Summary
I denna studie utvecklades en metod för att underlätta överföring av experimentella inställningar och analysmallar mellan två flödescytometrar i två laboratorier för detektion av lymfocyter hos japanska encefalitvaccinerade barn. Standardiseringsmetoden för flödescytometerexperimenten gör det möjligt att effektivt genomföra forskningsprojekt i flera centra.
Abstract
Ett ökande antal laboratorier behöver samla in data från flera flödescytometrar, särskilt för forskningsprojekt som utförs över flera centra. Utmaningarna med att använda två flödescytometrar i olika laboratorier inkluderar bristen på standardiserade material, programvarukompatibilitetsproblem, inkonsekvenser i instrumentinställningar och användningen av olika konfigurationer för olika flödescytometrar. För att etablera ett standardiserat flödescytometriexperiment för att uppnå konsistens och jämförbarhet av experimentella resultat över flera centra etablerades en snabb och genomförbar standardiseringsmetod för att överföra parametrar över olika flödescytometrar.
Metoderna som utvecklades i denna studie möjliggjorde överföring av experimentella inställningar och analysmallar mellan två flödescytometrar i olika laboratorier för detektion av lymfocyter hos japanska encefalit (JE)-vaccinerade barn. En konsekvent fluorescensintensitet erhölls mellan de två cytometrarna med hjälp av fluorescensstandardpärlor för att fastställa cytometerinställningarna. Jämförbara resultat erhölls i två laboratorier med olika typer av instrument. Med hjälp av denna metod kan vi standardisera analys för utvärdering av immunfunktionen hos JE-vaccinerade barn i olika laboratorier med olika instrument, minska skillnaderna i data och resultat mellan flödescytometrar i flera centra och ge ett genomförbart tillvägagångssätt för ömsesidig ackreditering av laboratorieresultat. Standardiseringsmetoden för flödescytometerexperiment kommer att säkerställa ett effektivt utförande av forskningsprojekt över flera centra.
Introduction
Standardiseringen av flödescytometri är användbar för jämförbarheten av resultat erhållna från olika cytometrar över olika laboratorier och studiecentra och bidrar till ömsesidigt erkännande av resultat för att förbättra arbetseffektiviteten. Allt fler scenarier kräver standardisering. Under läkemedelsutvecklingsprocessen är standardisering av flödescytometri viktig, eftersom en utvecklad och validerad analys kommer att stödja hela läkemedelsutvecklingsprocessen från preklinisk till klinisk analys. Flödescytometriska metoder överförs ofta mellan läkemedelsindustrin och samarbetande laboratorier1. Dessutom är det viktigt att få jämförbara data från multicentriska kliniska studier. Till exempel utvecklades ett standardiseringsarbetsflöde i Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project för att erhålla jämförbara data från multicentrisk flödescytometri2.
Standardiseringen av flödescytometrimetoder är utmanande. De utmaningar som upplevs i laboratorier tillskrivs bristen på standardiserade material, programvarukompatibilitetsproblem, inkonsekvenser i instrumentinställningar och användningen av olika konfigurationer mellan olika flödescytometrar och divergerande grindstrategier mellan centren 3,4. Därför är det viktigt att göra en gapanalys mellan laboratorier. Provåtkomst, kvalitetssystem, personalkvalifikationer och instrumentkonfiguration måste granskas för att säkerställa att kraven uppfylls.
För närvarande har barn som vaccinerats med vaccinet mot japansk encefalit (JE) en signifikant minskad förekomst av JE5. Övervakning av perifera blodimmunceller kan hjälpa till att förstå förändringarna i cellmedierad adaptiv immunitet efter vaccination och korrelationen mellan förändringarna i perifera blodlymfocytundergrupper och effekterna av vaccination. På grund av den begränsade stabiliteten hos helblodprover utförs ofta utvärderingar av vaccinets effektivitet i flera centra. För denna analys definierade vi naiva CD8 + eller CD4 + T-celler som CD27 + CD45RA +, centrala minnes-T-celler (T CM) som CD27 + CD45RA-, effektorminnes-T-celler (TEM) som CD27- CD45RA-, och terminalt differentierade effektorminnes-T-celler (TEMRA) som CD27- CD45RA +. CD19 + B-celler kan separeras i populationer som uttrycker CD27 kontra IgD 6,7, naiva B-celler uttrycker CD27n-minne B-celler (mBC) kan identifieras baserat på uttrycket av IgD6 och regulatoriska T-celler (Tregs) kan identifieras som CD4 + CD25 + + CD127låg 8. För att etablera ett standardiserat flödescytometriexperiment för att uppnå konsistens och jämförbarhet av experimentella resultat i flera centra etablerades en snabb och genomförbar standardiseringsmetod för att underlätta överföringen av protokoll över olika flödescytometrar för detektion av lymfocyter i helblod hos JE-vaccinerade barn. Sex friska barn (2 år) rekryterades från Beijing Children's Hospital, Capital Medical University. Efter att ha fått en prime- och boost-vaccination med ett levande försvagat JE SA14-14-2-vaccin mindre än 6 månader tidigare samlades perifera blodprover från volontärerna. Mycket jämförbara data erhölls från olika instrument efter standardiserade procedurer, vilket är till hjälp för multicenterbedömningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien godkändes av etikkommittén vid Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (godkännandenummer: 2020-k-85). Informerat samtycke från försökspersoner avstod från eftersom endast restprover efter kliniska tester användes i denna studie. Två labb är involverade i denna studie. Det överförande labbet är där den standardiserade metoden utvecklades med hjälp av en flödescytometer. Cytometern i detta laboratorium kallas nedan cytometer A. Testmetodlaboratoriet är det laboratorium som tar emot metoder med en annan flödescytometer, och cytometern i detta laboratorium kallas nedan cytometer B.
1. Perifer blodprovssamling och cellberedning
- Samla perifera blodprover (2 ml) från JE-vaccinerade barn och ovaccinerade barn i EDTA-K 2-antikoagulerade rör med standard venpunktur.
- Blanda hela blodprovet genom att vända rören upp och ner 10x. Tillsätt 100 μl helblod till ett rör på 12 x 75 mm. Gör varje prov i två exemplar.
- Tillsätt 10 μL briljant fläckbuffert (BV-buffert) till ett rör på 12 mm x 75 mm. Tillsätt 5 μl av varje antikropp (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; utspädningsfaktor: 1:20) och 20 μL antikropp (CD25, CD45RA; utspädningsfaktor: 1:5) till BV-bufferten. Virvel försiktigt.
OBS: Volymer och information om antikroppsreagenserna visas i tabell 1. - Tillsätt antikroppscocktailen i röret med hela blodprovet. Vortex försiktigt och inkubera vid rumstemperatur i 15 min i mörkret.
- Späd 10x lyseringslösningen 1:10 med destillerat vatten för att förbereda 1x lyseringslösningen. Lysera blodproverna genom att tillsätta 2 ml 1x lyseringslösning. Vortex försiktigt och inkubera i 10 minuter i mörkret vid rumstemperatur.
- Centrifugera vid 300 × g i 5 minuter och dekantera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 2 ml 1x PBS, centrifugera vid 300 × g i 5 minuter och dekantera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 0,5 ml 1x PBS och blanda noggrant. Förvaras vid 2 °C till 8 °C. Skicka proverna till de två laboratorierna för flödescytometrisk analys.
Anmärkning: Det negativa kontrollprovet och cellfärgningen måste bearbetas samtidigt.
2. Förbereda kompensationspärlor och enkelfärgad kontroll
- Etikett V500-anti-CD45 enkelfärgad, APC-H7-anti-CD3 enkelfärgad, FITC-anti-CD4 enkelfärgad, R718-anti-CD8 enkelfärgad, BV605-anti-CD27 enkelfärgad, APC-anti-CD45RA enkelfärgad, PE-anti-CD25 enkelfärgad, BV421-anti-CD127 enkelfärgad, BB700-anti-CD19 enkelfärgad och PE-CY7-anti-IgD enkelfärgade rör.
- Tillsätt 100 μL 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösningsbuffert (DPBS) innehållande 1% fetalt bovint serum (FBS) till ett 5 ml rundbottens polystyrenprovrör.
- Tillsätt 50 μL av de negativa pärlorna och 50 μL av anti-musen Ig, κ-pärlorna till varje rör och virvel.
- Tillsätt 2 μL av varje märkt antikropp (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) till ett enkelfärgat rör. Blanda försiktigt och inkubera i 15 minuter i mörker vid rumstemperatur (20 °C till 25 °C).
- Återsuspendera pärlorna i 2 ml 1x PBS, centrifugera vid 300 × g i 5 minuter och dekantera supernatanten.
- Resuspendera pärlorna i 0,5 ml 1x PBS och blanda noggrant. Förvaras vid 2 °C till 8 °C.
3. Använda identiska konfigurationsnamn på de olika cytometrarna i två laboratorier
- Skapa en ny konfiguration i programvaran för cytometer A. Klicka på knappen Cytometer och välj Visa konfigurationer för att visa konfigurationsfönstret.
- Högerklicka på baskonfigurationsmappen i konfigurationslistan, välj Ny mapp och byt namn på den.
- Högerklicka på grundkonfigurationen och välj kopiera.
- Högerklicka på den nya mappen och klistra in baskonfigurationen för att skapa en ny konfiguration. Byt namn på den nya konfigurationen "Standardiserad metodöverföring".
- Dra parameternamnet, till exempel FITC, från listan Parametrar till lämplig detektor (530/30).
- Redigera ytterligare parametrar (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 och BV605) till den nya konfigurationen.
- Följ den här metoden för att skapa en ny konfiguration på en annan flödescytometermodell med samma namn "Standardiserad metodöverföring". Kontrollera att konfigurationen innehåller samma parametrar för varje detektor.
Om du vill identifiera experimentmallen på de två olika flödescytometermodellerna kontrollerar du att namnet är konsekvent. - Under cytometerkonfigurationerna använder du cytometerinställnings- och spårningspärlor (CST) för att definiera cytometerbaslinjen och spåra cytometerprestanda. Klicka på knappen Cytometer och välj CST för att visa arbetsytan för cytometerinställning och spårning.
- Tillsätt tre droppar (150 μL) installationspärlor till 0,5 ml 1x PBS i ett 5 ml rundbottens polystyrenprovrör. Placera pärlröret på cytometern.
- I fönstret Inställningskontroll väljer du Definiera baslinje och klickar på Kör.
4. Standardiserande experiment med cytometer A i det överförande laboratoriet
- Kör en prestandakontroll med cytometerinställningen och spårningspärlor för att verifiera att cytometern fungerar bra.
- Högerklicka på cytometerinställningarna i programvarufönstret och välj Programinställningar för att skapa ett kalkylblad.
- Använd ett ofärgat prov och justera fotomultiplikatorrörets (PMT) spänningar för FSC, SSC och alla fluorescensparametrar. FSC: 260; SSC: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; APC: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; och BV605: 505.
- Högerklicka på experimentets cytometerinställningar och välj programinställningar för att spara den.
- Klicka på experimentknappen och välj inställningsmenyn för kompensation . Välj sedan Skapa kompensationskontroller för att automatiskt lägga till kompensationskontroller .
- Registrera data för alla kompensationskontrollpärlor.
- Klicka på experimentet och välj kompensationsinställningar. Beräkna sedan kompensationen automatiskt.
- Registrera data för enkelfärgade cellkontroller.
- Använd CD45RA APC för att ändra kompensationsvärdet för R718 till 15 % APC. Använd CD19 BB700 för att ändra kompensationsvärdet för APC-H7 till 14 % BB700. Använd CD8 R718 för att ändra kompensationsvärdet för APC-H7 till 60 % R718.
- Registrera data för CST-pärlorna.
- Skapa ett globalt kalkylblad för målvärdesmallen för CST-ljusa pärlor.
- Använd ett FSC/SSC-diagram och rita polygongrinden för CST-ljuspärlorna. Hämta histogramdiagram med 10 fluorescenskanaler för CST-ljuspärlorna: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 och BV605. Skapa intervallgrindar i histogramdiagrammen. Skapa statistikvyn genom att visa medianen för intervallgrindarna.
- Kör proverna på flödescytometern; samla totalt 25 000 lymfocyter.
- Skapa ett globalt kalkylblad för analysmallen för exemplen.
- Använd följande exempelgrindstrategi:
- Använd ett CD45/sidospridningsområde (SSC-A) punktdiagram och rita polygongrinden för att identifiera den intakta lymfocytpopulationen medan skräp utesluts.
- Använd ett CD3 / CD19-punktdiagram och rita en rektangulär grind för att välja CD3 + T-celler och CD19 + B-celler.
- Använd ett CD4 / CD8-punktdiagram och rita en fyrgrind för att välja CD4 + eller CD8 + T-celler (celler med hög fluorescens för dessa markörer).
- Använd ett CD45RA/CD27-punktdiagram och rita en fyrgrind för att dela upp CD8+- eller CD4+ T-celler i naiva (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+, CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA-) och TEMRA-celler (CD27-CD45RA+).
- Använd ett CD25 / CD127-punktdiagram och rita en fyrgrind för att dela upp CD4 + T-celler i Treg-celler (CD4 + CD25 + + CD127låg).
- Använd ett CD27 / IgD-punktdiagram och rita en fyrgrind för att dela upp CD19 + B-celler i naiva B-celler (CD27-IgD +) och minnes-B-celler (CD27 + IgD-).
- Spara experimentmallen på cytometer A.
- Använd CD-ROM-skivan för att exportera experimentmallen.
5. Överföring av experimentmallen till cytometer B i testmetodlaboratoriet
OBS: Den experimentella mallen innehåller instrumentinställningar, analysmallen och målvärdesmallen för medianfluorescensintensitet (MFI).
- Gör en prestandakontroll med CST-pärlor för att verifiera att cytometern fungerar bra.
- Importera experimentmallen och skapa ett experiment för cytometer B med hjälp av mallen.
- Använd samma parti CST-pärlor för att justera de fluorescerande parameterspänningarna för varje fluorescenskanal för att matcha det tidigare MFI-instrumentet.
MFI-värdena varierar inom ±5% (MFI för ljusa pärlor före och efter överföring visas i tabell 2). - Justera spänningen för FSC med hjälp av det ofärgade provet, om det behövs.
- Högerklicka på de experimentella cytometerinställningarna och välj programinställningar för att spara programinställningarna .
- Använd CD45RA APC för att ändra kompensationsvärdet för R718 till 15 % APC. Använd CD19 BB700 för att ändra kompensationsvärdet för APC-H7 till 24% BB700. Använd CD8 R718 för att ändra kompensationsvärdet för APC-H7 till 60 % R718.
- Kör proverna på flödescytometern; samla totalt 25 000 lymfocyter.
6. Överensstämmelse mellan de experimentella resultaten erhållna på de två cytometrarna
- Bedöm skillnaderna i lymfocytundergrupper mellan instrument med enkelriktad ANOVA (p < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bild 1 visar ett globalt kalkylblad för målvärdesmallen för CST-ljusa pärlor. Med hjälp av ett FSC/SSC-diagram ritas en polygongrind för att välja CST-ljuspärlor. Histogramdiagram med 10 fluorescenskanaler erhölls för CST-ljuspärlorna: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 och BV605. Målvärdet för varje parameter visas genom att medianen visas inom histogramgrindarna i tabell 2. Skärmdumparna av mallar och parameterinställningar i programvaran för cytometer A och cytometer B visas i kompletterande figur S1.
Figur 2 visar punktdiagrammen för ett prov mellan de två instrumenten efter instrumentstandardisering. Data visar konsistens mellan olika instrument med hjälp av en automatisk analysmall. Resultaten från sex prover jämfördes mellan två olika instrumentmodeller i tabell 3. Inga signifikanta skillnader i procentandelen av 15 lymfoida undergrupper mättes i de två laboratorierna. Dessa resultat visar att mycket jämförbara data erhölls enligt den standardiserade metoden. Procentandelarna för 15 lymfoida undergrupper från olika instrument visas i kompletterande tabell S1.
Bild 1: Global kalkylbladsmall för CST-ljusa pärlor. CST ljusa pärlor är gated i FSC kontra SSC-tomten. Histogramdiagram med 10 fluorescenskanaler presenteras för CST-ljuspärlorna. Intervallgrindar skapas för att inkludera den ljusa pärlpopulationen av CST-pärlor för varje fluorescensdetektor. Förkortningar: FSC-A = framåtspridningsområde; SSC-A = sidospridningsområde. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Jämförelse av punktdiagram från ett prov mellan de två instrumenten. (A) CD45/SSC-A punktdiagram används för att grinda lymfocyter. (B) CD3/CD19 punktdiagram används för att grinda CD3 + T-celler och CD19 + B-celler. (C) CD4/CD8 punktdiagram används för att identifiera CD3 + CD8 + T och CD3 + CD4 + T-celler. (D) CD25/CD127 punktdiagram används för att grinda Treg-celler (CD4+CD25++CD127låg). (E) CD45RA/CD27 punktdiagram för CD4+ T-celler används för att grinda naiva (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) och TEMRA (CD27-CD45RA+). (F) CD45RA/CD27 punktdiagram för CD8+ T-celler används för att grinda naiva (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) och TEMRA (CD27-CD45RA+). (G) CD27/IgD-punktdiagram används för att grinda naiva B-celler (CD27- IgD+) och minnes-B-celler (CD27+ IgD-). Grindstrategin är från Zhang et al.7. Förkortningar: SSC-A = sidospridningsområde; TCM = centralt minne T-celler; TEM = effektorminne T-celler; TEMRA = terminalt differentiellt effektorminne T-celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Antikroppsmål | Fluorokrom | Klon | Katalognummer | Volym per test (μL) |
| CD4 | FITC | SK3 | 566320 | 5 |
| CD25 | PE | M-A251 | 555432 | 20 |
| CD19 | BB700 | HIB19 | 745907 | 5 |
| IgD | PE-CY7 | IA6-2 | 561314 | 5 |
| CD45RA | APC | HI100 | 550855 | 20 |
| CD8 | R718 | G42-8 | 751953 | 5 |
| CD3 | APC-H7 | SK7 | 560176 | 5 |
| CD127 | BV421 | HIL-7R-M21 | 562436 | 5 |
| CD45 | V500 | HI30 | 560777 | 5 |
| CD27 | BV605 | L128 | 562656 | 5 |
Tabell 1: Antikroppsvolymer och konjugerad fluoroforinformation för flödescytometriska analyser. Förkortningar: BV = lysande violett; BB = lysande blå; FITC = fluoresceinisotiocyanat, PE = fykoerytrin; APC = allofykocyanin.
| MFI av ljusa pärlor | |||
| Kanal | Cytometer A | Cytometer B | %Diff i MFI |
| FSC | 22,133 | 22,689 | 2.51% |
| SSC | 1,51,361 | 1,51,261 | -0.07% |
| FITC | 9,956 | 9,964 | 0.08% |
| PE | 30,877 | 31,264 | 1.25% |
| BB700 | 19,265 | 19,440 | 0.91% |
| PE-CY7 | 14,406 | 14,375 | -0.22% |
| APC | 64,494 | 64,340 | -0.24% |
| R718 | 41,271 | 41,456 | 0.45% |
| APC-H7 | 90,666 | 90,837 | 0.19% |
| BV421 | 9,882 | 9,776 | -1.07% |
| V500 | 19,680 | 19,425 | -1.30% |
| BV605 | 10,794 | 10,356 | -4.06% |
Tabell 2: MFI av ljusa pärlor före och efter överföring. Förkortningar: MFI = genomsnittlig fluorescensintensitet; BV = lysande violett; BB = lysande blå; FITC = fluoresceinisotiocyanat, PE = fykoerytrin; APC = allofykocyanin.
| Genomsnitt av procentsatser | Genomsnitt av procentsatser | ||
| Cytometer A (n = 6) | Cytometer B (n = 6) | P-värde | |
| T-celler | 71.30 | 74.73 | 0.19 |
| CD4 + T-celler | 48.63 | 47.75 | 0.82 |
| CD4+ TCM | 30.68 | 28.20 | 0.06 |
| CD4+ naiv | 57.60 | 58.25 | 0.90 |
| CD4+ TEM | 8.98 | 10.52 | 0.51 |
| CD4 + TEMRA | 2.73 | 3.07 | 0.81 |
| Treg | 9.07 | 8.57 | 0.74 |
| CD8 + T-celler | 40.63 | 40.45 | 0.98 |
| CD8+ TCM | 16.83 | 14.78 | 0.75 |
| CD8+ naiv | 49.08 | 47.70 | 0.80 |
| CD8+ TEM | 6.35 | 8.20 | 0.51 |
| D4+ TEMRA | 27.75 | 29.30 | 0.77 |
| B-celler | 13.88 | 13.20 | 0.84 |
| naiv B | 67.88 | 70.38 | 0.84 |
| Minne B | 11.88 | 11.80 | 0.95 |
Tabell 3: Bedömning av skillnader i undergrupper av lymfocyter mellan instrument. P > 0,05 indikerar ingen signifikant skillnad. Förkortningar: TCM = centralt minne T-celler; TEM = effektorminne T-celler; TEMRA = terminalt differentierade effektorminnes-T-celler.
Kompletterande tabell S1: Procentandelar av lymfocytundergrupper i sex prover från olika instrument. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S1: Skärmdumpar av mallar och parameterinställningar i programvaran för cytometer A och cytometer B. (A) XML-filen med mallar. (B) Skärmdumpar av mallar. (C) Parameterinställningarna i cytometer A. (D) Parameterinställningarna i cytometer B. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunofenotypning av undergrupper av perifera lymfocyter kan hjälpa till att förstå förändringarna i cellmedierad adaptiv immunitet efter vaccination hos barn. I kliniska tillämpningar uppstår oväntade situationer, såsom underlåtenhet att upptäcka prover i tid eller ersättning av en flödescytometer; Därför behövs snabba standardiserade metoder som underlättar överföringar mellan flödescytometrar i olika laboratorier 9,10,11. Här beskriver vi en snabb standardiserad metod för att säkerställa konsekventa resultat mellan olika instrument. Den standardiserade metoden användes för att övervaka immunceller i perifert blod hos barn efter vaccination, och konsekventa resultat erhölls i två laboratorier. Den standardiserade metoden etablerades mellan BD Canto och LSRFortessa. Protokollet är också lämpligt för FACSCelesta, FACSymphony A5 och FACSAria II. Jämfört med andra standardiseringsmetoder 2,3 kräver denna standardmetod inte användning av programvara från tredje part för att få enhetlighet av data. Den använder endast egenskaperna hos Diva-programvaran för att skapa en mallmodul som innehåller målvärdesposition och automatisk analys för att realisera överföringsmetoden mellan olika instrument och minskar behovet av dataanalys. Metoden sparar tid, är enkel att använda och kräver inte utveckling av ett automatiserat grindverktyg.
Standardisering av ett flödescytometriprotokoll i denna studie uppnås genom att skapa en experimentell mall på ett instrument som inkluderar cytometriinställningar, automatisk dataanalys och målpositionsblad. Sedan använder de andra instrumenten CST-pärlor för att justera parameterspänningarna för att nå målvärdet. Flera viktiga funktioner bör övervägas för att slutföra framgångsrik standardisering över olika flödescytometerinstrument. För det första kräver den standardiserade metoden att instrumenten använder samma programvarusystem, så att XML-filen i experimentmallen kan delas mellan instrumentens programvara. För det andra bör de två instrumenten ha samma namn för konfigurationen, och parametrarna bör också namnges identiskt. För det tredje bör CST-pärlorna samlas in under de angivna spänningsförhållandena utan kompensation som målvärden. Med tanke på de olika laserkrafterna och PMT-känsligheten hos olika instrument är det nödvändigt att använda CST-pärlor från samma partinummer för att justera spänningsparametrarna, enligt målvärdena på andra instrument, och se till att MFI-värdet ligger inom ±5%. För det fjärde är dagliga kvalitetskontroller av instrument också mycket viktiga. Om ett instrument inte klarar bedömningen måste flödescellen rengöras för bubblor eller utsättas för laserkalibrering. Slutligen, för att minska skillnader orsakade av beredningsförfaranden, bör proverna beredas på ett identiskt sätt när sådana stora multicenterstudier genomförs, förutom att överföra inställningar för att kunna analysera proverna i olika laboratorier. Det finns dock fortfarande utrymme för paneloptimering för bättre identifiering av minne B-celler i detta protokoll. Frekvensen av minne B-celler är relativt låg hos 2-åriga barn, och CD27-uttryck på ytan av dessa celler är diffust. Detta kan bättre identifiera minne B-celler om markören ersätts med ett ljusare fluorescein än BV605.
Vissa begränsningar bör dock noteras. Först användes två flödescytometrar för standardisering i detta experiment; Ytterligare instrumentmodeller bör inkluderas i efterföljande experiment. För det andra användes cellytfärgningsmetoden för att skilja och bestämma lymfocytundergrupper och involverade inte detektion av mer intracellulära cytokiner. För det tredje jämförde vi inte de experimentella resultaten med och utan standardiseringsprocessen för två flödescytometrar.
Fördelen med denna standardiserade metod är att olika instrument kan dela XML-filen i experimentmallen om programvaran är densamma. Den experimentella mallen innehåller mallen för fasta målvärden och data kan endast erhållas efter justering av PMT-spänningar till målvärdena mellan instrumenten. Dessutom innehåller experimentmallen också automatisk grindstrategianalys. När data har erhållits genereras den automatiska analysrapporten. Denna procedur är enkel att använda och minskar skillnaderna i resultat som orsakas av manuell analys. Denna standardiserade metod kan användas för att bedöma förändringar i lymfocytundergrupper i helblodet hos JE-vaccinerade barn med hjälp av olika instrument över laboratorier, vilket uppnår målet att säkerställa att studieprojektet utförs konsekvent över flera centra. I denna studie strävar vi efter att testa konvertibiliteten av den standardiserade metoden genom ytfärgning, och dess framgång kommer att lägga en grund för utövandet av senare intracellulär färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
RW stöddes av Beijing Natural Science Foundation, Kina (nr 7222059), National Natural Science Foundation of China (nr 82002130), XZ stöddes av CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nr 2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
