Summary
在这项研究中，开发了一种方法来促进两个实验室中两个流式细胞仪之间实验设置和分析模板的转移，以检测接种日本脑炎疫苗的儿童的淋巴细胞。流式细胞仪实验的标准化方法将使研究项目能够在多个中心有效进行。
Abstract
越来越多的实验室需要从多个流式细胞仪收集数据，特别是对于跨多个中心进行的研究项目。在不同实验室使用两台流式细胞仪的挑战包括缺乏标准化材料、软件兼容性问题、仪器设置不一致以及不同流式细胞仪使用不同的配置。为了建立标准化的流式细胞术实验，实现实验结果在多个中心的一致性和可比性，建立了一种快速可行的标准化方法，在不同流式细胞仪之间传递参数。
本研究中开发的方法允许在不同实验室的两个流式细胞仪之间转移实验设置和分析模板，以检测接种乙型脑炎（JE）的儿童的淋巴细胞。使用荧光标准微球在两个细胞仪之间获得一致的荧光强度，以建立细胞仪设置。在两个使用不同类型仪器的实验室中获得了可比的结果。利用该方法，我们可以对不同实验室使用不同仪器评估JE接种儿童免疫功能的分析进行标准化，减少多个中心流式细胞仪之间数据和结果的差异，为实验室结果的相互认证提供可行的方法。流式细胞仪实验的标准化方法将确保跨多个中心的研究项目的有效性能。
Introduction
流式细胞术的标准化有助于不同实验室和研究中心不同细胞仪结果的可比性，有利于结果的相互认可，提高工作效率。越来越多的方案需要标准化。在药物开发过程中，流式细胞术标准化非常重要，因为开发和验证的检测方法将支持从临床前到临床分析的整个药物开发过程。流式细胞术方法经常在制药行业和合作实验室之间转移1.此外，从多中心临床研究中获取可比数据至关重要。例如，在系统性自身免疫性疾病多中心临床研究项目中开发了一个标准化工作流程，以获得多中心流式细胞术2的可比数据。
流式细胞术方法的标准化具有挑战性。实验室面临的挑战归因于缺乏标准化材料、软件兼容性问题、仪器设置不一致以及不同流式细胞仪之间使用不同的配置以及中心之间的不同门控策略3，4。因此，在实验室之间进行差距分析很重要。必须审查样品访问、质量体系、人员资格和仪器配置，以确保满足要求。
目前，接种乙型脑炎（JE）疫苗的儿童乙型乙型肝炎5发病率显著降低。监测外周血免疫细胞有助于了解接种后细胞介导的适应性免疫的变化，以及外周血淋巴细胞亚群的变化与疫苗接种效果之间的相关性。由于全血样本的稳定性有限，疫苗功效的评估通常在多个中心进行。对于此分析，我们将幼稚CD8+或CD4 + T细胞定义为CD27 + CD45RA+，将中枢记忆T细胞（TCM）定义为CD27 + CD45RA-，效应记忆T细胞（TEM）定义为CD27-CD45RA-，终末分化的效应记忆T细胞（T EMRA）定义为CD27-CD45RA+。CD19+ B细胞可以分为表达CD27与IgD 6，7的群体，表达CD27n记忆的幼稚B细胞可以根据IgD 6的表达进行鉴定，调节性T细胞（Tregs）可以鉴定为CD4 + CD25++ CD127低8。为了建立标准化的流式细胞术实验，以实现多个中心实验结果的一致性和可比性，建立了一种快速可行的标准化方法，以促进不同流式细胞仪之间转移方案，以检测接种乙脑疫苗的儿童全血淋巴细胞。从首都医科大学附属北京儿童医院招募了6名健康儿童（2岁）。在不到6个月前接种了JE SA14-14-2减毒活疫苗后，从志愿者身上收集了外周血样本。按照标准化程序从不同仪器获得高度可比的数据，这有助于多中心评估。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
该研究已获得首都医科大学北京儿童医院伦理委员会批准（批准文号：2020-k-85）。本研究放弃了人类受试者的知情同意，因为仅使用临床试验后的残留样本。两个实验室参与了这项研究。 转移实验室 是使用一台流式细胞仪开发标准化方法的地方。本实验室的细胞仪以下简称 细胞仪A。测试方法实验室是使用另一个流式细胞仪接收方法的实验室，该 实验室 中的细胞仪在下文中称为 细胞仪B。
1. 外周血样本采集和细胞制备
- 通过标准静脉穿刺在 EDTA-K 2 抗凝管中收集接种 JE 疫苗的儿童和未接种疫苗的儿童的外周血样本 （2 mL）。
- 通过将试管倒置 10 倍来混合全血样品。将 100 μL 全血加入 12 mm x 75 mm 试管中。将每个样本一式两份。
- 将 10 μL 亮色染色缓冲液（BV 缓冲液）加入 12 mm x 75 mm 试管中。向BV缓冲液中加入5 μL每种抗体（CD45，CD3，CD4，CD8，CD127，CD27，CD19，IgD;稀释因子：1：20）和20 μL抗体（CD25，CD45RA;稀释因子：1：5）。轻轻涡旋。
注意：抗体试剂的体积和信息如 表1所示。 - 将抗体混合物与全血样本一起添加到试管中。轻轻涡旋并在室温下在黑暗中孵育15分钟。
- 用蒸馏水以1：10稀释10x裂解液，制备1x裂解液。通过加入 2 mL 的 1x 裂解溶液来裂解血液样品。轻轻涡旋并在室温下在黑暗中孵育10分钟。
- 以300× g 离心5分钟，倒出上清液。
- 将沉淀重悬于2mL的1x PBS中，以300× g 离心5分钟，然后倒出上清液。
- 将沉淀重悬于 0.5 mL 的 1x PBS 中并充分混合。储存在2°C至8°C。 将样品送到两个实验室进行流式细胞术分析。
注意：阴性对照样品和细胞单染色对照必须同时处理。
2. 制备补偿珠和单染色对照
- 标记 V500-抗 CD45 单染色、APC-H7-抗 CD3 单染色、FITC-抗 CD4 单染色、R718-抗 CD8 单染色、BV605-抗 CD27 单染色、APC-抗 CD45RA 单染色、PE-抗 CD25 单染色、BV421-抗 CD127 单染色、BB700-抗 CD19 单染色和 PE-CY7-抗 IgD 单染色管。
- 将 100 μL 含有 1% 胎牛血清 （FBS） 的 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 缓冲液加入 5 mL 圆底聚苯乙烯试管中。
- 向每个试管和涡旋中加入 50 μL 负磁珠和 50 μL 抗小鼠 Ig、κ 磁珠。
- 向单染色管中加入 2 μL 每种标记抗体（CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RA、CD27、CD19、IgD）。轻轻涡旋混合物，并在室温（20°C至25°C）下在黑暗中孵育15分钟。
- 将珠子重悬于2 mL 1x PBS中，以300 × g 离心5分钟，然后倒出上清液。
- 将磁珠重悬于 0.5 mL 的 1x PBS 中并充分混合。储存在2°C至8°C。
3. 在两个实验室的不同细胞仪上使用相同的配置名称
- 在流式细胞仪 A 的软件中创建新配置，单击 “流式细胞仪 ”按钮并选择 “查看 配置”以显示配置窗口。
- 在配置列表中，右键单击 基本配置文件夹，选择 新建文件夹，然后重命名。
- 右键单击 基本配置 ，然后选择 复制。
- 右键单击 新文件夹 并粘贴基本配置以创建新配置。将新配置重命名为“标准化方法传输”。
- 将参数 名称（如 FITC）从 “参数”列表 拖到 相应的检测器 （530/30） 上。
- 将其他参数（PE、BB700、PE-CY7、APC、R718、APC-H7、BV421、V500 和 BV605）编辑到新配置。
- 按照此方法在具有相同名称“标准化方法转移”的不同流式细胞仪型号上创建新配置。确保配置包含每个检测器的相同参数。
注意：要成功识别两种不同流式细胞仪型号的实验模板，请确保名称一致。 - 在细胞仪 配置下，使用 细胞仪设置和跟踪 （CST） 微球定义细胞仪基线并跟踪细胞仪性能。单击 “细胞仪 ”按钮并选择 CST 以显示流式细胞仪设置和跟踪工作区。
- 在 5 mL 圆底聚苯乙烯试管中，将三滴 （150 μL） 设置珠加入 0.5 mL 的 1x PBS 中。将磁珠管放在细胞仪上。
- 在“ 设置控制 ”窗口中，选择“ 定义基线”，然后单击“ 运行”。
4. 在转移实验室中使用细胞仪A进行标准化实验
- 使用细胞仪设置和跟踪微球运行性能检查，以验证细胞仪是否运行良好。
- 在软件浏览器窗口中，右键单击细胞仪设置，然后选择应用程序设置以创建工作表。
- 使用未染色的样品，调整FSC，SSC的光电倍增管（PMT）电压和所有荧光参数。FSC： 260;SSC： 460;FITC： 490;PE： 575;BB700： 620;PE-CY7： 640;APC： 600;R718： 620;APC-H7： 620;BV421： 466;V500： 420;和 BV605：505。
- 右键单击实验细胞仪设置，然后选择应用程序设置以保存它。
- 单击 实验 按钮并选择 补偿设置 菜单。然后，选择 创建薪酬控制以 自动添加薪酬控制。
- 记录所有补偿控制磁珠的数据。
- 单击 实验 并选择 补偿设置。然后，自动计算补偿。
- 记录细胞单染色对照的数据。
- 使用CD45RA APC将R718的补偿值修改为15%APC。使用CD19 BB700将APC-H7的补偿值修改为14%BB700。使用CD8 R718将APC-H7的补偿值修改为60%R718。
- 记录CST磁珠的数据。
- 为 CST 亮珠创建目标值模板的全局工作表。
- 使用 FSC/SSC 图，绘制 CST 亮珠的多边形门。获得CST亮珠的10个荧光通道的直方图：FITC，PE，BB700，PE-Cy7，APC，R718，APC-H7，BV421，V500和BV605。在直方图中创建区间门。通过显示间隔门的中位数来创建统计视图。
- 在流式细胞仪上运行样品;总共收集25，000个淋巴细胞。
- 为样本创建分析模板的全局工作表。
- 使用以下示例门控策略：
- 使用 CD45/侧散射面积 （SSC-A） 点图绘制多边形门以识别完整的淋巴细胞群，同时排除碎片。
- 使用 CD3/CD19 点图，绘制一个矩形门以选择 CD3+ T 细胞和 CD19+ B 细胞。
- 使用 CD4/CD8 点图，绘制四门以选择 CD4+ 或 CD8+ T 细胞（分别具有这些标记物高荧光的细胞）。
- 使用 CD45RA/CD27 点图，绘制一个四门将 CD8+ 或 CD4+ T 细胞细分为幼稚细胞 （CD27+CD45RA+）、TCM （CD27+ CD45RA-）、TEM （CD27-CD45RA-） 和 TEMRA （CD27-CD45RA+） 细胞。
- 使用 CD25/CD127 点图，绘制一个四门，将 CD4+ T 细胞细分为 Treg 细胞（CD4+CD25++CD127低）。
- 使用 CD27/IgD 点图，绘制一个四门，将 CD19+ B 细胞细分为幼稚 B 细胞 （CD27-IgD+） 和记忆 B 细胞 （CD27+IgD-）。
- 将实验模板保存在 细胞仪A上。
- 使用 CD-ROM 导出实验模板。
5.将实验模板转移到测试方法实验室的细胞仪B
注意：实验模板包括仪器设置、分析模板和中位荧光强度 （MFI） 的目标值模板。
- 使用 CST 微球进行性能检查，以验证细胞仪是否表现良好。
- 导入实验模板并使用该模板为细胞仪 B 创建实验。
- 使用相同批次的CST磁珠调整每个荧光通道的荧光参数电压，以匹配以前的MFI仪器。
注意：MFI值在±5%以内变化（转印前后光珠的MFI如 表2所示）。 - 如果需要，使用未染色的样品调整FSC的电压。
- 右键单击 实验细胞仪 设置，然后选择应用程序设置以保存 应用程序设置 。
- 使用CD45RA APC将R718的补偿值修改为15%APC。使用CD19 BB700将APC-H7的补偿值修改为24%BB700。使用CD8 R718将APC-H7的补偿值修改为60%R718。
- 在流式细胞仪上运行样品;总共收集25，000个淋巴细胞。
6.在两个细胞仪上获得的实验结果之间的一致性
- 使用单因素方差分析评估仪器之间淋巴细胞亚群的差异（p < 0.05）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图1显示了CST亮珠的目标值模板的全局工作表。使用 FSC/SSC 图绘制多边形门以选择 CST 亮珠。获得CST亮珠的10个荧光通道的直方图：FITC，PE，BB700，PE-Cy7，APC，R718，APC-H7，BV421，V500和BV605。通过显示 表2中直方图门内的中位数来显示每个参数的目标值。细胞仪A和细胞仪B软件中的模板和参数设置截图见 补充图S1。
图 2 显示了仪器标准化后两个仪器之间一个样本的点图。数据证明了使用自动分析模板的不同仪器之间的一致性。在表3中的两种不同仪器型号中比较了六个样品的结果。在两个实验室中测量到15个淋巴亚群的百分比没有显着差异。这些结果表明，采用标准化方法获得了高度可比的数据。来自不同仪器的15个淋巴亚群的百分比显示在补充表S1中。
图 1：CST 亮珠的全局工作表模板。 CST明亮的珠子在FSC与SSC图中被选通。为CST亮珠提供了10个荧光通道的直方图。创建间隔门以包括每个荧光检测器的CST磁珠的明亮微球群。缩写：FSC-A = 前向散射区域;SSC-A = 侧散射区域。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：两种仪器之间一个样本的点阵图比较。 （A）CD45 / SSC-A点图用于门禁淋巴细胞。（B）CD3 / CD19点图用于门控CD3 + T细胞和CD19 + B细胞。（C）CD4 / CD8点图用于识别CD3 + CD8 + T和CD3 + CD4 + T细胞。（D）CD25 / CD127点图用于门Treg细胞（CD4 + CD25 ++ CD127低）。（E）CD4 + T细胞的CD45RA / CD27点图用于门幼稚（CD27 + CD45RA+），TCM（CD27 + CD45RA-），TEM（CD27- CD45RA-）和TEMRA（CD27-CD45RA +）。（F）CD8 + T细胞的CD45RA / CD27点图用于门幼稚（CD27 + CD45RA+），TCM（CD27 + CD45RA-），TEM（CD27- CD45RA-）和TEMRA（CD27-CD45RA+）。（G）CD27 / IgD点图用于门控幼稚B细胞（CD27- IgD +）和记忆B细胞（CD27 + IgD-）。门控策略来自Zhang等人7。缩写：SSC-A = 侧散射区域;TCM = 中央记忆 T 细胞;TEM = 效应记忆 T 细胞;TEMRA = 终末差异效应记忆 T 细胞。请点击此处查看此图的大图。
| 抗体靶标 | 荧光染料 | 克隆 | 货号 | 每次测试的体积（μL） |
| CD4 | FITC | SK3 | 566320 | 5 |
| CD25 | 体育 | M-A251 | 555432 | 20 |
| CD19 | BB700 | HIB19 | 745907 | 5 |
| 免疫球蛋白酶 | PE-CY7 | IA6-2 | 561314 | 5 |
| CD45RA | 装甲运兵车 | HI100 | 550855 | 20 |
| CD8 | R718 | G42-8 | 751953 | 5 |
| CD3 | APC-H7 | SK7 | 560176 | 5 |
| CD127 | BV421 | 希尔-7R-M21 | 562436 | 5 |
| CD45 | V500型 | HI30 | 560777 | 5 |
| CD27 | BV605 | L128 | 562656 | 5 |
表1：用于流式细胞术分析的抗体体积和偶联荧光团信息。 缩写：BV = 灿烂的紫罗兰色;BB = 亮蓝色;FITC = 异硫氰酸荧光素;PE = 藻红蛋白;APC = 别藻蓝蛋白。
| 亮珠的小额信贷指标 | |||
| 渠道 | 细胞仪 A | 细胞仪B | MFI 中的 %差异 |
| 森林管理委员会 | 22,133 | 22,689 | 2.51% |
| 南南合作 | 1,51,361 | 1,51,261 | -0.07% |
| FITC | 9,956 | 9,964 | 0.08% |
| 体育 | 30,877 | 31,264 | 1.25% |
| BB700 | 19,265 | 19,440 | 0.91% |
| PE-CY7 | 14,406 | 14,375 | -0.22% |
| 装甲运兵车 | 64,494 | 64,340 | -0.24% |
| R718 | 41,271 | 41,456 | 0.45% |
| APC-H7 | 90,666 | 90,837 | 0.19% |
| BV421 | 9,882 | 9,776 | -1.07% |
| V500型 | 19,680 | 19,425 | -1.30% |
| BV605 | 10,794 | 10,356 | -4.06% |
表2：转印前后光珠的MFI。 缩写：MFI = 平均荧光强度;BV = 明亮的紫色;BB = 亮蓝色;FITC = 异硫氰酸荧光素;PE = 藻红蛋白;APC = 别藻蓝蛋白。
| 百分比平均值 | 百分比平均值 | ||
| 细胞仪 A （n=6） | 细胞仪 B （n=6） | P 值 | |
| T细胞 | 71.30 | 74.73 | 0.19 |
| CD4+ T 细胞 | 48.63 | 47.75 | 0.82 |
| CD4+ TCM | 30.68 | 28.20 | 0.06 |
| CD4+ 天真 | 57.60 | 58.25 | 0.90 |
| CD4+ TEM | 8.98 | 10.52 | 0.51 |
| CD4+ TEMRA | 2.73 | 3.07 | 0.81 |
| 特雷格 | 9.07 | 8.57 | 0.74 |
| CD8+ T 细胞 | 40.63 | 40.45 | 0.98 |
| CD8+ TCM | 16.83 | 14.78 | 0.75 |
| CD8+ 天真 | 49.08 | 47.70 | 0.80 |
| CD8+ TEM | 6.35 | 8.20 | 0.51 |
| D4+ TEMRA | 27.75 | 29.30 | 0.77 |
| B细胞 | 13.88 | 13.20 | 0.84 |
| 天真 B | 67.88 | 70.38 | 0.84 |
| 内存 B | 11.88 | 11.80 | 0.95 |
表3：评估仪器之间淋巴细胞亚群的差异。 p > 0.05表示无显著差异。缩写：TCM = 中央记忆 T 细胞;TEM = 效应记忆 T 细胞;TEMRA = 终末分化的效应记忆 T 细胞。
补充表S1：来自不同仪器的六个样品中淋巴细胞亚群的百分比。请点击此处下载此文件。
补充图S1：流式细胞仪A和细胞仪B软件中的模板和参数设置截图。 （A） 模板的 XML 文件。（B） 模板的截图。（C） 细胞仪 A 中的参数设置。（D） 细胞仪 B 中的参数设置。 请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
外周血淋巴细胞亚群的免疫分型有助于了解儿童接种疫苗后细胞介导的适应性免疫的变化。在临床应用中，会出现意外情况，如未能及时检测样本或更换流式细胞仪;因此，需要快速标准化的方法，以促进不同实验室中流式细胞仪之间的转移9，10，11。在这里，我们描述了一种快速标准化的方法，以确保不同仪器之间的结果一致。采用标准化方法监测接种后儿童外周血中的免疫细胞，在两个实验室获得了一致的结果。标准化方法在BD Canto和LSRFortessa之间建立。该协议也适用于FACSCelesta，FACSymphony A5和FACSAria II。与其他标准化方法2，3相比，该标准方法不需要使用第三方软件即可获得数据的一致性。它仅利用Diva软件的特性，创建包含目标值位置和自动分析的模板模块，实现不同仪器之间的转移方法，降低了数据分析的要求。该方法节省时间，易于操作，并且不需要开发自动浇口工具。
本研究中流式细胞术方案的标准化是通过在一台仪器上创建一个实验模板来实现的，该模板包括细胞术设置、自动数据分析和目标位置工作表。然后，其他仪器使用CST磁珠调整参数电压以达到目标值。要完成不同流式细胞仪仪器的成功标准化，应考虑几个重要特征。首先，标准化方法要求仪器使用相同的软件系统，以便实验模板的XML文件可以在仪器的软件之间共享。其次，两个仪器的配置名称应相同，参数的名称也应相同。第三，CST磁珠应在规定的电压条件下收集，无需补偿作为目标值。鉴于不同仪器的激光功率和PMT灵敏度不同，有必要使用相同批号的CST磁珠根据其他仪器上的目标值调整电压参数，并确保MFI值在±5%以内。第四，仪器的日常质量控制评估也非常重要。如果一台仪器未通过评估，则必须清洁流通池是否有气泡或进行激光校准。最后，为了减少制备程序引起的差异，在进行此类大型多中心研究时，除了转移设置以便能够在不同实验室中分析样品外，还应以相同的方式制备样品。然而，在该协议中，为了更好地识别记忆B细胞，仍有面板优化的空间。记忆B细胞在2岁儿童中的频率相对较低，这些细胞表面的CD27表达是弥漫性的。如果用比BV605更亮的荧光素代替标记物，这可能更好地识别记忆B细胞。
但是，应注意一些限制。首先，在该实验中使用两台流式细胞仪进行标准化;后续实验中应包括其他仪器模型。其次，使用细胞表面染色法来区分和确定淋巴细胞亚群，并且不涉及检测更多的细胞内细胞因子。第三，我们没有比较两台流式细胞仪标准化过程的实验结果。
这种标准化方法的优点是，如果软件相同，不同的仪器可以共享实验模板的XML文件。实验模板包含固定目标值模板，只有在仪器之间将PMT电压调整到目标值后才能获得数据。此外，实验模板还包含自动浇口策略分析。获得数据后，将生成自动分析报告。该程序易于操作，并减少了手动分析引起的结果差异。这种标准化方法可用于评估接种JE疫苗的儿童全血淋巴细胞亚群的变化，使用实验室的不同仪器，实现确保研究项目在多个中心一致执行的目标。在这项研究中，我们旨在通过表面染色测试标准化方法的可转换性，其成功将为以后的细胞内染色实践奠定基础。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
RW获得北京自然科学基金（第7222059号），国家自然科学基金（第82002130号），XZ获得中国医学科学院医学科学创新基金（编号：2019-I2M-5-026）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
