения микровакуолизации, макровакуолизации и миграции RPE у трех 25-дневных мышей Tmem135 TG (TG). Патологии СИЗО выделены черными стрелками на каждом изображении. Увеличение = 40x. Масштабная линейка = 20 мкм. (B-D) Количественная оценка микро- и макровакуолизации RPE, а также мигрирующих клеток RPE у 25-дневных мышей WT и Tmem135 TG. Цифры в скобках обозначают количество мышей, использованных в этом исследовании. *p < 0,05 и ****p < 0,0001, t-критерий Стьюдента. Все данные являются средними ± sd. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Ультраструктурный анализ BLamD в сетчатке WT в молодом и возрасте . (A) Репрезентативные электронные микрофотографии 2-месячного и 24-месячного WT RPE. Увеличение = 15 000x. Масштабная линейка = 800 нм. Пример базального ламинарного отложения (BLamD) представлен на диаграмме с помощью скобки. (B) Кумулятивные частоты высот BLamD. (C) Средние значения высоты BLamD. Цифры в скобках обозначают общее количество мышей на генотип, использованный в этом исследовании. **p < 0,01, t-критерий Стьюдента. Все данные являются средними ± sd. На рисунке 2 приведены обозначения аббревиатур слоев сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Плоские крепления РПЭ выявляют патологии СИЗОЭ у мышей Tmem135 TTG. (A) Репрезентативные изображения плоских креплений WT и Tmem135 TG (TG) RPE 4-месячного возраста с защитой от ZO-1 зеленого цвета и DAPI синего цвета. Увеличение = 20х. Масштабная линейка = 100 мкм. (B) размер клеток RPE, (C) плотность клеток RPE и (D) многоядерность RPE у 4-месячных мышей WT и Tmem135 TG. Число в скобках обозначает количество мышей, использованных в исследовании. *p < 0,05, **p < 0,01 и ****p < 0,0001, t-критерий Стьюдента. Все данные являются средними ± sd. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Схема настройки и использования сердечной перфузии. (А) Гравитационная система перфузии. (B) Цилиндр шприца перфузионной системы для фиксации буфера. (C) Клапан поворачивается до тех пор, пока он не станет параллелен трубопроводной линии, чтобы буфер мог течь через трубопроводную трубку. (D) Клапан должен поворачиваться до тех пор, пока он не станет перпендикулярным трубопроводной линии, чтобы остановить поток буфера в трубопроводную линию. Изображение создано в Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Схема процедуры перфузии сердца у мышей. (А) Четыре разреза, сделанные для обнажения брюшной полости. (B) Разрез, сделанный через диафрагму и грудину, чтобы обнажить сердце. (C) Калибровочная игла, вводимая в левый желудочек сердца. Клапан поворачивается до тех пор, пока он не станет параллелен трубопроводной линии. Правое предсердие разрезается изогнутыми ножницами, чтобы кровь и фиксатор выходили. Изображение создано в Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Схема процедуры энуклеации глаз у мыши. (A) Осторожно надавите большим и указательным пальцами на глазницу, чтобы вызвать выпячивание глаза из глазницы. (B) Возьмите изогнутые ножницы и держите их лезвием под углом 30° от глазницы. Продолжайте резать вокруг глаза изогнутыми ножницами под углом 30 °. Цветные точки обозначают расположение пальцев на мыши или изогнутые ножницы. Изображение создано в Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Изображения вскрытия глаза мыши с получением заднего сегмента мыши. (А) Глаз переносится на препарирующий микроскоп. (B) Жир и мышцы, удаленные из глазного яблока. (C) Роговица и радужная оболочка удаляются из глазного яблока. (D) Хрусталик удален из глазного яблока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Процедура окрашивания гематоксилин-эозином (H&E). Схема, изображающая процедуру H&E для окрашивания участков сетчатки, встроенных в парафин. Стрелки указывают на переход между шагами. Время каждого шага указано красным шрифтом. Реагенты для окрашивания предоставляются черным шрифтом в стеклянных окрашивающих емкостях. Для каждого реагента, включенного в приведенную выше схему, должна быть подготовлена емкость для окрашивания стекла. Все этапы должны быть выполнены в вытяжном шкафу. При добавлении покровного стекла на предметное стекло будьте осторожны, чтобы не допустить появления пузырьков на предметном стекле. После завершения процедуры слайды можно хранить в слайд-боксе. Изображение создано в Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 6: Пример измерения толщины СИЗОД. Черной стрелкой изображена красная линия сверху вниз СИЗО. Эта линия может быть измерена для определения толщины СИЗОД. Масштабная линейка = 100 мкм. Увеличение = 20x. Область в штучной упаковке уменьшена для более удобного просмотра СИЗО. Аббревиатуры слоев сетчатки см. в легенде на рисунке 1 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 7: Процедура обезвоживания задних сегментов мыши EtOH для обработки ПЭМ. Изображение создано в Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 8: Пример измерения высоты BLamD. Красной линией изображен самый большой BLamD на этом изображении. Желтые точки очерчивают BLamD на изображении. Эта красная линия может быть измерена, чтобы определить высоту этого BLamD на этом изображении. Масштабная линейка = 800 нм. Увеличение = 15 000x. На рисунке 2 приведены обозначения аббревиатур слоев сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 9: Вскрытие глаза мыши для плоского крепления СИЗОД. (A) Глаз переносят в чашку Петри, содержащую 1x PBS, под препарирующим микроскопом. (B) Жир и мышцы, удаленные из глазного яблока. (C) Роговица и радужная оболочка удаляются из глазного яблока. (D) Хрусталик и сетчатка удалены из глазного яблока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 10: Процедура фиксации метанолом (MeOH) задних наглазников мыши. Изображение создано в Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 11: Процедура иммунофлуоресценции для маркировки плотных соединений и ядер клеток RPE. Схема, изображающая этапы иммунофлюоресцентного метода из этого протокола. Обратите внимание, что этот метод занимает 2 дня. Все шаги происходят при RT и на шейкере со скоростью вращения 75 об/мин, если специально не указано на схеме. Первичное (1°) антитело, используемое в этом исследовании, представляло собой поликлональный анти-ZO1 кролика, а вторичное (2º) антитело, используемое в этом исследовании, представляло собой 488 флуорофор-конъюгированных ослиных антикроличьих IgG. После того, как вторичное антитело и DAPI добавлены к образцам, образцы должны быть завернуты в алюминиевую фольгу для защиты от фотообесцвечивания образца. Изображение создано в Biorender. Сокращения: NDS = нормальная ослиная сыворотка, Ab = антитело. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 12: Изображение разрезов для получения четырех квадрантов плоского крепления СИЗОД мыши. N = север, E = восток, S = юг, W = запад. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 13: Примеры конечных точек анализа с плоским креплением RPE. (A) Образ плоского крепления RPE. (B) Изображение трассировки границ RPE. (C) RPE Cell Profiler проанализировал изображение. Увеличение = 20x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 1: Ikeda RPE Area Calculator.cpproj Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы представили протокол фенотипирования для оценки структурных патологий RPE мышиных моделей. Мы описали этапы, необходимые для обработки глаз для различных методов визуализации, включая световую, просвечивающую электронную и конфокальную микроскопию, а также количественную оценку типичных патологий, наблюдаемых с помощью этих методов визуализации. Мы доказали эффективность нашего протокола фенотипирования РПЭ, исследуя Tmem135 TG и 24-месячных мышей WT, так как у этих мышей наблюдаются патологии РПЭ30,31,32. Этот протокол может быть применен к любой генетически модифицированной или фармакологически обработанной мыши, у которой могут быть такие патологии RPE, как истончение RPE, вакуолизация, миграция и дисморфия, а также BLamDs 6,7. Хотя патологии RPE, наблюдаемые у Tmem135 TG и 24-месячных мышей WT, присутствуют и у других моделей мышей AMD 7,30, для исследователя важно ознакомиться с моделью мыши AMD, выбранной для его исследований, поскольку возраст начала и тяжесть патологий RPE их модели мыши AMD могут отличаться от Tmem135 ТГ и 24-месячные мыши WT. Исследователям, возможно, придется использовать больше мышей для своих исследований, чем количество мышей, использованных для получения репрезентативных результатов, показанных в этой статье, если представление патологий RPE является переменным в их соответствующей модели мышей AMD. Кроме того, многие модели мышей AMD в настоящее время доступны исследователям AMD, но не имеют полных описаний их патологий RPE, что может потребовать от исследователей проведения предварительных исследований для получения этой информации.

Несмотря на то, что могут быть внесены изменения в то, как глаза мыши обрабатываются для различных методов визуализации, крайне важно поддерживать количественную оценку структурных аномалий RPE, как описано в протоколе. Например, пять окрашенных H&E срезов сетчатки были подготовлены для подсчета количества случаев микровакуолизации, макровакуолизации и миграции RPE, что позволило исследователям оценить патологии RPE в нескольких местах сетчатки мыши. Другим примером является использование сетки электронной микроскопии меди с тонкими стержнями размером 400 меш для оценки ультраструктурных аномалий RPE. Сетка электронной микроскопии обеспечивает основу для систематической и объективной оценки образца сетчатки с помощью просвечивающей электронной микрографии, а также для получения от 40 до 70 изображений на срез сетчатки для изучения присутствия BLamD. Это не может быть достигнуто с помощью сетки с электронными микроскопиями, и мы рекомендуем не использовать их с этим протоколом. Наконец, получение изображений с 20-кратным увеличением из четырех квадрантов плоского крепления RPE позволяет исследователям исследовать большие области мышиного RPE на предмет дисморфии и многоядерности. Исследователи могут свободно расширять этот протокол и изучать дополнительные срезы сетчатки на наличие патологий RPE в своих исследованиях. Вместе эти методы позволяют исследователям собрать достаточно данных, чтобы сделать выводы о структурных патологиях RPE, которые могут присутствовать в их моделях мышей AMD.

Еще одной ключевой особенностью этого протокола является согласованность методов фенотипирования RPE. Например, все глаза, используемые для световой и просвечивающей электронной микроскопии, были ориентированы верхней стороной сетчатки мыши для секции. Важно поддерживать ориентацию глаза мыши на протяжении всей его обработки для световой и просвечивающей электронной микроскопии, потому что глаз мыши имеет топографическое распределение клеток сетчатки33,34. Анатомическая ориентация глаза мыши не поддерживалась при подготовке плоского крепления РПЭ, так как превосходящих по сравнению с худшими топографическими изменениями клетки РПЭ мыши не наблюдалось. Фактически, RPE в сетчатке человека отображает топографические изменения, которые излучаются от головкизрительного нерва 35, предполагая, что это может иметь место для RPE мыши. Наконец, получение изображения, описанное в этом протоколе, зависит от анатомического положения зрительного нерва. Включение этих методологических аспектов поможет воспроизвести результаты патологий RPE для исследователей при работе со своими моделями мышей AMD.

Исследователи могут захотеть добавить больше аналитических функций в протокол фенотипирования RPE. Некоторые фенотипические исходы, не представленные в этом протоколе, включают исследование толщины BrM, апикальных микроворсинок RPE и других ультраструктурных компонентов RPE. Эти компоненты включают митохондрии, пигментные гранулы и другие органеллы, такие как фагосомы. Исследователи могут определить размер и количество этих компонентов на электронных микрофотографиях, полученных с помощью этого протокола, с помощью программы Fiji ImageJ. В частности, состояние митохондрий может быть важным фенотипическим исходом, который следует учитывать, поскольку нацеливание на митохондрии в RPE является важной терапевтической стратегией для ВМД36. Другим фенотипическим результатом являются дополнительные измерения дисморфии СИЗО на плоских креплениях СИЗОД. Изображения плоского монтирования РПЭ, полученные с помощью протокола, могут быть исследованы на гексагональную форму РПЭ, количество соседних ячеек РПЭ и другие свойства с помощью программы РЕШАПЭ (https://github.com/nih-nei/REShAPE)35. Другой возможный фенотипический исход заключается в том, возникают ли патологии RPE в центральных или периферических областях сетчатки мыши. Эти дополнительные фенотипические соображения еще больше укрепят протокол фенотипирования RPE, описанный в этой статье.

У этого протокола фенотипирования RPE есть несколько ограничений. Одним из ограничений этого метода является необходимость жертвовать мышами, чтобы собрать их глаза для фенотипирования RPE. В качестве альтернативы новые достижения в области оптической когерентной томографии в спектральной области (SD-OCT) позволяют количественно определять толщину RPE и патологии у живых мышей37-39. Это может быть полезно для исследователей, которые хотят провести лонгитюдные исследования своих когорт моделей мышей AMD. Еще одним ограничением этого метода является отсутствие функциональных оценок RPE у мышей. Если исследователи заинтересованы в функциональной оценке RPE у мышей, мы рекомендуем проводить электроретинографию и измерять компонент c-волны, поскольку c-волна указывает на функциональную роль RPE в фототрансдукции40. Еще одним ограничением этого метода является отсутствие биохимических измерений маркеров РПЭ у мышей. Если исследователи хотят исследовать уровни маркеров RPE, таких как клеточный белок, связывающий ретинальдегид (CRABLP), специфический для пигментного эпителия сетчатки белок 65 кДа (RPE65), член подсемейства J 13 калиевого выпрямляющего канала (KCNJ13) или бестрофин 1 (BEST1), мы рекомендуем собирать глаза для иммуногистохимии, количественной ПЦР в реальном времени или анализа вестерн-блоттинга.

В заключение, этот протокол фенотипирования RPE может быть важным ресурсом для исследователей, использующих мышиные модели, повторяющие патологические аспекты ВМД. Этот протокол также служит для стандартизации оценки RPE в моделях мышей AMD, что ранее не было описано в литературе. Стандартизация фенотипирования RPE будет иметь решающее значение для перевода результатов от мышей на другие модели AMD, включая модели клеточных культур RPE4 и модели более высоких организмов, включая приматов, не являющихся людьми. Это также поможет нам понять патобиологические механизмы, лежащие в основе развития ВМД, и потенциально разработать новые методы лечения этого слепящего заболевания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы этого протокола не имеют раскрытия информации и конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность Сатоши Киносите и Университету Висконсина (UW) за подготовку наших тканей к световой микроскопии. Это ядро поддерживается Департаментом патологии и лабораторной медицины UW, Онкологическим центром Карбоне Университета Висконсина (P30 CA014520) и Офисом директора NIH (S10OD023526). Конфокальная микроскопия проводилась в оптическом ядре биохимии UW, который был создан при поддержке Фонда биохимии Университета Вашингтона. Эта работа также была поддержана грантами Национального глазного института (R01EY022086 А. Икеда; R01EY031748 К. Боузу Рикману; P30EY016665 на кафедру офтальмологии и визуальных наук Университета Вашингтона; P30EY005722 в офтальмологический центр Дьюка; NIH T32EY027721 М. Ландовски; F32EY032766 М. Ландовски), председательство Тимоти Уильяма Траута (А. Икеда), Премия AMD Free Family FFB (К. Боуз Рикман); и неограниченный грант от Исследования по предотвращению слепоты (Глазной центр Дьюка).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 193
Протокол оценки и количественной оценки патологий пигментного эпителия сетчатки на мышиных моделях возрастной макулярной дегенерации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., … More

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter