Summary
В этом исследовании был разработан метод, облегчающий перенос экспериментальных настроек и шаблонов анализа между двумя проточными цитометрами в двух лабораториях для обнаружения лимфоцитов у детей, вакцинированных японским энцефалитом. Метод стандартизации экспериментов с проточным цитометром позволит эффективно проводить исследовательские проекты в нескольких центрах.
Abstract
Все большему числу лабораторий необходимо собирать данные с нескольких проточных цитометров, особенно для исследовательских проектов, выполняемых в нескольких центрах. Проблемы использования двух проточных цитометров в разных лабораториях включают отсутствие стандартизированных материалов, проблемы совместимости программного обеспечения, несоответствия в настройке прибора и использование разных конфигураций для разных проточных цитометров. Для проведения стандартизированного эксперимента по проточной цитометрии для достижения согласованности и сопоставимости экспериментальных результатов в нескольких центрах был создан быстрый и осуществимый метод стандартизации для переноса параметров между различными проточными цитометрами.
Методы, разработанные в этом исследовании, позволили перенести экспериментальные настройки и шаблоны анализа между двумя проточными цитометрами в разных лабораториях для обнаружения лимфоцитов у детей, вакцинированных против японского энцефалита (ЯЭ). Между двумя цитометрами была получена постоянная интенсивность флуоресценции с использованием стандартных флуоресцентных шариков для установления настроек цитометра. Сопоставимые результаты были получены в двух лабораториях с разными типами приборов. Используя этот метод, мы можем стандартизировать анализ для оценки иммунной функции детей, вакцинированных ЯЭ, в разных лабораториях с разными инструментами, уменьшить различия в данных и результатах между проточными цитометрами в нескольких центрах и обеспечить осуществимый подход к взаимной аккредитации результатов лабораторных исследований. Метод стандартизации экспериментов с проточным цитометром обеспечит эффективное выполнение исследовательских проектов в нескольких центрах.
Introduction
Стандартизация проточной цитометрии полезна для сопоставимости результатов, полученных от разных цитометров в разных лабораториях и исследовательских центрах, и способствует взаимному признанию результатов для повышения эффективности работы. Все большее число сценариев требует стандартизации. В процессе разработки лекарств важна стандартизация проточной цитометрии, поскольку разработанный и валидированный анализ будет поддерживать весь процесс разработки лекарств от доклинического до клинического анализа. Проточные цитометрические методы часто передаются между фармацевтической промышленностью и сотрудничающими лабораториями1. Кроме того, важно получить сопоставимые данные многоцентровых клинических исследований. Например, в рамках многоцентрового проекта клинических исследований системных аутоиммунных заболеваний был разработан рабочий процесс стандартизации для получения сопоставимых данных многоцентровой проточной цитометрии2.
Стандартизация методов проточной цитометрии является сложной задачей. Проблемы, с которыми сталкиваются лаборатории, связаны с отсутствием стандартизированных материалов, проблемами совместимости программного обеспечения, несоответствиями в настройке приборов и использованием различных конфигураций между различными проточными цитометрами и расходящимися стратегиями стробирования между центрами 3,4. Поэтому важно провести анализ пробелов между лабораториями. Доступ к образцам, системы качества, квалификация персонала и конфигурация приборов должны быть проверены, чтобы убедиться в соблюдении требований.
В настоящее время у детей, привитых вакциной против японского энцефалита (ЯЭ), значительно снижается заболеваемость ЯЭ5. Мониторинг иммунных клеток периферической крови может помочь понять изменения клеточно-опосредованного адаптивного иммунитета после вакцинации и корреляцию между изменениями в подмножествах лимфоцитов периферической крови и эффектами вакцинации. Из-за ограниченной стабильности образцов цельной крови оценка эффективности вакцины часто проводится в нескольких центрах. Для этого анализа мы определили наивные CD8+ или CD4+ Т-клетки как CD27+ CD45RA+, Т-клетки центральной памяти (T CM) как CD27+ CD45RA-, эффекторные Т-клетки памяти (TEM) как CD27-CD45RA-, а терминально дифференцированные эффекторные Т-клетки памяти (TEMRA) как CD27-CD45RA+. CD19+ В-клетки могут быть разделены на популяции, которые экспрессируют CD27 по сравнению с IgD 6,7, наивные В-клетки экспрессируют CD27n В-клетки памяти (mBCs) могут быть идентифицированы на основе экспрессии IgD6, а регуляторные Т-клетки (Tregs) могут быть идентифицированы как CD4 + CD25 ++ CD127с низким 8. Для проведения стандартизированного эксперимента по проточной цитометрии для достижения согласованности и сопоставимости экспериментальных результатов в нескольких центрах был создан быстрый и осуществимый метод стандартизации для облегчения передачи протоколов между различными проточными цитометрами для обнаружения лимфоцитов в цельной крови детей, вакцинированных ЯЭ. Шесть здоровых детей (2 года) были набраны из Пекинской детской больницы Столичного медицинского университета. После первичной и бустерной вакцинации живой аттенуированной вакциной JE SA14-14-2 менее чем за 6 месяцев до этого у добровольцев были взяты образцы периферической крови. Высокосопоставимые данные были получены из различных инструментов в соответствии со стандартизированными процедурами, что полезно для многоцентровых оценок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование было одобрено Комитетом по этике Пекинской детской больницы Столичного медицинского университета (номер одобрения: 2020-k-85). Информированное согласие людей было отменено, поскольку в этом исследовании использовались только остаточные образцы после клинических испытаний. В этом исследовании участвуют две лаборатории. В передаточной лаборатории был разработан стандартизированный метод с использованием одного проточного цитометра. Цитометр в этой лаборатории в дальнейшем именуется цитометром А. Лаборатория метода испытаний - это лаборатория, которая получает методы с использованием другого проточного цитометра, и цитометр в этой лаборатории в дальнейшем именуется цитометром B.
1. Сбор образцов периферической крови и подготовка клеток
- Собирают образцы периферической крови (2 мл) у детей, вакцинированных ЯЭ, и невакцинированных детей в 2-антикоагулянтные пробирки ЭДТА-К с помощью стандартной венепункции.
- Смешайте образец цельной крови, перевернув пробирки вверх дном в 10 раз. Добавьте 100 мкл цельной крови в пробирку размером 12 мм x 75 мм. Сделайте каждый образец в двух экземплярах.
- Добавьте 10 мкл блестящего буфера для окрашивания (буфер BV) в тюбик размером 12 мм x 75 мм. Добавьте 5 мкл каждого антитела (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; коэффициент разведения: 1:20) и 20 мкл антитела (CD25, CD45RA; коэффициент разведения: 1:5) в буфер BV. Осторожно вихряйте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы и информация о реагентах антител приведены в таблице 1. - Добавьте коктейль антител в пробирку с образцом цельной крови. Осторожно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте.
- Разбавьте 10-кратный лизирующий раствор 1:10 дистиллированной водой, чтобы приготовить 1-кратный лизирующий раствор. Лизируют образцы крови, добавляя 2 мл 1x лизирующего раствора. Осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре.
- Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин и сцедить надосадочную жидкость.
- Ресуспендируют гранулу в 2 мл 1x PBS, центрифугу при 300 × г в течение 5 мин и декантируют надосадочную жидкость.
- Ресуспендировать гранулы в 0,5 мл 1x PBS и тщательно перемешать. Хранить при температуре от 2 °C до 8 °C. Отправьте образцы в две лаборатории для проточного цитометрического анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный контрольный образец и одноцветный контроль клеток должны обрабатываться одновременно.
2. Подготовка компенсационных бусин и одинарного контроля
- Этикетка V500-анти-CD45 одноокрашенный, APC-H7-анти-CD3 одноокрашенный, FITC-анти-CD4 одноокрашенный, R718-анти-CD8 одноокрашенный, BV605-анти-CD27 одноокрашенный, APC-анти-CD45RA одноокрашенный, PE-анти-CD25 одноокрашенный, BV421-анти-CD127 одноокрашенный, BB700-анти-CD19 одноокрашенный и PE-CY7-анти-IgD одноокрашенный.
- Добавьте 100 мкл 1x буфера с фосфатным буфером (DPBS) Dulbecco, содержащего 1% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), в пробирку из полистирола с круглым дном.
- Добавьте 50 мкл отрицательных шариков и 50 мкл антимышиных шариков Ig, κ в каждую трубку и вихрь.
- Добавьте 2 мкл каждого меченого антитела (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) в однотонную пробирку. Аккуратно перемешайте смесь и инкубируйте в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре (от 20 ° C до 25 ° C).
- Ресуспендируют шарики в 2 мл 1x PBS, центрифугу при 300 × г в течение 5 мин и декантируют надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте шарики в 0,5 мл 1x PBS и тщательно перемешайте. Хранить при температуре от 2 °C до 8 °C.
3. Использование одинаковых названий конфигураций на разных цитометрах в двух лабораториях
- Создайте новую конфигурацию в программном обеспечении цитометра А. Нажмите кнопку « Цитометр » и выберите «Просмотреть конфигурации», чтобы отобразить окно конфигурации.
- В списке конфигураций щелкните правой кнопкой мыши папку базовых конфигураций, выберите пункт Создать папку и переименуйте ее.
- Щелкните правой кнопкой мыши базовую конфигурацию и выберите «Копировать».
- Щелкните правой кнопкой мыши новую папку и вставьте базовую конфигурацию, чтобы создать новую конфигурацию. Переименуйте новую конфигурацию в "Standardized Method Transfer".
- Перетащите имя параметра, например FITC, из списка Параметры на соответствующий детектор (530/30).
- Измените дополнительные параметры (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 и BV605) в новой конфигурации.
- Следуйте этому методу, чтобы создать новую конфигурацию на другой модели проточного цитометра, используя то же имя «Стандартизированный перенос метода». Убедитесь, что конфигурация включает одинаковые параметры для каждого датчика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы успешно идентифицировать шаблон эксперимента на двух разных моделях проточных цитометров, убедитесь, что имя совпадает. - В конфигурациях цитометра используйте шарики настройки и отслеживания цитометра (CST) для определения базового уровня цитометра и отслеживания производительности цитометра. Нажмите кнопку «Цитометр » и выберите CST , чтобы отобразить рабочее пространство настройки и отслеживания цитометра.
- Добавьте три капли (150 мкл) установочных шариков в 0,5 мл 1x PBS в пробирке из полистирола с круглым дном объемом 5 мл. Поместите пробирку с шариками на цитометр.
- В окне " Управление установкой " выберите "Определить базовую линию" и нажмите кнопку "Выполнить".
4. Стандартизация эксперимента с использованием цитометра А в передающей лаборатории
- Запустите проверку производительности с помощью настройки цитометра и контрольных шариков, чтобы убедиться, что цитометр работает хорошо.
- В окне браузера программного обеспечения щелкните правой кнопкой мыши настройки цитометра и выберите « Параметры приложения », чтобы создать рабочий лист.
- Используя неокрашенный образец, отрегулируйте напряжение фотоумножителя (ФЭУ) FSC, SSC и всех параметров флуоресценции. КФС: 260; КСК: 460; ФИТК: 490; ПЭ: 575; ВВ700: 620; PE-CY7: 640; БТР: 600; Р718: 620; БТР-Н7: 620; БВ421: 466; В500: 420; и BV605: 505.
- Щелкните правой кнопкой мыши параметры экспериментального цитометра и выберите параметры приложения , чтобы сохранить его.
- Нажмите на кнопку эксперимента и выберите меню настройки компенсации . Затем выберите Создать элементы управления компенсацией, чтобы автоматически добавить элементы управления компенсацией .
- Записывайте данные для всех контрольных шариков компенсации.
- Нажмите на эксперимент и выберите настройку компенсации. Затем рассчитайте компенсацию автоматически.
- Запись данных для элементов управления с одним окрашиванием.
- Используйте CD45RA APC для изменения значения компенсации R718 до 15% APC. Используйте CD19 BB700 для изменения значения компенсации APC-H7 до 14% BB700. Используйте CD8 R718 для изменения значения компенсации APC-H7 до 60% R718.
- Запишите данные для бусин CST.
- Создайте глобальный рабочий лист шаблона целевого значения для ярких бусин CST.
- Используя график FSC/SSC, нарисуйте полигональные ворота для ярких бусин CST. Получите графики гистограммы 10 каналов флуоресценции для ярких шариков CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 и BV605. Создайте интервальные ворота на графиках гистограммы. Создайте представление статистики, показав медиану интервальных вентилей.
- Запустите образцы на проточном цитометре; Соберите в общей сложности 25 000 лимфоцитов.
- Создайте глобальный лист шаблона анализа для образцов.
- Используйте следующий пример стратегии стробирования:
- Используя точечную диаграмму CD45/боковой зоны рассеяния (SSC-A), нарисуйте полигональные ворота, чтобы идентифицировать популяцию интактных лимфоцитов, исключив при этом мусор.
- Используя точечную диаграмму CD3/CD19, нарисуйте прямоугольные ворота, чтобы выбрать CD3+ Т-клетки и CD19+ В-клетки.
- Используя точечный график CD4/CD8, нарисуйте квадратный затвор, чтобы выбрать CD4+ или CD8+ Т-клетки (клетки с высокой флуоресценцией для этих маркеров соответственно).
- Используя точечную диаграмму CD45RA/CD27, нарисуйте четыре затвора для разделения CD8+ или CD4+ Т-клеток на наивные (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA-) и TEMRA (CD27-CD45RA+) клетки.
- Используя точечную диаграмму CD25/CD127, нарисуйте четыре затвора, чтобы разделить CD4+ Т-клетки на клетки Treg (CD4+CD25++CD127низкий).
- Используя точечный график CD27 / IgD, нарисуйте четыре ворота, чтобы разделить CD19+ В-клетки на наивные В-клетки (CD27-IgD+) и В-клетки памяти (CD27+IgD-).
- Сохраните экспериментальный шаблон на цитометре А.
- Используйте компакт-диск для экспорта экспериментального шаблона.
5. Перенос экспериментального шаблона на цитометр Б в лаборатории методов испытаний
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальный шаблон включает в себя настройки прибора, шаблон анализа и шаблон целевого значения медианной интенсивности флуоресценции (MFI).
- Проведите проверку производительности с помощью шариков CST, чтобы убедиться, что цитометр работает хорошо.
- Импортируйте экспериментальный шаблон и создайте эксперимент для цитометра B, используя шаблон.
- Используйте одну и ту же партию шариков CST для регулировки напряжений флуоресцентных параметров для каждого флуоресцентного канала в соответствии с предыдущим прибором MFI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения MFI варьируются в пределах ±5% (MFI ярких шариков до и после переноса показаны в таблице 2). - При необходимости отрегулируйте напряжение для FSC, используя неокрашенный образец.
- Щелкните правой кнопкой мыши настройки экспериментального цитометра и выберите настройки приложения, чтобы сохранить настройки приложения .
- Используйте CD45RA APC для изменения значения компенсации R718 до 15% APC. Используйте CD19 BB700 для изменения значения компенсации APC-H7 до 24% BB700. Используйте CD8 R718 для изменения значения компенсации APC-H7 до 60% R718.
- Запустите образцы на проточном цитометре; Соберите в общей сложности 25 000 лимфоцитов.
6. Согласованность экспериментальных результатов, полученных на двух цитометрах
- Оцените различия в подмножествах лимфоцитов между инструментами с помощью односторонней ANOVA (p < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показан глобальный рабочий лист шаблона целевого значения для ярких бусин CST. Используя график FSC/SSC, рисуются полигональные ворота для выбора ярких бусин CST. Для ярких шариков CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 и BV605 были получены графики гистограммы 10 каналов флуоресценции. Целевое значение для каждого параметра отображается путем отображения медианы в воротах гистограммы в таблице 2. Скриншоты шаблонов и настроек параметров в программном обеспечении цитометра А и цитометра В показаны на дополнительном рисунке S1.
На рисунке 2 показаны точечные графики одного образца между двумя приборами после стандартизации прибора. Данные демонстрируют согласованность между различными инструментами с использованием шаблона автоматического анализа. Результаты шести образцов сравнивались по двум различным моделям приборов в таблице 3. В двух лабораториях не было измерено существенных различий в процентах 15 лимфоидных подмножеств. Эти результаты показывают, что высокосопоставимые данные были получены в соответствии со стандартизированным методом. Процентное содержание 15 лимфоидных подмножеств из разных инструментов показано в дополнительной таблице S1.
Рисунок 1: Глобальный шаблон рабочего листа для ярких бусин CST. Яркие бусины CST закрыты на графике FSC и SSC. Представлены графики гистограммы 10 каналов флуоресценции для ярких бусин CST. Интервальные затворы созданы для включения яркой популяции шариков CST для каждого флуоресцентного детектора. Сокращения: FSC-A = область прямого рассеяния; SSC-A = площадь бокового рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сравнение точечных графиков из одного образца между двумя инструментами. (A) Точечный график CD45 / SSC-A используется для ворот лимфоцитов. (B) Точечный график CD3/CD19 используется для затвора CD3+ Т-клеток и CD19+ В-клеток. (C) Точечный график CD4/CD8 используется для идентификации CD3+ CD8+ Т-клеток и CD3+ CD4+ Т-клеток. (D) Точечный график CD25/CD127 используется для затвора Treg-ячеек (CD4+CD25++CD127низкий). (E) Точечный график CD45RA/CD27 для CD4+ Т-клеток используется для затвора наивных (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA-) и TEMRA (CD27-CD45RA+). (F) Точечный график CD45RA/CD27 для CD8+ Т-клеток используется для затворов наивных (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA-) и TEMRA (CD27-CD45RA+). (G) Точечный график CD27 / IgD используется для затвора наивных В-клеток (CD27-IgD+) и В-клеток памяти (CD27+ IgD-). Стратегия стробирования взята из Zhang et al.7. Сокращения: SSC-A = площадь бокового рассеяния; TCM = Т-ячейки центральной памяти; TEM = эффекторные Т-клетки памяти; TEMRA = терминально дифференциальные эффекторные Т-клетки памяти. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Мишень антител | Флуорохром | Клон | Номер в каталоге | Объем на тест (мкл) |
| СД4 | ФИТК | СК3 | 566320 | 5 |
| КД25 | ЧП | М-А251 | 555432 | 20 |
| КД19 | ВВ700 | ХИБ19 | 745907 | 5 |
| IgD | ПЭ-CY7 | ИА6-2 | 561314 | 5 |
| КД45РА | БТР | ХИ100 | 550855 | 20 |
| СД8 | Р718 | Г42-8 | 751953 | 5 |
| СД3 | БТР-Н7 | СК7 | 560176 | 5 |
| КД127 | БВ421 | ХИЛ-7Р-М21 | 562436 | 5 |
| КД45 | В500 | HI30 | 560777 | 5 |
| CD27 | БВ605 | Л128 | 562656 | 5 |
Таблица 1: Объемы антител и информация о конъюгированных флуорофорах для проточного цитометрического анализа. Сокращения: BV = блестящий фиолетовый; BB = блестящий синий; FITC = изотиоцианат флуоресцеина; ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин.
| МФИ из ярких бусин | |||
| Канал | Цитометр А | Цитометр B | %Diff в MFI |
| КФС | 22,133 | 22,689 | 2.51% |
| ОЦО | 1,51,361 | 1,51,261 | -0.07% |
| ФИТК | 9,956 | 9,964 | 0.08% |
| ЧП | 30,877 | 31,264 | 1.25% |
| ВВ700 | 19,265 | 19,440 | 0.91% |
| ПЭ-CY7 | 14,406 | 14,375 | -0.22% |
| БТР | 64,494 | 64,340 | -0.24% |
| Р718 | 41,271 | 41,456 | 0.45% |
| БТР-Н7 | 90,666 | 90,837 | 0.19% |
| БВ421 | 9,882 | 9,776 | -1.07% |
| В500 | 19,680 | 19,425 | -1.30% |
| БВ605 | 10,794 | 10,356 | -4.06% |
Таблица 2: МФИ светлых бусин до и после переноса. Сокращения: MFI = средняя интенсивность флуоресценции; BV = блестящий фиолетовый; BB = блестящий синий; FITC = изотиоцианат флуоресцеина; ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин.
| Среднее значение процентов | Среднее значение процентов | ||
| Цитометр А (n=6) | Цитометр B (n=6) | Значение P | |
| Т-клетки | 71.30 | 74.73 | 0.19 |
| CD4+ Т-клетки | 48.63 | 47.75 | 0.82 |
| CD4+ ТСМ | 30.68 | 28.20 | 0.06 |
| CD4+ наивный | 57.60 | 58.25 | 0.90 |
| CD4+ ТЭМ | 8.98 | 10.52 | 0.51 |
| CD4+ ТЭМРА | 2.73 | 3.07 | 0.81 |
| Трег | 9.07 | 8.57 | 0.74 |
| CD8+ Т-клетки | 40.63 | 40.45 | 0.98 |
| CD8+ ТСМ | 16.83 | 14.78 | 0.75 |
| CD8+ наивный | 49.08 | 47.70 | 0.80 |
| CD8+ ТЭМ | 6.35 | 8.20 | 0.51 |
| D4+ TEMRA | 27.75 | 29.30 | 0.77 |
| В-клетки | 13.88 | 13.20 | 0.84 |
| наивный Б | 67.88 | 70.38 | 0.84 |
| Память B | 11.88 | 11.80 | 0.95 |
Таблица 3: Оценка различий в подмножествах лимфоцитов между инструментами. p > 0,05 указывает на отсутствие существенной разницы. Сокращения: TCM = Т-клетки центральной памяти; TEM = эффекторные Т-клетки памяти; TEMRA = терминально дифференцированные эффекторные Т-клетки памяти.
Дополнительная таблица S1: Процент подмножеств лимфоцитов в шести образцах из разных инструментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S1: Скриншоты шаблонов и настроек параметров в программном обеспечении цитометра А и цитометра В. (A) XML-файл шаблонов. (B) Скриншоты шаблонов. (C) Настройки параметров в цитометре A. (D) Настройки параметров в цитометре B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Иммунофенотипирование подмножеств лимфоцитов периферической крови может помочь понять изменения клеточно-опосредованного адаптивного иммунитета после вакцинации у детей. В клинических применениях возникают непредвиденные ситуации, такие как несвоевременное обнаружение образцов или замена проточного цитометра; Поэтому необходимы быстрые стандартизированные методы, облегчающие перенос между проточными цитометрами в разных лабораториях 9,10,11. Здесь мы описываем быстрый стандартизированный метод для обеспечения согласованных результатов между различными инструментами. Стандартизированный метод использовался для мониторинга иммунных клеток в периферической крови детей после вакцинации, и в двух лабораториях были получены согласованные результаты. Стандартизированный метод был установлен между BD Canto и LSRFortessa. Протокол также подходит для FACSCelesta, FACSymphony A5 и FACSAria II. По сравнению с другими методами стандартизации2,3, этот стандартный метод не требует использования стороннего программного обеспечения для получения согласованности данных. Он использует только характеристики программного обеспечения Diva для создания шаблонного модуля, содержащего целевую позицию значения и автоматический анализ, для реализации метода передачи между различными инструментами и снижает потребность в анализе данных. Метод экономит время, прост в эксплуатации и не требует разработки автоматизированного литникового инструмента.
Стандартизация протокола проточной цитометрии в этом исследовании достигается путем создания экспериментального шаблона на одном приборе, который включает настройки цитометрии, автоматический анализ данных и рабочий лист по положению мишени. Затем другие приборы используют шарики CST для регулировки напряжения параметров для достижения целевого значения. Для успешной стандартизации различных приборов проточного цитометра следует учитывать несколько важных особенностей. Во-первых, стандартизированный метод требует, чтобы приборы использовали одну и ту же программную систему, так что XML-файл шаблона эксперимента может совместно использоваться программным обеспечением приборов. Во-вторых, два инструмента должны иметь одинаковое имя конфигурации, и параметры также должны быть названы одинаково. В-третьих, шарики CST должны собираться при заданных условиях напряжения без компенсации в качестве целевых значений. Учитывая различную мощность лазера и чувствительность к ФЭУ у разных приборов, необходимо использовать шарики CST из одного и того же номера партии для регулировки параметров напряжения в соответствии с целевыми значениями на других приборах и обеспечения того, чтобы значение MFI находилось в пределах ±5%. В-четвертых, очень важны также ежедневные оценки контроля качества инструментов. Если один прибор не проходит оценку, проточная ячейка должна быть очищена от пузырьков или подвергнута лазерной калибровке. Наконец, чтобы уменьшить различия, вызванные процедурами подготовки, образцы должны быть подготовлены идентичным образом при проведении таких крупных многоцентровых исследований, в дополнение к переносу настроек, чтобы иметь возможность анализировать образцы в разных лабораториях. Тем не менее, все еще есть место для оптимизации панели для лучшей идентификации В-ячеек памяти в этом протоколе. Частота В-клеток памяти относительно низкая у 2-летних детей, а экспрессия CD27 на поверхности этих клеток диффузна. Это может лучше идентифицировать В-клетки памяти, если маркер заменить более ярким флуоресцеином, чем BV605.
Однако следует отметить некоторые ограничения. Во-первых, для стандартизации в этом эксперименте использовались два проточных цитометра; В последующие эксперименты должны быть включены дополнительные модели приборов. Во-вторых, метод окрашивания клеточной поверхности использовался для различения и определения подмножеств лимфоцитов и не включал обнаружение большего количества внутриклеточных цитокинов. В-третьих, мы не сравнивали экспериментальные результаты с процессом стандартизации двух проточных цитометров и без него.
Преимущество этого стандартизированного метода заключается в том, что различные инструменты могут совместно использовать XML-файл шаблона эксперимента, если программное обеспечение одно и то же. Экспериментальный шаблон содержит шаблон фиксированных целевых значений, и данные могут быть получены только после настройки напряжений ФЭУ на целевые значения между приборами. Кроме того, экспериментальный шаблон также содержит автоматический анализ стратегии ворот. Как только данные получены, создается автоматический отчет об анализе. Эта процедура проста в эксплуатации и уменьшает различия в результатах, вызванные ручным анализом. Этот стандартизированный метод может быть использован для оценки изменений в подмножествах лимфоцитов в цельной крови детей, вакцинированных ЯЭ, с использованием различных инструментов в разных лабораториях, достигая цели обеспечения последовательного выполнения исследовательского проекта в нескольких центрах. В этом исследовании мы стремимся проверить обратимость стандартизированного метода путем поверхностного окрашивания, и его успех заложит основу для практики последующего внутриклеточного окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
RW был поддержан Пекинским фондом естественных наук, Китай (No 7222059), Национальным фондом естественных наук Китая (No 82002130), XZ был поддержан Инновационным фондом медицинских наук CAMS (No 2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
