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Genetics

Protocole d’évaluation et de quantification des pathologies de l’épithélium pigmenté rétinien dans des modèles murins de dégénérescence maculaire liée à l’âge

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

Les modèles murins peuvent être des outils utiles pour étudier la biologie de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR). Il a été établi que les souris peuvent développer un éventail de pathologies RPE. Ici, nous décrivons un protocole de phénotypage pour élucider et quantifier les pathologies RPE chez la souris en utilisant la lumière, l’électron de transmission et la microscopie confocale.

Abstract

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est un trouble rétinien débilitant chez les populations vieillissantes. Il est largement admis que le dysfonctionnement de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) est un événement pathobiologique clé dans la DMLA. Pour comprendre les mécanismes qui conduisent au dysfonctionnement de l’EPR, les chercheurs peuvent utiliser des modèles murins. Il a été établi par des études antérieures que les souris peuvent développer des pathologies RPE, dont certaines sont observées dans les yeux des personnes diagnostiquées avec la DMLA. Nous décrivons ici un protocole de phénotypage pour évaluer les pathologies de l’EPR chez la souris. Ce protocole comprend la préparation et l’évaluation de coupes transversales rétiniennes par microscopie optique et microscopie électronique à transmission, ainsi que celle de montures plates RPE par microscopie confocale. Nous détaillons les types courants de pathologies de l’EPR murin observés par ces techniques et les moyens de les quantifier grâce à des méthodes non biaisées pour les tests statistiques. Comme preuve de concept, nous utilisons ce protocole de phénotypage RPE pour quantifier les pathologies RPE observées chez les souris surexprimant la protéine transmembranaire 135 (Tmem135) et les souris âgées de type sauvage C57BL/6J. L’objectif principal de ce protocole est de présenter des méthodes de phénotypage RPE standard avec des évaluations quantitatives non biaisées pour les scientifiques utilisant des modèles murins de DMLA.

Introduction

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est une maladie cécitante courante qui touche les populations de plus de 55 ans1. De nombreux chercheurs pensent que le dysfonctionnement de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) est un événement pathobiologique précoce et crucial dans la DMLA2. L’EPR est une monocouche de cellules polarisées chargée de maintenir l’homéostasie des photorécepteurs voisins et des vaisseaux sanguins choroïdiens3. Il existe divers modèles pour étudier les mécanismes associés à la maladie au sein de l’EPR, y compris les modèles de culture cellulaire 4,5 et les souris 6,7,8. Un rapport récent a décrit des protocoles normalisés et des critères de contrôle de la qualité pour les modèles de culture cellulaire EPR4, mais aucun rapport n’a tenté de normaliser le phénotypage de l’EPR dans les modèles murins. En fait, de nombreuses publications sur des modèles murins de DMLA manquent d’une description complète de l’EPR ou d’une quantification des pathologies de l’EPR qu’ils contiennent. L’objectif global de ce protocole est de présenter des méthodes de phénotypage RPE standard avec des évaluations quantitatives non biaisées pour les scientifiques utilisant des modèles murins AMD.

Des publications antérieures ont noté la présence de plusieurs pathologies RPE chez la souris grâce à trois techniques d’imagerie. Par exemple, la microscopie optique permet aux chercheurs de visualiser la morphologie grossière de la rétine murine (Figure 1A) et de détecter des pathologies de l’EPR telles que l’amincissement de l’EPR, la vacuolisation et la migration. L’amincissement de l’EPR dans un modèle murin AMD est illustré par un écart de la hauteur de l’EPR par rapport à leurs contrôles respectifs (Figure 1B). La vacuolisation de l’EPR peut être divisée en deux catégories distinctes : la microvacuolisation (figure 1C) et la macrovacuolisation (figure 1D). La microvacuolisation de l’EPR est résumée par la présence de vacuoles dans l’EPR qui n’affectent pas sa hauteur totale, tandis que la macrovacuolisation est indiquée par la présence de vacuoles qui font saillie dans les segments externes des photorécepteurs. La migration de l’EPR se distingue par l’agrégat focal de pigment au-dessus de la monocouche de l’EPR dans une section transversale rétinienne (Figure 1E). Il convient de noter que les cellules EPR migratrices dans les yeux des donneurs de DMLA présentent une immunoréactivité aux marqueurs des cellules immunitaires, tels que le groupe de différenciation 68 (CD68)9, et pourraient représenter des cellules immunitaires engloutissant des débris d’EPR ou des EPR subissant une transdifférenciation 9. Une autre technique d’imagerie appelée microscopie électronique à transmission peut permettre aux chercheurs de visualiser l’ultrastructure de l’EPR et de sa membrane basale (Figure 2A). Cette technique permet d’identifier le dépôt sous-RPE prédominant chez la souris, connu sous le nom de dépôt laminaire basal (BLamD) (Figure 2B)10. Enfin, la microscopie confocale peut révéler la structure des cellules EPR grâce à l’imagerie des supports plats de l’EPR (Figure 3A). Cette méthode permet de découvrir la dysmorphie de l’EPR, c’est-à-dire la déviation de l’EPR par rapport à sa forme classique en nid d’abeille (Figure 3B). Il peut également détecter la multinucléation de l’EPR, la présence de trois noyaux ou plus dans une cellule EPR (Figure 3C). Pour un résumé des types de pathologies RPE présentes dans les modèles murins DMLA actuels, nous renvoyons les chercheurs à ces revues de la littérature 6,7.

Les chercheurs qui étudient la DMLA devraient être conscients des avantages et des inconvénients de l’utilisation de souris pour étudier les pathologies de l’EPR avant le protocole de phénotypage. Les souris sont avantageuses en raison de leur durée de vie relativement courte et de leur rentabilité, ainsi que de leur manipulabilité génétique et pharmacologique. Les souris présentent également des changements dégénératifs de l’EPR, y compris la migration de l’EPR, la dysmorphie et la multinucléation, qui sont observés dans les yeux des donneurs de DMLA 11,12,13,14,15,16,17; cela suggère que des mécanismes similaires peuvent sous-tendre le développement de ces pathologies RPE chez la souris et l’homme. Cependant, il existe des différences clés qui limitent la transposabilité des études sur les souris à la DMLA humaine. Premièrement, les souris n’ont pas de macula, une région anatomiquement distincte de la rétine humaine nécessaire à l’acuité visuelle qui est préférentiellement affectée dans la DMLA. Deuxièmement, certaines pathologies de l’EPR chez la souris, comme l’amincissement et la vacuolisation de l’EPR, ne sont généralement pas observées dans les yeux des donneurs de DMLA18. Troisièmement, les souris ne développent pas de drusen, une caractéristique de la pathologie DMLA19. Les Drusen sont des dépôts contenant des lipides et des protéines avec très peu de protéines de la membrane basale qui se forment entre la lame basale RPE et la couche collagène interne de la membrane de Bruch (BrM)19. Drusen diffère de BLamD, le dépôt sous-RPE commun chez la souris, à la fois dans sa composition et sa localisation anatomique. Les BLamD sont des anomalies enrichies par la matrice extracellulaire dépendantes de l’âge et du stress qui se forment entre la lame basale RPE de BrM et les repliements basaux du RPE20. Fait intéressant, les BLamD ont une composition protéique et une apparence similaires chez les souris et les humains 6,10,21. Des travaux récents suggèrent que les BLamD peuvent agir dans la pathobiologie de la DMLA en influençant la progression de la DMLA vers ses stades ultérieurs18,22 ; ainsi, ces dépôts peuvent représenter un EPR malade dans la rétine de la souris. La connaissance de ces avantages et limites est essentielle pour les chercheurs intéressés à traduire les résultats d’études sur la souris à la DMLA.

Dans ce protocole, nous discutons des méthodes de préparation des yeux à la lumière, à l’électron de transmission et à la microscopie confocale pour visualiser les pathologies de l’EPR. Nous décrivons également comment quantifier les pathologies de l’EPR de manière impartiale pour les tests statistiques. Comme preuve de concept, nous utilisons le protocole de phénotypage RPE pour étudier les pathologies structurelles de l’EPR observées chez les souris surexprimant la protéine transmembranaire 135- (Tmem135) et les souris âgées de type sauvage (WT) C57BL/6J. En résumé, nous visons à décrire la méthodologie de phénotypage pour caractériser l’EPR dans les modèles murins AMD, car il n’existe actuellement aucun protocole standard disponible. Les chercheurs intéressés par l’examen et la quantification des pathologies des photorécepteurs ou des choroïdes, qui sont également affectées dans les modèles murins DMLA, peuvent ne pas trouver ce protocole utile pour leurs études.

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Protocol

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Wisconsin-Madison et sont conformes à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

1. Évaluation de l’EPR chez la souris par microscopie optique

  1. Fabriquez un tampon fixateur qui a une concentration finale de 2% de paraformaldéhyde et 2% de glutaraldéhyde à température ambiante (RT) dans une bouteille en verre.
    REMARQUE: Ce protocole nécessite, au maximum, 14 mL de tampon fixateur par souris.
    ATTENTION : Le paraformaldéhyde et le glutaraldéhyde sont des substances dangereuses. Veuillez suivre les procédures opérationnelles normalisées lorsque vous travaillez avec ces substances.
  2. Préparer un système de perfusion par gravité sur un sous-coussin absorbant pour la perfusion cardiaque dans une hotte (figure supplémentaire 1A).
    1. Placer 40 mL du tampon fixateur dans le corps de la seringue du système de perfusion (figure supplémentaire 1B).
    2. Tournez la vanne jusqu’à ce qu’elle soit parallèle à la conduite de tuyauterie pour permettre au tampon de s’écouler dans la conduite de tuyauterie (figure supplémentaire 1C). Rincez la ligne avec un tampon jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient retirées de la ligne.
    3. Tourner la vanne jusqu’à ce qu’elle soit perpendiculaire à la conduite de tuyauterie pour empêcher le tampon de s’écouler dans la conduite de tuyauterie (figure supplémentaire 1D).
      REMARQUE: Le système de perfusion est maintenant prêt à l’emploi.
  3. Euthanasier la souris en la plaçant dans une chambre de dioxyde de carbone (CO 2) et laisser le CO2 s’écouler dans la chambre à un débit de 30% du volume de la chambre par minute. Une fois que la souris cesse de respirer, laissez le CO2 s’écouler dans la chambre pendant au moins 1 min. Vérifiez que la souris est morte avant de passer à l’étape suivante.
    NOTE: L’euthanasie par injection d’agents pharmacologiques peut être utilisée dans ce protocole comme alternative à l’inhalation de CO2 .
  4. Effectuer une perfusion cardiaque sur la souris euthanasiée.
    1. Transférez la souris dans un plateau peu profond près du système de perfusion avec son abdomen tourné vers le haut. Vaporiser l’abdomen avec de l’éthanol à 70% (EtOH).
    2. Faites quatre incisions pour exposer la cavité abdominale (figure supplémentaire 2A).
      1. Créez une coupe inférieure de 5 cm à l’aide de ciseaux incurvés et de pinces à travers la peau et la paroi abdominale sur le côté gauche le plus éloigné de la souris qui se trouve directement sous la cage thoracique.
      2. Procédez à une coupe médiale de 3 cm à travers la peau et la paroi abdominale de la souris qui commence au sommet de la coupe inférieure.
      3. Faites une autre coupe inférieure de 5 cm à l’extrémité de la coupe médiale à travers la peau et la paroi abdominale sur le côté droit le plus éloigné de la souris directement sous la cage thoracique.
      4. Faites une autre incision médiale de 3 cm pour enlever le lambeau de peau abdominale avec une pince incurvée.
    3. Coupez le diaphragme et le sternum pour exposer le cœur (figure supplémentaire 2B).
      REMARQUE: Veillez à éviter de entailler le cœur, les artères et les veines. Entailler ceux-ci conduira à une perfusion cardiaque inefficace.
    4. Insérez l’aiguille de jauge dans le ventricule gauche du cœur. Tournez la vanne jusqu’à ce qu’elle soit parallèle à la conduite de tuyauterie. Coupez l’oreillette droite avec des ciseaux incurvés pour permettre au sang et au fixateur de sortir du cœur (figure supplémentaire 2C).
    5. Laisser 10 mL de tampon fixateur pénétrer dans la souris pendant au moins 1 à 2 minutes, ou jusqu’à ce que le foie devienne de couleur pâle et qu’aucun sang ne s’écoule de l’oreillette droite. Une fois la perfusion terminée, tournez la vanne jusqu’à ce qu’elle soit perpendiculaire à la conduite de tuyauterie pour arrêter l’écoulement du tampon.
  5. Énucléer les yeux de la souris après perfusion cardiaque.
    1. Retirez la souris du plateau peu profond et placez-la sur le sous-tampon absorbant dans une hotte aspirante. Orientez la tête de la souris de telle sorte que l’œil gauche soit face à l’expérimentateur et que l’œil droit soit hors de vue. Annoter le côté supérieur de l’œil avec un colorant de marquage tissulaire.
    2. Appuyez doucement vers le bas avec le pouce et l’index autour de l’orbite pour provoquer une saillie de l’œil de l’orbite (figure supplémentaire 3A).
    3. Prenez des ciseaux incurvés et tenez-les avec la lame à un angle de 30 ° de l’orbite. Procéder à la coupe autour de l’œil avec les ciseaux incurvés à un angle de 30° (figure supplémentaire 3B).
      REMARQUE: Il est acceptable de couper l’excès de tissu de l’orbite pour préserver l’intégrité du globe oculaire.
    4. Retirez le globe oculaire de la tête à l’aide d’une pince incurvée et placez-le sur un coussinet absorbant. Entailler la cornée avec une lame de scalpel numéro 11 et placer l’œil avec une pince incurvée dans un microtube de 2 ml avec 2 ml de tampon fixateur. Étiqueter le microtube de 2 mL avec identification de la souris et « gauche » pour indiquer l’œil gauche.
      REMARQUE: L’entaille dans la cornée permet au fixateur de pénétrer facilement dans l’œil pour mieux le préserver.
    5. Répétez les étapes 1.5.1-1.5.4 pour l’œil droit.
  6. Laisser les yeux incuber dans un tampon fixateur pendant la nuit sur un agitateur dans une pièce à 4 ° Celsius (C), à une vitesse de 75 rotations par minute (tr/min).
  7. Remplacez le tampon fixateur par 2 mL de solution saline tampon phosphate 1x (PBS). Incuber les yeux en 1x PBS pendant 10 min sur un agitateur à TA et 75 rpm. Répétez cette étape deux fois.
  8. Nettoyez et disséquez les yeux pour générer des segments postérieurs.
    REMARQUE: Le segment postérieur est le globe oculaire de la souris avec la rétine neurale, l’EPR, la choroïde et la sclérotique sans la cornée, l’iris et le cristallin.
    1. Placer l’œil dans une boîte de Petri remplie de 1x PBS sous un microscope à dissection (figure supplémentaire 4A).
    2. Soulevez doucement la graisse et les muscles loin du globe oculaire à l’aide d’une pince à pointe fine. Coupez soigneusement la graisse et le muscle avec des ciseaux microdisséquants dans une direction parallèle au globe oculaire jusqu’à ce que le globe oculaire ait une couleur bleu-noir uniforme (figure supplémentaire 4B).
      REMARQUE: Ne coupez pas dans une direction perpendiculaire, car cela endommage le globe oculaire. De plus, si le colorant de marquage tissulaire se détache pendant le traitement, réannotez immédiatement le côté supérieur du globe oculaire.
    3. Placez des pinces à pointe fine au site de ponction cornéenne. Couper autour du périmètre de la cornée, en commençant par le site de ponction, avec des ciseaux à microdissection, pour retirer la cornée et l’iris du globe oculaire (Figure supplémentaire 4C).
    4. Prenez des pinces à pointe fine et retirez doucement la lentille du globe oculaire pour obtenir le segment postérieur (Figure supplémentaire 4D).
    5. Replacez le segment postérieur dans un microtube de 2 mL contenant 2 mL de 1x PBS. Conservez le segment postérieur dans un réfrigérateur à 4 °C.
      REMARQUE: Les segments postérieurs peuvent rester dans 1x PBS à 4 ° C pendant plusieurs semaines avant un traitement ultérieur.
  9. Répétez les étapes 1.3-1.8 pour préparer les yeux des autres souris de l’étude.
  10. Traiter et intégrer l’un des segments postérieurs de chaque souris dans de la paraffine pour la section. Assurez-vous que le côté supérieur du segment postérieur est au-dessus.
    NOTE: Les auteurs s’appuient sur le laboratoire Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) de l’Université du Wisconsin-Madison (UW) pour effectuer ces tâches. Voici des protocoles publiés utilisant une méthode similaire de traitement et d’intégration de la paraffine23,24.
  11. Couper et couper chaque bloc de paraffine pour obtenir une section rétinienne de 5 μm d’épaisseur qui comprend la tête du nerf optique, ainsi que quatre sections rétiniennes supplémentaires de 5 μm d’épaisseur qui sont distantes de 250 μm les unes des autres. Étiquetez les lames avec l’identification de la souris et le numéro de section de série (c.-à-d. 1, 2, 3, 4 ou 5). Conservez les diapositives dans une boîte de diapositives.
    NOTE: Les auteurs comptent sur le laboratoire UW TRIP pour leurs services de sectionnement de paraffine. Voici des protocoles publiés utilisant une méthode de section de paraffine similaire25,26.
  12. Colorer les lames contenant des sections rétiniennes avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E). Un protocole de coloration H&E se trouve à la figure supplémentaire 5.
    REMARQUE: Toutes les étapes de la procédure de coloration H & E doivent être complétées dans une hotte.
  13. Collectez des images cousues de coupes rétiniennes colorées H & E avec une barre d’échelle à l’aide d’un microscope optique à un grossissement de 20x.
  14. Quantifier l’épaisseur de l’EPR dans les images rétiniennes contenant la tête du nerf optique pour chaque échantillon.
    1. Téléchargez et ouvrez le programme Fiji ImageJ. Faites glisser toutes les images rétiniennes cousues contenant la tête du nerf optique dans la barre des tâches Fiji ImageJ. Vérifiez que l’échelle de l’image est calibrée en μm et non en pixels.
      REMARQUE: L’échelle de l’image est située dans le coin supérieur gauche de la fenêtre contenant une image rétinienne dans le programme Fiji ImageJ. Si l’échelle est définie en pixels, veuillez vous référer au manuel d’instructions du programme Fiji ImageJ pour convertir les pixels en μm.
    2. Marquez tous les intervalles de 300 μm dans chaque image du bord de la tête du nerf optique à l’extrémité de la rétine (ora serrata). Cliquez sur l’icône Droit dans la barre des tâches Fiji ImageJ. Cliquez et faites glisser une ligne du bord de la tête du nerf optique vers l’ora serrata d’une longueur de 300 μm. Cliquez sur l’outil Pinceau dans la barre des tâches Fiji ImageJ et cliquez sur la fin de la ligne de 300 μm pour la marquer.
    3. Mesurez l’épaisseur RPE à chaque intervalle marqué. Cliquez sur l’icône Droit dans la barre des tâches Fiji ImageJ. Cliquez et faites glisser une ligne du haut vers le bas de l’EPR (Figure supplémentaire 6). Cliquez sur Analyser > mesurer dans la barre de menus Fiji ImageJ pour obtenir l’épaisseur RPE.
    4. Transférez les mesures d’épaisseur RPE dans une feuille de calcul et étiquetez la colonne contenant les mesures avec identification de la souris. Étiquetez une colonne supplémentaire avec « Intervalle marqué » et entrez la distance par rapport aux valeurs du nerf optique (c.-à-d. 300, 600, 900, etc.)
      NOTE: Le premier intervalle mesuré correspond à 300 μm du nerf optique, le deuxième intervalle mesuré correspond à 600 μm de distance, et ainsi de suite.
  15. Quantifier les taux d’incidence de la pathologie de l’EPR en fonction des images rétiniennes de chaque échantillon.
    1. Ouvrez le programme Fiji ImageJ.
    2. Ouvrez l’application Cell Counter dans le programme Fiji ImageJ. Cliquez sur Plugins > Analyze > Cell Counter dans la barre de menu Fiji ImageJ. Faites glisser une image rétinienne dans la barre des tâches Fiji ImageJ et cliquez sur Initialiser dans la fenêtre Cell Counter .
    3. Comptez le nombre de pathologies RPE par section rétinienne à l’aide de l’application Cell Counter . Cliquez sur Type 1 sous Compteurs, puis cliquez sur tous les événements de microvacuolisation dans l’image. Cliquez sur Type 2 sous Compteurs, puis cliquez sur tous les événements de macrovacuolisation dans l’image. Cliquez sur Type 3 sous Compteurs, puis cliquez sur tous les événements de migration individuels dans l’image.
    4. Transférez les numéros des pathologies RPE dans une feuille de calcul. Étiquetez les lignes avec microvacuolisation, macrovacuolisation ou migration, et la colonne avec identification de la souris.
    5. Répétez les étapes 1.15.2 à 1.15.4 pour les autres images de l’exemple. Faire la moyenne du nombre de pathologies EPR par échantillon et diviser par cinq pour calculer le taux d’incidence de chaque pathologie EPR pour l’échantillon dans la feuille de calcul.
  16. Effectuer une analyse statistique des épaisseurs de l’EPR à chaque intervalle et des taux d’incidence de la pathologie de l’EPR afin de déterminer s’il existe des différences significatives entre les groupes de l’étude.

2. Évaluation de l’EPR chez la souris par microscopie électronique à transmission

  1. Couper les autres segments postérieurs cédés après les étapes 1,5-1,9 en deux à travers la marque supérieure en deux sections avec une lame de rasoir. Réannoter la face supérieure des segments postérieurs sectionnés avec un colorant de marquage tissulaire. Séparer les segments postérieurs sectionnés en nouveaux microtubes de 2 mL contenant 2 mL de 1x PBS et identification de souris.
    REMARQUE: Le segment postérieur de la souris est trop grand pour être traité en une seule pièce et doit être coupé en deux pour le traitement par microscopie électronique à transmission.
  2. Rincer les tissus avec 2 mL de tampon cacodylate 0,1 M, pH 7,2. Incuber pendant 10 min à RT sur la paillasse. Répétez cette étape deux fois de plus.
  3. Remplacer le tampon cacodylate 0,1 M par 2 mL de tétroxyde d’osmium à 2 % (OsO4) dilué dans un tampon cacodylate 0,1 M. Incuber pendant 1,5 h à TA dans la hotte.
    ATTENTION : L’OsO4 est une substance toxique. Veuillez suivre les procédures opérationnelles standard lorsque vous travaillez avec OsO4.
  4. Rincer les mouchoirs avec 2 mL de tampon cacodylate 0,1 M pendant 10 min à TA dans la hotte. Répétez cette étape une fois.
  5. Déshydrater les tissus avec des dilutions graduées d’EtOH allant de 50% à 100% à RT dans la hotte. Un protocole pour la procédure de déshydratation se trouve à la figure supplémentaire 7.
  6. Retirer 100 % d’EtOH des tissus et ajouter 2 mL d’oxyde de propylène aux tissus. Incuber à TA dans la hotte pendant 15 min. Retirez l’oxyde de propylène des tissus et ajoutez 2 mL d’oxyde de propylène frais aux tissus. Incuber à TA dans la hotte pendant 15 min.
    ATTENTION : L’oxyde de propylène est une substance toxique. Veuillez suivre les procédures opérationnelles normalisées lorsque vous travaillez avec de l’oxyde de propylène.
  7. Retirez l’oxyde de propylène des tissus et ajoutez 2 mL d’un mélange 1:1 d’oxyde de propylène et de résine aux tissus. Laisser passer la nuit sous vide dans la hotte à RT.
    ATTENTION : La résine est une substance dangereuse pour l’homme. Veuillez suivre les procédures opérationnelles normalisées du laboratoire lorsque vous travaillez avec de la résine.
  8. Remplacer le mélange 1:1 d’oxyde de propylène et de résine de tissus par 2 mL de résine pure. Laisser passer la nuit sous vide dans la hotte à RT.
  9. Incorporer les tissus dans de la résine. Placez une étiquette avec identification de la souris au crayon et une goutte de résine dans le moule. Placez le tissu sur la goutte de résine. Remplir le moule avec de la résine et placer sous vide pendant 1 h à TA dans la hotte.
  10. Repositionnez les étiquettes et les spécimens à l’aide d’une pince à pointe fine, avec le côté postérieur de la section postérieure de l’œilleton sur le dessus. Laisser la moisissure toute la nuit à 65 °C dans un four dans la hotte.
  11. Retirez les moules du four. Laissez les moules refroidir à RT sur la paillasse. Retirez les blocs des moules.
    REMARQUE: Les blocs sont maintenant prêts pour le rognage.
  12. Façonnez les blocs de résine avec une lame de rasoir pour former un trapèze. Coupez les blocs de résine à l’aide d’un microtome jusqu’à ce que la tête du nerf optique soit visible. Procédez à l’utilisation d’un couteau diamanté pour couper des sections semi-minces des blocs de résine d’une épaisseur de 0,5 μm.
    NOTE: Voici un protocole publié sur la section microtome27. Si vous le souhaitez, des sections semi-minces de 0,5 μm d’épaisseur provenant des blocs de résine peuvent être collectées et colorées pour évaluer l’intégrité de l’échantillon.
  13. Couper une section ultramince de 70 nm d’épaisseur de chaque bloc paré à l’aide d’un ultramicrotome. Collectez une section ultramince de 70 nm d’épaisseur sur une grille de cuivre à barres minces de 400 mailles. Placez la grille dans une boîte de stockage de grille et étiquetez l’emplacement avec l’identification de la souris.
    NOTE: Voici un protocole publié sur la section ultramicrotome28.
  14. Colorer les grilles avec 2% d’acétate d’uranyle pendant 5 min, puis avec une solution de citrate de plomb à 3,5% pendant 5 min à TA dans la hotte.
    ATTENTION : L’acétate d’uranyle et le citrate de plomb sont des substances dangereuses. Veuillez suivre les procédures opérationnelles normalisées lorsque vous travaillez avec ces substances.
  15. Obtenir des images pour chaque échantillon à l’aide d’un microscope électronique à transmission à un grossissement de 15 000x, où les lignes de grille de la grille de cuivre croisent le RPE et BrM.
    REMARQUE: Il devrait y avoir au moins 20 à 35 images par section et 40 à 70 images par échantillon.
  16. Quantifier les hauteurs BLamD dans les images des échantillons de l’étude.
    1. Ouvrez le programme Fiji ImageJ. Faites glisser toutes les images de la section d’exemple vers la barre des tâches Fiji ImageJ. Vérifiez que les images sont calibrées en μm et non en pixels.
    2. Mesurez la hauteur BLamD dans les images. Cliquez sur l’icône Droit dans la barre des tâches Fiji ImageJ. Cliquez et faites glisser une ligne du limbe élastique de BrM vers le haut du dépôt le plus haut de l’image (Figure supplémentaire 8). Cliquez sur Analyser > mesure dans la barre de menus Fiji ImageJ pour obtenir la hauteur BLamD de l’image.
      REMARQUE: S’il n’y a pas de BLamD dans l’image, tracez une ligne entre la lame élastique de BrM et la lame basale du RPE.
    3. Transférez les hauteurs BLamD dans une feuille de calcul et une étiquette avec identification de la souris.
  17. Calculez les fréquences cumulées des hauteurs BLamD par génotype et les moyennes des hauteurs BLamD par souris dans la feuille de calcul. Effectuer une analyse statistique sur les moyennes des hauteurs BLamD pour déterminer s’il existe des différences significatives entre les groupes de l’étude.

3. Évaluation de l’EPR chez la souris par microscopie confocale

  1. Recueillez les yeux des souris. Euthanasier les souris selon la procédure décrite à l’étape 1.3. Énucléez les yeux à l’étape 1.5. Placez les yeux à l’aide d’une pince incurvée dans un microtube de 2 mL contenant 2 mL de 1x PBS et identification de la souris.
    REMARQUE: Ne pas adapter les souris à l’obscurité, car l’internumérisation des photorécepteurs et des processus apicaux RPE permet une meilleure visualisation de l’EPR par microscopie confocale.
  2. Nettoyez et disséquez immédiatement les yeux de la souris pour générer des oculaires postérieurs de souris.
    REMARQUE: L’œilleton postérieur est différent du segment postérieur car il ne contient pas la rétine neurale.
    1. Transférer l’œil dans une boîte de Petri contenant 1x PBS au microscope à dissection (figure supplémentaire 9A).
    2. Enlevez la graisse et les muscles du globe oculaire, comme décrit à l’étape 1.8.2 (figure supplémentaire 9B).
    3. Entailler la cornée du globe oculaire avec une lame de scalpel numéro 11. Retirez la cornée et l’iris, comme indiqué à l’étape 1.8.3 (figure supplémentaire 9C).
    4. Retirez l’objectif à l’aide d’une pince à pointe fine. Prenez deux pinces à pointe fine et séparez doucement la rétine neurale du segment postérieur.
    5. Couper soigneusement la rétine neurale à la tête du nerf optique pour l’enlever de l’œilleton postérieur (figure supplémentaire 9D).
    6. Placez l’œilleton postérieur dans un nouveau microtube de 2 mL contenant 500 μL de 1x PBS avec identification de souris.
  3. Fixez les oculaires postérieurs avec du méthanol (MeOH) (figure supplémentaire 10).
    REMARQUE: Étape 3.3 prend environ 2 h et 40 min pour terminer.
    1. Ajouter 500 μL de MeOH aux tissus. Incuber sur agitateur à 75 tours pendant 5 min à TA.
    2. Retirer les 500 μL de solution des tissus et ajouter 500 μL de MeOH. Incuber pendant 5 min sur un shaker à 75 tours pendant 5 min à TA. Répétez cette étape une fois de plus.
    3. Retirez toute la solution des tissus et ajoutez 500 μL de MeOH. Incuber sur agitateur à 75 tours pendant au moins 2 h à TA.
      NOTE: Comme alternative à l’étape 3.3.3, l’œilleton postérieur peut être incubé pendant une nuit dans MeOH sur un agitateur à 75 tr/min dans une pièce à 4 °C.
    4. Ajouter 500 μL de 1x PBS aux tissus. Incuber sur agitateur à 75 tours pendant 5 min à TA.
    5. Retirer les 500 μL de solution des tissus et ajouter 500 μL de 1x PBS. Incuber sur un shaker à 75 tours pendant 5 min à TA. Répétez cette étape une fois de plus.
    6. Retirez toute la solution des tissus et remplacez-la par 500 μL de 1x PBS.
      NOTE: Les tissus sont entièrement fixés par le MeOH et peuvent être conservés dans un réfrigérateur à 4 °C pendant au moins 1 mois.
  4. Effectuer une coloration par immunofluorescence des oculaires postérieurs pour visualiser les jonctions serrées et les noyaux de l’EPR (figure supplémentaire 11).
    1. Retirer les 500 μL de 1x PBS des échantillons et ajouter 100 μL de sérum d’âne dilué à 10% normal dans 1x solution de PBS. Incuber sur un shaker à 75 tours pendant 30 min à TA.
    2. Retirer la solution diluée de sérum d’âne normal à 10 % des échantillons et ajouter 100 μL d’une dilution 1:50 d’un anticorps polyclonal anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) de lapin dans 1x PBS. Transférer les échantillons dans une pièce à 4 °C et incuber pendant la nuit sur un agitateur à 75 tr/min.
    3. Retirer la dilution des anticorps des échantillons et ajouter 2 mL de 1x PBS. Incuber sur un shaker à 75 tr/min pendant 10 min à TA. Répétez cette étape deux fois de plus.
    4. Retirez le PBS 1x des échantillons. Ajouter 100 μL d’une dilution 1:250 d’un anticorps IgG anti-lapin d’âne avec une étiquette conjuguée au fluorophore 488 et une dilution 1:250 de dichlorhydrate de 4',6-diamidine-2'-phénylindole (DAPI) dans 1x PBS aux échantillons. Couvrir les échantillons de papier d’aluminium et incuber sur un agitateur à 75 rpm pendant 2 h à TA.
      REMARQUE: Les échantillons doivent être complètement recouverts de papier d’aluminium pour éviter le photoblanchiment.
    5. Retirer les dilutions d’anticorps et de DAPI des échantillons. Ajouter 2 ml de 1x PBS aux échantillons, recouvrir de papier d’aluminium et incuber sur un agitateur à 75 rpm pendant 10 min à TA. Répétez cette étape trois fois de plus.
      REMARQUE: Les jonctions serrées et les noyaux de l’EPR sont maintenant entièrement marqués et colorés, respectivement.
  5. Montez les oculaires postérieurs sur des lames de microscope.
    1. Étiquetez une lame de microscope avec identification de souris. Transférez l’œilleton postérieur sur une lame de microscope sous un microscope à dissection avec le côté choroïdien vers le bas. Ajoutez une goutte de 1x PBS à l’œilleton postérieur pour l’empêcher de se dessécher (Figure supplémentaire 12).
    2. Coupez l’œilleton postérieur à l’aide d’une lame de scalpel numéro 11 à quatre endroits qui donnera quatre quadrants correspondant aux directions cardinales (c.-à-d. nord, est, sud et ouest). Tamponner l’excès de 1x PBS avec le tissu du périmètre de l’œilleton postérieur. Aplatir doucement l’œilleton postérieur à l’aide d’une brosse à cheveux camel et d’une pince à pointe fine (figure supplémentaire 12).
      REMARQUE : Le produit résultant est maintenant connu sous le nom de montage plat RPE.
    3. Ajoutez une goutte de support de montage au support plat RPE et placez un couvercle dessus. Appliquez du vernis à ongles transparent pour sceller la lamelle de couverture et laissez-la sécher pendant au moins 30 minutes à TA dans un tiroir fermé. Placez les lames dans une boîte de support de diapositives et conservez-la au réfrigérateur à 4 °C.
      REMARQUE: Veillez à éviter d’introduire des bulles sur le support plat RPE. Les supports plats RPE peuvent être imagés dans un délai de 2 semaines.
  6. Obtenez une image de chacun des quatre quadrants entourant le nerf optique de la monture plate RPE sur un microscope confocal à un grossissement de 20x pour chaque échantillon. Un exemple d’image à montage plat RPE se trouve à la figure supplémentaire 13A.
    REMARQUE : Il peut être nécessaire d’effectuer une imagerie z-stack des supports plats RPE où plusieurs images sont prises et empilées pour compenser les différences dimensionnelles du montage plat RPE.
  7. Tracez les jonctions serrées des cellules RPE dans chaque image à montage plat RPE. Un exemple d’image à montage plat RPE tracée se trouve à la figure supplémentaire 13B.
    1. Ouvrez le programme Fiji ImageJ. Faites glisser une image à montage plat RPE dans la barre des tâches Fiji ImageJ. Vérifiez que l’image est calibrée en micromètres et non en pixels.
    2. Double-cliquez sur l’icône Overlay Brush Tool dans la barre des tâches Fiji ImageJ pour définir la largeur du pinceau sur 3, la transparence sur 0 et la couleur sur le rouge. Cliquez sur le bouton Fermer dans la fenêtre Overlay Brush Tool (Outil Pinceau de superposition ).
    3. Cliquez sur l’icône Overlay Brush Tool (Pinceau de superposition ). Cliquez et faites glisser sur les jonctions serrées de toutes les cellules RPE qui se trouvent complètement dans l’image.
      REMARQUE: Si une erreur de suivi est commise, double-cliquez sur l’icône Outil Pinceau de superposition et cliquez sur la case Annuler dans la fenêtre Outil Pinceau de superposition pour supprimer l’erreur de traçage de l’image.
    4. Cliquez sur l’icône Rectangle dans la barre des tâches Fiji ImageJ. Cliquez sur l’image et faites-la glisser autour du périmètre de l’image. Cliquez sur Modifier > Effacer dans la barre de menus Fiji ImageJ pour conserver les lignes tracées et supprimer les couleurs bleues et vertes de l’image.
    5. Enregistrez l’image de trace dans un emplacement approprié avec identification de la souris, emplacement du quadrant (nord, sud, est ou ouest) et une étiquette de suffixe CP.
      REMARQUE : n’enregistrez pas l’image de trace RPE avant d’avoir terminé l’étape 3.7.4.
  8. Calculez les surfaces des cellules EPR pour chaque échantillon.
    1. Désignez un emplacement pour enregistrer les fichiers de l’analyse de zone RPE en créant un dossier sur l’écran du bureau de l’ordinateur. Générez des sous-dossiers pour chaque image de trace RPE et étiquetez-les avec l’identification de la souris ainsi que l’emplacement du quadrant (nord, sud, est ou ouest).
    2. Installez et ouvrez le programme Cell Profiler29. Téléchargez le fichier de projet Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1). Ouvrez le fichier Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj en cliquant sur Fichier > Ouvrir le projet dans la barre de menus du programme Cell Profiler.
    3. Faites glisser une image de trace RPE dans la zone Image > Déposer des fichiers et des dossiers ici dans la fenêtre du programme Cell Profiler.
    4. Entrez l’emplacement du dossier dans le programme Cell Profiler qui correspond à l’image de trace RPE. Cliquez sur le bouton Paramètres de sortie dans le coin inférieur gauche de la fenêtre du programme Cell Profiler et entrez l’emplacement du dossier dans les zones de texte Dossier d’entrée par défaut et Dossier de sortie par défaut .
    5. Cliquez sur le bouton Analyser les images dans le coin inférieur gauche de la fenêtre du programme Cell Profiler. Une fois l’analyse terminée, une fenêtre Analyse terminée apparaît à l’écran. Cliquez sur le bouton OK dans la fenêtre Analyse terminée .
      Remarque : Cette action générera un fichier csv et une image jpeg. Le fichier csv contiendra les zones des cellules RPE dans l’image de trace. L’image jpeg correspondra à l’image de trace RPE, où chaque cellule RPE sera étiquetée avec un numéro (Figure supplémentaire 13C).
    6. Transférez les zones RPE du fichier csv vers une feuille de calcul. Étiquetez la feuille de calcul avec l’identification de la souris.
    7. Effectuez une enquête de contrôle de la qualité des données en confirmant que chaque zone RPE du fichier csv est liée à une cellule RPE entièrement tracée dans une image jpeg. Supprimez de la feuille de calcul toutes les valeurs qui ne correspondent pas aux cellules RPE entièrement tracées.
    8. Revenez au programme Cell Profiler. Cliquez avec le bouton droit sur le nom de l’image de trace RPE dans la zone Déposer les fichiers et dossiers ici et sélectionnez Effacer la liste pour supprimer l’image du programme Cell Profiler.
    9. Répétez les étapes 3.8.3-3.8.8 pour calculer les tailles RPE pour les trois images de trace RPE restantes de l’échantillon.
  9. Quantifier les moyennes de taille de cellule RPE pour chaque échantillon de la feuille de calcul.
  10. Quantifier les densités de cellules EPR pour chaque échantillon de la feuille de calcul. Pour calculer la densité des cellules EPR, divisez le nombre total de cellules EPR par quadrant par la surface totale des cellules EPR par quadrant détectées par le programme Cell Profiler. Déterminer la moyenne des densités cellulaires RPE à partir des quatre quadrants par échantillon.
  11. Quantifier le nombre de cellules EPR multinucléées par montage plat d’EPR pour chaque échantillon. Utilisez l’application Cell Counter du programme Fiji ImageJ, comme décrit aux étapes 1.15.1-1.15.3, pour compter le nombre de cellules EPR avec plus de trois noyaux dans quatre quadrants de l’échantillon.
  12. Effectuer une analyse statistique sur les moyennes de taille et de densité des cellules EPR, ainsi que sur le nombre de cellules EPR multinucléées afin de déterminer s’il existe des différences significatives entre les groupes de l’étude.

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Representative Results

L’achèvement du protocole de phénotypage RPE décrit dans cet article fournit une analyse quantitative des anomalies structurelles de l’EPR couramment observées dans les modèles murins de DMLA. Pour confirmer l’efficacité de ce protocole, nous l’avons utilisé chez des souris connues pour présenter des pathologies de l’EPR, y compris des souris transgéniques qui surexpriment WT Tmem135 entraînées par le promoteur de la bêta-actine de poulet (Tmem135 TG)30 et des souris C57BL/6J âgées31,32. L’objectif de ces expériences est de montrer des résultats représentatifs qui pourraient être obtenus en utilisant les méthodes décrites dans ce protocole aux chercheurs novices dans les modèles murins.

Nous avons adhéré aux méthodes de l’étape 1 du protocole pour traiter et évaluer les yeux de souris WT et Tmem135 TG afin d’évaluer les pathologies RPE par microscopie optique. Nous avons constaté que les souris Tmem135 TG âgées de 4 mois présentaient une réduction significative de l’épaisseur de l’EPR à deux intervalles mesurés par rapport au WT apparié selon l’âge par le biais d’une ANOVA avec test de Tukey post-hoc (Figure 4). Ces résultats indiquent que l’EPR est plus mince chez les souris Tmem135 TG âgées de 4 mois que chez les souris WT appariées selon l’âge à 600 et 900 μm du nerf optique.

De plus, en utilisant les méthodes de l’étape 1 du protocole, nous avons calculé l’incidence des pathologies de l’EPR, y compris la microvacuolisation, la macrovacuolisation et la migration de trois souris WT et Tmem135 TG âgées de 25 jours (Figure 5A). La fréquence moyenne des pathologies de microvacuolisation RPE par lame chez les souris WT était de 0,67 ± 0,31 et chez les souris Tmem135 TG était de 7,07 ± 0,61 (Figure 5B). Il n’y avait pas de macrovacuolisation RPE chez les souris WT, mais il y avait en moyenne 5,33 ± 2,02 événements de macrovacuolisation chez les souris Tmem135 TG (Figure 5C). Enfin, les taux de cellules EPR migratrices par lame étaient de zéro chez les souris WT et de 0,4 ± 0,35 chez les souris Tmem135 TG (Figure 5D). Après avoir effectué un test t de l’étudiant, l’incidence de la microvacuolisation et de la microvacuolisation de l’EPR était significativement différente entre les souris WT et Tmem135 TG. Cependant, l’incidence plus élevée de cellules migratoires EPR chez les souris TG Tmem135 n’était pas significativement différente de celle de WT (p = 0,1161). Ces données montrent que la microvacuolisation et la macrovacuolisation de l’EPR, mais pas la migration, sont significativement plus élevées chez les souris Tmem135 TG âgées de 25 jours que chez les souris WT.

En suivant les méthodes du protocole inclus à l’étape 2, nous avons préparé des coupes rétiniennes de souris WT C57BL/6J âgées de 2 mois et de 24 mois pour la microscopie électronique à transmission afin d’analyser la présence et la hauteur des BLamD. Nous avons trouvé des BLamD présents dans les rétines WT de 24 mois qui étaient notablement absents dans les rétines WT de 2 mois (Figure 6A). Nous avons présenté les hauteurs des BLamD dans les rétines WT âgées de 24 mois en calculant et en traçant les fréquences cumulées de leur apparition. Les fréquences cumulatives des hauteurs BLamD ont été représentées graphiquement par rapport à la hauteur des dépôts pour illustrer la distribution des hauteurs de dépôt. Il y a un déplacement vers la droite de la ligne pour les hauteurs WT BLamD de 24 mois par rapport aux hauteurs WT BLamD de 2 mois, ce qui démontre une augmentation des dépôts chez les souris WT âgées de 24 mois (Figure 6B). Ce graphique est soutenu par une moyenne plus élevée des hauteurs BLamD dans les rétines WT âgées de 24 mois (1,01 μm ± 0,43 μm) que dans les rétines WT âgées de 2 mois (0,23 μm ± 0,017 μm), qui étaient significativement différentes selon le test t d’un étudiant (Figure 6C). En résumé, nous concluons que les souris WT âgées de 24 mois ont de gros BLamD dans l’espace sous-RPE de leur rétine par rapport aux souris WT âgées de 2 mois.

Nous avons appliqué les méthodes de préparation des yeux de souris WT et Tmem135 TG âgées de 4 mois à l’étape 3 pour générer des supports plats RPE pour la détection et l’analyse de la dysmorphie et de la multinucléation RPE. Dans ce protocole, nous avons défini la dysmorphie RPE par des changements dans la taille et la densité des cellules RPE dans un modèle murin AMD par rapport à leurs témoins. Nous avons constaté que l’EPR chez les souris Tmem135 TG âgées de 4 mois est dysmorphique (Figure 7A). L’EPR dans les rétines Tmem135 TG est plus grande (806,89 μm 2 ± 252,67 vs 291,69 μm 2 ± 26,31) et moins dense (0,0014 cellules/μm 2 ± 0,00039 vs 0,0033 cellules/μm 2 ± 0,00024) que les rétines WT appariées selon l’âge (Figure 7B,C). De plus, il y avait plus de cellules EPR multinucléées dans les rétines Tmem135 TG que dans les témoins WT (8,04 cellules ± 5,54 contre 0,33 cellules ± 0,29) (Figure 7D). Tous ces paramètres ont atteint une signification statistique avec le test t d’un étudiant. Ensemble, les souris Tmem135 TG âgées de 4 mois ont plus de cellules RPE dysmorphiques et multinucléées que les souris WT âgées de 4 mois.

Figure 1
Figure 1 : Pathologies de l’EPR détectées par microscopie optique. Images représentatives de l’EPR normale chez WT (A) et de l’EPR anormale chez les souris Tmem135 TG (B-E). Les pathologies RPE observées chez les souris Tmem135 TG comprennent l’amincissement de l’EPR (B), la macrovacuolisation (C), la microvacuolisation (D) et la migration (E). Chaque pathologie est illustrée par une flèche noire. Barre d’échelle = 100 μm. Grossissement = 20x. Abréviations : RGC = couche de cellules ganglionnaires de la rétine, IPL = couche plexiforme interne, INL = couche nucléaire interne, OPL = couche plexiforme externe, ONL = couche nucléaire externe, IS = segments internes du photorécepteur, OS = segments externes du photorécepteur, EPR = épithélium pigmenté rétinien, Cho = choroïde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Pathologies EPR détectées par microscopie électronique à transmission. Images représentatives (A) de l’EPR chez les jeunes souris CFH-H/H et (B) des souris CFH-H/H âgées de 2 ans qui présentent d’abondants dépôts laminaires basaux (BLamDs). Les BLamD sont tracés avec des points jaunes dans l’image. Barre d’échelle = 800 nm. Grossissement = 15 000x. Abréviations : N = noyau, M = mitochondrie, P = granule pigmentaire, BI = repliements basaux, EL = lame élastique, EPR = épithélium pigmenté rétinien, BrM = membrane de Bruch, Cho = choroïde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Pathologies EPR détectées par microscopie confocale. Images représentatives de (A) RPE normale de WT de 8 mois et (B) RPE anormale de souris Tmem135 TG âgées de 8 mois qui présentent une dysmorphie RPE. Le carré blanc est zoomé (C) pour représenter une cellule RPE multinucléée avec trois noyaux. La couleur verte est des jonctions serrées RPE associées à l’anti-ZO1, et la couleur bleue est la coloration DAPI des noyaux RPE. Barre d’échelle = 50 μm. Grossissement = 20x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Épaisseur de l’EPR chez des souris de type sauvage (WT) et Tmem135 TG âgées de 4 mois. (A) Images représentatives de la rétine de souris WT et Tmem135 TG (TG) âgées de 4 mois. Grossissement = 20x. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Graphiques linéaires des mesures d’épaisseur RPE chez des souris WT (noires) et Tmem135 TG (vertes) âgées de 4 mois jusqu’à 3 000 μm du nerf optique. Les nombres après le génotype indiquent le nombre de souris utilisées dans cette étude. *p < 0,05, ANOVA avec test de Tukey post-hoc. Toutes les données sont moyennes ± sd. Veuillez consulter la légende de la figure 1 pour les abréviations des couches rétiniennes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Pathologies de l’EPR chez des souris Tmem135 TG âgées de 25 jours. (A) Images représentatives de la microvacuolisation, de la macrovacuolisation et de la migration de l’EPR chez trois souris Tmem135 TG (TG) âgées de 25 jours. Les pathologies RPE sont mises en évidence par des flèches noires dans chaque image. Grossissement = 40x. Barre d’échelle = 20 μm. (B-D) Quantification de la micro- et macrovacuolisation de l’EPR ainsi que des cellules EPR migratrices chez les souris WT et Tmem135 TG âgées de 25 jours. Les nombres entre parenthèses indiquent le nombre de souris utilisées dans cette étude. *p < 0,05 et ****p < 0,0001, test t de Student. Toutes les données sont moyennes ± sd. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Analyse ultrastructurale des BLamD dans les rétines WT jeunes et âgées. (A) Micrographies électroniques représentatives de l’EPR WT âgé de 2 mois et de 24 mois. Grossissement = 15 000x. Barre d’échelle = 800 nm. Un exemple de dépôt laminaire basal (BLamD) est schématisé avec un crochet. (B) Fréquences cumulées des hauteurs BLamD. (C) Moyennes de hauteur BLamD. Les nombres entre parenthèses indiquent le nombre total de souris par génotype utilisé dans cette étude. **p < 0,01, test t de l’étudiant. Toutes les données sont moyennes ± sd. Veuillez consulter la légende de la figure 2 pour les abréviations des couches rétiniennes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Les supports plats RPE révèlent des pathologies RPE chez des souris Tmem135 TG. (A) Images représentatives de supports plats WT et Tmem135 TG (TG) RPE âgés de 4 mois avec anti-ZO-1 en vert et DAPI en bleu. Grossissement = 20x. Barre d’échelle = 100 μm. (B) taille des cellules EPR, (C) densité des cellules EPR et (D) multinucléation RPE chez les souris WT et Tmem135 TG âgées de 4 mois. Le nombre entre parenthèses indique le nombre de souris utilisées dans l’étude. *p < 0,05, **p < 0,01 et ****p < 0,0001, test t de Student. Toutes les données sont moyennes ± sd. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Schéma de la configuration et de l’utilisation de la perfusion cardiaque. (A) Système de perfusion gravitaire. (B) Boîte de seringue du système de perfusion pour tampon fixateur. (C) Vanne à tourner jusqu’à ce qu’elle soit parallèle à la conduite de tuyauterie pour permettre au tampon de circuler dans la conduite de tuyauterie. D) Soupape à tourner jusqu’à ce qu’elle soit perpendiculaire à la conduite de tuyauterie pour empêcher le tampon de s’écouler dans la conduite de tuyauterie. Image créée dans Biorender. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Schéma de la procédure de perfusion cardiaque d’une souris. (A) Quatre incisions faites pour exposer la cavité abdominale. (B) Coupe faite à travers le diaphragme et le sternum pour exposer le cœur. (C) Aiguille de jauge insérée dans le ventricule gauche du cœur. La vanne est tournée jusqu’à ce qu’elle soit parallèle à la conduite de tuyauterie. L’oreillette droite est coupée avec des ciseaux incurvés pour permettre au sang et au fixateur de sortir. Image créée dans Biorender. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Schéma de la procédure pour énucléer les yeux d’une souris. (A) Appuyez doucement vers le bas avec le pouce et l’index autour de l’orbite pour provoquer une saillie de l’œil de l’orbite. (B) Prenez des ciseaux incurvés et tenez-les avec la lame à un angle de 30° par rapport à l’orbite. Procéder à la coupe autour de l’œil avec les ciseaux incurvés à un angle de 30°. Les points colorés représentent le placement des doigts sur la souris ou les ciseaux incurvés. Image créée dans Biorender. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Images de dissection oculaire de souris pour obtenir un segment postérieur de souris. (A) Œil transféré dans un microscope à dissection. (B) Graisse et muscle enlevés du globe oculaire. (C) Cornée et iris retirés du globe oculaire. (D) Lentille retirée du globe oculaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Procédure de coloration à l’hématoxyline éosine (H&E). Schéma illustrant la procédure H & E pour colorer les sections rétiniennes incrustées de paraffine. Les flèches indiquent le transfert entre les étapes. L’heure de chaque étape est indiquée en caractères rouges. Les réactifs de coloration sont fournis en caractères noirs dans les contenants de coloration en verre. Un contenant de coloration en verre devrait être préparé pour chaque réactif inclus dans le diagramme ci-dessus. Toutes les étapes doivent être complétées dans une hotte. Lorsque vous ajoutez un bordereau de couverture à une diapositive, veillez à ne pas introduire de bulles dans la diapositive. Une fois la procédure terminée, les diapositives peuvent être stockées dans une boîte à diapositives. Image créée dans Biorender. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 6 : Exemple de mesure de l’épaisseur de l’EPR. La flèche noire représente une ligne rouge du haut vers le bas de l’EPR. Cette ligne peut être mesurée pour déterminer l’épaisseur de l’EPR. Barre d’échelle = 100 μm. Grossissement = 20x. La zone encadrée est dézoomée pour faciliter la visualisation du RPE. Veuillez consulter la légende de la figure 1 pour les abréviations des couches rétiniennes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 7 : Procédure de déshydratation de l’EtOH des segments postérieurs de la souris pour le traitement TEM. Image créée dans Biorender. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 8 : Exemple de mesure de hauteur BLamD. La ligne rouge représente le plus grand BLamD dans cette image. Des points jaunes délimitent les BLamD dans l’image. Cette ligne rouge peut être mesurée pour déterminer la hauteur de ce BLamD dans cette image. Barre d’échelle = 800 nm. Grossissement = 15 000x. Veuillez consulter la légende de la figure 2 pour les abréviations des couches rétiniennes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 9 : Dissection oculaire de souris pour montage plat EPR. (A) Œil transféré dans une boîte de Petri contenant 1x PBS au microscope à dissection. (B) Graisse et muscle enlevés du globe oculaire. (C) Cornée et iris retirés du globe oculaire. (D) Cristallin et rétine retirés du globe oculaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 10 : Procédure de fixation au méthanol (MeOH) des oculaires postérieurs de souris. Image créée dans Biorender. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 11 : Procédure d’immunofluorescence pour marquer les jonctions serrées et les noyaux des cellules EPR. Diagramme illustrant les étapes de la technique d’immunofluorescence de ce protocole. Notez que cette technique prend 2 jours. Toutes les étapes se produisent à RT et sur un agitateur avec une vitesse de 75 tr / min, sauf indication contraire dans le diagramme. L’anticorps primaire (1°) utilisé dans cette étude était l’anti-ZO1 polyclonal de lapin, et l’anticorps secondaire (2º) utilisé dans cette étude était 488 IgG anti-lapin conjuguées au fluorophore. Une fois que l’anticorps secondaire et le DAPI sont ajoutés aux échantillons, les échantillons doivent être enveloppés dans du papier d’aluminium pour protéger contre le photoblanchiment de l’échantillon. Image créée dans Biorender. Abréviations : NDS = sérum d’âne normal, Ab = anticorps. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 12 : Représentation des coupes pour obtenir quatre quadrants de montage plat RPE de souris. N = nord, E = est, S = sud, W = ouest. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 13 : Exemples de paramètres d’analyse à montage plat RPE. (A) Image à montage plat RPE. (B) Image de tracé des limites RPE. (C) Image analysée par RPE Cell Profiler. Grossissement = 20x. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 1: Ikeda RPE Area Calculator.cpproj Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Dans cet article, nous avons présenté un protocole de phénotypage pour évaluer les pathologies structurelles de l’EPR de modèles murins. Nous avons décrit les étapes nécessaires au traitement des yeux pour diverses techniques d’imagerie telles que la lumière, l’électron de transmission et la microscopie confocale, ainsi que la quantification des pathologies typiques observées via ces méthodes d’imagerie. Nous avons prouvé l’efficacité de notre protocole de phénotypage RPE en examinant des souris Tmem135 TG et WT âgées de 24 mois, car ces souris présentent des pathologies RPE30,31,32. Ce protocole peut être appliqué à toute souris génétiquement modifiée ou pharmacologiquement traitée qui peut être porteuse de pathologies RPE telles que l’amincissement de l’EPR, la vacuolisation, la migration et la dysmorphie, ainsi que BLamDs 6,7. Bien que les pathologies RPE observées chez les souris Tmem135 TG et WT âgées de 24 mois soient présentes dans d’autres modèles de souris AMD 7,30, il est important que le chercheur se familiarise avec le modèle murin AMD choisi pour ses études, car l’âge d’apparition et la gravité des pathologies RPE de leur modèle murin AMD peuvent différer de ceux du Tmem135 TG et WT souris de 24 mois. Les chercheurs devront peut-être utiliser plus de souris pour leurs études que le nombre de souris utilisées pour produire les résultats représentatifs présentés dans cet article, si la présentation des pathologies RPE est variable dans leur modèle murin DMLA respectif. De plus, de nombreux modèles de souris AMD sont actuellement disponibles pour les chercheurs DMLA, mais n’ont pas de descriptions complètes de leurs pathologies RPE, ce qui peut obliger les chercheurs à effectuer des études préliminaires pour acquérir cette information.

Bien que des modifications puissent être apportées à la façon dont les yeux de souris sont traités pour les différentes méthodes d’imagerie, il est essentiel de maintenir l’évaluation quantitative des anomalies structurelles de l’EPR telle que décrite dans le protocole. Par exemple, cinq coupes rétiniennes colorées H & E ont été préparées pour compter le nombre d’événements de microvacuolisation, de macrovacuolisation et de migration de l’EPR, permettant aux chercheurs d’évaluer les pathologies de l’EPR à plusieurs endroits de la rétine de la souris. Un autre exemple est l’utilisation d’une grille de microscopie électronique en cuivre à barres minces de 400 mailles pour évaluer les anomalies ultrastructurales de l’EPR. La grille de microscopie électronique fournit un cadre pour évaluer un échantillon rétinien de manière systématique et impartiale par micrographie électronique à transmission, ainsi que pour obtenir 40 à 70 images par section rétinienne pour examiner la présence de BLamD. Cela ne peut pas être réalisé avec une grille à fente de microscopie électronique, et nous suggérons de ne pas les utiliser avec ce protocole. Enfin, la capture d’images d’agrandissement 20x à partir des quatre quadrants d’un support plat RPE permet aux chercheurs d’étudier de grandes zones d’EPR murin pour la dysmorphie et la multinucléation. Les chercheurs sont libres de développer ce protocole et d’examiner des coupes rétiniennes supplémentaires pour les pathologies de l’EPR dans leurs études. Ensemble, ces méthodes permettent aux chercheurs de recueillir de nombreuses données pour tirer des conclusions sur les pathologies structurelles de l’EPR qui peuvent être présentes dans leurs modèles murins DMLA.

Une autre caractéristique clé de ce protocole est la cohérence des méthodes de phénotypage RPE. Par exemple, tous les yeux utilisés pour la microscopie électronique à lumière et à transmission ont été orientés par le côté supérieur de la rétine de la souris pour la section. Il est important de maintenir l’orientation de l’œil de souris tout au long de son traitement pour la microscopie électronique à lumière et à transmission car l’œil de souris a une distribution topographique des cellules rétiniennes33,34. L’orientation anatomique de l’œil de souris n’a pas été maintenue pour la préparation de l’EPR à montage plat, car aucune modification topographique supérieure à inférieure de la cellule EPR de la souris n’a été observée. En fait, l’EPR dans la rétine humaine présente des changements topographiques qui rayonnent loin de la tête du nerf optique35, ce qui suggère que cela pourrait être le cas pour l’EPR de la souris. Enfin, l’acquisition d’images décrite dans ce protocole repose sur le positionnement anatomique du nerf optique. L’inclusion de ces aspects méthodologiques aidera à reproduire les résultats des pathologies RPE pour les chercheurs qui travaillent avec leurs modèles murins DMLA.

Les chercheurs peuvent souhaiter ajouter plus de caractéristiques analytiques au protocole de phénotypage RPE. Certains résultats phénotypiques non présentés dans ce protocole sont l’examen de l’épaisseur BrM, des microvillosités apicales RPE et d’autres composants ultrastructuraux de l’EPR. Ces composants comprennent les mitochondries, les granules de pigment et d’autres organites comme les phagosomes. Les chercheurs peuvent déterminer la taille et le nombre de ces composants dans les micrographies électroniques obtenues avec ce protocole en utilisant le programme Fiji ImageJ. En particulier, le statut des mitochondries peut être un résultat phénotypique important à considérer, car le ciblage des mitochondries dans l’EPR est une stratégie thérapeutique importante pour la DMLA36. Un autre résultat phénotypique est la mesure supplémentaire de la dysmorphie de l’EPR sur les montures plates de l’EPR. Les images à montage plat RPE obtenues à l’aide du protocole peuvent être examinées pour la forme hexagonale RPE, le nombre de cellules RPE voisines et d’autres propriétés avec le programme REShAPE (https://github.com/nih-nei/REShAPE)35. Un autre résultat phénotypique possible est de savoir si les pathologies RPE se produisent dans les zones centrales ou périphériques de la rétine de la souris. Ces considérations phénotypiques supplémentaires renforceront davantage le protocole de phénotypage RPE décrit dans cet article.

Il y a quelques limites à ce protocole de phénotypage RPE. L’une des limites de cette méthode est la nécessité de sacrifier des souris pour récolter leurs yeux pour le phénotypage de l’EPR. Comme alternative, de nouvelles avancées dans l’imagerie par tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) permettent de quantifier l’épaisseur et les pathologies de l’EPR chez des souris vivantes37-39. Cela peut être avantageux pour les chercheurs qui souhaitent effectuer des études longitudinales sur leurs cohortes de modèles murins DMLA. Une autre limite de cette méthode est le manque d’évaluations fonctionnelles de l’EPR chez la souris. Si les chercheurs sont intéressés par une évaluation fonctionnelle de l’EPR chez la souris, nous recommandons d’effectuer une électrorétinographie et de mesurer la composante de l’onde c, car l’onde c indique le rôle fonctionnel de l’EPR dans la phototransduction40. Une autre limite de cette méthode est le manque de mesures biochimiques des marqueurs RPE chez la souris. Si les chercheurs souhaitent étudier les niveaux de marqueurs RPE, tels que la protéine cellulaire de liaison au rétinaldéhyde (CRABLP), la protéine 65 kDa spécifique de l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE65), le potassium rectifiant vers l’intérieur la sous-famille J membre 13 (KCNJ13) ou la bestrophine 1 (BEST1), nous recommandons de prélever des yeux pour l’immunohistochimie, la PCR quantitative en temps réel ou l’analyse Western blot.

En conclusion, ce protocole de phénotypage RPE peut être une ressource importante pour les chercheurs utilisant des modèles murins récapitulant les aspects pathologiques de la DMLA. Ce protocole sert également à normaliser la façon dont le RPE est évalué dans les modèles de souris AMD, ce qui n’a pas été décrit auparavant dans la littérature. La normalisation du phénotypage de l’EPR serait essentielle pour traduire les résultats des souris vers d’autres modèles de DMLA, y compris les modèles de culture cellulaireEPR 4 et les modèles d’organismes supérieurs, y compris les primates non humains. Cela nous aiderait également à comprendre les mécanismes pathobiologiques sous-jacents au développement de la DMLA et potentiellement au développement de nouvelles thérapies pour cette maladie cécitante.

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Disclosures

Les auteurs de ce protocole n’ont pas de divulgations et de conflits d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Satoshi Kinoshita et le laboratoire TRIP (Translational Research Initiatives in Pathology Medicine) de l’Université du Wisconsin (UW) pour avoir préparé nos tissus à la microscopie optique. Ce noyau est soutenu par le Département de pathologie et de médecine de laboratoire de l’UW, le Centre de cancérologie Carbone de l’Université du Wisconsin (P30 CA014520) et le Bureau du directeur-NIH (S10OD023526). La microscopie confocale a été réalisée au noyau optique de biochimie de l’UW, qui a été créé avec le soutien du Département de dotation en biochimie de l’UW. Ce travail a également été soutenu par des subventions du National Eye Institute (R01EY022086 à A. Ikeda; R01EY031748 à C. Bowes Rickman; P30EY016665 au Département d’ophtalmologie et de sciences visuelles de l’UW; P30EY005722 au Duke Eye Center; NIH T32EY027721 à M. Landowski; F32EY032766 à M. Landowski), Timothy William Trout Présidence (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); et une subvention sans restriction de la Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

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References

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