Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

Modelos murinos podem ser ferramentas úteis para investigar a biologia do epitélio pigmentado da retina (EPR). Foi estabelecido que camundongos podem desenvolver uma série de patologias do EPR. Aqui, descrevemos um protocolo de fenotipagem para elucidar e quantificar patologias do EPR em camundongos usando microscopia de luz, elétron de transmissão e confocal.

Abstract

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma doença debilitante da retina em populações envelhecidas. Acredita-se que a disfunção do epitélio pigmentado da retina (EPR) seja um evento patobiológico chave na DMRI. Para entender os mecanismos que levam à disfunção do EPR, modelos de camundongos podem ser utilizados por pesquisadores. Foi estabelecido por estudos anteriores que camundongos podem desenvolver patologias do EPR, algumas das quais são observadas nos olhos de indivíduos diagnosticados com DMRI. Descrevemos um protocolo de fenotipagem para avaliar patologias do EPR em camundongos. Este protocolo inclui a preparação e avaliação de cortes transversais da retina usando microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão, bem como de montagens planas de EPR por microscopia confocal. Detalhamos os tipos comuns de patologias murinas do EPR observadas por essas técnicas e formas de quantificá-las através de métodos imparciais para testes estatísticos. Como prova de conceito, usamos este protocolo de fenotipagem do EPR para quantificar as patologias do EPR observadas em camundongos superexpressando a proteína transmembrana 135 (Tmem135) e camundongos selvagens C57BL/6J envelhecidos. O principal objetivo deste protocolo é apresentar métodos padrão de fenotipagem da PSE com avaliações quantitativas imparciais para cientistas usando modelos de DMRI em camundongos.

Introduction

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma doença cegante comum que afeta populações acima de 55 anos1. Muitos pesquisadores acreditam que a disfunção dentro do epitélio pigmentado da retina (PSE) é um evento patobiológico precoce e crucial na DMRI2. O EPR é uma monocamada de células polarizadas encarregada de manter a homeostase dos fotorreceptores vizinhos e dos vasos sanguíneos de coroide3. Existe uma variedade de modelos para investigar mecanismos associados à doença dentro do EPR, incluindo modelos de cultura de células4,5 e camundongos 6,7,8. Um relatório recente descreveu protocolos padronizados e critérios de controle de qualidade para modelos de cultura de células PSE4, mas nenhum relato tentou padronizar a fenotipagem do EPR em modelos de camundongos. De fato, muitas publicações sobre modelos de camundongos com DMRI carecem de uma descrição completa do EPR ou quantificação das patologias do EPR neles. O objetivo geral deste protocolo é apresentar métodos padrão de fenotipagem de EPR com avaliações quantitativas imparciais para cientistas usando modelos de camundongos com DMRI.

Publicações anteriores observaram a presença de várias patologias do EPR em camundongos através de três técnicas de imagem. Por exemplo, a microscopia de luz permite aos pesquisadores visualizar a morfologia macroscópica da retina murina (Figura 1A) e detectar patologias do EPR, como afinamento do EPR, vacuolização e migração. O afinamento do EPR em um modelo de mouse AMD é exemplificado por um desvio na altura do EPR em relação aos seus respectivos controles (Figura 1B). A vacuolização do EPR pode ser dividida em duas categorias distintas: microvacuolização (Figura 1C) e macrovacuolização (Figura 1D). A microvacuolização do EPR é resumida pela presença de vacúolos no EPR que não afetam sua altura total, enquanto a macrovacuolização é indicada pela presença de vacúolos que se projetam para os segmentos externos dos fotorreceptores. A migração do EPR é distinguida pelo agregado focal de pigmento acima da monocamada do EPR em um corte transversal da retina (Figura 1E). Deve-se ressaltar que as células migratórias do EPR em olhos de doadores de DMRI exibem imunorreatividade a marcadores de células imunes, como o cluster de diferenciação 68 (CD68)9, e poderiam representar células imunes engolindo restos de EPR ou EPR em transdiferenciação9. Outra técnica de imagem chamada microscopia eletrônica de transmissão pode permitir ao pesquisador visualizar a ultraestrutura do EPR e sua membrana basal (Figura 2A). Essa técnica pode identificar o depósito sub-PSE predominante em camundongos, conhecido como depósito laminar basal (BLamD) (Figura 2B)10. Por fim, a microscopia confocal pode revelar a estrutura das células do EPR por meio de imagens de suportes planos do EPR (Figura 3A). Esse método pode revelar a dismorfia do EPR, o desvio do EPR de sua forma clássica em favo de mel (Figura 3B). Também pode detectar multinucleação do EPR, a presença de três ou mais núcleos dentro de uma célula do EPR (Figura 3C). Para um resumo dos tipos de patologias do EPR presentes nos modelos atuais de camundongos com DMRI, remetemos os pesquisadores para essas revisões da literatura 6,7.

Os pesquisadores que estudam a DMRI devem estar cientes das vantagens e desvantagens do uso de camundongos para investigar patologias do EPR antes do protocolo de fenotipagem. Os camundongos são vantajosos por causa de sua vida útil relativamente curta e custo-efetividade, bem como sua manipulabilidade genética e farmacológica. Camundongos também exibem alterações degenerativas do EPR, incluindo migração do EPR, dismorfia e multinucleação, que são observadas em olhos de doadores de DMRI11,12,13,14,15,16,17; isso sugere que mecanismos semelhantes podem estar subjacentes ao desenvolvimento dessas patologias do EPR em camundongos e humanos. No entanto, existem diferenças fundamentais que limitam a traduzibilidade de estudos em camundongos para DMRI humana. Primeiro, os camundongos não têm mácula, uma região anatomicamente distinta da retina humana necessária para a acuidade visual que é preferencialmente afetada na DMRI. Em segundo lugar, algumas patologias do EPR em camundongos, como afinamento e vacuolização do EPR, não são tipicamente vistas em olhos de doadores de DMRI18. Terceiro, camundongos não desenvolvem drusa, uma característica da patologia da DMRI19. Drusen são depósitos contendo lipídios e proteínas com pouquíssimas proteínas da membrana basal que se formam entre a lâmina basal do EPR e a camada colágena interna da membrana de Bruch (BrM)19. Drusen diferem de BLamD, o depósito comum de sub-PSE em camundongos, tanto em sua composição quanto em sua localização anatômica. Os BLamDs são anormalidades enriquecidas com matriz extracelular dependentes da idade e do estresse que se formam entre a lâmina basal do EPR do BrM e os infoldings basais do EPR20. Curiosamente, os BLamDs têm composição e aparência proteica semelhantes em camundongos e humanos 6,10,21. Trabalhos recentes sugerem que os BLamDs podem atuar na patobiologia da DMRI, influenciando a progressão da DMRI para seus estágios mais avançados18,22; portanto, esses depósitos podem representar EPR doente na retina de camundongos. O conhecimento desses benefícios e limitações é fundamental para pesquisadores interessados em traduzir resultados de estudos em camundongos para a DMRI.

Neste protocolo, discutimos os métodos de preparação dos olhos para luz, elétrons de transmissão e microscopia confocal para visualização de patologias do EPR. Também descrevemos como quantificar patologias do EPR de forma imparcial para testes estatísticos. Como prova de conceito, utilizamos o protocolo de fenotipagem do EPR para investigar as patologias estruturais do EPR observadas em camundongos superexpressando a proteína transmembrana 135- (Tmem135) e camundongos selvagens envelhecidos (WT) C57BL/6J. Em resumo, objetivamos descrever a metodologia de fenotipagem para caracterizar a PSE em modelos de camundongos com DMRI, uma vez que atualmente não existem protocolos padronizados disponíveis. Pesquisadores interessados em examinar e quantificar patologias dos fotorreceptores ou coroides, que também são afetadas em modelos de camundongos com DMRI, podem não achar esse protocolo útil para seus estudos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Wisconsin-Madison, e estão em conformidade com a Declaração da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e da Visão.

1. Avaliação da PSE de camundongos por microscopia de luz

  1. Fazer um tampão fixador que tenha uma concentração final de 2% de paraformaldeído e 2% de glutaraldeído à temperatura ambiente (TR) em um frasco de vidro.
    NOTA: Este protocolo requer, no máximo, 14 ml de tampão fixador por rato.
    CUIDADO: Paraformaldeído e glutaraldeído são substâncias perigosas. Siga os procedimentos operacionais padrão ao trabalhar com essas substâncias.
  2. Preparar um sistema de perfusão por gravidade em uma almofada absorvente para perfusão cardíaca em uma capela de fumaça (Figura 1A suplementar).
    1. Colocar 40 mL do tampão fixador no barril da seringa do sistema de perfusão (Figura 1B suplementar).
    2. Gire a válvula até que ela fique paralela à linha de tubulação para permitir que o tampão flua através da linha de tubulação (Figura suplementar 1C). Lave a linha com tampão até que todas as bolhas de ar sejam removidas da linha.
    3. Gire a válvula até que ela esteja perpendicular à linha de tubulação para impedir que o tampão flua para a linha de tubulação (Figura 1D Suplementar).
      NOTA: O sistema de perfusão já está pronto para uso.
  3. Eutanasiar o camundongo colocando-o em uma câmara de dióxido de carbono (CO 2) e permitir que o CO2 flua para a câmara a uma taxa de fluxo de 30% do volume da câmara por minuto. Quando o rato parar de respirar, deixe o CO2 fluir para a câmara durante pelo menos 1 minuto. Verifique se o mouse está morto antes de avançar para a próxima etapa.
    NOTA: A eutanásia através da injeção de agentes farmacológicos pode ser utilizada neste protocolo como alternativa à inalação de CO2 .
  4. Realizar perfusão cardíaca no camundongo eutanasiado.
    1. Transfira o mouse para uma bandeja rasa perto do sistema de perfusão com o abdome voltado para cima. Borrifar o abdome com etanol 70% (EtOH).
    2. Realizar quatro incisões para exposição da cavidade abdominal (Figura 2A Suplementar).
      1. Crie um corte inferior de 5 cm usando tesoura curva e pinça através da pele e da parede abdominal no lado esquerdo mais distante do mouse que está diretamente abaixo da caixa torácica.
      2. Proceder a um corte medial de 3 cm através da pele e parede abdominal do rato que começa no topo do corte inferior.
      3. Faça outro corte inferior de 5 cm na extremidade do corte medial através da pele e da parede abdominal no lado direito mais distante do mouse diretamente abaixo da caixa torácica.
      4. Realizar outra incisão medial de 3 cm para retirada do retalho cutâneo abdominal com pinça curva.
    3. Cortar o diafragma e o esterno para expor o coração (Figura 2B suplementar).
      NOTA: Tenha cuidado para evitar cortar o coração, artérias e veias. Nicking estes levará a uma perfusão cardíaca ineficiente.
    4. Insira a agulha do calibre no ventrículo esquerdo do coração. Gire a válvula até que ela fique paralela à linha da tubulação. Cortar o átrio direito com tesoura curva para permitir a saída de sangue e fixador do coração (Figura 2C suplementar).
    5. Deixe 10 mL de tampão fixador penetrar no camundongo por pelo menos 1-2 min, ou até que o fígado fique pálido e nenhum sangue flua para fora do átrio direito. Quando a perfusão estiver completa, gire a válvula até que ela esteja perpendicular à linha de tubulação para interromper o fluxo do tampão.
  5. Enuclear os olhos do camundongo após a perfusão cardíaca.
    1. Remova o mouse da bandeja rasa e coloque-o na parte inferior do absorvente em um exaustor. Orientar a cabeça do rato de tal forma que o olho esquerdo esteja virado para o experimentador e o olho direito esteja fora de vista. Anote o lado superior do olho com um corante de marcação de tecido.
    2. Empurre suavemente para baixo com o polegar e o indicador ao redor da cavidade ocular para causar protrusão do olho a partir da cavidade ocular (Figura 3A suplementar).
    3. Pegue uma tesoura curva e segure-a com a lâmina em um ângulo de 30° da cavidade ocular. Proceder ao corte ao redor do olho com a tesoura curva em um ângulo de 30° (Figura 3B Suplementar).
      NOTA: Não há problema em cortar o excesso de tecido da cavidade ocular para preservar a integridade do globo ocular.
    4. Retire o globo ocular da cabeça com pinça curva e coloque-o em uma almofada absorvente. Corte a córnea com uma lâmina de bisturi número 11 e coloque o olho com pinça curva em um microtubo de 2 mL com 2 mL de tampão fixador. Rotular o microtubo de 2 mL com identificação do mouse e 'esquerda' para indicar o olho esquerdo.
      NOTA: O nick na córnea permite que o fixador penetre prontamente no olho para melhor preservá-lo.
    5. Repita as etapas 1.5.1-1.5.4 para o olho direito.
  6. Deixe os olhos incubarem em tampão fixador durante a noite em um agitador em uma sala de 4 °Celsius (C), a uma velocidade de 75 rotações por minuto (rpm).
  7. Substitua o tampão fixador por 2 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) 1x. Incubar os olhos em 1x PBS por 10 min em um agitador a RT e 75 rpm. Repita esta etapa duas vezes.
  8. Limpar e dissecar os olhos para gerar segmentos posteriores.
    NOTA: O segmento posterior é o globo ocular do camundongo com a retina neural, PSE, coroide e esclera sem córnea, íris e lente.
    1. Coloque o olho em uma placa de Petri preenchida com 1x PBS sob um microscópio dissecante (Figura 4A suplementar).
    2. Levante suavemente qualquer gordura e músculo para longe do globo ocular com pinças de ponta fina. Aparar cuidadosamente a gordura e o músculo com uma tesoura microdissecante em direção paralela ao globo ocular até que o globo ocular tenha uma cor preto-azulada uniforme (Figura 4B Suplementar).
      OBS: Não corte no sentido perpendicular, pois isso danifica o globo ocular. Além disso, se o corante de marcação de tecido sair durante o processamento, reanote o lado superior do globo ocular imediatamente.
    3. Coloque pinça de ponta fina no local da punção corneana. Corte ao redor do perímetro da córnea, iniciando-se no local da punção, com tesoura microdissecante, para retirada da córnea e íris do globo ocular (Figura 4C Suplementar).
    4. Pegue a pinça de ponta fina e remova suavemente a lente do globo ocular para obter o segmento posterior (Figura 4D Suplementar).
    5. Coloque o segmento posterior novamente em um microtubo de 2 mL com 2 mL de PBS 1x. Conservar o segmento posterior num frigorífico a 4 °C.
      NOTA: Os segmentos posteriores podem permanecer em 1x PBS a 4 °C por muitas semanas antes do processamento adicional.
  9. Repita os passos 1.3-1.8 para preparar os olhos de outros ratos no estudo.
  10. Processar e incorporar um dos segmentos posteriores de cada camundongo em parafina para seccionamento. Certifique-se de que o lado superior do segmento posterior esteja na parte superior.
    NOTA: Os autores confiam no laboratório Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) da Universidade de Wisconsin-Madison (UW) para realizar essas tarefas. Aqui estão publicados protocolos utilizando um método semelhante de processamento e incorporação emparafina23,24.
  11. Aparar e seccionar cada bloco de parafina para obter uma seção retiniana de 5 μm de espessura que inclua a cabeça do nervo óptico, bem como quatro cortes adicionais de retina de 5 μm de espessura que estejam a 250 μm de distância um do outro. Rotule os slides com a identificação do mouse e o número da seção de série (ou seja, 1, 2, 3, 4 ou 5). Armazene os slides em uma caixa de slides.
    NOTA: Os autores contam com o laboratório UW TRIP para seus serviços de secção em parafina. Aqui estão publicados protocolos utilizando método semelhante de secção emparafina25,26.
  12. Manchar as lâminas contendo cortes de retina com hematoxilina e eosina (H&E). Um protocolo de coloração de H&E pode ser encontrado na Figura Suplementar 5.
    NOTA: Todas as etapas do procedimento de coloração H&E devem ser concluídas em um exaustor.
  13. Coletar imagens costuradas de cortes retinianos corados com H&E com uma barra de escala usando um microscópio de luz com aumento de 20x.
  14. Quantificar a espessura do EPR nas imagens retinianas contendo a cabeça do nervo óptico para cada amostra.
    1. Baixe e abra o programa Fiji ImageJ. Arraste todas as imagens da retina costuradas contendo a cabeça do nervo óptico para a barra de tarefas do Fiji ImageJ. Verifique se a escala da imagem está calibrada em μm e não em pixels.
      Observação : a escala de imagem está localizada no canto superior esquerdo da janela que contém uma imagem retiniana no programa Fiji ImageJ. Se a escala estiver definida em pixels, consulte o manual de instruções do programa Fiji ImageJ para converter pixels em μm.
    2. Marque a cada intervalo de 300 μm em cada imagem desde a borda da cabeça do nervo óptico até o final da retina (ora serrata). Clique no ícone Reto na barra de tarefas do Fiji ImageJ. Clique e arraste uma linha da borda da cabeça do nervo óptico em direção à ora serrata que tem 300 μm de comprimento. Clique na ferramenta Pincel na barra de tarefas Fiji ImageJ e clique no final da linha de 300 μm para marcá-la.
    3. Meça a espessura do PSE em cada intervalo marcado. Clique no ícone Reto na barra de tarefas do Fiji ImageJ. Clique e arraste uma linha da parte superior para a inferior do RPE (Figura 6 Suplementar). Clique em Analisar > Medir na barra de menus do Fiji ImageJ para obter a espessura do PSE.
    4. Transfira as medidas de espessura de PSE para uma planilha e rotule a coluna que contém as medidas com identificação do mouse. Rotule uma coluna adicional com "Intervalo marcado" e insira a distância longe dos valores do nervo óptico (ou seja, 300, 600, 900, etc.)
      NOTA: O primeiro intervalo medido corresponde a 300 μm de distância do nervo óptico, o segundo intervalo medido corresponde a 600 μm de distância, e assim por diante.
  15. Quantificar as taxas de incidência de EPR com base nas imagens retinianas de cada amostra.
    1. Abra o programa Fiji ImageJ.
    2. Abra o aplicativo Contador de células dentro do programa Fiji ImageJ. Clique em Plugins > Analisar > contador de células na barra de menus do Fiji ImageJ. Arraste uma imagem retiniana para a barra de tarefas do Fiji ImageJ e clique em Inicializar na janela Contador de células .
    3. Conte o número de patologias de EPR por seção da retina usando o aplicativo Contador de células . Clique em Tipo 1 em Contadores e, em seguida, clique em todos os eventos de microvacuolização na imagem. Clique em Tipo 2 em Contadores e, em seguida, clique em todos os eventos de macrovacuolização na imagem. Clique em Tipo 3 em Contadores e, em seguida, clique em todos os eventos de migração individuais na imagem.
    4. Transfira os números das patologias do EPR para uma planilha. Rotule as linhas com microvacuolização, macrovacuolização ou migração, e a coluna com identificação do mouse.
    5. Repita as etapas 1.15.2-1.15.4 para outras imagens da amostra. Média do número de patologias do EPR por amostra e dividir por cinco para calcular a taxa de incidência de cada patologia do EPR para a amostra da planilha.
  16. Realizar análise estatística das espessuras de EPR em cada intervalo e das taxas de incidência de EPR para determinar se há diferenças significativas entre os grupos no estudo.

2. Avaliação do PSE de camundongos por microscopia eletrônica de transmissão

  1. Cortar os demais segmentos posteriores cedidos após os passos 1,5-1,9 ao meio através da marcação superior em duas seções com lâmina de barbear. Reanotar a face superior dos segmentos posteriores seccionados com corante tecidual marcador. Separe os segmentos posteriores seccionados em novos microtubos de 2 mL contendo 2 mL de PBS 1x e identificação em camundongos.
    NOTA: O segmento posterior do mouse é muito grande para ser processado em uma peça e deve ser cortado ao meio para processamento de microscopia eletrônica de transmissão.
  2. Enxaguar os tecidos com 2 mL de tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,2. Incubar por 10 min em TR na bancada. Repita esta etapa mais duas vezes.
  3. Substitua o tampão cacodilato 0,1 M por 2 mL de tetróxido de ósmio a 2% (OsO4) diluído em tampão cacodilato 0,1 M. Incubar durante 1,5 h em RT no exaustor.
    CUIDADO: OsO4 é uma substância venenosa. Siga os procedimentos operacionais padrão ao trabalhar com o OsO4.
  4. Enxaguar os tecidos com 2 mL de tampão cacodilato 0,1 M por 10 min em RT no exaustor. Repita esta etapa uma vez.
  5. Desidratar os tecidos com diluições graduadas de EtOH variando de 50% a 100% em RT no exaustor. Um protocolo para o procedimento de desidratação pode ser encontrado na Figura 7 Suplementar.
  6. Remover 100% de EtOH dos tecidos e adicionar 2 mL de óxido de propileno aos tecidos. Incubar em RT no exaustor durante 15 min. Remova o óxido de propileno dos tecidos e adicione 2 mL de óxido de propileno fresco aos tecidos. Incubar em RT no exaustor durante 15 min.
    CUIDADO: O óxido de propileno é uma substância tóxica. Siga os procedimentos operacionais padrão ao trabalhar com óxido de propileno.
  7. Remova o óxido de propileno dos tecidos e adicione 2 mL de uma mistura 1:1 de óxido de propileno e resina aos tecidos. Deixe durante a noite sob um vácuo no exaustor de fumaça no RT.
    CUIDADO: A resina é uma substância perigosa para os seres humanos. Por favor, siga os procedimentos operacionais padrão do laboratório ao trabalhar com resina.
  8. Substitua a mistura 1:1 de óxido de propileno e resina dos tecidos por 2 mL de resina pura. Deixe durante a noite sob um vácuo no exaustor de fumaça no RT .
  9. Embutir os tecidos em resina. Coloque uma etiqueta com a identificação do rato a lápis e uma gota de resina no molde. Posicione o tecido sobre a gota de resina. Encha o molde com resina e coloque sob vácuo por 1 h no RT no exaustor.
  10. Reposicione as etiquetas e os espécimes com pinça de ponta fina, com a face posterior da seção posterior da ocular por cima. Deixe o molde durante a noite a 65 °C em um forno no exaustor.
  11. Retire as formas do forno. Deixe os moldes esfriarem para RT na bancada. Retire os blocos dos moldes.
    Observação : os blocos agora estão prontos para corte.
  12. Molde os blocos de resina com uma lâmina de barbear para formar um trapézio. Corte os blocos de resina usando um micrótomo até que a cabeça do nervo óptico esteja visível. Proceder ao uso de uma faca diamantada para cortar seções semifinas dos blocos de resina com espessura de 0,5 μm.
    NOTA: Aqui está um protocolo publicado sobre micrótomo seccionamento27. Se desejado, cortes semifinos de 0,5 μm de espessura dos blocos de resina podem ser coletados e corados para avaliar a integridade da amostra.
  13. Corte uma seção ultrafina de 70 nm de espessura de cada bloco aparado usando um ultramicrótomo. Colete uma seção ultrafina de 70 nm de espessura em uma grade de cobre de barra fina de 400 malhas. Coloque a grade em uma caixa de armazenamento de grade e rotule o slot com identificação do mouse.
    NOTA: Aqui está um protocolo publicado sobre a secção de ultramicrótomo28.
  14. Manchar as grades com acetato de uranila a 2% por 5 min e, em seguida, com solução de citrato de chumbo a 3,5% por 5 min no TR no exaustor.
    CUIDADO: Acetato de uranila e citrato de chumbo são substâncias perigosas. Siga os procedimentos operacionais padrão ao trabalhar com essas substâncias.
  15. Obter imagens para cada amostra usando um microscópio eletrônico de transmissão em um aumento de 15.000x, onde as linhas de grade da grade de cobre cruzam o PSE e BrM.
    NOTA: Deve haver pelo menos 20 a 35 imagens por seção e 40 a 70 imagens por amostra.
  16. Quantificar as alturas dos BLamD nas imagens das amostras em estudo.
    1. Abra o programa Fiji ImageJ. Arraste todas as imagens da seção de exemplo para a barra de tarefas do Fiji ImageJ. Verifique se as imagens estão calibradas em μm e não em pixels.
    2. Meça a altura do BLamD nas imagens. Clique no ícone Reto na barra de tarefas do Fiji ImageJ. Clique e arraste uma linha da lâmina elástica de BrM até o topo do depósito mais alto da imagem (Figura 8 Suplementar). Clique em Analisar > Medir na barra de menus do Fiji ImageJ para obter a altura BLamD na imagem.
      NOTA: Se não houver BLamDs na imagem, desenhe uma linha da lâmina elástica de BrM para a lâmina basal do PSE.
    3. Transfira as alturas do BLamD para uma planilha e etiqueta com identificação do mouse.
  17. Calcule as frequências cumulativas de alturas de BLamD por genótipo e médias de alturas de BLamD por mouse na planilha. Realizar análise estatística das médias das alturas dos CLMamD para determinar se há diferenças significativas entre os grupos no estudo.

3. Avaliação da PSE de camundongos através de microscopia confocal

  1. Colete os olhos dos ratos. Eutanásia dos ratinhos de acordo com o procedimento descrito no passo 1.3. Enuclear os olhos usando o passo 1.5. Coloque os olhos usando pinça curva em um microtubo de 2 mL com 2 mL de PBS 1x e identificação do camundongo.
    OBS: Não adaptar os camundongos ao escuro, pois a interdigitalização dos fotorreceptores e dos processos apicais de EPR permite melhor visualização do EPR através da microscopia confocal.
  2. Limpe e disseque os olhos do rato imediatamente para gerar os óculos posteriores do rato.
    OBS: A ocular posterior é diferente do segmento posterior por não conter a retina neural.
    1. Transfira o olho para uma placa de Petri contendo 1x PBS em microscópio dissecante (Figura 9A suplementar).
    2. Remover gordura e músculo do globo ocular, conforme descrito no passo 1.8.2 (Figura 9B suplementar).
    3. Nick a córnea do globo ocular com uma lâmina de bisturi número 11. Remover a córnea e a íris, conforme detalhado na etapa 1.8.3 (Figura 9C suplementar).
    4. Puxe a lente com pinças de ponta fina. Pegue duas pinças de ponta fina e separe suavemente a retina neural do segmento posterior.
    5. Cortar cuidadosamente a retina neural na cabeça do nervo óptico para remoção da ocular posterior (Figura 9D suplementar).
    6. Coloque a ocular posterior em um novo microtubo de 2 mL contendo 500 μL de 1x PBS com identificação em camundongo.
  3. Fixar as oculares posteriores com metanol (MeOH) (Figura suplementar 10).
    NOTA: O passo 3.3 demora cerca de 2 h e 40 min a ser concluído.
    1. Adicionar 500 μL de MeOH aos tecidos. Incubar em um agitador a 75 rpm por 5 min em TR.
    2. Retire os 500 μL de solução dos tecidos e adicione 500 μL de MeOH. Incubar por 5 min em um agitador a 75 rpm por 5 min no RT. Repita este passo mais uma vez.
    3. Retire toda a solução dos tecidos e adicione 500 μL de MeOH. Incubar num agitador a 75 rpm durante, pelo menos, 2 h em TR.
      NOTA: Como alternativa ao passo 3.3.3, o óculos posterior pode ser incubado durante a noite em MeOH num agitador a 75 rpm numa sala a 4 °C.
    4. Adicionar 500 μL de 1x PBS aos tecidos. Incubar em um agitador a 75 rpm por 5 min em TR.
    5. Retire os 500 μL de solução dos tecidos e adicione 500 μL de 1x PBS. Incubar em um agitador a 75 rpm por 5 min no TR. Repita esta etapa mais uma vez.
    6. Retire toda a solução dos tecidos e substitua-a por 500 μL de 1x PBS.
      NOTA: Os tecidos são totalmente fixados pelo MeOH e podem ser mantidos em um refrigerador de 4 °C por pelo menos 1 mês.
  4. Realizar coloração por imunofluorescência das oculares posteriores para visualização das tight junctions e núcleos do EPR (Figura 11 Suplementar).
    1. Remover os 500 μL de 1x PBS das amostras e adicionar 100 μL de soro normal diluído a 10% em solução de 1x PBS. Incubar em um agitador a 75 rpm por 30 min em TR.
    2. Retirar a solução diluída de soro normal de burro a 10% das amostras e adicionar 100 μL de uma diluição de 1:50 de um anticorpo policlonal de coelho anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) em 1x PBS. Transferir as amostras para uma sala a 4 °C e incubar durante a noite num agitador a 75 rpm.
    3. Retirar a diluição de anticorpos das amostras e adicionar 2 ml de PBS 1x. Incubar em um agitador a 75 rpm por 10 min no TR. Repita esta etapa mais duas vezes.
    4. Remova o PBS 1x das amostras. Adicionar 100 μL de uma diluição de 1:250 de um anticorpo IgG anti-coelho de burro com um tag conjugado com 488 fluoróforos e uma diluição de 1:250 de 4',6-Diamidina-2'-dicloridrato de fenilindol (DAPI) em 1x PBS às amostras. Cubra as amostras com papel alumínio e incube em um agitador a 75 rpm por 2 h no TR.
      NOTA: As amostras devem ser completamente cobertas com papel alumínio para evitar o fotobranqueamento.
    5. Remover as diluições de anticorpos e DAPI das amostras. Adicione 2 mL de 1x PBS às amostras, cubra novamente com papel alumínio e incube em um agitador a 75 rpm por 10 min no TR. Repita esta etapa mais três vezes.
      NOTA: As tight junctions e os núcleos do EPR estão agora totalmente marcados e corados, respectivamente.
  5. Monte as oculares posteriores em lâminas de microscópio.
    1. Rotule uma lâmina de microscópio com identificação do mouse. Transfira a ocular posterior para uma lâmina de microscópio sob um microscópio dissecante com o lado coroidal voltado para baixo. Adicione uma gota de 1x PBS ao óculos posterior para evitar que ele seque (Figura 12 suplementar).
    2. Corte a ocular posterior usando uma lâmina de bisturi número 11 em quatro pontos que produzirão quatro quadrantes correspondentes às direções cardeais (ou seja, norte, leste, sul e oeste). Dab excesso 1x PBS com tecido do perímetro da ocular posterior. Achate suavemente a ocular posterior com uma escova de cabelo camel e pinça de ponta fina (Figura 12 Suplementar).
      Observação : o produto resultante agora é conhecido como uma montagem plana RPE.
    3. Adicione uma gota de meio de montagem ao suporte plano RPE e coloque uma tampa sobre ele. Aplique esmalte de unha transparente para selar a lamínula e deixe secar por pelo menos 30 min em RT em uma gaveta fechada. Coloque as corrediças numa caixa transportadora de corrediças e guarde a caixa num frigorífico a 4 °C.
      NOTA: Tenha cuidado para evitar a introdução de bolhas no suporte plano RPE. As montagens planas RPE podem ser visualizadas dentro de um período de tempo de 2 semanas.
  6. Obter uma imagem de cada um dos quatro quadrantes ao redor do nervo óptico da montagem plana do EPR em um microscópio confocal com aumento de 20x para cada amostra. Um exemplo de uma imagem de montagem plana RPE pode ser encontrado na Figura Suplementar 13A.
    NOTA: Pode ser necessário executar imagens z-stack das montagens planas RPE onde várias imagens são tiradas e empilhadas para compensar as diferenças dimensionais da montagem plana RPE.
  7. Rastreie as junções apertadas das células RPE dentro de cada imagem de montagem plana RPE. Um exemplo de uma imagem de montagem plana RPE rastreada pode ser encontrado na Figura Suplementar 13B.
    1. Abra o programa Fiji ImageJ. Arraste uma imagem de montagem plana RPE para a barra de tarefas do Fiji ImageJ. Verifique se a imagem está calibrada em micrômetros e não em pixels.
    2. Clique duas vezes no ícone Overlay Brush Tool na barra de tarefas do Fiji ImageJ para definir a largura do pincel como 3, transparência como 0 e cor como vermelho. Clique no botão Fechar na janela Ferramenta Pincel de sobreposição .
    3. Clique no ícone Overlay Brush Tool . Clique e arraste nas junções apertadas de todas as células RPE que estão completamente dentro da imagem.
      Observação : no caso de um erro de rastreamento é feito, clique duas vezes no ícone Overlay Brush Tool e clique na caixa Desfazer na janela Overlay Brush Tool para remover o erro de rastreamento da imagem.
    4. Clique no ícone Retângulo na barra de tarefas do Fiji ImageJ. Clique na imagem e arraste pelo perímetro da imagem. Clique em Editar > Limpar na barra de menus do Fiji ImageJ para manter as linhas traçadas e remover as cores azul e verde da imagem.
    5. Salve a imagem de rastreamento em um local apropriado com identificação do mouse, localização do quadrante (ou seja, norte, sul, leste ou oeste) e um rótulo de sufixo CP.
      Observação : não salve a imagem de rastreamento RPE antes de concluir a etapa 3.7.4.
  8. Calcule as áreas celulares do EPR para cada amostra.
    1. Designe um local para salvar os arquivos da análise da área RPE criando uma pasta na tela da área de trabalho do computador. Gere subpastas para cada imagem de rastreamento RPE e rotule as subpastas com a identificação do mouse, bem como a localização do quadrante (ou seja, norte, sul, leste ou oeste).
    2. Instale e abra o programa Cell Profiler29. Baixe o arquivo de projeto Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1). Abra o arquivo Calculator.cpproj da área Ikeda_RPE clicando em Arquivo > Abrir projeto na barra de menus do programa Cell Profiler.
    3. Arraste uma imagem de rastreamento RPE para a caixa Imagem > Soltar arquivos e pastas aqui na janela do programa Cell Profiler.
    4. Insira o local da pasta no programa Cell Profiler que corresponde à imagem de rastreamento RPE. Clique no botão Configurações de saída no canto inferior esquerdo da janela do programa Cell Profiler e digite o local da pasta nas caixas de texto Pasta de entrada padrão e Pasta de saída padrão .
    5. Clique no botão Analisar imagens no canto inferior esquerdo da janela do programa Cell Profiler. Após a conclusão da análise, uma janela Análise Concluída aparecerá na tela. Clique no botão OK na janela Análise concluída .
      Observação : essa ação gerará um arquivo csv e imagem jpeg. O arquivo csv conterá as áreas para as células RPE dentro da imagem de rastreamento. A imagem jpeg corresponderá à imagem de rastreamento RPE, onde cada célula RPE será rotulada com um número (Figura Suplementar 13C).
    6. Transfira as áreas de RPE do arquivo csv para uma planilha. Rotule a planilha com a identificação do mouse.
    7. Execute uma pesquisa de controle de qualidade dos dados confirmando que cada área RPE no arquivo csv se vincula a uma célula RPE totalmente rastreada em uma imagem jpeg. Remova quaisquer valores da planilha que não correspondam a células RPE totalmente rastreadas.
    8. Retorne ao programa Cell Profiler. Clique com o botão direito do mouse no nome da imagem de rastreamento RPE na caixa Soltar arquivos e pastas aqui e selecione Limpar a lista para remover a imagem do programa Cell Profiler.
    9. Repita as etapas 3.8.3-3.8.8 para calcular os tamanhos de EPR para as três imagens de rastreamento de EPR restantes da amostra.
  9. Quantifique as médias de tamanho de célula RPE para cada amostra na planilha.
  10. Quantifique as densidades de células de PSE para cada amostra na planilha. Para calcular a densidade celular do EPR, divida o número total de células do EPR por quadrante pela área total de células do EPR por quadrante que foi detectada pelo programa Cell Profiler. Determinar a média das densidades celulares do EPR a partir dos quatro quadrantes por amostra.
  11. Quantificar o número de células de EPR multinucleadas por montagem plana de EPR para cada amostra. Use o aplicativo Contador de células dentro do programa Fiji ImageJ, conforme descrito nas etapas 1.15.1-1.15.3, para contar o número de células RPE com mais de três núcleos em quatro quadrantes da amostra.
  12. Realizar análise estatística sobre as médias de tamanho e densidade celular do EPR, bem como o número de células multinucleadas do EPR para determinar se há diferenças significativas entre os grupos no estudo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A conclusão do protocolo de fenotipagem da PSE descrito neste artigo fornece uma análise quantitativa das anormalidades estruturais da EPR comumente observadas em modelos murinos de DMRI. Para confirmar a eficácia desse protocolo, nós o usamos em camundongos que são conhecidos por apresentar patologias do EPR, incluindo camundongos transgênicos que superexpressam WT Tmem135 impulsionado pelo promotor de beta-actina de frango (Tmem135 TG)30 e camundongos C57BL/6J envelhecidos31,32. O objetivo desses experimentos é mostrar resultados representativos que possam ser obtidos usando os métodos descritos neste protocolo para pesquisadores iniciantes em modelos de camundongos.

Aderimos aos métodos da Etapa 1 do protocolo de processamento e avaliação de olhos de camundongos WT e Tmem135 TG para avaliação de patologias do EPR por microscopia óptica. Observamos que camundongos Tmem135 TG com 4 meses de idade apresentam uma redução significativa na espessura da PSE em dois intervalos medidos em relação ao TP pareado por idade por meio de uma ANOVA com teste post-hoc de Tukey (Figura 4). Esses resultados indicam que o EPR é mais fino nos camundongos Tmem135 TG de 4 meses de idade do que nos camundongos WT pareados por idade a 600 e 900 μm de distância do nervo óptico.

Além disso, utilizando os métodos da Etapa 1 do protocolo, calculamos a incidência de patologias do EPR, incluindo microvacuolização, macrovacuolização e migração de três camundongos WT e Tmem135 TG com 25 dias de idade (Figura 5A). A frequência média de patologias de microvacuolização por lâmina de EPR em camundongos WT foi de 0,67 ± 0,31 e em camundongos TG Tmem135 foi de 7,07 ± 0,61 (Figura 5B). Não houve macrovacuolização do EPR em camundongos WT, mas houve, em média, 5,33 ± 2,02 eventos de macrovacuolização em camundongos Tmem135 TG (Figura 5C). Por fim, a taxa de células RPE migratórias por lâmina foi zero nos camundongos WT e de 0,4 ± 0,35 nos camundongos Tmem135 TG (Figura 5D). Após a realização do teste t de Student, a incidência de microvacuolização e microvacuolização de PSE foi significativamente diferente entre camundongos WT e Tmem135 TG. No entanto, a maior incidência de células migratórias do EPR em camundongos Tmem135 TG não foi significativamente diferente em comparação com o WT (p = 0,1161). Esses dados mostram que a microvacuolização e macrovacuolização do EPR, mas não a migração, é significativamente maior em camundongos Tmem135 TG com 25 dias de idade do que em camundongos WT.

Seguindo os métodos do protocolo incluído na Etapa 2, preparamos cortes de retina de camundongos WT C57BL/6J com 2 meses de idade e 24 meses de idade para microscopia eletrônica de transmissão para analisar a presença e a altura de BLamDs. Encontramos CDamS presentes em retinas WT de 24 meses de idade que estavam notavelmente ausentes em retinas WT de 2 meses de idade (Figura 6A). Apresentamos as alturas dos BLamDs nas retinas WT de 24 meses de idade por meio do cálculo e plotagem das frequências cumulativas de sua ocorrência. As frequências cumulativas das alturas da DCm foram grafadas contra a altura de depósito para ilustrar a distribuição das alturas de depósito. Há um desvio para a direita da linha para as alturas WT BLamD de 24 meses em comparação com as alturas WT BLamD de 2 meses, demonstrando um aumento de depósitos em camundongos WT de 24 meses de idade (Figura 6B). Este gráfico é suportado por uma maior média das alturas dos TP nas retinas WT aos 24 meses (1,01 μm ± 0,43 μm) do que nas retinas WT aos 2 meses (0,23 μm ± 0,017 μm), que foram significativamente diferentes pelo teste t de um estudante (Figura 6C). Em resumo, concluímos que camundongos WT de 24 meses de idade têm grandes BLamDs no espaço sub-RPE de suas retinas em comparação com camundongos WT de 2 meses de idade.

Aplicamos os métodos de preparo dos olhos de camundongos WT e Tmem135 TG de 4 meses de idade na Etapa 3 para gerar suportes planos de EPR para detecção e análise de dismorfia e multinucleação do EPR. Neste protocolo, definimos dismorfia do EPR por mudanças no tamanho e densidade celular do EPR em um modelo de camundongo AMD em relação aos seus controles. Observamos que a PSE em camundongos Tmem135 TG com 4 meses de idade é dismórfica (Figura 7A). A PSE nas retinas TG Tmem135 é maior (806,89 μm 2 ± 252,67 vs. 291,69 μm 2 ± 26,31) e menos densa (0,0014 células/μm 2 ± 0,00039 vs. 0,0033 células/μm 2 ± 0,00024) do que as retinas WT pareadas por idade (Figura 7B,C). Além disso, havia mais células EPR multinucleadas nas retinas TG Tmem135 em comparação com os controles WT (8,04 células ± 5,54 vs. 0,33 células ± 0,29) (Figura 7D). Todos esses parâmetros alcançaram significância estatística com o teste t de Student. Juntos, camundongos Tmem135 TG de 4 meses de idade têm mais células RPE dismórficas e multinucleadas do que camundongos WT de 4 meses de idade.

Figure 1
Figura 1: Patologias do EPR detectadas à microscopia óptica. Imagens representativas de EPR normal em WT (A) e EPR anormal em camundongos Tmem135 TG (B-E). As patologias do EPR observadas em camundongos Tmem135 TG incluem afinamento do EPR (B), macrovacuolização (C), microvacuolização (D) e migração (E). Cada patologia é ilustrada por uma seta preta. Barra de escala = 100 μm. Ampliação = 20x. Abreviações: RGC = camada de células ganglionares da retina, IPL = camada plexiforme interna, INL = camada nuclear interna, OPL = camada plexiforme externa, ONL = camada nuclear externa, IS = segmentos internos de fotorreceptores, OS = segmentos externos de fotorreceptores, RPE = epitélio pigmentado da retina, Cho = coroide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Patologias do EPR detectadas por microscopia eletrônica de transmissão. Imagens representativas de (A) PSE em camundongos jovens CFH-H/H e (B) CFH-H/H de 2 anos de idade que apresentam abundantes depósitos laminares basais (BLamDs). BLamDs são rastreados com pontos amarelos na imagem. Barra de escala = 800 nm. Ampliação = 15.000x. Abreviações: N = núcleo, M = mitocôndria, P = grânulo de pigmento, BI = dobras basais, EL = lâmina elástica, PSE = epitélio pigmentado da retina, BrM = membrana de Bruch, Cho = coroide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Patologias do EPR detectadas por microscopia confocal. Imagens representativas de (A) PSE normal de WT de 8 meses de idade e (B) PSE anormal de camundongos Tmem135 TG de 8 meses de idade que exibem dismorfia de EPR. O quadrado branco é ampliado em (C) para representar uma célula EPR multinucleada com três núcleos. A cor verde é anti-ZO1 associada a junções apertadas de EPR, e a cor azul é coloração DAPI de núcleos de EPR. Barra de escala = 50 μm. Ampliação = 20x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Espessura do EPR em camundongos selvagens (WT) e Tmem135 TG com 4 meses de idade. (A) Imagens representativas da retina de camundongos WT e Tmem135 TG (TG) com 4 meses de idade. Ampliação = 20x. Barra de escala = 100 μm. (B) Gráficos de linha das medidas de espessura de PSE em camundongos WT (preto) e Tmem135 TG (verde) com 4 meses de idade até 3.000 μm de distância do nervo óptico. Números após o genótipo denotam o número de camundongos utilizados neste estudo. *p < 0,05, ANOVA com teste post-hoc de Tukey. Todos os dados são médios ± sd. Por favor, veja a legenda da Figura 1 para abreviações das camadas da retina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Patologias do EPR em camundongos Tmem135 TG com 25 dias de idade. (A) Imagens representativas da microvacuolização, macrovacuolização e migração de EPR em três camundongos Tmem135 TG (TG) com 25 dias de idade. As patologias do EPR são destacadas por setas pretas em cada imagem. Ampliação = 40x. Barra de escala = 20 μm. (B-D) Quantificação da micro e macrovacuolização do EPR, bem como das células migratórias do EPR em camundongos WT e Tmem135 TG com 25 dias de idade. Números entre parênteses denotam o número de camundongos usados neste estudo. *p < 0,05 e ****p < 0,0001, teste t de Student. Todos os dados são médios ± sd. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Análise ultraestrutural dos BLamDs em retinas WT jovens e envelhecidas . (A) Micrografias eletrônicas representativas do PSE WT de 2 meses e 24 meses. Ampliação = 15.000x. Barra de escala = 800 nm. Um exemplo de depósito laminar basal (BLamD) é diagramado com um suporte. (B) Frequências cumulativas das alturas da DC. (C) Médias de altura da BLamD. Os números entre parênteses indicam o número total de camundongos por genótipo utilizado neste estudo. **p < 0,01, teste t de Student. Todos os dados são médios ± sd. Consulte a legenda da Figura 2 para abreviações das camadas da retina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Suportes planos de EPR revelam patologias do EPR em camundongos Tmem135 TG. (A) Imagens representativas de suportes planos WT e Tmem135 TG (TG) RPE com anti-ZO-1 em verde e DAPI em azul. Ampliação = 20x. Barra de escala = 100 μm. (B) tamanho da célula RPE, (C) densidade celular RPE e (D) multinucleação RPE em camundongos WT e Tmem135 TG com 4 meses de idade. O número entre parênteses denota o número de camundongos usados no estudo. *p < 0,05, **p < 0,01 e ****p < 0,0001, teste t de Student. Todos os dados são médios ± sd. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Esquema de instalação e uso da perfusão cardíaca. (A) Sistema de perfusão por gravidade. (B) Tambor de seringa do sistema de perfusão para tampão fixador. (C) Válvula a ser girada até que fique paralela à linha de tubulação para permitir que o tampão flua através da linha de tubulação. (D) Válvula a ser girada até ficar perpendicular com a linha de tubulação para impedir que o tampão flua para a linha de tubulação. Imagem criada em Biorender. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 Suplementar: Esquema do procedimento para perfusão cardíaca de camundongo. (A) Quatro incisões feitas para expor a cavidade abdominal. (B) Corte feito através do diafragma e esterno para exposição do coração. (C) Agulha calibre inserida no ventrículo esquerdo do coração. A válvula é girada até ficar paralela à linha da tubulação. O átrio direito é cortado com tesoura curva para permitir a saída de sangue e fixador. Imagem criada em Biorender. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Esquema do procedimento para enuclear os olhos de um rato. (A) Empurre suavemente para baixo com o polegar e o indicador ao redor da cavidade ocular para causar protrusão do olho a partir da cavidade ocular. (B) Pegue uma tesoura curva e segure-a com a lâmina em um ângulo de 30° em relação à cavidade ocular. Prossiga para cortar ao redor do olho com a tesoura curva em um ângulo de 30°. Pontos coloridos representam a colocação dos dedos no mouse ou tesoura curva. Imagem criada em Biorender. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 4 Suplementar: Imagens de dissecção de olho de camundongo para produzir segmento posterior de camundongo. (A) Olho transferido para microscópio dissecante. (B) Gordura e músculo retirados do globo ocular. (C) Córnea e íris removidas do globo ocular. (D) Lente retirada do globo ocular. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 5: Coloração hematoxilina-eosina (H&E). Esquema descrevendo o procedimento de H&E para corar cortes retinianos embebidos em parafina. As setas indicam a transferência entre etapas. O tempo de cada etapa é dado em fonte vermelha. Os reagentes para coloração são fornecidos em fonte preta dentro de recipientes de coloração de vidro. Deve haver um recipiente de coloração de vidro preparado para cada reagente incluído no diagrama acima. Todas as etapas devem ser concluídas em um exaustor de fumaça. Ao adicionar uma lamínula a um slide, tenha cuidado para não introduzir bolhas no slide. Após a conclusão do procedimento, os slides podem ser armazenados em uma caixa de slides. Imagem criada em Biorender. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 6 suplementar: Exemplo de medição da espessura do EPR. A seta preta representa uma linha vermelha de cima para baixo do PSE. Esta linha pode ser medida para determinar a espessura do PSE. Barra de escala = 100 μm. Ampliação = 20x. A área em caixa é reduzida para facilitar a visualização do RPE. Por favor, veja a legenda da Figura 1 para abreviações das camadas da retina. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 7: Procedimento de desidratação de EtOH de segmentos posteriores de camundongos para processamento de MET. Imagem criada em Biorender. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 8: Exemplo de medição de altura da BLamD. A linha vermelha representa o maior BLamD nesta imagem. Pontos amarelos delineiam BLamDs na imagem. Esta linha vermelha pode ser medida para determinar a altura deste BLamD nesta imagem. Barra de escala = 800 nm. Ampliação = 15.000x. Consulte a legenda da Figura 2 para abreviações das camadas da retina. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 9: Dissecção do olho do mouse para montagem plana do EPR. (A) Olho transferido para uma placa de Petri contendo 1x PBS sob microscópio dissecante. (B) Gordura e músculo retirados do globo ocular. (C) Córnea e íris removidas do globo ocular. (D) Lente e retina removidas do globo ocular. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 10: Procedimento de fixação com metanol (MeOH) em copos oculares posteriores de camundongos. Imagem criada em Biorender. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 11: Procedimento de imunofluorescência para marcação de tight junctions e núcleos de células do EPR. Diagrama descrevendo os passos da técnica de imunofluorescência a partir deste protocolo. Observação Essa técnica leva 2 dias para ser concluída. Todas as etapas ocorrem no RT e em um agitador com uma velocidade de 75 rpm, a menos que especificamente indicado no diagrama. O anticorpo primário (1º) utilizado neste estudo foi o anti-ZO1 policlonal de coelho, e o anticorpo secundário (2º) utilizado neste estudo foi 488 IgG anti-coelho conjugado com fluoróforo. Uma vez que o anticorpo secundário e o DAPI são adicionados às amostras, as amostras devem ser envolvidas em papel alumínio para proteger contra o fotobranqueamento da amostra. Imagem criada em Biorender. Abreviações: NDS = soro normal de burro, Ab = anticorpo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 12: Representação dos cortes para produzir quatro quadrantes de montagem plana de EPR do mouse. N = norte, E = leste, S = sul, W = oeste. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 13: Exemplos de pontos de extremidade de análise de montagem plana de EPR. (A) Imagem de montagem plana RPE. (B) Imagem de traçado de limite de EPR. (C) Imagem analisada do RPE Cell Profiler. Ampliação = 20x. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 1: Ikeda RPE Area Calculator.cpproj Clique aqui para baixar este arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neste artigo, apresentamos um protocolo de fenotipagem para avaliação das patologias estruturais do EPR em modelos murinos. Descrevemos as etapas necessárias para o processamento dos olhos para várias técnicas de imagem, incluindo microscopia de luz, elétron de transmissão e confocal, bem como a quantificação de patologias típicas observadas por esses métodos de imagem. Comprovamos a eficácia de nosso protocolo de fenotipagem de EPR examinando camundongos Tmem135 TG e WT de 24 meses de idade, uma vez que esses camundongos apresentam patologias do EPR30,31,32. Esse protocolo pode ser aplicado a qualquer camundongo geneticamente modificado ou tratado farmacologicamente que possa abrigar patologias do EPR, como afinamento do EPR, vacuolização, migração e dismorfia, além de CDs 6,7. Embora as patologias do EPR observadas em camundongos Tmem135 TG e WT com 24 meses de idade estejam presentes em outros modelos de camundongos AMD 7,30, é importante que o pesquisador se familiarize com o modelo de camundongo AMD escolhido para seus estudos, pois a idade de início e a gravidade das patologias do EPR de seu modelo de camundongo AMD podem diferir do Tmem135 Camundongos TG e WT com 24 meses de idade. Os pesquisadores podem precisar utilizar mais camundongos para seus estudos do que o número de camundongos usados para produzir os resultados representativos mostrados neste artigo, se a apresentação de patologias do EPR for variável em seus respectivos modelos de camundongos AMD. Além disso, muitos modelos de camundongos AMD estão atualmente disponíveis para os pesquisadores da AMD, mas ainda não têm descrições completas de suas patologias de EPR, o que pode exigir que os pesquisadores realizem estudos preliminares para obter essas informações.

Embora modificações possam ser feitas na forma como os olhos de camundongos são processados para os vários métodos de imagem, é fundamental manter a avaliação quantitativa das anormalidades estruturais do EPR descritas no protocolo. Por exemplo, cinco seções retinianas coradas com H&E foram preparadas para contar o número de eventos de microvacuolização, macrovacuolização e migração do EPR, permitindo que os pesquisadores avaliassem patologias do EPR em vários locais na retina de camundongos. Outro exemplo é o uso de uma grade de microscopia eletrônica de cobre de barra fina de 400 mesh para avaliar as anormalidades ultraestruturais do PSE. A grade de microscopia eletrônica fornece uma estrutura para avaliar uma amostra de retina de forma sistemática e imparcial por micrografia eletrônica de transmissão, bem como obter 40 a 70 imagens por corte da retina para examinar a presença de BLamDs. Isso não pode ser obtido com uma grade de slots de microscopia eletrônica, e sugerimos não utilizá-los com este protocolo. Por fim, a captura de imagens de aumento de 20x a partir dos quatro quadrantes de uma montagem plana de EPR permite que os pesquisadores investiguem grandes áreas de EPR murino para dismorfia e multinucleação. Os pesquisadores são livres para expandir esse protocolo e examinar seções adicionais da retina para patologias do EPR em seus estudos. Juntos, esses métodos permitem que os pesquisadores reúnam dados amplos para tirar conclusões sobre as patologias estruturais do EPR que podem estar presentes em seus modelos de camundongos AMD.

Outra característica fundamental desse protocolo é a consistência dos métodos de fenotipagem da PSE. Por exemplo, todos os olhos usados para microscopia de luz e eletrônica de transmissão foram orientados pelo lado superior da retina do camundongo para secção. É importante manter a orientação do olho de camundongo durante todo o seu processamento para microscopia de luz e eletrônica de transmissão, pois o olho de camundongo tem uma distribuição topográfica de células da retina33,34. A orientação anatômica do olho de camundongo não foi mantida para a preparação do EPR de montagem plana, uma vez que não foram observadas alterações topográficas superiores e inferiores da célula de EPR de camundongo. De fato, o EPR na retina humana apresenta alterações topográficas que irradiam para longe da cabeça do nervo óptico35, sugerindo que este pode ser o caso do EPR de camundongos. Por fim, a aquisição das imagens descritas neste protocolo baseia-se no posicionamento anatômico do nervo óptico. A inclusão desses aspectos metodológicos ajudará a reproduzir resultados de patologias do EPR para os pesquisadores que trabalham com seus modelos de camundongos AMD.

Os pesquisadores podem desejar adicionar mais características analíticas ao protocolo de fenotipagem da EPR. Alguns desfechos fenotípicos não apresentados neste protocolo são o exame da espessura do BrM, microvilosidades apicais do PSE e outros componentes ultraestruturais do EPR. Esses componentes incluem mitocôndrias, grânulos de pigmento e outras organelas como fagossomos. Os pesquisadores podem determinar o tamanho e o número desses componentes nas micrografias eletrônicas obtidas com este protocolo usando o programa Fiji ImageJ. Em particular, o status das mitocôndrias pode ser um desfecho fenotípico importante a ser considerado, uma vez que o alvo mitocondrial no EPR é uma estratégia terapêutica importante para a DMRI36. Outro desfecho fenotípico são medidas adicionais de dismorfia do EPR em montagens planas do EPR. Imagens de montagem plana de EPR obtidas usando o protocolo podem ser examinadas quanto à forma hexagonal do EPR, número de células de EPR vizinhas e outras propriedades com o programa REShAPE (https://github.com/nih-nei/REShAPE)35. Outro possível resultado fenotípico é se as patologias do EPR ocorrem nas áreas centrais ou periféricas da retina de camundongos. Essas considerações fenotípicas adicionais fortalecerão ainda mais o protocolo de fenotipagem da PSE descrito neste artigo.

Existem algumas limitações desse protocolo de fenotipagem da PSE. Uma limitação desse método é a necessidade de sacrificar camundongos para colher os olhos para fenotipagem do EPR. Como alternativa, novos avanços na tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) permitem quantificar a espessura do EPR e patologias em camundongos vivos37-39. Isso pode ser vantajoso para pesquisadores que desejam realizar estudos longitudinais em suas coortes de modelos de camundongos AMD. Outra limitação desse método é a falta de avaliações funcionais da PSE em camundongos. Se os pesquisadores estiverem interessados em uma avaliação funcional do PSE em camundongos, recomendamos a realização de eletrorretinografia e a mensuração do componente da onda c, pois a onda c é indicativa do papel funcional do PSE na fototransdução40. Outra limitação deste método é a falta de medidas bioquímicas de marcadores de PSE em camundongos. Se os pesquisadores desejam investigar os níveis de marcadores de EPR, como proteína ligadora de retinaldeído celular (CRABLP), proteína de 65 kDa específica do epitélio pigmentar da retina (RPE65), subfamília J do canal retificante de potássio 13 (KCNJ13) ou besttrofina 1 (BEST1), recomendamos a coleta de olhos para imunohistoquímica, PCR quantitativo em tempo real ou análise de western blot.

Em conclusão, este protocolo de fenotipagem da PSE pode ser um recurso importante para pesquisadores que utilizam modelos murinos recapitulando aspectos patológicos da DMRI. Esse protocolo também serve para padronizar como a PSE é avaliada em modelos de camundongos com DMRI, o que não foi descrito anteriormente na literatura. A padronização da fenotipagem do EPR seria fundamental para traduzir os achados de camundongos para outros modelos de DMRI, incluindo modelos de cultura de células EPR4 e modelos de organismos superiores, incluindo primatas não humanos. Isso também ajudaria em nossa compreensão dos mecanismos patobiológicos subjacentes ao desenvolvimento da DMRI e potencialmente no desenvolvimento de novas terapias para essa doença cegante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores deste protocolo não têm divulgações e conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Satoshi Kinoshita e ao laboratório Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) da Universidade de Wisconsin (UW) pela preparação de nossos tecidos para microscopia de luz. Este núcleo é apoiado pelo Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da UW, pelo Centro de Câncer Carbone da Universidade de Wisconsin (P30 CA014520) e pelo Escritório do Diretor do NIH (S10OD023526). A microscopia confocal foi realizada no UW Biochemistry Optical Core, que foi estabelecido com o apoio do UW Department of Biochemistry Endowment. Este trabalho também foi apoiado por subsídios do National Eye Institute (R01EY022086 para A. Ikeda; R01EY031748 para C. Bowes Rickman; P30EY016665 ao Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais da UW; P30EY005722 para o Duke Eye Center; NIH T32EY027721 para M. Landowski; F32EY032766 para M. Landowski), Timothy William Trout Chairmanship (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); e uma bolsa irrestrita da Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Tags

Este mês no JoVE edição 193
Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., … More

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter